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II.  Material und Methoden

A. Versuchsplanung und Studiendesign

Abbildung 7: Studien Design. Die Studien 101 und 102 wurden im Rattenmodell und die Studien 201 und 202 im Primatenmodell durchgeführt. Sie dienten der Vorbereitung zur Aortentransplantations-Studie 301, um die MMF - Dosis, - Formulierung und - Administration zu optimieren. Ferner wurden die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Methoden im Primatenmodell etabliert. (PK: Pharmakokinetik; PD: Pharmakodynamik; LEW: Lewis Ratten; BN: Brown-Norway Ratten, HTX: Herztransplantation; Tox: Toxikologie


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Insgesamt wurden vier Studien zur Vorbereitung der Hauptstudie 301 durchgeführt ( Abbildung 7 ). Die Studien 101 und 102 erfolgten im Rattenmodell und die Studien 201 und 202 im Primatenmodell. In diesen Studien wurden verschiedene MMF - Dosierungen, - Dosierungsintervalle und - Applikationswege getestet. Ferner wurden Methoden für pharmakokinetische und pharmakodynamische Meßparameter vom Ratten- ins Primatenmodell transferiert, getestet und validiert (Klupp et al., 2000). Medikamententoxizität und deren Behandlungsmöglichkeiten wurden geprüft.

1. Studie 101

Bei der Studie 101 ( Abbildung 8 ) handelte sich um eine PK/PD Studie in Lewis Ratten. In 6 Gruppen von je 4 Ratten wurden orale MMF Dosierungsintervalle von 24 (QD: „Quaque Die“; einmal täglich) und 12 Stunden (BID: „Bis In Die“; zweimal täglich) in vergleichbaren Tagesdosen getestet.

Abbildung 8: Design Studie 101. Verglichen wurde die einmal tägliche (QD) mit der zwei mal täglichen (BID) Gabe von MMF in einer PK/PD Studie an nicht transplantierten Lewis Ratten über 36 Stunden. In den QD Gruppen A, C und E erfolgte eine einmalige MMF Gabe morgens um 8:00 Uhr, in den Gruppen B und D die Gabe um 8:00 und 20:00 Uhr. Dosierungsangaben in mg/kg. V: Vehikel – Methylcellulose-Lösung


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Tiere in Gruppe A erhielten 5 mg/kg MMF einmalig (QD), in Gruppe B 5 mg/kg MMF zweimalig (BID), in Gruppe C 10 mg/kg QD, in Gruppe D 10 mg/kg BID und in Gruppe E 20 mg/kg QD. Tiere in Gruppe F dienten als Kontrolltiere und wurden nur mit Vehikel – Lösung gavagiert. Die Studiendauer betrug 36 Stunden mit einer MMF Gabe zu den Zeitpunkten 0h in den Gruppen A, C und E und mit MMF Gaben zu den Zeitpunkten 0h und 12h in den Gruppen B und D. Retroorbitale Blutentnahmen unter Ätheranästhesie erfolgten vor, 30 Minuten, 6 Stunden, 12 Stunden, 12,5 Stunden, 18 Stunden, 24 Stunden, 30 Stunden und 36 Stunden nach Medikamenten Erstgabe. Gemessen wurden die MPA und MPAG Plasmaspiegel mittels HPLC (Gummert et al., 1999b). Nach mitogener ConA Stimulation wurden mittels Durchfluss-Zytometrie die Lymphozytenproliferation (intrazelluläre PCNA Expression) und die T Zell Aktivierung anhand der Oberflächen-Antigenpräsentationen von IL-2 Rezeptor (CD25), Transferrin Rezeptor (CD71), der Adhäsionsmoleküle LFA-1 (CD11a) und ICAM-1 (CD54) bestimmt. Von zuvor durchgeführten Untersuchungen (Gummert et al., 1999a) war bekannt, dass in diesem Tiermodell die pharmakodynamischen Parameter den Rejektionsgrad nach heterotoper Herztransplantation widerspiegeln. Somit sollten die PK/PD Ergebnisse der Studie 101 dazu dienen, die MMF - Dosen und die Zeitpunkte der Blutentnahmen für die nachfolgende Transplantationsstudie 102 festzulegen.


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2.  Studie 102

Abbildung 9: Design Studie 102. Heterotope Herztransplantation von BN zu Lewis Ratten. Die Nachbeobachtungsdauer betrug 7 Tage. Vor der Transplantation und am Tag 6 wurde zu den angegebenen Zeitpunkten Blut für die PK und PD Untersuchungen entnommen und mit der Histologie an Tag 7 verglichen. Die Studie umfaßte zwei Gruppen mit je 6 Tiere, die mit einer Gesamt-Tagesdosis von 10 mg/kg MMF behandelt wurden. (5 mg/kg BID vs. 10 mg/kg QD). Die Studie prüfte die Frage, ob die tierexperimentelle übliche QD Gabe von MMF eine niedrigere Effektivität zur klinisch üblichen BID Gabe aufzeigt.

Mit den aus der vorherigen Studie gewonnenen Daten wurde diese Transplantationsstudie geplant. Insgesamt 12 Lewis Ratten waren Empfänger von heterotop ins Abdomen verpflanzten Herzen von Brown-Norway Spendern. Zwei Gruppen mit je 6 Tieren erhielten insgesamt eine Tagesdosis von 10 mg/kg MMF. Bei den Tieren in Gruppe A erfolgte die Gabe einmal täglich (10 mg/kg MMF QD), bei den Tieren in Gruppe B wurde die Gesamtdosis in zwei Einzeldosen (5 mg/kg MMF BID) aufgeteilt.

Die Wirkung des Dosierungsintervalls auf den Rejektionsgrad an Tag 7 wurde evaluiert. Die Blutentnahmen fanden zu den in Studie 101 getesteten Zeitpunkten am Tag 6 nach Transplantation statt. Die beschriebenen pharmakokinetischen und [Seite 27↓]pharmakodynamischen Parameter wurden mit der Histologie verglichen. Ziel dieser Studie war es zu prüfen, ob die im Tierversuch übliche einmal tägliche Gabe von MMF negativ mit dem Abstoßungverhalten des Transplantates korrelierte. Weiterhin wurde die Möglichkeit evaluiert, PK und PD Parameter zum Monitoring zu verwenden.

3. Studie 201

Studie 201 bestand aus einem in vitro und einem in vivo Teil. In vitro wurden die im Rattenmodell entwickelten pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Methoden für den Primaten angepaßt und weiterentwickelt. Die bestehende HPLC – Methode zur Bestimmung von MPA und MPAG Plasmaspiegeln (Gummert et al., 1999b) wurde für Cynomolgus fascicularis Plasma optimiert und validiert. Die vorbeschriebenen pharmakodynamischen Methoden, die für die T Zell Aktivierung im Rattenmodell entwickelt worden waren (Gummert et al., 1999a; Barten et al., 2001), wurden auf das Primatenmodell übertragen. Hierzu wurden verschiedene Mitogene, in verschiedenen Konzentrationen und mit unterschiedlichen Stimulationszeiten evaluiert, um nicht nur T Zellen, sondern auch B Zellen und Monozyten untersuchen zu können. Humane Antikörper wurden auf Kreuzreaktivität mit Cynomolgus Antigenen getestet und das Spektrum der untersuchten Antigene wurde erheblich erweitert. Ebenso wurde die Methode des intrazellulären Zytokin-Nachweis in T Zellen und Monozyten im Makaken entwickelt. Einzelheiten dieser Methodenentwicklung werden hier nicht detailliert aufgeführt, da eine Zusammenfassung der Methodik publiziert ist (Klupp et al., 2000; Klupp et al., submitted-a).

Diese zunächst in vitro entwickelten Methoden wurden dann in vivo an 4 Cynomolgus Affen validiert. In diesem Versuch wurden die Tiere für 21 Tage einmal täglich mit verschiedenen MMF Dosen, beginnend mit 100 mg/kg mittels Gavage behandelt. Neben der Bestimmung der verschiedenen PK und PD Parametern galt die besondere Aufmerksamkeit der sich entwickelten Medikamententoxizität.


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4.  Studie 202

In Studie 201 bestätigte sich die Beobachtung aus den Rattenversuchen, dass mit einer einmal täglichen MMF - Gabe keine suffiziente immunsuppressive Wirksamkeit über einen 24 Stunden Zeitraum zu erzielen war, und dass hohe Dosen zu einer erheblichen Toxizität führten. Weiterhin zeigte sich in der vorangegangenen Studie, dass die notwendigen Mengen von zu verabreichendem MMF sich in dem Vehikel nicht lösen bzw. dass das zur Lösung notwendige Volumen für die Gavage zu groß war. Ferner führte die inhomogene Suspension zu Dosierungsproblemen. In Studie 202 wurde somit bei 2 Affen in einer vierzehntägigen Studie die BID Gabe von subkutanem CellCept-IV® getestet und bei 4 Affen die orale Resorption von CellCept-IV® geprüft. Hierbei wurde Pharmakokinetik und Verträglichkeit getestet.

5. Studie 301

In der Aorten-Transplantationsstudie 301 wurde bei 6 Cynomolgus Affen eine orthotope, infrarenale Aortensegment-Transplantation durchgeführt. Nachdem sich ohne jegliche Immunsuppression eine Intimahyperplasie im Sinne einer Transplantat-Vaskulopathie entwickelte, wurde ab Tag 45 mit der MMF Therapie begonnen. Diese Tiere wurden mit einer Kontrollgruppe von weiteren 6 Tieren verglichen, die bis zum Ende des Versuchs am Tag 105 keine Immunsuppression erhielten. Entsprechend den Ergebnissen der Studien 101 – 202 wurden die Tiere in der Behandlungsgruppe individuell, zweimal täglich mit CellCept-IV® behandelt. In Studie 301 wurden die in den Vorstudien entwickelten pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Methoden verwendet, um die MMF Therapie zu optimieren. Die Dosis wurde entsprechend der auftretenden Medikamententoxizität, den MPA Plasmaspiegeln und der Lymphozyten-Proliferationsrate im peripheren Blut täglich angepaßt. Bei allen Tieren wurde an den postoperativen Tagen 21, 42, 63, 84 und 105 ein intravaskulärer Ultraschall durchgeführt. Nach Abschluß des Versuches wurden die Tiere getötet und die Aortentransplantate histologisch aufgearbeitet und vermessen. Primäres Zielkriterium der Studie war die Intimahyperplasie im mittleren Segment des Transplantates. Die anastomosennahen Segmente wurden aus der Untersuchung ausgeschlossen um sicher zu stellen, dass die [Seite 29↓]beurteilte Intimahyperplasie nicht durch chirurgische Artefakte, sondern nur durch die allogene Immunantwort hervorgerufen wurde. Des weiteren wurden diese morphometrischen Variablen mit der mittleren verabreichten MMF Dosis und verschiedener pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern korreliert, um die Frage beantworten zu können, ob und in welchem Ausmaß MMF in der Lage ist die Entwicklung der Transplantat-Vaskulopathie zu beeinflussen.

B. Tiere und Tierhaltung

1. Ratten

Männliche, virusantikörperfreie Lewis Ratten (RT11/CrlBR) (LEW) mit einem Gewicht von 300 – 350 g, 11 bis 15 Wochen alt und Brown-Norway Ratten (RT1n) (BN) mit einem Gewicht von 250 – 350 g, 11 bis 16 Wochen alt, wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) bezogen und in Mikroisolationskäfigen untergebracht. Standarddiät für Ratten und Wasser wurde ad libitum zur Verfügung gestellt. Die Tiere wurden über eine Woche in den Tierräumen bei einem 12 Stunden Tag/Nacht-Rhythmus akklimatisiert, bevor mit den Versuchen begonnen wurde. Die Tiere wurden entsprechend den Richtlinien „Principles of Laboratory Animal Care“ der National Society for Medical Research und dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ des National Health Institute (NIH Publikation No. 80 – 123, Revision 1985) versorgt. Die Studien wurden durch die Tierversuchskommision (Stanford University, 1999) der Stanford Universität (Stanford CA, USA) genehmigt.

2. Cynomolgus Affen

Zwanzig gesunde, männliche Cynomolgus Affen (Macaca fascicularis) (5,9 – 8,3 kg) wurden von Charles River BRF Inc. (Houston, TX, USA) bezogen. In einem Screening wurden Infektionen (Herpes B–Virusinfektion, Hepatitis, Tuberkulose, Simian immunodeficience Virusinfektion, Simian Retrovirusinfektion und Simian T-lymphotrophische Virusinfektionen) ausgeschlossen. Nach Überstellung der Tiere nach Stanford wurden diese zunächst in 6 wöchiger Quarantäne gehalten, bevor sie für die [Seite 30↓]Tierexperimente freigegeben wurden. Die Tiere standen unter kontinuierlicher veterinärmedizinischer Aufsicht. Sämtliche Versuche wurden durch die Tierversuchskommision (Stanford University, 1999) der Stanford Universität (Stanford, CA, USA) genehmigt und die Versuchsdurchführung von Tierärzten überwacht. Bei den Tieren wurden eine Blutgruppenbestimmung durch das New York University Medical Center Laboratory for Experimental Medicine and Surgery in Primates durchgeführt. In der Transplantationsstudie diente jedes Tier gleichzeitig als Spender und Empfänger des Aortentransplantates. Die Tiere wurden ABO-Blutgruppen-identisch gepaart und die Histoinkompatibilität wurde durch einen Stimulationsindex von mindestens 2,0 (SI: 2,7 – 38,3) im MLR sichergestellt.

Vor jeglicher Prozedur wurden die Tiere zunächst für mindestens eine Woche in dem Raum akklimatisiert, in dem sie für die Dauer des Versuches gehalten wurden. Raumluft und –temperatur wurden kontrolliert und ein Tag/Nachtzyklus von 12 Stunden eingehalten. Die Tiere erhielten Standard Primatendiät und Wasser ad libitum. Zusätzlich wurde die Nahrung durch frische Früchte und Gatorade® (Stokely-Van Camp, Inc, Indianapolis, IN, USA) angereichert. Bei Gewichtsverlusten von mehr als 5% wurde eine Sonderdiät bestehend aus Honig, Butter, Nudeln und Boost Plus®-Hyperalimen­tations­nahrung (Mead Johnson Nutritionals, New York, NY, USA) über eine unter Ketamin Sedierung (5 mg/kg i.m.) gelegte Magensonde verabreicht (Gavage). Die Tiere wurden entsprechend den Richtlinien der US Public Health Policy of the Humane Care and Use of Animals (PHS Manual, Ch. 143) und dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ des National Health Institute (NIH Publikation No. 8523, Revision 1985) versorgt (Stanford University, 1999).


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C.  Operative Modelle

1. Heterotope Herztransplantation im Rattenmodell

Die intraabdominelle heterotope Herztransplantation wurde modifiziert nach Ono und Lindsay (Ono und Lindsey, 1969) durchgeführt ( Abbildung 10 ). Die Spender BN Ratten wurden mit 50 mg/kg Phenobarbital durch intraperitoneale Injektion anästhesiert.

Abbildung 10: Heterotope Herztransplantation nach Ono (Ono und Lindsey, 1969) im Rattenmodell. Die Aorta (Ao) des Spenderherzens wird mit der Aorta abdominalis des Empfängers anastomosiert und über diese Verbindung mit arteriellem Blut versorgt. Das aus dem Sinus coronarius (SC) kommende Blut fließt über den rechten Vorhof (RA) und den rechten Ventrikel (RV), die Pulmonalarterie (PA) in die Vena cava inferior des Empfängers. (Modifiziert nach Chapman et al., 1994)

Nach Eröffnung der Bauch und Brusthöhle wurden 1000 IE/kg Heparin (Fujisawa Inc.,
Delaware, IL, USA) über die V. cava inferior injizierte und die A. pulmonalis und Aorta ca. 3 mm distal des Ursprungs durchtrennt. Nach topischer Kühlung mit 4°C kalter isotoner Kochsalz Lösung folgte die Ligatur der V. cava superior und inferior, sowie der Pulmonalvenen mit 5-0 Vicryl und die Excision des Herzens. Vorhöfe und Ventrikel wurden mit der kalten Kochsalz Lösung gespült und das Herz bis zur Implantation in 4°C kalter isotoner Kochsalz Lösung gelagert.


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Nach entsprechender Anästhesie der Empfänger Ratte (LEW) wurden die Aorta abdominalis und V. cava inferior infrarenal auf einer Länge von 2 cm dargestellt und ausgeklemmt. Das Spenderherz wurde mit fortlaufender Nahttechnik mit 8-0 Ethilon mit einer BV 130-4 Nadel (Ethicon Inc., Someville, NJ, USA) anastomosiert. Die Ischämiezeiten lagen zwischen 20 und 26 Minuten, die Gesamt-Operationszeiten zwischen 32 und 47 Minuten. Die technische Erfolgsrate lag bei 100%.

2. Orthotope Aortentransplantation im Primatenmodell

Alle operativen Eingriffe wurden bei den Affen in einer tiefen Allgemeinnarkose durchgeführt. Diese wurde mit 10 mg/kg Ketamin-Hydrochlorid (Ketanest®) s.c. eingeleitet.

Abbildung 11: Orthotope Aortentransplantation im Primatenmodell. Ein 3 cm langes infrarenales Segment wird
zwischen zwei blutgruppen-identischen, aber histo-inkompatiblen Tieren transplantiert. Hierbei dient
jedes Tier gleichzeitig als Spender und Empfänger

Zusätzlich erhielten die Tiere vor endotrachealer Intubation noch 0,04 mg/kg Atropin-Sulfat i.m. und 0.01 mg/kg Buprenorphin-Hydrochlorid (Buprenex®) i.m.. Die Narkose wurde mit Propofol (2,5 mg/ml; 0,1 mg/kg/min) und Midazolam Infusion (1 mg/ml; 0,35 μg/kg/min) fortgeführt. Zur Flüssigkeitssubstitution wurde 20 ml/kg/h Ringer-Lactat Lösung infundiert. Bis zur Extubation erfolgte ein engmaschiges Monitoring bei [Seite 33↓]dem kontinuierlich EKG, Körpertemperatur, Sauerstoff-Sättigung, Respirationsrate und endexpiratorische C02 - Messungen durchgeführt wurden. Der Blutdruck wurde in 3 minütlichen Intervallen mittels Manschette am Oberarm gemessen und alle Daten sind in 15 minütlichen Intervallen dokumentiert worden. Perioperativ bis zum 3. postoperativen Tag erhielten die Tiere eine antibiotische Prophylaxe, bestehend aus Cefazolin (25 mg/kg i.m.) und Gentamicin (5 mg/kg i.m.). Postoperativ wurden die Tiere in spezielle Käfige verbracht, in denen die Käfigtemperatur und der Sauerstoffgehalt der Luft individuell geregelt werden konnte. Zur postoperativen Schmerzkontrolle wurde 0.03 mg/kg Buprenorphin-Hydrochlorid (Buprenex®) i.m. alle 6 bis 8 Stunden verabreicht.

Alle Tiere dienten gleichzeitig als Spender und Empfänger eines 3 cm langen, infrarenalen Aortensegmentes. Die Eingriffe wurden parallel durchgeführt, um Ischämie- und Operationszeiten konstant zu halten. In tiefer Narkose wurde eine mediane Laparotomie durchgeführt und die infrarenale Aorta bis über die Iliacal-Bifurkation hinaus dargestellt. Drei Zentimeter wurden von der Bifurkation aus vermessen und falls notwendig die A. mesenterica inferior abgesetzt. Nach Heparingabe (70 IE/kg) wurde das fadenmarkierte Aortensegment nach Unterbindung der Lumbalarterien reseziert, mit 4°C kalter Kochsalz Lösung gespült und mit dem Segment des anderen Empfängertieres ausgetauscht. Die zur Vermeidung von Strikturen angeschrägte Anastomose erfolgte in fortlaufender Technik End-zu-End mit Prolene 7-0 ( Abbildung 12 . Nach Kontrolle auf Bluttrockenheit wurde das Retroperitoneum und das Abdomen wieder schichtweise verschlossen.


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bbildung 12: Operationssitus bei Aortentransplantation. Anastomosen sind mit Pfeilen markiert: a) Durch die Eigenelastizität der Aorta kommt es nach Explantation des Transplantates (Tx) zu einer erheblichen Streckendifferenz. Der Stern (*) markiert die Gefäßklemmen auf den beiden Iliacal-Arterien und die mit einer Bulldog-Klemme versorgte Schwanzarterie. VC: Vena cava. b) Situs nach Reperfusion

3. Intravaskulärer Ultraschall (IVUS)

a) Operative Durchführung

Die intravaskuläre Ultraschalluntersuchung (IVUS) wurde an den Tagen 21, 42, 63, 84 und 105 nach Transplantation durchgeführt. In tiefer Allgemeinnarkose wurde die rechte oder linke Leiste freigelegt und die A. femoralis communis und superficialis dargestellt. Nach Heparinisierung (70 IE/kg i.v.) und querer Arteriotomie wurde eine 5F Schleuse in das Gefäß eingeführt ( Abbildung 13 ). Nach intraarterieller Injektion von 20 μg Nitroglycerin wurde ein 5F Swanz-Ganz-Katheter (Baxter, Deerfield, IL, USA) bis in die thorakale Aorta vorgeschoben und eine stufenweise intravasale Blutdruckmessung durchgeführt, um die Druckgradienten an den Anastomosen aufzuzeichnen.

Die sequentielle Ultraschalluntersuchung wurde mit dem Cardiovascular Imaging System (Boston Scientific, Sunnyvale, CA, USA) und einem 40 MHz 2,6F Ultraschallkatheter (SciMed / Boston Scientific, Sunnyvale, CA, USA) durchgeführt. Der Schallkopf wurde oberhalb der Nierenarterienabgänge plaziert und unter kontinuierlichem, maschinellem Rückzug (0,5 mm/sec) durch das Transplantat geführt. Die IVUS-Bilder wurden zur späteren Analyse auf ein S-VHS Band aufgezeichnet. Nach Abschluß der Untersuchungen erfolgte der Verschluß der Arteriotomie mir 7-0 Prolene Einzelknopfnähten.


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Abbildung 13: Intravaskulärer Ultraschall. Die Femoralarterie wird freigelegt (a) und eine 5F Schleuse eingeführt. Über diese wird ein 2,6F Ultraschallkatheter (b) in die Aorta vorgeschoben und der Scan wird unterkontinuierlichem Rückzug (0,5mm/sec) auf ein S-VHS Videoband aufgezeichnet. c) Verschluß der Arteriotomie mit Prolene 7-0 Einzelknopfnähten


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b)  Morphometrische Analysen und Datenverarbeitung

Die aufgezeichneten Ultraschallbilder wurden mit der Echoplaque® Software (Indec Systems Inc., Mountain View, CA, USA) mit 15 Bilder/sec digitalisiert und 3-D rekonstruiert. Die Konturen der Intima- und Lumenbegrenzungen wurden in 1 mm Abständen gezeichnet und vom System in den Zwischenräumen interpoliert. Flächen und Durchmesser wurden manuell ausgemessen und die Volumenberechnung wurde von der Software gemäß folgender Formel

V = n * ∑i=1 .. n * (Ai * H)

berechnet, wobei Ai die Fläche des Segmentes i, H die Dicke des Segmentes i (0,33 mm bei einer Rückzugsgeschwindigkeit von 0,5 mm/sec) und n die Zahl der gemessenen IVUS-Segmente darstellt. Volumetrisch wurden das Gefäßvolumen (VV), das Lumenvolumen (LV) und das Intimavolumen (IV) bestimmt. Gemessene Flächen waren Gefäßfläche (VA), Lumenfläche (LA) und Intimafläche (IA) in dem mittleren 1cm langen Segment des Transplantates. Die Randsegmente wurden nicht in die Auswertung mit einbezogen um mögliche Störeinflüsse durch die Anastomosen auszuschließen. Durch Einlesen der planaren, longitudinalen Rekonstruktion wurden minimale und maximale Flächenwerte für Lumen (LAmin, LAmax) und Intima bestimmt (IAmin, IAmax).


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Abbildung 14: Computerbild der mit Echoplaque® 3-D digitalisierten IVUS-Bilder. Zwischen den manuell bestimmten Flächen für Intima, Lumen und Gefäß interpoliert das System die Zwischenwerte um so
eine planare longitudinale Gefäßdarstellung zu berechnen. Rot, die nachgezeichnete Membrana interna elastica, gelb die Grenze der Intima zum Gefäßlumen

D. Histologische Analysen

1. Heterotope Herztransplantation im Rattenmodell

Ein Pathologe (Frau Prof. Margret E. Billingham) führte ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit, an den fixierten und mit Hämatoxylin & Eosin gefärbten Präparaten die histologische Analysen durch. Anhand von drei Querschnitten durch das Transplantat wurde die akute Rejektion in sechs Schweregrade eingeteilt:

Grade 0 – keine histologischen Zeichen einer Rejektion, Grade 1 – geringe Lymphozyteninfiltration ohne Nekrosen oder Einblutungen, Grade 2 – mäßiggradige mononukleäre oder lymphozytäre Infiltrate mit minimalen Nekrosen, ohne Einblutungen, [Seite 39↓]Grade 2.5 – mäßiggradige bis schwere entzündliche Infiltration, Grade 3 – massive Infiltrate mit Nekrosen und perivaskulärer Einblutung, Grade 4 – massive Einblutungen und Nekrosen und Verlust der Zellmorphologie.

2. Orthotope Aortentransplantation im Primatenmodel

a) Euthanasie, Transplantat Gewinnung und Präservierung

Nach der letzten IVUS-Untersuchung an Tag 105 wurde in tiefer Narkose eine Thorako-Laparotomie durchgeführt und die Aorta auf ihrer gesamten Länge dargestellt. Abgänge der Aorta wurden unterbunden und die thorakale Aorta wurde kanüliert. Nach der Tötung der Tiere mit einer Überdosis von Pentobarbital, wurde die Aorta mit dem Transplantat zunächst mit isotoner Kochsalz Lösung gespült und anschließend in situ mit 10% Formalin Lösung mit einem intravaskulären Druck von 100 mm Hg für 10 Minuten vorfixiert. Dann erfolgte die Exzision der Aorta und des Transplantates. Anschließend wurde das Präparat ex vivo für 18 Stunden mit einem intravaskulären Druck von 100 mm Hg weiter mit 10% Formalin Lösung vollständig fixiert um ein elastisches Schrumpfen des Gefäßes zu verhindern.

Abbildung 15: Nekropsie und Darstellung des Aortentransplantates (Tx). Truncus coeliacus (TC), A. mesen terica
superior (SMA), rechte (ARd) und linke Nierenarterie (ARs), sowie A. iliaca communis (AICs)
links und rechts werden vor der in situ Perfusion unterbunden.


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b)  Histologische Färbungen und Immunhistochemie

Das Transplantat wurde alle 1 mm in 4 μm dicke, quere Sektionen geschnitten, Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin & Eosin, sowie mit einer Elastin – van Gieson Färbung dargestellt. Entparaffinierte Schnitte wurden mit Antikörper (Verdünnung 1:4000, Sigma Corp., St. Louis, MO, USA) gegen α-Actin / glatte Muskelzellen gefärbt. Die qualitative histologische Beurteilung erfolgte durch einen Pathologen (Dr. Gerald Berry), der keine Kenntnis von der Gruppenzugehörigkeit der Präparate hatte. Neben der Ausprägung der Intimahyperplasie wurde die Zerstörung der Membrana elastica interna, die Infiltration der Media und des periadventitiellen Bindegewebes begutachtet.

Abbildung 16: Ex vivo Perfusion mit 10% Formalin Lösung für 18 Stunden mit einem intravasalen Druck
von100 mm Hg um eine Schrumpfung des Transplantates zu vermindern und somit eine möglichst
exakte morphometrische Vermessung zu ermöglichen

c) Morphometrische Analysen

Video Bilder von Elastin – van Gieson gefärbten Präparaten wurden mit einer Dage MTI-81 hochauflösenden Farbbildkamera auf einem Leica DMAB Mikroskop aufgenommen. Die morphometrische Analyse erfolgte mit dem C-imaging 1280 Morpho­metrie System (Compix Inc., Cranberry Township, PA, USA). Im 1 cm langen, mittleren Drittel des Transplantates wurden die Sektionen manuell nachgezeichnet und die Mittelwerte für [Seite 41↓]Lumenfläche (LA), Intimafläche (IA) und Gefäßfläche (VA) mit der Systemsoftware berechnet. Korrespondierend zur IVUS-Auswertung wurden auch die minimalen und maximalen Querschnitte bestimmt.

E. Behandlung mit Mycophenolat Mofetil

1. Ratten

Reines Mycophenolat Mofetil Pulver (Gabe von Roche Bioscience, Palo Alto, CA, USA) wurde zur Therapie in den Studien 101 und 102 verwandt. Die Vehikel-Lösung für MMF wurde aus 0,2% Natriumcarboxymethylcellulose-Lösung (Viskosität von 1300 – 2200 Zentipoises bei 25°C, 1% Lsg.) (CMC ; City Chemical Corp., New York, NY, USA), 0,9% Benzyl-Alkohol (V/V), 0,4% Polysorbat 80 (W/V) und 0,9% Natrium Chlorid (W/V) in de-ionisiertem Wasser hergestellt, hitzesterilisiert und bei 4°C gelagert. Bei einem pH von 3,5 wurde hierbei eine maximale Löslichkeit von 4,3 mg MMF / ml Vehikel erreicht. Unmittelbar vor der Anwendung wurden 1 bis 4 mg/ml MMF Lösungen frisch zubereitet, und die nicht narkotisierten Tiere erhielten bei jeder Therapie 2 ml/kg Vehikel-Lösung mittels Gavage. Die Behandlung der Tiere mit MMF oder reiner Vehikel Lösung fand um 8:00 und 20:00 Uhr statt.


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2.  Cynomolgus Affen

In der Studie 201 wurde aus dem oben beschriebenen Vehikel und reinem MMF Pulver eine 64 mg/ml Suspension hergestellt. Unter Ketanest® Sedierung (5 mg/kg) wurde den Tieren die MMF - Suspension über eine Magensonde verabreicht (Gavage). In den Studien 202 und 301 wurde CellCept-IV® (MMF Hydrochlorid Lösung; Gabe von
Roche Laboratories Inc., Nutley, NJ, USA) mit einer initialen Dosis von 100 mg/kg/Tag, aufgeteilt in zwei Einzeldosen subkutan injiziert oder oral mittels Gavage appliziert. In der Transplantationsstudie wurde mit der MMF Gabe an Tag 45 begonnen und die Dosierung individuell angepaßt um eine maximal tolerierte Dosis (MTD) zu erreichen: Ein Gesamtgewichtsverlust der Versuchstiere von 10% oder ein Verlust von 3% des Körpergewichtes innerhalb von 3 Tagen, sowie Erbrechen und Diarrhoe führten zu einer 20%igen Dosisreduktion. MPA-Plasmaspiegel von kleiner als 2,0 mg/l und Lymphozyten-Proliferationsraten von mehr als 5% führten zu einer MMF-Dosiserhöhung von 10 mg/kg/Tag.

F. Analytische Methoden

Sämtliche Blutentnahmen bei Ratten wurden an Äther-anästhesierten Tieren durchgeführt. In tiefer Narkose wurde mit Heparin-beschichteten Mikrokapillaren der retroorbitale Venenplexus punktiert und maximal 500 μl Blut gewonnen. Bei den Affen erfolgte die venöse Punktion, vornehmlich aus der Vena femoralis unter Ketanest® Sedierung (5 mg/kg). Die notwendige Blutmenge für die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Messungen lag unter 2 ml pro Abnahme. Das heparinisierte Blut wurde innerhalb einer Stunde weiterverarbeitet.

1. Pharmakokinetik (PK) der Mycophenolsäure

Die MPA und MPAG Plasmaspiegel Bestimmungen wurden mittels einer Gradienten HPLC Analyse bestimmt. Die Methode ist eigens für minimale Plasmamengen für das Rattenmodell entwickelt und publiziert worden (Gummert et al., 1999b). Zu 50 μl Plasma wurden 100 μl Phenolphthaleinglukuronsäure (PGA[Seite 43↓]; Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) gelöst in Acetonitril (Baxter, Deventer, Niederlande) in einer Konzentration von 25 μg/ml als interner Standard hinzu gegeben. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril und 0,1%iger Schwefelsäure (pH 1,5). Eine 200 x 4,6 mm Sphereclone 5 μm ODS Chromatographie Säule (Phenomenex, Torrance, CA, USA) wurde auf einem HPLC System der Firma Shimadzu (Kyoto, Japan) verwandt. Die MPA und MPAG Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Kalibrationskurve mit der Class-VP Software Vers. 4.2 (Shimadzu, Kyoto, Japan) berechnet.

Diese Methode konnte problemlos auf Affenplasma übertragen werden. Es wurde eine Linearität der Ergebnisse von r²=0,99, eine Intra-Tag Präzision von 2,5% und eine Inter-Tag Präzision von 9,25% erreicht.

Nach MMF Gabe wurde in den verschiedenen Versuchen zu verschiedenen Zeitpunkten Blut gewonnen und aus den MPA Spiegeln die AUC mittels der linearen Trapez-Regel bestimmt:

AUC0-n = (C0 + C1 / 2) * t1 – t0) + (C1 + C2 / 2) * t2 – t1) + ... (Cn-1 + Cn / 2) * tn – tn-1)

Hierbei benennt Cn die MPA Konzentration zum Zeitpunkt tn .

2. Pharmakodynamik (PD) der Mycophenolsäure

Die entwickelten Methoden sind publiziert (Gummert et al., 1999a; Klupp et al., 2000; Barten et al., 2001; Klupp et al., 2001a; Klupp et al., 2001b; Klupp et al., 2001c; Klupp et al., submitted-a; Klupp et al., submitted-b) und werden hier zusammengefaßt:

a) Reagenzien

Das Kulturmedium RPMI1640 wurde mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin ergänzt (alles: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Die Mitogene Concanavalin A (ConA; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA), Pokeweed Mitogen (PWM[Seite 44↓]; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und Lipopolysaccharid (LPS E.coli, Serotyp 055:B5, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) wurden im Kulturmedium verdünnt, steril gefiltert und bei –70°C gelagert. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) und Brefeldin A (beides von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) wurden in DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und Ionomycin (IONO; ICN Biomedical Inc., Costa Mesa, CA, USA) in Ethanol gelöst und bei –20°C gelagert.

Alle FITC-, PE-, PECy5-, PCP- und Biotin-konjungierten monoklonalen Antikörper wurden von Pharmingen (San Diego, CA, USA) bezogen. In den Rattenexperimenten wurden Antikörper gegen OX-52 (anti-T Zell-Ak), CD71 (Transferrin-Rezeptor), CD25 (IL-2 Rezeptor), CD11a (LFA-1) und CD54 (ICAM-1) verwendet. Die gegen die menschliche Antigene (CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD20, CD25, CD69, CD 86 (B7-2), CD71, CD95 (FAS), CD154 (CD40L), TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4) gerichteten Antikörper wurden im Primatenmodell auf Kreuzreaktivität getestet. Streptavidin-PECy5 und anti-PCNA-Ak wurden von Dako Co. (Carpinteria, CA, USA) und RNAse, Propidium-Jodid (PI), Saponin und Natriumazid wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. Das Lysat für die Erythrozyten wurde täglich frisch aus 8,29g NH4Cl, 37,2 mg Na2-EDTA und 1 g KHCO3 (alles von J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ, USA) in 1 l de-ionisiertem Wasser (pH 7,2) hergestellt. Der Permeabilisations-Puffer aus 1% hitzeinaktiviertem Rinderserum, 0,1% Saponin und 0,1% Natriumazid gelöst in PBS (Coulter Inc., Miami, FL, USA) wurde bei 4°C gelagert.


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Abbildung 17: Pharmakodynamische Messungen der MMF Aktivität. In vitro wird Vollblut mit unterschiedlichen Konzentrationen von MPA versetzt, in vivo wird nach MMF Gabe zu verschiedenen Zeitpunkten Vollblut entnommen. Nach mitogener Stimulation werden Aktivierung und Proliferation verschiedener Leukozyten mittels Durchfluss-Zytometrie bestimmt.


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b)  Mitogen - stimulierte Vollblut Assays

Zur mitogenen Stimulation von T Zellen wurde 80 μl heparinisiertes Vollblut 1:10 in Kulturmedium verdünnt und mit ConA zwischen 24 und 96 Stunden bei 37°C in einer 5% CO2 wassergesättigten Atmosphäre inkubiert. Zur Stimulierung des Rattenblutes wurde 15 μg/ml ConA verwandt; das Primatenblut wurde mit 5 bis 7,5 μg/ml ConA stimuliert. Zur Bestimmung der intrazellulären Zytokin-Expression in T Zellen wurde 50 μl Vollblut mit 15 ng/ml PMA und 750 ng/ml IONO für 5 Stunden stimuliert und die Zytokin-Sekretion mit 10 μg/ml Brefeldin A blockiert.

Einhundert Mikroliter unverdünntes, heparinisiertes Primaten Vollblut wurde mit 20 μg/ml PWM für 24 Stunden stimuliert, um eine B Zell Aktivierung zu erzielen. Fünfzig Mikroliter unverdünntes, heparinisiertes Primaten Vollblut wurde mit 1 μg/ml LPS für 2 Stunden stimuliert um eine Monozyten Aktivierung zu erreichen.

c) Analyse der Lymphozyten Proliferation

Erythrozyten in dem ConA stimulierten Blut wurden lysiert (8 ml Lysat zu 800 μl verdünntem Blut, 10 min), die verbliebenen Zellen zentrifugiert (10 min, 1000 U/min), mit PBS gewaschen und mit 1% Formalin - Lösung für 5 Minuten fixiert. Nach Resuspension in Methanol (4°C, 10 min) wurden die Zellen erneut gewaschen und bei 37°C mit dem Permeabilisationspuffer, PI und anti-PCNA-FITC Ak für 25 Minuten inkubiert. Nach einem erneuten Waschvorgang wurden die Zellen in 0.5% Formalin-PI Lösung resuspendiert und bis zur Untersuchung bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

d) Analyse der Lymphozyten Oberflächen Aktivierungs-Antigene

Zweihundert Mikroliter 1:10 verdünntes, ConA stimuliertes bzw. 100 μl unverdünntes, PWM stimuliertes Blut wurde gewaschen, pelletiert und mit anti-Ratten bzw. anti-humanen monoklonalen Antikörpern für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, die Erythrozyten lysiert und mit 0.5% Formalin-PBS Lösung fixiert und bis zu ihrer Verwendung bei 4°C lichtgeschützt [Seite 47↓]gelagert. Bei den Rattenexperimenten wurden für die 3-Farbenanalysen Biotin-konjungierte Antikörper verwendet und nach der primären Ak-Inkubation erfolgte ein zweiter Inkubationsschritt mit Streptavidin-PECy5. Alle Protokolle enthielten einen Antikörper gegen Lymphoyzten Untergruppen (FITC-CD3 bzw. FITC-OX52, PCP-CD3ε, PE-CD4, PE-CD8 oder PE-Cy5-CD20) um so eine spezifische Subgruppen-Analyse durchführen zu können.

e) Analyse der intrazellulären Zytokin-Bestimmung

Fünfzig Mikroliter unverdünntes, PMA und IONO stimuliertes Affenblut wurde mit anti-CD3ε-PCP Antikörper versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, fixiert (IntraPrep I, Immunotech, Marseille, Frankreich) und anschließend mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit FITC- bzw. PE-Anti-Zytokin Antikörper behandelt, permeabilisiert (IntraPrep II, Immunotech, Marseille, Frankreich) und in einer 1% Formalin-PBS Lösung bis zu ihrer Verwendung bei 4°C lichtgeschützt gelagert.

f) Analyse der Monozyten Funktion

LPS stimuliertes Blut (50 μl) wurde gemäß dem intrazellulären Lymphozytenprotokoll mit FITC-anti-CD14 und PE-anti-TNFα Antikörper behandelt, und für die durchflusszytometrische Analyse vorbereitet.


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g)  Durchfluss-Zytometrische Auswertun

Abbildung 18: Analyse der mononucleären Proliferationsrate mittels Durchfluss-Zytometrie. a) FS/SS Scatter; 76% der Zellen wurden für die weitere Analyse (b) mit einbezogen. Hier wurden Zelldoublets und weiterer Debris aussortiert und die verbleibenden Zellen (89,5%) für die Bestimmung der Proliferationsrate benutzt. c) Unstimmulierte unbehandelte Negativ - Kontrolle. Als proliferierende Zellen wurden solche gewertet die FITC-antiPCNA positiv und SG2M positiv sind (1,37%). Nach ConA Stimulation (d) proliferierten 28,5% der Zellen (Positiv - Kontrolle, E0). Bei Zugabe von 0,5 mg/l MPA (e) reduzierte sich die Proliferation um ca. 50% auf14.1% (≈ IC50) und be einer Konzentration von 1,0 mg/l MPA (f) war die Proliferation fast vollständig gehemmt (3,5%).

Alle Analysen wurden auf einem Epics XL-MCL Durchflusszytometer (498 nm luftgekühltem Laser) der Firma Beckmann-Coulter (Fullerton, FL, USA) durchgeführt. Die Auswertung der Zellen erfolgte innerhalb von 6 Stunden nach ihrer Präparation. Die abgegebenen Fluoreszenzen wurden in folgenden Bandbreiten registriert: FITC: 525 nm (505 – 545 nm), PE: 575 nm (555 – 600 nm) und PECy5, PCP, PI: 675 nm (660 – 700 nm).

Die tägliche Qualitätskontrolle erfolgte mit Hilfe von Beads und Einfarben-Analysen zur Geräte-Kompensation. Als Negativ-Kontrolle (Eneg) dienten Blutanalysen, die mit [Seite 49↓]inaktiven Antikörpern gleichen Isotyps behandelt wurden. Unspezifische Antikörperbindungen von maximal 1 - 3% wurden toleriert.

Zur Bestimmung der Leukozyten Proliferationsrate wurde Zell-Debris im FS/SS Scatter aussortiert ( Abbildung 18 a) und Zell-Doubletten im DNA – Peak / Integral Display ( Abbildung 18 ) ausgegrenzt. Fünftausend Zellen pro Analyse wurden in einer 2 Farben-Analyse bestimmt. Die intrazelluläre FITC-PCNA Expression wurde logarithmisch bei 525 nm und der DNA-Gehalt linear bei 635 nm gemessen. Als positiv wurden Zellen gewertet, die sich in der S, G2 oder M Phase ihres Zellzyklus befanden und PCNA exprimierten.

In Zwei- und Drei-Farben Protokollen wurden Oberflächen-Antigene und intrazelluläre Zytokine bestimmt. Im FS/SS Scatter wurden 5000 Lymphozyten bzw. 3000 Monozyten je Probe aufgrund ihrer typischen Morphologie (Shifrine et al., 1978) ausgewählt und von anderen Zellen und Debris getrennt. Die Expression getesteter Antigene erfolgte in den mit monoklonalen Antikörper markierten Subgruppen. Die multivariate Datenanalyse erfolgte mit der FlowJo® - Software (Tree Star Inc., San Carlos, CA, USA). Die Daten wurden als Histogramme und als Zweifarben-Punktdiagramme dargestellt um positive Zellen zu werten.


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Abbildung 19 : Bestimmung der Expression von Zelloberflächen Antigenen hier am Beispiel von CD25, dem Rezeptor von IL-2. Im FS/SS Scatter zeigen die Lymphozyten eine typische Morphologie im unstimulierten (a) und ConA stimulierten(b) Blut. Hieraus werden die Zellen für die weitere Analyse verwendet. Nach Subtypisierung im Histogramm auf CD3 + Zellen (c) wird die CD25 Expression bestimmt (d): Grau dargestellt das Ergebnis der unstimulierten Zellen (Negativ -Kontrolle), blau die stimulierten, unbehandelten Zellen (Positiv - Kontrolle) und rot stimulierte und mit 0,5 mg/l MPA inkubierte Zellen

Die absolute Prozentzahl antigen-präsentierender Zellen (Eabs) wurde in vitro zur Expression MPA unbehandelter Proben (E0, Positiv - Kontrolle) und in vivo zur Expression in den mit MMF unbehandelten Tieren vor Transplantation (E0) normalisiert. Die normalisierte Antigen-Expression (E) ergibt sich somit aus folgender Formel:

E [rel%]= (Eabs – Eneg) / E0 *100


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Unter Inhibition (I) wird der Wert: 100 - E [rel%] verstanden.

Entsprechend der Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (AUC) für MPA wurde der pharmakodynamische Effekt von MPA auf Zellproliferation und –aktivierung pro Zeiteinheit als Fläche unter der Effekt-Zeitkurve (AUE) mit der Trapez-Regel

Abbildung 20: Sigmoidales pharmakodynamisches Modell zur Berechnung von IC50 und Imax

berechnet. Mit Hilfe der WinNonLin Software Vers 1.1 (Scientific Consulting Inc., Cary, NC, USA) wurde die MPA Konzentration bestimmt, die zu einer 50%igen Inhibition (IC50) des berechneten maximalen inhibitorischen MPA-Effektes (Imax) führte. Hierfür wurde entsprechend den immunsuppressiven Eigenschaften von MPA bzw. MMF ein sigmoidales pharmakodynamisches Modell mit folgender Formel gewählt:

I = Imax * Cγ / (Cγ + IC50 γ)


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Hierbei ist I die inhibitorische Aktivität auf eine Antigen Expression bei einer MPA Konzentration C, Imax der maximale Medikamenteneffekt bei C = ∝ und γ eine Konstante, die die Steilheit der Kurve beschreibt und von der MPA Verteilung und Affinität bestimmt wird (Hill – Faktor).

3. Hämatologische Analysen und Blutchemie

Blutbild-Analysen wurden jeweils vor Versuchsbeginn, am Versuchsende und in Studie 301 zusätzlich alle 3 Wochen bzw. unter MMF Therapie einmal wöchentlich durchgeführt. In den Primaten Versuchen wurden zusätzlich zu den gleichen Zeitpunkten blutchemische Untersuchungen durchgeführt, die die Bestimmung von Gesamt-Eiweiß, Albumin, Kreatinin, Harnstoff, Triglyzeride, Cholesterin, AST, ALT, gGT, LDH und Lipase mit einschlossen. Blutelektrolyte (Natrium, Kalium, Chlorid) wurden unter MMF-Therapie in Studie 301 wöchentlich bestimmt.

G. Statistik

Zur statistischen Auswertung wurde das SPSS Software Paket Vers. 10.0 (SPSS Corp., Birmingham, AL, USA) verwendet. Alle kontinuierlichen Daten wurden als Mittelwerte ± Standard Fehler (SEM) dargestellt. Zur Prüfung auf Unterschiede zwischen den Gruppen wurde bei gleichen Varianzen der Student’s T-Test angewandt. Zwei unabhängige, nicht normal verteilte Stichproben wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test geprüft. Abhängige Variablen sind mit dem T-Test oder dem Wilcoxon-Rangsummen-Test auf Unterschiede getestet worden. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine ANOVA Analyse mit der Levene Prüfung auf Homogenität verwendet. Im Falle homogener Subgruppen erfolgte die Post-Hoc Korrektur mit dem Bonferroni Test, ansonsten mit dem Dunnett’s C Test. Bivariate Korrelationen wurden mit dem Pearson’s Korrelations Faktor geprüft. Diskrete Daten sind mit dem Fisher’s Exakt Test auf Unterschiedlichkeit getestet worden. In Studie 301 erfolgte die Prüfung der IVUS Ergebnisse auf Unterschiedlichkeit der Gruppen mit dem GLM Modell für wiederholte Messungen. Für alle Versuche wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 festgelegt.


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17.09.2004