Zur
Erlangung der venia legendi
für das Fach Innere Medizin
der Humboldt-Universität Berlin

vorgelegt von: Dr. Ralph Kettritz

Berlin

1999

Zusammenfassung

Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen zu zellulären Mechanismen ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden. Es wurde dabei zunächst die ANCA-induzierte Aktivierung neutrophiler Granulozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Quervernetzung der ANCA-Antigene auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten die Generation von Sauerstoffradikalen auslöst. Der zweite Komplex beschäftigte sich mit der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten, die einen zentralen Mechanismus für die Auflösung von Entzündungen darstellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Apoptose neutrophiler Granulozyten durch IL-8 verzögert und durch TNF-alpha akzeleriert wird. Dabei führt die Interaktion mit extrazellulären Matrixsubstanzen wie Fibronektin zu einer weiteren Akzeleration der TNF-alpha-induzierten Apoptose. Die Bedeutung der Tyrosin Phosphorylierung für diesen Prozess wird gezeigt, und Ly-GDI, ein regulatorisches Protein für kleine GTPase-Proteine der Ras-Superfamilie, wurde als ein Substrat der Tyrosin-Kinasen charakterisiert. Letztlich konnten neue Kandidaten-Proteine für die Regulation der Lebensspanne neutrophiler Granulozyten identifiziert werden.

Schlagwörter:
Vaskulitis, ANCA, neutrophile Granulozyten, Apoptose

Abstract

Mechanisms of ANCA-associated vasculitis were studied. First, the activation of human neutrophils by ANCA was investigated. The data demonstrate the important role of cross-linking ANCA-antigens by the auto-antibodies on the cell surface for the initiation of a respiratory burst. The second issue was the regulation of neutrophil apoptosis that is central to the resolution of inflammation. These experiments indicate that apoptosis was delayed by IL-8 and accelerated by TNF-alpha. Interaction with extracellular matrix proteins, such as fibronectin resulted in further acceleration of apoptosis. The important role of protein tyrosine phosphorylation was demonstrated, and Ly-GDI, a regulator of GTPase-proteins of the ras-superfamily was characterized. Finally, proteins that may control the life span of neutrophils were identified.

Keywords:
Vasculitis, ANCA, neutrophils, apoptosis

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Untersuchungen zu zellulären Mechanismen bei ANCA-assoziierten nekrotisierenden Vaskulitiden Grundlagen der Aktivierung und der Apoptose neutrophiler Granulozyten
Abkürzungsverzeichnis	Abkürzungsverzeichnis
Zusammenfassung	Zusammenfassung
1	Einleitung
1.1	Nosologie der nekrotisierenden systemischen Vaskulitiden
1.2	Die Pathophysiologie ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden
1.2.1	Charakterisierung der ANCA
1.2.2	Die Interaktion von ANCA mit neutrophilen Granulozyten
1.2.3	Die Interaktion von ANCA-aktivierten neutrophilen Granulozyten mit Endothelzellen
1.3	Fragestellungen der Arbeit
2	Material und Methoden
2.1	Puffer und Reagenzien
2.2	Isolierung von humanen neutrophilen Granulozyten
2.3	Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA
2.3.1	Präparation der intakten Immunglobuline und der Immunglobulin-Fragmente
2.3.2	ELISA zur Bestimmung der Reinheit der ANCA F(ab')2-und Fab-Fragmente
2.3.3	Durchflußzytometrische Studien zu den Bindungseigenschaften von intakten ANCA und den F(ab')2- und Fab-Fragmenten
2.3.4	Messung der Superoxid-Generation
2.3.5	Quervernetzung von ANCA-Antigenen
2.3.6	Blockade des FcIIa-Rezeptors
2.4	Zellkultur
2.4.1	Zellkulturbedingungen
2.4.2	Beschichtung der Zellkulturplatten
2.5	Nachweis der Apoptose
2.5.1	Färbung mit Propidium-Jodid
2.5.2	Färbung mit Annexin
2.5.3	Bestimmung der FcIII (CD16)-Rezeptor-Expression
2.5.4	Zellfärbung mit Wright Giemsa und 4',6 Diamidino-2-Phenylindol
2.5.5	DNA-Fragmentations-Assay
2.6	Bestimmung der Zelladhäsion und des Zell-Spreadings
2.7	Analyse der Proteinexpression
2.7.1	Western Blot-Analyse zur Expression von Bcl-2 und Ly-GDI sowie zur Detektion von Tyrosin-phosphorylierten Proteinen
2.7.2	Nachweis der Expression von Bcl-2 mit der Durchflußzytometrie
2.7.3	Zweidimensionale Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse zur Identifizierung von Substraten der Tyrosin-Phosphorylierung
2.7.4	Immunzytochemie zur Lokalisation der Tyrosin-Phosphorylierung
2.8	Analyse der mRNA-Expression durch RT-PCR
2.8.1	Extraktion der RNA
2.8.2	Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der RNA
2.8.3	Durchführung der RT-PCR
2.8.4	Gelelektrophorese
2.9	Charakterisierung von differentiell exprimierten Proteinen bei der Apoptose neutrophiler Granulozyten
2.9.1	Separation nicht-apoptotischer und apoptotischer Zellen durch Sortierung mit Antikörper-beladenen magnetischen Teilchen
2.9.2	Zweidimensionale hochauflösende Gelelektrophorese
2.9.3	Enzymatischer in-gel-Verdau, Extraktion und Entsalzung der Proteine
2.9.4	Reverse HPLC und Sequenzierung durch Edman-Degradation
2.9.5	Peptid-Sequenzierung durch MALDI-MS (Matrix assisted laser desorption/ionization)
2.9.6	Peptid-Sequenzierung durch Nanoelektrospray-Massen-Spektrometrie
2.9.7	Datenbankvergleiche
2.10	Auswertungen
3	Ergebnisse
3.1	Mechanismen der Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA
3.1.1	Bindungsverhalten von ANCA und den korrespondierenden F(ab')2- und Fab-Fragmenten
3.1.2	Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA und die korrespondierenden F(ab')2- und Fab-Fragmente
3.1.3	Rolle des FcIIa-Rezeptors bei der Aktivierung
3.1.4	Regulation der Apoptose durch extrazelluläre Matrix-Proteine
3.1.4.1	Effekt von extrazellulären Matrixproteinen auf die spontane und auf die TNF-vermittelte Apoptose
3.1.4.2	Signaltransduktion der Fibronektin-induzierten Akzeleration von TNF-vermittelter Apoptose
3.1.4.2.1	Der Effekt von Inhibitoren der Signaltransduktion
3.1.4.2.2	Charakterisierung der Tyrosin-Phosphorylierung
3.1.4.2.3	Identifizierung von Ly-GDI als ein Substrat der Tyrosin-Phosphorylierung
4	Diskussion
4.1	Mechanismen der Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch ANCA
4.2	Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten
4.2.1	Die Rolle von Zytokinen
4.2.2	Differentiell exprimierte Proteine bei der Apoptose
4.2.3	Die Bedeutung von extrazellulären Matrix-Proteinen
5	Nachwort
Bibliographie	Literatur

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:	Superoxid-Produktion in TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten nach Stimulation mit humanen ANCA, Maus-Antikörpern gegen humane PR3 und den jeweiligen korrespondierenden Antikörperfragmenten.
Tabelle 2:	Ergebnisse der Sequenzierung der Proteine 1-5. Es handelt sich um Kandidaten-Proteine mit regulatorischer Funktion für das Überleben neutrophiler Granulozyten.

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:	Betroffene Gefäßabschnitte bei systemischen Vaskulitiden. Es läßt sich eine deutliche Überlappung erkennen. Small-vessel-Vaskulitiden stellen eine Krankheitsgruppe dar, die immer auch Gefäße distal der Arteriolen befällt. Die mit einem Stern gekennzeichneten Erkrankungen sind durch das Auftreten von ANCA charakterisiert.
Abbildung 2:	Schematische Darstellung zentraler pathophysiologischer Abläufe bei der Entstehung ANCA-assoziierter Vaskulitiden und Glomerulonephritiden. 1) Priming von PMN durch geringe Zytokinkonzentrationen im Rahmen von Infektionen 2) Aktivierung der geprimten PMN durch ANCA 3) Schädigung von Endothelzellen durch adhärierende ANCA- aktivierte PMN
Abbildung 3:	Schematische Darstellung pathophysiologischer Abläufe bei der Entstehung ANCA-assoziierter Vaskulitiden und Glomerulonephritiden.1) Priming von PMN durch geringe Zytokinkonzentrationen im Rahmen von Infektionen 2) Aktivierung der geprimten PMN durch ANCA 3) Schädigung von Endothelzellen durch adhärierende ANCA-aktivierte PMN 4) Transmigration der PMN durch die endotheliale Barrierre mit vielfältigen Interaktionen zwischen PMN und ECM 5) Apoptose der aktivierten PMN unter dem Einfluß von Zytokinen und ECM 6) Phagozytose apoptotischer PMN
Abbildung 4:	Mittels Durchflußzytometrie wurden die Bindungseigenschaften von biotinylierten humanen PR3-ANCA, PR3 F(ab')2- und Fab-Fragmenten mit denen von entsprechenden Kontroll-Präparationen verglichen (Panel A). Das Bindungsverhalten des intakten monoklonalen Antikörpers gegen menschliche PR3 und seines korrespondierenden F(ab')2-Fragmentes sowie der monoklonalen Kontroll-Präparationen ist in Panel B gezeigt.
Abbildung 5:	TNF-geprimte neutrophile Granulozyten wurden mit 5, 50, 125, und 250 µg/ml intakte PR3-ANCA und 0,5, 1, 5, 10, 15, 25, 50 und 125 µg/ml des korrespondierenden F(ab')2-Fragmentes stimuliert. Die Superoxid-Produktion zeigt eine Dosis-Wirkungs-Beziehung.
Abbildung 6:	Der Effekt von intakten ANCA, F(ab')2- und Fab-Fragmenten auf die Superoxidgeneration wurde parallel an TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten derselben Präparation getestet. Die Zellen wurden mit 125 µg/ml intakten ANCA oder den korrespondierenden Antikörper-Fragmenten stimuliert (Panel A-C).
Abbildung 7:	Dargestellt ist die Generation von Superoxid durch TNF-geprimte neutrophile Granulozyten, die mit 125 µg/ml humanen ANCA-Fab-Fragmenten ohne oder mit nachfolgender Gabe von quervernetzenden F(ab')2-Fragmenten eines Ziegen-Antikörpers gegen menschliche IgG-F(ab')2 stimuliert wurden.
Abbildung 8:	Der Effekt von intaktem monoklonalen Antikörper gegen menschliche Proteinase 3 (schwarze Säulen) und dem korrespondierenden F(ab')2-Fragment (offene Säulen) auf die Superoxidproduktion TNF-geprimter neutrophiler Granulozyten. Es besteht eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für den intakten monoklonalen Antikörper, während die F(ab')2-Fragmente bei keiner der eingesetzten Konzentrationen eine Aktivierung auslösten (n=5).
Abbildung 9:	Die Quervernetzung von F(ab')2-Fragmenten eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen humane PR3 auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten führt nicht zur Generation von Superoxid.
Abbildung 10:	Die Blockade des FcIIa-Rezeptors mit dem Antikörper IV.3 hemmt die Freisetzung von Superoxid in TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten, die mit 125 µg/ml PR3-ANCA (Pat K.M.) stimuliert wurden. Die Superoxid-Generation ohne (offene Symbole) und mit FcIIa-Rezeptor-Blockade (geschlossene Symbole) wurde nach 5, 15, 30 und 60 min. bestimmt.
Abbildung 11:	Die Blockade des FcIIa-Rezeptors bewirkte eine Inhibition der Superoxid-Freisetzung in TNF-geprimten neutrophilen Granulozyten, die entweder mit humanen ANCA oder mit monoklonalem Antikörper gegen menschliche Proteinase 3 stimuliert wurden. Superoxid wurden in der Abwesenheit (offene Symbole) oder in der Anwesenheit (geschlossene Symbole) eines FcIIa-Rezeptor-blockierenden Antikörpers gemessen.
Abbildung 32:	Zweidimensionale hochauflösende Gelelektrophoresen von humanen neutrophilen Granulozyten. Dargestellt sind die Proteinexpressionsmuster von frisch isolierten Zellen (links), 24 h kultivierten nicht-apoptotischen (Mitte) und apoptotischen Zellen (rechts). Die Entwicklung der Gele erfolgte durch Silberfärbung. Die Proteine, die sequenziert wurden, sind im mittleren Gel mit den Zahlen 1-5 numeriert.
Abbildung 33:	Schematischer Ablauf der Proteinsequenzierung
Abbildung 34:	Der Effekt von Fibronektin und PolyHema auf die spontane Apoptose-Rate von neutrophilen Granulozyten. Die Zellen wurden entweder auf PolyHema (unterbrochene Linie) oder auf Fibronektin (durchgezogenene Linie) kultiviert und zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die Zellen wurden mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Daten sind als Mittelwerte±SD dargestellt.
Abbildung 35:	Der Effekt von Fibronektin und PolyHema auf die Apoptose-Rate von TNF-stimulierten neutrophilen Granulozyten. TNF-stimulierte Zellen wurden entweder auf PolyHema (unterbrochene Linie) oder auf Fibronektin (durchgezogene Linie) kultiviert und zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die Zellen wurden mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Daten sind als Mittelwerte±SD dargestellt.
Abbildung 36:	Der Effekt von Fibronektin und PolyHema auf die DNA-Fragmentierung von TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten. Keine DNA-Fragmentation wurde in frisch isolierten Zellen (Bahn 1) und in unbehandelten Zellen auf PolyHema (Bahn 2) und Fibronektin (Bahn 3) beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen TNF-stimulierte Zellen auf PolyHema (Bahn 4) und auf Fibronektin (Bahn 5) typische niedrigmolekulare DNA-Fragmente. Die DNA-Fragmentierung war stärker ausgeprägt, wenn die Zellen auf Fibronektin kultiviert wurden. Bahn M zeigt die 100 bp DNA-Marker. Ein typisches Beispiel von 2 separaten Experimenten ist abgebildet.
Abbildung 37:	Der Effekt von löslichem Fibronektin auf die Apoptose von TNF-behandelten neutrophilen Granulozyten in Suspension. TNF-stimulierte Zellen (20 ng/ml) wurden für 4 Stunden in der Anwesenheit ansteigender Konzentrationen von löslichem Fibronektin (5 to 75 mg/ml) in Polypropylen-Röhrchen als Zellsuspension kultiviert. Die Proben wurden nach Ethanol-Permeabilisierung und Propidium-Jodid-Färbung mittels Durchflußzytometrie analysiert. Die Daten sind als Mittelwerte±SEM dargestellt (n=5).
Abbildung 38:	Der Effekt von verschiedenen extrazellulären Matrix-Proteinen auf die TNF-vermittelte Apoptose. Neutrophile Granulozyten wurden auf PolyHema (PH), Fibronektin (FN), Kollagen I (Col I), Kollagen IV (Col IV) und auf Laminin (Lam) für 8 h kultiviert. Die Zellen wurden mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Apoptose wurde mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Daten sind als Mittelwerte±SEM dargestellt (n=6). *Die Differenzen zwischen allen Matrices und PolyHema (p<0,05) sowie zwischen Fibronektin und allen anderen Matrix-Proteinen (p<0,05) waren signifikant.
Abbildung 39 :	Der Effekt von Genistein auf die TNF-vermittelte Apoptose. Neutrophile Granulozyten wurden auf Zellkultur-Platten kultiviert, die mit PolyHema, Fibronektin oder Poly-l-lysine beschichtet waren. Es erfolgte eine Stimulation mit 20 ng/ml TNF ohne oder mit Vorinkubation in Genistein (50 µM). Apoptose wurde nach Ethanol-Permeabilisierung und Propidium-Jodid-Färbung der Zellen mittels Durchflußzytometrie analysiert Die Daten sind als Mittelwerte±SEM dargestellt. Eine signifikante Hemmung durch Genistein war in TNF-behandelten Zellen auf Fibronektin (offene Säulen) und auf Poly-l-lysine (schraffierte Säulen), aber nicht auf PolyHema (schwarze Säulen) zu beobachten.
Abbildung 40:	Messung der Tyrosin Phosphorylierung mittels Western-Blotting. Die Zellen wurden auf Fibronektin oder auf PolyHema in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 ng/ml TNF kultiviert. Die Proben wurden nach 15, 30 und 60 Minuten geerntet. 50 µg Protein pro Bahn wurden für die Elektrophorese eingesetzt, geblottet und mit einem monoklonalen Antikörper (PY20) gegen Phosphotyrosin entwickelt. Die Tyrosin-Phosphorylierung der Proteinbanden mit 102, 95, 89, 63, 54 und 51 kDa war hochreguliert, wenn TNF-behandelte Zellen auf Fibronektin kultiviert wurden. Neue Tyrosin-phosphorylierte Banden waren bei 185, 85, 66, 56 und 42 kDa sichtbar. Ein typisches Beispiel von 3 unabhängigen Experimenten ist gezeigt.
Abbildung 41:	Konfokale Mikroskopie der Tyrosin-Phosphorylierung in TNF-stimulierten neutrophilen Granulozyten auf PolyHema (Panel A) und auf Fibronektin (Panel B). Eine starke Hochregulation der Tyrosin-Phosphorylierung war in den TNF-behandelten Zellen auf Fibronektin zu erkennen (Panel B). Die semi-quantitative Analyse ist in Panel C gezeigt. Die Zellen auf Fibronektin weisen ein charakteristisches Spreading auf. Eine verstärkte Tyrosin-Phosphorylierung ist an den Orten des Zell-Matrix-Kontaktes sowie im Zytoplasma zu sehen (Panel D, horizontaler Schnitt). In Panel E, einer Analyse in der vertikalen Achse (z-Achse), ist die gesteigerte Tyrosin-Phosphorylierung an den Zell-Matrix-Kontaktstellen und im Zytoplasma zu sehen. Eine repräsentative Untersuchung von 3 unabhängigen Experimenten ist abgebildet.
Abbildung 42:	2D-Gelektrophorese und Western-Blotting zur Untersuchung des Effektes von Fibronektin und TNF auf die Tyrosin-Phosphorylierung. Neutrophile Granulozyten wurden auf Fibronektin oder auf PolyHema kultiviert und entweder mit 20 ng/ml TNF stimuliert oder ohne Stimulation kultiviert. Die Proben wurden nach 60 Minuten lysiert, und 100 µg Protein/Gel wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (PY20) entwickelt. Die Zahl der Tyrosin-phosphorylierten Spots war in TNF-stimulierten PMN auf Fibronektin deutlich hochreguliert (Panel A), wohingegen wenig Phosphorylierung in TNF-stimulierten Zellen auf PolyHema (Panel B) oder in unstimulierten Zellen auf Fibronektin nachweisbar war (Panel C). Der mit einem Stern markierte Spot (*) konnte im korrespondierenden Coomassie-gefärbten Gel identifiziert werden.
Abbildung 43:	Die Identifizierung von Ly-GDI mittels Nanoelectrospray-Massen-Spektrometrie. Die Peptid-Ionen-Massen-Karte, die Masse der Framente A-F, die identifizierten Aminosäurensequenzen und deren Position im Ly-GDI Molekül sind dargestellt.
Abbildung 44:	Zeitverlauf der Spaltung von Ly-GDI. Neutrophile Granulozyten wurden mit 20 ng/ml TNF stimuliert und auf Fibronektin (Panel A) oder PolyHema (Panel B) kultiviert. Kontrollen wurden auf Fibronektin ohne Stimulation inkubiert (Panel C). Die Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und lysiert. 30 µg Protein wurden elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet, und die Blots wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen Ly-GDI entwickelt. TNF führte zur Abnahme von intaktem Ly-GDI und zum Auftreten eines 23-kDa-Spaltproduktes. Die Interaktion TNF-behandelter Zellen mit Fibronektin verstärkt die Spaltung von intaktem Ly-GDI.
Abbildung 45:	Bestimmung der Ly-GDI-Protein-Expression mittels optischer Densitometrie. Die Behandlung der neutrophilen Granulozyten mit TNF führt zu einer zeitabhängigen Abnahme der Ly-GDI-Expression. Im Vergleich zu PolyHema (o) war dieser Effekt stärker, wenn die Zellen auf Fibronektin (•) kultiviert wurden. Die Inkubation auf Fibronektin ohne Stimulation mit TNF führte zu keiner Abnahme der Ly-GDI Expression (?). Für die optische Densitometrie wurden eingescante Röntgenfilme der Western-Blot Analysen verwendet.
Abbildung 46:	Der Effekt des Caspase-3-Hemmers z-DEVD-cmk auf die TNF-vermittelte Spaltung von Ly-GDI wurde untersucht. Neutrophile Granulozyten wurden mit 100µM z-DEVD-cmk oder mit derselben Menge Lösungsmittel vorinkubiert und anschließend mit 20 ng/ml TNF stimuliert. Nach 8 Stunden Inkubation wurden die Zellen lysiert. 30 µg Protein wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet, und die Blots wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen Ly-GDI entwickelt. Die TNF-vermittelte Spaltung von intaktem Ly-GDI sowie die Generation des 23 kDa Fragmentes wurden durch 100 µM z-DEVD-cmk gehemmt.
Abbildung 47:	Der Effekt des Caspase-3-Hemmers z-DEVD-cmk und des Caspase-1-Hemmers YVAD-cmk auf die TNF-vermittelte Apoptose auf Fibronektin (quadratische Symbole) und auf PolyHema (Kreise) wurde untersucht. Dazu wurden neutrophile Granulozyten mit steigenden Dosen von entweder z-DEVD-cmk (durchgezogene Linie) oder YVAD-cmk (gestrichelte Linie) vorinkubiert und dann mit 20 ng/ml TNF behandelt Nach 8 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit Ethanol permeabilisiert und mit Propidium-Jodid gefärbt. Die Auswertung erfolgte mittels Durchfußzytometrie. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte dargestellt (n=5).
Abbildung 48:	Schematische Darstellung der Signaltransduktion der Matrix-induzierten Akzeleration vonTNF-vermittelter Apoptose in neutrophilen Granulozyten

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