Kettritz, Ralph: Untersuchungen zu zellulären Mechanismen bei ANCA-assoziierten nekrotisierenden Vaskulitiden Grundlagen der Aktivierung und der Apoptose neutrophiler Granulozyten

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Zusammenfassung

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zu zellulären Mechanismen ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden. Es wurden dabei 1) die ANCA-induzierte Aktivierung neutrophiler Granulozyten und 2) die Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten untersucht. Beide Vorgänge stellen zentrale Krankheitsmechanismen dar. Während die Aktivierung bei der Initiierung der Krankheit eine besondere Rolle spielt, ist die Regulation der Apoptose für die Unterhaltung und die Auflösung der inflammatorischen Antwort von hervorragender Bedeutung.

Um Mechanismen der ANCA-induzierten Aktivierung neutrophiler Granulozyten zu untersuchen und den Teil des ANCA-Moleküles zu identifizieren, der für die Auslösung dieses Vorganges essentiell ist, wurden intakte Antikörper und deren korrespondierende F(ab')2- und Fab-Fragmente präpariert und getestet. Das Priming der Zellen mit nicht-aktivierenden Dosen von TNFalpha führte zur Translokation der ANCA-Antigene auf die äußere Zellmembran. Es wird gezeigt, daß intakte ANCA, ANCA-F(ab')2- und ANCA-Fab-Fragmente an TNFalpha-geprimte neutrophile Granulozyten binden. Dabei resultierte nur aus der Bindung des intakten ANCA-Moleküls und des korrespondierenden ANCA-F(ab')2-Fragmentes die Generation von Sauerstoffradikalen. Im Gegensatz dazu war für die Aktivierung durch Fab-Fragmente zusätzlich zur Bindung eine Quervernetzung notwendig. Diese Daten demonstrieren, daß die Generation von Superoxid in ANCA-aktivierten neutrophilen Granulozyten nur durch die konzertierte Aktion von Bindung des Auto-Antikörpers und gleichzeitiger Quervernetzung der Ziel-Antigene ausgelöst wird. Es konnte darüberhinaus gezeigt werden, daß die Blockade des FcgammaIIa-Rezeptors zu einer partiellen Hemmung der ANCA-stimulierten Superoxid-Generation führt. Die Ligation des Fcgamma-Rezeptors moduliert die Aktivierung TNFalpha-geprimter neutrophiler Granulozyten durch ANCA, stellt selbst aber keine conditio sine qua non dar.

Der zweite Themenkomplex beschäftigte sich mit der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten. ANCA-aktivierte neutrophile Granulozyten produzieren Sauerstoffradikale und geben diese in ihre Umgebung ab. Die Ergebnisse zeigen, daß Superoxid einen wichtigen Mediator für die Apoptose darstellt. Es konnte darüberhinaus demonstriert werden, daß die konstitutive Apoptose neutrophiler Granulozyten durch krankheitsrelevante lösliche Mediatoren beeinflußt wird. Dabei wird die Apoptose-akzelerierende Wirkung des bakteriellen Peptides FMLP und des proinflammatorischen Zytokines TNFalpha charakterisiert und gezeigt, daß die Wirkung von Zytokinen auf die Apoptose interaktiv sein kann. So weist Interleukin-8, ein Zytokin mit chemotaktischen Eigenschaften, zusätzlich eine Apoptose-verzögernde Wirkung auf. Interleukin-8 hemmte sowohl die spontane als auch die TNFalpha-vermittelte Apoptose. RT-PCR und Western-Blot-Untersuchungen zeigten, daß die IL-8-Behandlung nicht zur Induktion der Expression des Apoptose-verzögernden Genes Bcl-2 führt.

In den durchgeführten Untersuchungen wurden neue Proteine mit potentieller regulatorischer Bedeutung für das Überleben neutrophiler Granulozyten identifiziert. Apoptotische und nicht-apoptotische Zellen wurden mit Hilfe eines diskriminierenden Antikörpers und magnetischer Teilchen separiert und die Protein-Expressionsmuster wurden in der hochauflösenden


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zweidimensionalen Gelelektrophorese analysiert und verglichen. Da neutrophile Granulozyten Proteine neu synthetisieren müssen, um zu überleben, waren beonders solche Proteine interessant, die nach der Kultivierung in den nicht-apoptotischen Zellen stärker exprimiert waren als in den frisch isolierten Zellen und deren Expression in den apoptotischen Zellen vermindert war. Mit Hilfe verschiedener Proteinsequenzierungstechniken wurden die Proteine Aktin, MRP-8, MRP-14, alpha-Enolase und Katalase identifiziert. Die beiden letzteren sind interessanterweise kürzlich als Ziel-Antigene von ANCA beschrieben worden. Die potentielle Bedeutung dieser Proteine für die Apoptose wird diskutiert.

Letztlich wurde die Rolle von extrazellulären Matrixproteinen bei der Apoptose von neutrophilen Granulozyten untersucht. Die Resultate zeigen, daß die Interaktion mit extrazellulären Matrixsubstanzen wie Fibronektin zu einer Akzeleration der TNFalpha-induzierten Apoptose führt. Diese Akzeleration wurde durch Tyrosin-Phosphorylierung vermittelt und Ly-GDI, ein regulatorisches Protein für kleine G-Proteine der Ras-Superfamilie, wurde als ein Substrat der Tyrosin-Kinasen charakterisiert. Ly-GDI wurde nur dann phosphoryliert, wenn TNFalpha-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Fibronektin interagierten. Untersuchungen zur Expression von Ly-GDI demonstrierten, daß das intakte Protein in TNFalpha-behandelten Zellen gespalten wurde und daß diese Spaltung durch Fibronektin akzeleriert wurde. Bei der Spaltung von Ly-GDI wurde ein 23 kDa-Fragment generiert. Die spezifische Hemmung von Caspase-3 verhinderte gleichzeitig die Bildung dieses 23 kDa-Fragmentes und die TNFalpha-vermittelte Apoptose.

Zusammenfassend wurde in Beantwortung der ersten Fragestellung die Quervernetzung der exprimierten ANCA-Antigene durch die ANCA-Antikörper als ein initialer Mechanismus für die Aktivierung neutrophiler Granulozyten identifiziert. Im zweiten Themenkomplex wurden der Effekt krankheitsrelevanter löslicher Mediatoren sowie die Wirkung der extrazellulären Matrix auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten charakterisiert. Letztlich konnten neue Kandidaten-Proteine und neue intrazelluläre Signaltransduktionswege für die Regulation der Lebensspanne neutrophiler Granulozyten identifiziert werden.


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Thu Apr 19 14:16:02 2001