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III.  Ergebnisse

A. Studie 101

1. Allgemeine Ergebnisse

Keine der 24 mit MMF behandelten Ratten zeigte Toxizitätszeichen. Das Körpergewicht sank durch die wiederholten Blutentnahmen von 300 ± 3 g auf 286 ± 4 g nach 36 Stunden Versuchsdauer (p<0,01). Ebenso zeigten die Tiere einen Abfall im Hämatokrit (0,39 ± 0,03 auf 0,35 ± 0,02; p<0,01). Die Leukozytenzahl blieb konstant (11,9 ± 0,3 vs. 10,9 ± 0,4; p=0,1).

2. Pharmakokinetik nach eintägiger Behandlung mit MMF

a) MPAPlasmaspiegel

Abbildung 21: MPA Plasmaspiegel nach ein- bzw. zweimaliger oraler MMF Gabe in Lewis Ratten. Die MMF Gabe erfolgte nach den 0h und 12h Blutentnahmen. QD (Quaque Die) = einmal täglich, BID (Bis In Die) = zweimal täglich. Zugunsten der Übersichtlichkeit wurde auf die Darstellung des Standardfehlers verzichtet


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Im Detail sind die MPA Plasmaspiegel nach den verschiedenen Dosen und Dosierungsintervallen sind in Abbildung 21dargestellt. Nach Erstgabe von 5 bis 20 mg/kg MMF wurden die Spitzenspiegel innerhalb von 30 Minuten nach Dosierung erreicht und lagen zwischen 0,6 ± 0,1 und 10,2 ± 2,7 mg/l. Spitzenspiegel und Dosis korrelierten signifikant (r2=0,80, p<0,01); es zeigte sich jedoch ein überproportionales Ansteigen in der höchsten Dosisgruppe. Ein für die enterohepatische Zirkulation typischer zweiter Peak war nur in der 20 mg/kg QD Gruppe erkennbar.

Die MPA Exposition über die Zeit wird in Abbildung 22dargestellt. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der 5 mg/kg BID Gruppe (22,16 ± 1,8 mg/l*h) und der 10 mg/kg QD Gruppe (28,8 ± 1,8 mg/l*h).

Abbildung 22: Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve 0-24h (AUC0-24) als Parameter der MPA Exposition über einen Tag.Die AUC zeigte sich in Abhängigkeit von der Gesamt-Tagesdosis und nicht in Abhängigkeit vom Dosierungsinterval


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Dagegen waren die Unterschiede der MPA-AUC0-24 zwischen den Gruppen mit einer Gesamt-Tagesdosis von 10 mg/kg MMF und der 5 mg/kg QD Gruppe (12,9 ± 1,7 mg/l*h; p=0,03) und der 10 mg/kg BID Gruppe (61,4 ± 14,3 mg/l*h) statistisch signifikant (p=0,03). Es zeigte sich kein Unterschied innerhalb der Gruppen mit einer Gesamt-Tagesdosis von 20 mg/kg MMF.

b) MPAG Plasmaspiegel

Abbildung 23: Mittlere MPAG Plasma Konzentrationen nach eintägiger Behandlung von Lewis Ratten mit MMF. In den QD Gruppen wurde MMF nach den 0h und in den BID Gruppen nach den 0h und 12h Blutentnahmen oral verabreicht. Wie bei den MPA Spiegeln entsprachen die Kurven in den ersten zwölf Stunden der Höhe der Erstdosis. Nach der Zweitgabe in den BID Gruppen lagen dann die jeweiligen BID Kurven höher als die der Gesamt-Tagesdosis entsprechenden QD Kurven.


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3.  Pharmakodynamik nach eintägiger Behandlung mit MMF

a) DNA Gehalt und PCNA Expression

Nach der Erstgabe von 5 mg/kg MMF kam es zu einer 60% Inhibition der Lymphozytenproliferationsrate innerhalb von 30 Minuten nach oraler Applikation. Bei höheren Dosen (10 – 20 mg/kg MMF) war die Lymphozytenproliferation maximal inhibiert. Dieser Effekt war jedoch entsprechend der Plasma-Halbwertszeit von MPA rasch reversibel und die Wirkung nach 5 mg/kg QD Gabe innerhalb von 18 Stunden wieder vollständig aufgehoben. Nach Gabe von 10 mg/kg QD kam es nach 24 Stunden zu einer weitgehenden Erholung der Proliferationsrate und die Lymphozyten waren nur noch zu 20% in ihrem Wachstum gehemmt.

Abbildung 24: Hemmung der Proliferation von mononukleären Zellen nach der Gabe von MMF dargestellt als PCNA+/SG2M+ Zellen. Alle Werte wurden zu dem Nullwert vor Behandlungsbeginn normalisiert

Die Verteilung der Gesamt-Tagesdosis auf zwei Einzeldosen erhöhte die Exposition und verlängerte die Wirksamkeit auf die Proliferationshemmung. Nach 36 Stunden zeigte sich auch in den beiden BID Gruppen eine Erholung der Proliferationshemmung auf ca. 40% Inhibition und nach der Gabe von 20 mg/kg MMF QD war noch eine Inhibition von 68% zu verzeichnen.


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b)  Oberflächen Antigen - Expression auf T Zellen

MMF inhibierte nicht nur die Lymphozytenproliferation, sondern auch die T Zell Aktivierung durch Hemmung der Oberflächen Antigen Expression auf OX52+ Zellen. Innerhalb von 30 min nach Erstgabe wurde die IL-2 Rezeptor-Expression (CD25) dosisabhängig um 44,6 ± 6,3% (5 mg/kg MMF) bis zu 84,9 ± 2% (20 mg/kg MMF) gehemmt. Die Transferrin (CD71) Expression nahm bis auf 1,5 ± 0,4% ab und auch die Adhäsionsmoleküle LFA-1 (CD11a) und ICAM-1 (CD54) wurden in ihrer Expression auf T Zellen gehemmt. Alle Effekte von MMF waren rasch reversibel und 36 Stunden nach oraler Gabe normalisierten sich die Antigen-Expressionen wieder.

B. Studie 102

Nach den Ergebnissen der Studie 101 wurden die Dosisgruppen 5 mg/kg MMF BID und 10 mg/kg MMF QD für die Studie 102 ausgewählt. Diese Dosierung sicherte, entsprechend vorhergehenden Transplantationsstudien (Barten et al., submitted), die Entwicklung einer mäßiggradigen akuten Rejektion. Der Diagnostik-Zeitraum wurde auf 24 Stunden beschränkt und somit die Anzahl der Blutabnahmen reduziert.

1. Allgemeine Ergebnisse

Keines der Tiere zeigte nach 6 Tagen MMF Therapie Medikamententoxizität oder nahm an Gewicht ab. Der präoperative Hämatokrit (0,39 ± 0.03) und der Hämatokrit am Tag 7 nach der letzten Blutentnahme (0.38 ± 0.05) waren nicht signifikant unterschiedlich. Auch die Leukozytenzahl blieb konstant.


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2.  MPA Plasmaspiegel nach 6 Tagen MMF Therapie

Abbildung 25: MPA Plasma-Spiegel an Tag 6 nach heterotoper Herztransplantation im Rattenmodell. Während den ersten 12 Stunden waren die MPA Spiegel in beiden Gruppen vergleichbar, unterschieden sich dann aber nach dem 12h Zeitpunkt

Am Tag 6 nach Transplantation war der mittlere Talspiegel in der 10 mg/kg MMF QD Gruppe (0,3 ± 0,03 mg/l) signifikant niedriger als in der 5 mg/kg MMF BID Gruppe (0,68 ± 0,11 mg/l; p < 0,01). Die Spitzenspiegel, 30 Minuten nach der Morgendosis, waren dagegen in beiden Gruppen vergleichbar (Abbildung 25). Auch zu keinem anderen Zeitpunkt bis zur zweiten Dosis in der BID Gruppe (12h) unterschieden sich die Plasmaspiegel zwischen den Gruppen. Die AUC0-24 war in beiden Gruppen vergleichbar (QD: 29 ± 3,6 mg/l*h; BID: 39 ± 9 mg/l*h; p = 0,3).


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Abbildung 26: MPA - AUC nach 6 Tagen MMF Therapie. Während bei gleicher Tagesdosis die Gesamt-AUC in beiden Gruppen identisch war, kam es durch Aufteilung der Gesamtdosis in 2 Einzeldosen zu einer signifikanten Erhöhung der AUC12-24 in der 5mg/kg MMF BID Gruppe

Nach der zweiten MMF Gabe, 12 Stunden nach der Morgendosis, waren die MPA-Spiegel und die AUC12-24 (22,2 ± 2,6 mg/l*h) in der BID Gruppe signifikant höher als in der QD Gruppe (8,6 ± 0,98 mg/l*h; p < 0,01) (Abbildung 26).


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3.  Pharmakodynamik von MMF nach wiederholten Dosierungen

a) DNA Gehalt und PCNA Expression

Unabhängig von der Höhe der MMF Einzeldosis wurde die Lymphozytenproliferation am stärksten 30 Minuten nach MMF Gabe gehemmt. Auch nach multiplen MMF Dosierungen, sechs Tage nach Therapiebeginn, war in dieser Studie die Proliferationshemmung ebenfalls schnell reversibel. In der Gruppe mit dem kürzeren Dosierungsintervall (5 mg/kg MMF BID) war auch bei nur halb so großen Einzeldosen die Hemmung der Lymphozytenproliferation zu jedem Zeitpunkt der Untersuchung signifikant höher als in der 10 mg/kg MMF QD Gruppe. Insbesondere 18 Stunden nach Morgendosis war der Unterschied mit einer PCNA/SG2M Expression von 15,7 ± 3,7% in der 5 mg/kg MMF BID Gruppe und von 60,3 ± 3,9% in der 10 mg/kg MMF QD Gruppe am größten (p < 0.001).

Abbildung 27: Lymphozyten – Proliferationshemmung durch MMF. Auch nach 6 Tagen Therapie war die MMF Wirkung rasch
reversibel. Zum Zeitpunkt des MPA Talspiegels war die PCNA Expression in Zellen, die sich in ihrer S, G2 oder
M Phase des Zellzyklus befanden, in der 10 mg/kg QD Gruppe nur noch um 14% reduziert.

b) MMF Einfluss auf Lymphozyten Aktivität


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Wie nach Erstgabe kam es auch nach multiplen Gaben von MMF zu einem raschen Rückgang der MMF Wirkung und die hemmende Wirkung auf die Lymphozytenaktivität war schnell reversibel. Die Transferrin Expression auf T Zellen wurde von 5 mg/kg MMF und 10 mg/kg MMF innerhalb von 30 Minuten in gleicher Weise maximal unterdrückt (CD71 Expression: 10 mg/kg MMF QD: 15,6 ± 2,6 %; 5 mg/kg MMF BID: 15,5% ± 1,9%). Während es allerdings in der QD Gruppe zu einer kompletten Revision der MMF Wirkung zu den Zeitpunkten mit MPA-Talspiegeln kam (108 ± 10%), blieb in der 5 mg/kg MMF BID die CD71 Expression auf 56,5 ± 5% reduziert (p < 0,001). In gleicher Weise stellte sich der MMF Effekt für die CD25, CD11a und CD54 Expression dar.

Abbildung 28: Expression des Transferrin Rezeptors CD71 auf T Lymphozyten. Während die Behandlung mit 10 mg/kg MMF QD zu einer insuffizienten Immunsuppression in der zweiten Hälfte des Dosierung - Zeitraumes führte, resultierte aus der Gabe von5 mg/kg MMF BID eine mindestens 50% Reduktion der CD71 Expression zu allen Zeitpunkten

Bei der Berechnung der AUE0-24 zeigte sich, dass die BID Gruppe einen stärkeren pharmakodynamischen Effekt nicht nur für die Proliferationsrate, sondern auch für die Expression der Aktivierungsmarker CD71 und CD25 aufzeigte (Tabelle 1).

Tabelle 1: Zusammenfassung der pharmakodynamischen Unterschiede zwischen der 10 mg/kg MMF QD und der 5 mg/kg MMF BID Gruppe; Während sich an pharmakokinetischen Parametern nur die MPA-AUC12-24 nicht aber die AUC0-24 unterschied, führte die Aufteilung der MMF Gesamtdosis in zwei Einzeldosen zu einem signifikant höherem pharmakodynamisch, gemessenen immunsuppressiven Effekt über den gesamten 24 Stunden Zeitraum (Student’s T-Test, Signifikanzniveau 0,05).

PD Messwerte

p – Wert

E 0 PCNA/DANN

0,01

E 0 CD71

0,001

E 0 CD25

n.s.

E 0 CD11a

n.s.

E 0 CD54

0,03

AUC 0-24 PCNA/DNA

0,001

AUC 0-24 CD71

0,003

AUC 0-24 CD25

0,03

AUC 0-24 CD11a

n.s.

AUC 0-24 CD54

n.s.


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4.  Korrelationen zwischen PK, PD und Rejektionsgrad

Die MMF Therapie reduzierte die Schwere der auftretenden Rejektionen, war jedoch in den verabreichten Dosierungen und Dosierungsintervallen nicht in der Lage eine Rejektion komplett zu verhindern. Die Aufteilung der Gesamt-Tagesdosis von 10 mg/kg MMF in zwei Einzeldosen von je 5 mg/kg MMF führte zu einem signifikant (p < 0,001) niedrigeren Rejektionsgrad (10 mg/kg MMF QD: 2 (1,5 – 2); 5 mg/kg MMF BID: 0.75 (0.75 – 1).

Tabelle 2: Korrelationen zwischen Schwere der Rejektion, pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern 7 Tage nach heterotoper Herztransplantation und MMF Therapie im Rattenmodell.

 

Rejektionsgrad

 

PK Meßwerte

Pearsons Korrelations Koeffizient

p - Wert

C 0 MPA

0,7

0,01

MPA-AUC 0-24

0,45

n.s.

MPA-AUC 12-24

0,78

0,005

   

PD Meßwerte

  

E 0 PCNA

0,66

0,02

E 0 CD71

0,82

0,002

E 0 CD25

0,37

n.s.

E 0 CD11a

0,46

n.s.

E 0 CD54

0,69

0,01

PCNA AUE 0-24

0,85

0,001

CD71 AUE 0-24

0,81

0,002

CD25 AUE 0-24

0,64

0,03

CD11a AUE 0-24

0,27

n.s.

CD54 AUE 0-24

0,49

n.s.


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Abbildung 29: Zusammenhang zwischen den pharmakodynamischen Effekten von MMF und der Schwere des Rejektionsgrades in der Histologie nach heterotoper Herztransplantation im BN – LEW Rattenmodell. Die Abbildungen a) bis c) sind repräsentativ für die 10 mg/kg MMF QD Gruppe, die Abbildungen d) bis f) für die 5 mg/kg MMF BID Gruppe. Nach ConA Stimulation korrelierten zum Zeitpunkt der MPA-Plasma-Talspiegel (E0) die Proliferationsrate (a + d), dargestellt als PCNA+/SG2M+ Zellen, und die Expression von CD71+ auf OX52+ Zellen (b + e) mit dem Rejektionsgrad (c: Grad: 2; f: Grad 1) in der Histologie (HE Färbung, Vergrößerung 100
- 400x).

MPA Talspiegel korrelierten nur schwach (r2 = 0.7, p = 0,01) und die Gesamt - MPA-AUC0-24 korrelierte nicht mit der Schwere der Abstoßungsreaktion. Im Gegensatz dazu, korrelierten die AUE0-24 für Lymphozytenproliferation, CD71 und CD25 Expression, hoch mit dem Rejektionsgrad (Tabelle 2und Abbildung 29).


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C.  Studie 201

1. Allgemein

Vier Cynomolgus Affen (P1 – P4) wurden in diese PK/PD – Toxizitäts-Studie eingeschlossen und erhielten zu Beginn 100 mg/kg MMF p.o. einmal täglich (QD). Danach wurde die Dosierung individuell bei jedem Tier entsprechend der Tolerabilität angeglichen. Nach Beendigung der Studie erholten sich alle Tiere rasch.

Abbildung 30: Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der Studie 201. Für jeden Cynomolgus Affen (P1 – P4) ist ein eigener Graph angelegt, der die individuelle orale MMF Dosis (QD) und die Toxizitätszeichen zeigt. Alle Tiere hatten Gewicht verloren und zeigten eine Diarrhoe. Daher wurde in den Tieren P2 und P3 nach 14 Tagen, und in den restlichen Tieren nach 3 Wochen die initiale Dosis reduziert. Bei P3 mußte die MMF Therapie für einen Tag pausiert werden. Nach Absetzen der Therapie erholten sich alle Tiere rasch.


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2.  MMF Toxizität im Cynomolgus Affen

Nach oraler Gabe von 100 mg/kg MMF einmal täglich traten bei allen Tieren Toxizitätszeichen auf ( Abbildung 30 ).Alle Tiere hatten signifikant an Gewicht verloren und am 21. Tag der Studie lag der mittlere Gewichtsverlust bei 11,6% (7,6% - 19,4%; p < 0,02 im Vergleich zum Gewicht vor Therapiestart). Nach Dosisreduktion kam es sofort wieder zu einer Gewichtszunahme, und nach Therapieende kehrten alle Tiere wieder zu ihrem Ausgangsgewicht zurück.

Unter dem Gewichtsverlust war bei 2 Tieren der Appetit unverändert normal und bei 2 Tieren ab Tag 16 reduziert. Zwei Tiere hatten an einzelnen Tagen während des Versuches erbrochen. Bei allen Tieren trat eine Diarrhoe auf, deren Ausmaß individuell unterschiedlich war und zwischen 2 und 15 Tagen andauerte. Auch die Diarrhoe war nach Absetzen der MMF Medikation rasch reversibel.

Die hämatologischen Parameter veränderten sich deutlich, aber nicht statistisch signifikant, nach der MMF Therapie. So fielen der Hb von 12,4 ± 0,5 mg/dl auf 11,1 ± 1,0 mg/dl (p = 0.1), die Leukozyten von 9,3 ± 1,3 auf 7,4 ± 1,2 (p = 0,07) und der Lymphozytenanteil von 43,5 ± 5% auf 36 ± 6% (p = 0.08).

Aufgrund den Medikamenten Nebenwirkungen wurde an Tag 14 bei den Tieren P2 und P3 die MMF Dosis zunächst auf 60 mg/kg reduziert. Während sich der Gewichtsverlust bei P2 verlangsamte, war dieser bei P3 weiter progredient, so dass bei zusätzlichem Auftreten von Diarrhoe und Erbrechen die MMF Medikation zwischenzeitlich ausgesetzt werden mußte. Nachdem an Tag 21 auch bei dem letzten Tier eine Diarrhoe auftrat, wurde bei allen Tieren die Gesamtdosis auf 50 mg/kg reduziert. Unter dieser Reduktion waren sämtliche Toxizitätszeichen reversibel.


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3.  Pharmakokinetik nach oraler Gabe von MMF

Abbildung 31: Erstgabe von 100 mg/kg MMF oral in Form einer MMF Pulver Suspension in Vehikel Lösung. Die Tiere zeigten große Unterschiede in den erzielten MPA Spiegeln

Abbildung 32: Individuelle MPA Plasmaspiegel nach 7 Tagen oraler MMF Therapie (100 mg/kg QD) zeigte ein Fortbestehen der hohen inter-individuellen Variabilität.


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Nach der Erstgabe von 100 mg/kg MMF, hergestellt aus purem MMF Pulver und suspendiert in einer Vehikel-Lösung, kam es zu großen Resorptionsunterschieden bei den Tieren: Zwei Tiere zeigten die höchsten MPA Spiegel nach 2 Stunden und zwei weitere Tiere erst 10 Stunden nach oraler MMF Gabe. Aufgrund der wenigen Meßzeitpunkte konnte kein Tmax und Cmax bestimmt werden. Die höchsten, gemessenen MPA Spiegel variierten zwischen 1,8 und 22,8 mg/l ( Abbildung 31 ).

Abbildung 33: Individuelle MPA Plasmaspiegel am Tag 28 der Studie 201, nach 7 Tagen Therapie mit 50 mg/kg MMF QD.

Auch nach 7 Tagen oraler MMF Therapie mit 100 mg/kg (Abbildung 32 ) verringerte sich die Variation in den erzielten MPA Spiegeln nicht. Die Talspiegel lagen zwischen 1,9 mg/l und 13,6 mg/l. Am letzten Tag der Studie an Tag 28 lagen die MPA - Talspiegel nach sieben tägiger Therapie mit 50 mg/kg MMF QD (Abbildung 33) zwischen 0,6 mg/l und 3,6 mg/l.


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4.  Pharmakodynamik nach oraler QD Gabe von MMF

Im Rahmen der Studie 201 wurden die pharmakodynamischen Methoden für das Primatenmodell im Cynomolgus Affen entwickelt. Die Ergebnisse der verschiedenen mitogenen Stimulationsarten, der Testung der anti-humanen Antikörper auf Kreuzreaktivität mit den Cynomolgus Antigenen und der Abwandlungen der labortechnischen Protokolle werden hier nicht aufgezeigt.

Die pharmakodynamische Beurteilung der Inhibition von MMF auf die Lymphozytenproliferationsrate wurde anhand der Bestimmung des DNA-Gehaltes durchgeführt, da zum Zeitpunkt dieser Toxikologie-Studie die PCNA Methode noch nicht validiert war.

Nach der ersten Einzeldosis von 100 mg/kg MMF variierte der Einfluss von MMF auf die Lymphozytenproliferation entsprechend den unterschiedlichen MPA – Plasmaspiegeln. Demnach wurden 2 Stunden nach Gabe minimale Proliferationsraten von 17,3% bis 34,2% erreicht. Nach 7 Tagen Therapie zeigte sich dann aber unabhängig von der Variation der MPA Plasmaspiegel, eine maximale Inhibition der Proliferationsrate zu allen Zeitpunkten der Analyse. Diese lag zwischen 8,6 ± 1,5% und 15,5 ± 6% SG2M Expression.

Vergleicht man die PK und PD Werte nach kontinuierlicher Gabe von 100 und 50 mg/kg MMF ( Abbildung 34 ) so erkennt man, dass mit der geringeren Dosierung kein vollständiger immunsuppressiver Effekt über den gesamten Dosierungszeitraum zu erzielen war. Die Lymphozytenproliferation war in der 50 mg/kg QD Gruppe nur zum 2h Zeitpunkt maximal gehemmt und zeigte eine deutliche Erholung zu den anderen Meßzeitpunkten. Die Unterschiede zwischen den Gruppen an den Zeitpunkten 0h, 10h, und 24h verfehlten die statistische Signifikanz nur knapp (p = 0,068).


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Abbildung 34: Vergleich von den oralen MMF Dosisgruppen 50 mg/kg QD und 100 mg/kg QD; oben MPA Plasmaspiegel und unten die Lymphozyten-Proliferationsrate gemessen anhand der SG2M Expression. Während die höhere Dosis zwar zu sehr variablen MPA Plasmaspiegeln, aber zu einem maximalen immunsuppressiven Effekt über den 24 Stunden Zeitraum führte, waren die niedrigeren Plasmaspiegel in der 50 mg/kg QD Gruppe mit einer submaximalen Inhibition der Lymphozytenproliferation vergesellschaftet.


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Einen vergleichbaren Effekt zeigte MMF auf die Lymphozytenfunktionen: So wurde die Expression von CD25 auf CD3+ Zellen durch die wiederholte Gabe von 100 mg/kg MMF einmal täglich bis zu ihrem Maximum inhibiert und zeigte im Tagesverlauf relative Expressionsraten zwischen 16,9 ± 3,2% und 21,1 ± 3,1%. Nach der Gabe von 50 mg/kg MMF QD erholten sich die CD25 Expressionsraten zum Zeitpunkt der niedrigsten MPA Plasmaspiegel auf E0 = 39,4 ± 9,5% (p = 0,068).

Auch die CD71 Expression auf CD3+ Lymphozyten wurde MMF-Dosis und MPA-Plasmaspiegel abhängig im Primaten inhibiert. Der Effekt war jedoch im Vergleich zur Hemmung der Lymphozytenproliferation und der CD25 Expression nicht so ausgeprägt und minimale Expressionsraten von 32,5 ± 2,3% wurden erreicht.

D. Studie 202

1. Allgemein

In Studie 202 erhielten zwei Tiere (P5, P6) für die Dauer von 14 Tagen eine Gesamt-Tagesdosis von 100 mg/kg CellCept-IV® subkutan appliziert, die in zwei Einzeldosen aufgeteilt wurde (BID). Die Pharmakokinetik wurde mit der oralen Applikation von CellCept-IV® in vier Tieren (P5 – P8) verglichen. Alle Tiere tolerierten diese Studie gut. Örtliche Hautreizungen der subkutanen CellCept-IV® traten nicht auf.

2. Pharmakokinetik nach subkutaner MMF BID Applikation

Innerhalb von 2 Stunden nach subkutaner Erstgabe wurden suffiziente MPA-Plasmaspiegel von 10,6 – 11,9 mg/l erreicht. Auch die 12h und 24h Talspiegel lagen mit 1,8 bis 4,8 mg/l in einem Bereich, der als therapeutisch wirksam angesehen wird.


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MPAG-Plasmaspiegel lagen nach 2 Stunden bei 12,8 mg/l und 20,1 mg/l, nach 12 Stunden bei 2,9 mg/l und 9,7 mg/l und nach 24 Stunden bei 5,1 und 8,1 mg/l.

Abbildung 35: Erstapplikation von 50 mg/kg CellCept-IV® BID subkutan am Primaten. Effektive MPA Plasmaspiegel wurden innerhalb von 2 Stunden erreicht


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Nach 14 tägiger Therapie mit 50 mg/kg CellCept-IV® BID subkutan wurden konstante Talspiegel von 6,03 mg/l bis 9,4 mg/l erreicht. Es wurden keine Spitzenspiegel von mehr als 14,5 mg/l verzeichnet.

Abbildung 36: MMF Pharmakokinetik nach 14 Tagen 50 mg/kg CellCept-IV® subkutaner BID Therapie. Gleichmäßige MPA Plasmaspiegel

3. Toxizität nach subkutaner MMF Applikation

Am Ende der Studie lag der maximale Gewichtsverlust bei 9,4% und bei 7,3%. Ein Tier erbrach am Studienbeginn nach Ketamingabe und ein Tier entwickelte am Tag 10 eine Diarrhoe. Der Appetit war zu jeder Zeit unbeeinträchtigt. Andere Begleiterscheinungen der MMF Therapie traten nicht auf.


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4.  Pharmakokinetik nach oraler Gabe von CellCept-IV®

Nach oraler Applikation von 50 mg/kg CellCept-IV® kam es bei 3 von 4 Tieren innerhalb von 2 Stunden zu einem suffizienten MPA Plasmaspiegel zwischen 2,2 und 5,5 mg/l. Ein Tier zeigte keine erkennbare Resorption und es wurden zu keinem Zeitpunkt Plasmaspiegel von mehr als 0,3 mg/l bestimmt. Bei den anderen Tieren lagen die Talspiegel nach 12 h zwischen 1,6 und 4,1 mg/l und nach 24 h zwischen 2,7 und 7,9 mg/l .
Abbildung 37: MPA Plasmaspiegel nach oraler Gabe von 50 mg/kg CellCept-IVâ BID. Tier P6 zeigte nur minimale Spiegel, während die anderen Tiere anscheinend eine gute Resorption aufwiesen. Die Plasmaspiegel zeigten jedoch eine höhere Variabilität als nach subkutaner Applikation.


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E.  Studie 301

1. Allgemeine Daten und perioperativer Verlauf

Die demographischen Daten sind in Tabelle 3dargestellt. Bis auf einen Unterschied im Ausgangsgewicht waren beide Gruppen vergleichbar. Das höhere Körpergewicht der Kontrollgruppe hatte keine Auswirkung auf die Gefäßflächen der transplantierten Aorta (19,2 ± 1,5 mm2 vs. 15,5 ± 1,8 mm2, p = 0,2) und der mittlere Gewichtsunterschied zwischen Spender und Empfänger (1 ± 0,4 kg in der Kontrollgruppe und 0.9 ± 0.4 kg in der MMF Gruppe) war vergleichbar.

Tabelle 3: Demographie der Aortentransplantations-Studie. Die Tiere C1 und C4, C2 und C6, C3 und C5, Rx1 und Rx4, Rx2 und Rx6, sowie Rx3 und Rx5 dienten jeweils als Paare für die Transplantation.

Tier

(Nr)

Gewicht

(kg)

Blutgruppe

MLR

(SI)

Ischämiezeit

(min)

Op-Zeit

(min)

Kontrolle

C1

7,4

B

38.4

49

110

C2

7,9

AB

3,8

32

110

C3

8,8

B

3,6

40

108

C4

8,8

B

4,3

47

129

C5

7,3

B

2,8

55

118

C6

7,8

AB

5,3

56

102

MMF

Rx1

7,4

A

3,8

117

162

Rx2

8,3

A

6,8

43

108

Rx3

6,2

A

5,9

37

110

Rx4

6,8

A

4,9

47

132

Rx5

5,8

A

11,5

70

125

Rx6

6,4

A

10,9

56

135

P (Kontrolle vs. MMF)

0,03

-

0,7

0,27

0,12


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Bei den zwölf durchgeführten Transplantationen lagen die Ischämiezeiten im Mittel bei 54 Minuten (32 – 117 min) und die Operationszeiten bei 120 Minuten (102 – 162 min). Kein Tier verstarb an dem Eingriff.

Nur in einem Tier traten Komplikationen auf: Bei diesem Tier (Rx1) mußte aufgrund einer Dissoziation beider Iliacalarterien eine End-zu-End-Anastomose der Aorta mit der linken A. iliaca communis, sowie eine End-zu-Seit-Anastomose zwischen der rechten und linken A. iliaca communis durchgeführt werden ( Abbildung 38 ). Dieses Tier erlitt am 8. postoperativen Tag aufgrund einer ileocoecalen Invagination einen Dünndarmileus. Es erfolgte eine Dünndarmsegmentresektion des invaginierten Darmabschnittes ( Abbildung 39 ).

Abbildung 38: Tier Rx1: Rekonstruktion der Aortenbifurkation, nachdem die zunächst durchgeführte End-zu-End-Aorto- Aortostomie zu einer Dissoziation der Iliacalgefäße führte. Zur Vermeidung einer Abgangsstenose wurde eine End-zu-End-Anastomose zwischen Transplantat (Tx) und A. iliaca communis sinistra (AICs) durchgeführt und anschließend die rechte Iliacal- Arterie (AICd) End-zu-Seit (E-S) implantiert. Die Pfeile markieren die Anastomosen. VC: Vena cava


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Postoperativ erholte sich das Tier schnell und die Initima-Hyperplasie war am Tag 42 mit der Transplantat-Vaskulopathie der anderen Tieren vergleichbar. Das Tier wurde nicht von der Studie ausgeschlossen und entsprechend dem Protokoll begann die MMF Therapie an Tag 45.

Bei den insgesamt 60 operativen IVUS Eingriffen traten bei je einem Tier je Gruppe (3,3%) eine Dissektion der Aorta auf, die jedoch in beiden Fällen innerhalb von 3 Wochen folgenlos abheilte. Bei einem Eingriff in der Kontrollgruppe (3,3%) und bei 4 Eingriffen in der MMF Gruppe (13,3%; p=0,16) entwickelte sich während der IVUS-Untersuchung ein intraarterieller Thrombus, der mittels Fogarthy Manöver entfernt werden mußte. Bei einem Tier mußte aufgrund eines ausgeprägten Vasospasmus an Tag 42 die IVUS Untersuchung vorzeitig beendet werden.

Abbildung 39: Dünndarm Invagination (Tier Rx1). a) Operationsitus: etwa 30 cm vor der Bauhin’ Klappe war das terminale Ileum bis ins Colon ascendens invaginiert und hatte zu einem Darmverschluß mit Ischämie des terminalen Ileums geführt. Am Resektat (b) zeigte sich eine polypöse Raumforderung als Ursache (Inlay). c) Bei Versuchsende stellte sich die Anastomose reizlos, ohne Stenose und mit Omentum majus abgedeckt dar.


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Nach keinem der 60 Eingriffe kam es zu einer arteriellen Ischämie des Beines. Insgesamt mußte kein Tier aufgrund einer Komplikation aus der Studie ausgeschlossen werden. Auch eine MMF Intolerabilität führte nicht zu einem vorzeitigen Studienabbruch.

2. MMF Therapie und ihre spezifischen Komplikationen

In der Behandlungsgruppe begannen alle Tiere am Tag 45 nach der Aortentransplantation mit der MMF Therapie. Diese startete mit der subkutanen Gabe von 50 mg/kg CellCept-IV® BID für 8 Tage. Aufgrund von Hautveränderungen bei 2 Tieren wurde ab Tag 9 die MMF Therapie bei allen Tieren auf die orale Gabe von 50 mg/kg MMF BID umgestellt. Ab dem 50. postoperativen Tag wurde die MMF Dosis entsprechend des Studienprotokolles für jedes Tier individuell festgesetzt ( Abbildung 40 ).

Abbildung 40: Individuelle tägliche MMF Gesamtdosis verabreicht in zwei Einzeldosen. Die Dosierung richtete sich nach Toxizität, pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern.


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Für die gesamte Behandlungsdauer von 58 Tagen wurde eine mittlere MMF Dosis von 99,2 ± 4,2 mg/kg/Tag erreicht. Aufgrund von Medikamenten Nebenwirkungen mußte bei 4 Tieren zeitweilig die Dosis unter die Startdosis von 100 mg/kg/Tag gesenkt werden (Rx2 – 3 Tage, 5% der Behandlungstage; Rx4 – 18 Tage, 31% der Behandlungstage; Rx5 – 29 Tage, 50% der Behandlungstage; Rx6 – 30 Tage, 52% der Behandlungstage). Bei keinem Tier mußte MMF komplett abgesetzt werden, aber bei 2 Tieren wurde die Dosis zeitweilig auf unter 50 mg/kg/Tag reduziert.

Wie auch in Studie 201 war der Gewichtsverlust die bedeutendste Nebenwirkung von MMF. Bis zum Tag 42 waren die Gewichtsveränderungen in Kontroll- und Therapiegruppe gleich. Alle Tiere nahmen nach kurzfristigem Gewichtsverlust in Folge der Transplantation (p = 0,01 im Vergleich zum präoperativen Gewicht) wieder an Gewicht zu. Während sich diese Gewichtszunahme in der Kontrollgruppe fortsetzte, nahmen die Tiere in der MMF Gruppe nach Therapiebeginn wieder Gewicht ab und von Tag 63 an war der Unterschied

Abbildung 41: Gewichtsverlauf nach Aortentransplantation. Nach initialer Gewichtszunahme nach Tx nahmen die Tiere in der Therapiegruppe nach Beginn der MMF Therapie wieder an Gewicht ab.


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zur Kontrollgruppe statistisch signifikant (p = 0,02). Hierbei war die individuelle Sensitivität der Tiere auf MMF sehr unterschiedlich und der maximale Gewichtsverlust variierte zwischen 2,5% und 14,2%.

Während der gesamten Studiendauer zeigten alle Tiere zu jederzeit ein unauffälliges Verhalten, das täglich als wach, aufmerksam und empfänglich eingestuft wurde. Während der Therapiedauer war der Appetit bei 4 Tieren für die Dauer von ein bis 37 Tagen reduziert. Die maximale Dauer des Appetitverlustes war ein bis acht Tage in Folge. Durchfälle traten bei 4 Tieren in einer Dauer von 6 bis 12 Tage auf. Die Zusammenfassung der Nebenwirkungen der MMF Therapie ist in Tabelle 4 aufgeführt.

Andere Nebenwirkungen fielen während der Studie nicht auf oder sind bei der Autopsie nicht diagnostiziert worden. Die Veränderungen im Blutbild und in der Blutchemie sind in Tabelle 5 aufgezeigt. Knochenmarkstoxizität trat nicht auf. Lediglich die Erythrozytenzahl

Abbildung 42: Individueller Gewichtsverlauf in der Therapiegruppe. Die Tiere zeigten eine sehr unterschiedliche Sensitivität für die MMF Toxizität


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fiel von 6,1 ± 0,2 /nl auf 5,2 ± 0,4 /nl signifikant (p = 0,03), aber klinisch nicht bedeutsam ab. Es zeigten sich keine Zeichen einer Leber-, Nieren-, oder Pankreasfunktionsstörung. Erniedrigte Gesamt-Eiweißwerte an Tag 105 (6,9 ± 0,2 mg/dl vs. 6,3 ± 0,2 mg/dl; p = 0,01) und der Abfall des Serum-Cholesterins von Tag 42 zu Tag 105 in der MMF Gruppe (94 ± 4 vs. 75 ± 8; p = 0,05) wurde als diskrete Zeichen einer Mangelernährung gewertet.

Tabelle 4: Nebenwirkung der MMF Therapie für jedes Tier individuell aufgeführt: Dargestellt ist die Anzahl der Tage, an denen die unerwünschte Wirkung auftrat bzw. mittels Gavage zugefüttert wurde.

Tier

Depressives
Verhalten
[Tage]

Appetitverlust

[Tage]

Diarrhoe

[Tage]

Erbrechen

[Tage]

Zufütterung

[Tage]

Rx1

-

37

9

2

47

Rx2

-

10

-

2

37

Rx3

-

-

-

1

-

Rx4

-

14

7

-

37

Rx5

-

-

6

1

-

Rx6

-

1

12

5

-


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Tabelle 5: Blutbild und Laborchemie in Kontroll- und MMF-Gruppe Tag 42 und 105

 

Kontrolle

p
(42-105)

MMF

p
(42-105)

p
(Kontrolle vs. MMF)

 

Tag 42

Tag 105

 

Tag 42

Tag 105

 

Tag 42

Tag 105

Hämoglobin (mg/dl)

13,2±0,3

12,8±0,3

0,5

12,6±0,3

11,1±0,8

0,1

0,3

0,1

Hämatokrit (%)

41±0,8

40,5±1,1

0,4

39,9±0,9

35,5±0,8

0,3

0,1

0,1

Erythrozyten (103/nl) e

6,5±0,1

6,3±0,2

0,2

6,1±0,2

5,2±0,4

0,05

0,07

0,03

Leukozyten (/nl) e

9,2±1,3

8,2±0,6

0,7

11,2±,9

7,5±1,4

0,1

0,3

0,7

Thrombozyten (/nl)

356±33

331±23

0,5

399±30

306±33

0,1

0,3

0,6

Ges. Eiweiß (mg/dl)

7,1±0,1

6,9±0,1

0,2

6,8±0,2

6,3±0,2

0,1

0,2

0,01

Albumin (mg/dl)

3,9±0,1

3,9±0,2

0,9

3,9±0,1

3,8±0,2

0,3

0,5

0,3

Amylase (IU/l)

303±31

278±33

0,2

340±50

261±20

0,4

0,8

1,0

Lipase (IU/l)

10,8±1,6

15±2,9

0,2

9,4±1,9

6,7±1,5

0,05

0,6

0,02

Kreatinin (mg/dl)

1,2±0,1

1,1±0,05

0,3

0,9±0,05

0,8±0,1

0,3

0,08

0,09

Harnstoff (mg/dl) e

13,5±1,8

11,5±0,5

0,7

10,2±0,8

9±1,6

0,8

0,2

0,5

Ges. Bilirubin (mg/dl)

0,2±0,05

0,18±0,02

0,8

0,2±0,05

0,13±0,02

0,02

0,8

0,09

Konj.. Bilirubin (mg/dl)

0,05±0,02

0,03±0,01

0,5

0,04±0,001

0,03±0,01

0,01

1,0

0,3

AST (IU/l)

40±3

35±2

0,3

34±3

24±1

0,04

0,3

0,01

ALT (IU/l)

19±5

33±16

0,6

24±3

18±3

0,3

0,3

0,8

AP (IU/l)

164±17

141±14

0,5

229±19

192±15

0,3

0,04

0,06

Cholesterol (mg/dl)

98±6

92±8

0,8

94±4

75±8

0,05

0,7

0,2

Triglyzeride (mg/dl)

49±6

74±12

0,06

55±5

50±8

0,5

0,4

0,1

Glukose (mg/dl)

42,1±5,3

55,8±7,1

0,13

45,3±4,3

53,3±4,3

0,4

0,5

0,7

LDH (IU/l) e

508±96

413±71

0,5

460±83

273±30

0,1

0,7

0,2

CPK (IU/l)

356±80

233±71

0,2

488±205

285±147

0,18

0,6

0,8


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3.  Pharmakokinetische Untersuchungen

Nach der ersten MMF Dosis an Tag 45 nach Aortentransplantation wurden mittlere MPA Talspiegel von 2,3 mg/l (1,8 – 2,8 mg/l) erreicht. Auch nach der Umstellung auf die orale Applikation zeigten erste Talspiegel suffiziente MPA Werte (Mittel: 4,7 mg/l; 2,4 – 7,9 mg/l. Während der gesamten Versuchsdauer bis zur letzten MMF Dosis an Tag 103 variierten die MPA Plasma – Talspiegel zwischen 1,38 und 11,4 mg/l. Insgesamt wurde aber nur bei drei Tieren jeweils an einem einzelnen Tag ein MPA Talspiegel von unter 2 mg/l gemessen, was eine individuelle Dosiserhöhung zur Folge hatte.

Abbildung 43: Individuelle MPA Plasma Talspiegel nach MMF Therapie zwischen Tag 45 und 103 nach Aortentransplantation


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4.  Pharmakodynamische Untersuchungen

a) In vitro

Pharmakodynamische Untersuchungen wurden an Tag 42, vor Beginn der MMF Therapie, durchgeführt um einen Referenzwert für die weiteren Messungen der Studie zu erhalten. Hierbei wurde auch eine in vitro Versuchsreihe mit einbezogen, um inter-individuelle Unterschiede in der MPA Sensitivität der verschiedenen Tiere zu testen.

Die berechnete IC50 der Lymphozyten Proliferation, analysiert anhand der PCNA – Expression in SG2M+ Zellen, lag bei allen Tieren bei 0,48 mg/l (0,3 – 0,61 mg/l) und Imax bei 91,86 ± 4,5 rel% PCNA Inhibition. Die Korrelation (r2) zwischen MPA Konzentration und Inhibition der Lymphozyten Proliferation lag bei 0,95.

Abbildung 44: Korrelation zwischen in vitro MPA Konzentration und PCNA Expressionshemmung in S G2M Zellen (IC50: 0,48 mg/l (0,3 – 0,61 mg/l;, Imax: 91,86 ± 4,5 rel%; r2=0,95), gemessen an den 6 Tieren der Behandlungsgruppe vor Beginn der MMF Therapie an Tag 42 nach Transplantation.


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Abbildung 45: In vitro Einfluss von MPA auf Zelloberflächen-Antigene auf CD3+ Zellen in 6 Cynomolgus Affen (Rx1-Rx6) vor Beginn mit der MMF Therapie. Zur Erhaltung der Übersichtlichkeit wurde auf die
Darstellung von Fehlerbalken verzichtet; Einzelheiten im Text

Über die gesamte MPA Konzentrationsreihe war nach mitogener Stimulation die Expression der Subset Marker CD3, CD14 und CD20 konstant. Konzentrationsabhängig, aber in verschiedenem Ausmaß, wurden die Oberflächenantigen-Expression von CD71 (IC50: 0,33 ± 0,1 mg/l, Imax:51,4 ± 3,2 rel%; r2: 0,94), CD95 (IC50: 0,42 ± 0,07 mg/l, Imax:91,4 ± 5,6 rel%; r2: 0,94), CD25 (IC50: 0,51 ± 0,1 mg/l, Imax:83,7 ± 5,8 rel%; r2: 0,95), CD11a (IC50: 0,56 ± 0,1 mg/l, Imax:77,3 ± 6,2 rel%; r2: 0,9), und CD154 (IC50: > 10 mg/l, Imax:> 25,3 rel%; r2: 0,38) auf CD3+ Zellen gehemmt ( Abbildung 45 ). MPA hatte keinen Einfluss auf die intrazelluläre Zytokin-Expression (IL-2, IL-4, TNF-α, IFN-γ) in CD3+ Zellen ( Abbildung 46 ), sowie auf die B Zell- und Monozyten-Funktion Abbildung 47 ).


[Seite 86↓]

Abbildung 46: Intrazelluläre Expression von IL-2, Il-4, TNF-α und IFN-γ in CD3+ Zellen. MPA hat keinen
Einfluss auf die Zytokin - Expression in vitro

Abbildung 47: Einfluss von MPA auf die Monozyten- und B Zellfunktion in vitro. Die intrazelluläre TNF-α Expression in CD14+ Zellen und die CD69 bzw. CD86 Expression in CD20+ Zellen bleibt auch bei steigender MPA Konzentration konstant.


[Seite 87↓]

b)  In vivo

Parallel zu jeder Bestimmung der MPA-Plasma-Talspiegel wurde die Hemmung der Lymphozytenproliferation, sowie die Expression von CD25 und CD71 auf T Zellen gemessen.

Abbildung 48: Vergleich der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von MMF. Die MPA Plasma Talspiegel
zeigten eine höhere Streuung als die korrespondierenden Lymphozyten-Proliferationsraten.


[Seite 88↓]

Die Varianz der Messung der Proliferationsrate war deutlich niedriger als die der MPA-Plasmaspiegel ( Abbildung 48 ). Ziel während der Behandlung mit MMF war es, absolute Proliferationsraten von weniger als 5% zu erzielen. Bei höheren Werten wurde eine MMF Dosisanpassung angestrebt. Nach der ersten subkutanen MMF Gabe wurden PCNA-Expressionen von 1,85 bis 2,5 abs% erzielt ( Abbildung 49 ). Nach Umstellung auf die orale MMF Applikation stiegen die PCNA-Expressionsraten im Mittel auf 4,0 abs% an (1,98 – 9,03 abs%). Insgesamt wurden bei 5 von 6 Tieren an 2 bis 6 Therapietagen Proliferationsraten von mehr als 5 abs% gemessen.

Abbildung 49: Individuelle Bestimmung der Lymphozytenproliferation jeweils zum Zeitpunkt vor der nächsten MMF Gabe. Schon nach der initialen MMF Gabe wurde die PCNA Expression gehemmt und zeigte im Vergleich zu den MPA Plasmaspiegeln nur eine mäßige Variation. Am Tag 105, zwei Tage nach der letzten MMF Gabe, hatten sich die Werte noch nicht vollständig normalisiert.


[Seite 89↓]

Abbildung 50: Pharmakodynamisch – pharmakokinetische Beziehung in vivo zwischen der PCNA/SG2M Expression und den MPA Plasmaspiegeln in Cynomolgus Affen nach Aortentransplantation. Die geringe Anzahl von MPA – Konzentrationen von weniger als 2 mg/l verhinderten eine valide Bestimmung des IC50.

Tabelle 6: Individuelle Unterschiede im PK/PD Zusammenhang in vivo nach Aortentransplantation; Emin bezeichnet die berechnete, niedrigste mögliche PCNA Expression bei MPA = ∝.

Tier

E min [rel%]

r 2

Rx1

6,8

0,97

Rx2

12,8

0,94

Rx3

7,7

0,83

Rx4

4,7

0,99

Rx5

10,5

0,96

Rx6

4,7

0,95


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Die retrospektiv, nach Abschluß der Studie kalkulierte maximale Inhibition wurde mit 88,7 ± 1,3 rel% bestimmt. Die inter-individuellen Unterschiede zwischen den Tieren war hierbei jedoch hoch:

In vivo lag die Korrelation zwischen der CD71 Expression auf T Lymphozyten nur bei r2 = 0,59 bei einer Imax von 52,9 ± 3,7%. Während die CD71 Expression in den ersten drei Wochen der Behandlung bei allen Tieren inhibiert war (Tag 53: 27,3 ± 9,6 rel%), stieg sie im weiteren Verlauf trotz gleichbleibender MPA-Spiegel wieder an (Tag 84: 53,6 ± 8,8 rel%). Ähnlich verhielt sich die Expression von CD25 auf T-Lymphozyten (r2: 0,84; Imax: 75,4 ± 3,1 rel%).

In vivo wurde die IC50 für Proliferation, CD71 und CD25 Expression aufgrund der geringen Anzahl von MPA Plasmaspiegel von unter 2,0 mg/l nicht bestimmt (siehe Abbildung 50


[Seite 91↓]

5.  IVUS – Morphometrie

a) Gefäßvolumina

In der Kontrollgruppe lag am Tag 21 das Gefäßvolumen des mittleren Aortentransplantatdrittels bei 192,68 ± 15,95 mm3 und nahm bis zum Tag 105 (160,03 ± 16,79 mm3) signifikant ab (p = 0,02). In der Therapiegruppe waren die Gefäßvolumina an Tag 21 (154,62 ± 18,35 mm3) und Tag 42 (165,87 ± 15,12 mm3) vergleichbar (p = 0,47) und veränderte sich bis zum Tag 105 (137,87 ± 12,84 mm3) nicht signifikant (p = 0,17). Der Unterschied zwischen den Gruppen war zu keiner Zeit signifikant (p = 0,32 an Tag 105).

Abbildung 51: Mittleres Gefäßvolumen ± SEM im Aortentransplantat. Nur in der Kontrollgruppe und nicht in der Therapiegruppe fiel das Gefäßvolumen von Tag 21 zu Tag 105 signifikant ab (p = 0,02). Die Unterschiede zwischen Kontroll- und Therapiegruppen waren zu keinem Zeitpunkt signifikant.


[Seite 92↓]

Der minimale Gefäßquerschnitt änderte sich in der Kontrollgruppe von 17,9 ± 1,6 mm2 an Tag 21 auf 14,57 ± 1,6 mm2 an Tag 105 (p <0,04) und in der MMF Gruppe von 14,1 ± 2,1 mm2 auf 12,5 ± 1,2 mm2 (p = 0,3) Abbildung 51 und Abbildung 52

Abbildung 52: Individuelle Entwicklung der Gefäßvolumina von Tag 21 bis Tag 105 in Kontroll- und MMF- Gruppe.

b) Lumenvolumina

In der Kontrollgruppe verringerte sich die Lumenfläche in der Aorta im mittleren Drittel des Transplantates hoch signifikant von Tag 21 (16,7 ± 4,0 mm2) auf 10,4 ± 1,6 mm2 an Tag 105 (p < 0,001). In der MMF Therapiegruppe kam es ebenfalls zu einem Abfall des Lumens von 13,4 ± 1,6 mm2 auf 8,9 ± 0,6 mm2 (p < 0,01) und der Unterschied zwischen den Gruppen war nicht signifikant (p = 0,3Abbildung 53und Abbildung 54 ).


[Seite 93↓]

Die Reduktion des Gefäßlumens hatte in keiner Gruppe einen Einfluss auf den gemessenen Blutdruckgradienten über das Aorteninterponat: Bei einem Mitteldruck von 71 ± 2 mmHg in der proximalen Aorta war ein Blutdruckgradient zwischen proximal und distal des Transplantates in der Kontrollgruppe von 5,3 ± 1,6 mmHg und in der MMF Gruppe von 3,3 ± 1,6 mmHg zu messen (p = 0,3).

Abbildung 53: Mittlere Lumenfläche im Aortentransplantat. Um Einflüsse der Anastomose zu vermeiden bezog sich die Messung auf das mittlere 1cm-Segment. In beiden Gruppen nahmen die Lumina signifikant ab.


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Abbildung 54: Individuelle Entwicklung der Gefäßflächen in der IVUS Untersuchung

c) Intimavolumina

Bei der ersten IVUS Messung an Tag 21 nach Transplantation zeigte die Intima im mittleren Drittel der transplantierten Aorta ein Volumen von 24,9 ± 1,2 mm3 in der Kontrollgruppe und von 19,7 ± 2,5 mm3 in der Behandlungsgruppe (p = 0,1). An Tag 42, drei Tage vor Therapiebeginn, glichen sich die Volumina noch weiter an (Kontrolle: 25,4 ± 2,1 mm3; MMF: 25,1 ± 3,6 mm3; p = 0,9). Ausgehend von diesen Werten nahm das mittlere Intimavolumen bis zum Tag 105 in der Kontrollgruppe signifikant (p = 0,028) auf 55,2 ± 2,8 mm3 zu. In der MMF Behandlungsgruppe kam es zu einem geringeren, aber auch statistisch signifikanten (p = 0,043) Anstieg auf 47,8 ± 7,2 mm3. Der Unterschied zwischen den Gruppen war an Tag 105 nicht signifikant (p = 0,37) und auch im GLM Modell für wiederholte Messungen war kein Unterschied zwischen den Gruppen zu erkennen (p = 0,3) (Abbildung 55)


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Abbildung 55: Entwicklung der mittleren Intimahyperplasie, dargestellt anhand der IVUS Messung des Intimavolumens [mm3], an den Tagen 21, 42, 63, 84 und 105 nach Aortentransplantation. Die Messungen fanden im mittleren, 1 cm langen Segment des Transplantates statt, um nicht dem Einfluss der Anastomosen zu unterliegen. In der allgemeinen Auswertung mit dem GLM Modell wiederholter Messungen zeigte sich kein Unterschied zwischen den Gruppen (p = 0,3).

In der Analyse der einzelnen Tiere sah man, dass die Varianz in der Therapiegruppe deutlich höher war als in der Kontrollgruppe ( Abbildung 56 ): Die Intimahyperplasie nahm bei allen Tieren in der Kontrollgruppe homogen zu. In der MMF Gruppe kam es dagegen bei vier Tieren (Rx1 – Rx4) zu einer Verlangsamung des Intimawachstums. Nach 105 Tagen war bei diesen Tieren die Intimahyperplasie niedriger als bei jedem Tier der Kontrollgruppe und der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,02). Bei den anderen zwei Tieren (Rx5, Rx6; fett gedruckt in Abbildungen) schritt die Intimahyperplasie ungebremst fort und es zeigte sich kein Unterschied zu den Kontrolltieren.


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Abbildung 56: Entwicklung der mittleren Intimahyperplasie, dargestellt anhand der IVUS Messung des Intimavolumens [mm3], an den Tagen 21, 42, 63, 84 und 105 nach Aortentransplantation. Die Messungen fanden im mittleren, 1 cm langen Segment des Transplantates statt, um nicht dem Einfluss der Anastomosen zu unterliegen. In der allgemeinen Auswertung mit dem GLM Model wiederholter Messungen zeigte sich kein Unterschied zwischen den Gruppen (p = 0,3).


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6.  Histologische Untersuchungen

a) Qualitative Auswertung

Ohne immunsuppressive Therapie in der Kontrollgruppe zeigten alle Aortentransplantate nach 105 Tagen ausgeprägte Veränderungen, die im histologischen Bild von der klinischen Transplantat-Vaskulopathie nicht zu unterscheiden sind ( Abbildung 57 ). Die TVP bestand aus einer Infiltration und Proliferation von glatten Muskelzellen und Myofibroblasten, die zu einer konzentrischen Intimahyperplasie führte. Ferner waren Makrophagen und Lymphozyten in die kollagenöse Matrix der Intima eingelagert. In der α-Actin Färbung zeigte sich, dass die Intimahyperplasie vor allem aus glatten Muskelzellen bestand. Die Membrana elastica interna war teilweise durchbrochen, teilweise erhalten und dupliziert. Die Mediaschichten waren mit fibrinösem Bindegewebe durchsetzt, das sich auch in das periadventitielle Gewebe ausbreitete. Die perivaskuläre Entzündung war nur gering, Cholesteroleinlagerungen oder Kalzifikationen waren nicht erkennbar. Die semiquantitative Beurteilung zeigte eine geringgradige TVP in einem Tier, eine mittelgradige in zwei und eine ausgeprägte TVP in drei Tieren.

Bei den MMF behandelten Tieren ( Abbildung 58 ) war die Ausprägung der TVP geringgradig in zwei Tieren, mittelgradig in drei und ausgeprägt bei einem Tier. Auch hier entwickelte sich die Intimahyperplasie vor allem konzentrisch und die Veränderungen an der Membrana elastica interna, der Media und im periadventitiellem Bindegewebe entsprachen im wesentlichen denen der Kontrollgruppe.

Tabelle 7: Semiquantitatives Grading der histologischen Veränderungen nach Aortentransplantation. Grad 0: kein Anhalt für TVP; Grad I: minimale Intimaverdickung; Grad II: geringgradige Veränderungen; Grad III: mittelgradige Veränderungen; Grad IV: schwere Veränderungen der TVP.

Tier

TVP
Grade

M. elastica interna

Konzentrisch/
Exzentrisches
Wachstum

Kalzifikation/
Cholesterol

Perivaskuläre
Entzündung

Kontrolle

     

C1

IV

Intakt

konzentr.

-/-

bandförmig

C2

II

frakt/redupl

konzentr.

-/-

wenig

C3

III

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

C4

IV

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

C5

IV

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

C6

III

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

MMF

     

Rx1

III

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

Rx2

III

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

Rx3

II

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

Rx4

II

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal

Rx5

IV

frakt/redupl

konzentr.

-/-

wenig

RX6

III

frakt/redupl

konzentr.

-/-

multifokal


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Abbildung 57: Intimahyperplasie in der Kontrollgruppe an Tag 105 nach Aortentransplantation. Ohne jegliche Immunsuppression entwickelte sich eine signifikante Verdickung der Intima, die im histologischen Bild der Transplantat-Vaskulopathie im Menschen entspricht. α-Actin-Färbung (x20 – x30) zur Darstellung der glatten Muskelzellen.


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Abbildung 58: Histologie der Aortentransplantate in der MMF Behandlungsgruppe. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe erhielten die Tiere der Therapie Gruppe vom 45. Tag nach Transplantation an MMF zur Behandlung der bereits fortgeschrittenen Transplantat-Vaskulopathie (TVP). Im Gegensatz zur Kontrollgruppe entwickelte sich hier die TVP nicht in allen Tieren gleichmäßig: Während Rx1 – Rx4 die MMF Therapie gut tolerierten und eine geringere Intimahyperplasie als die Tiere in der Kontrollgruppe aufwiesen, zeigten die Tiere Rx5 und Rx6 bei schlechter MMF Verträglichkeit eine ungehinderte Entwicklung der Intimaverdickung. α-Actin- Färbung (x20 – x30) zur Darstellung der glatten Muskelzellen


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b)  Morphometrische Messungen

Die morphometrischen Messungen an den histologischen Präparaten und der letzten IVUS Untersuchung an Tag 105 korrelierten zwischen r2 = 0,675; p = 0,016 und r2 = 0,883; p < 0,001. Trotz der aufwendigen Präservation der Präparate lag die Morphometrie für die Fläche des Gefäßlumens am histologischen Präparat nur bei 41,6% und die Fläche der Intimahyperplasie bei 69,4% der letzten IVUS Messung.

Abbildung 59: Histomorphometrische Bestimmung der mittleren Lumen-, Intima- und Mediaflächen im mittleren Segment des Aortentransplantates. Im Mittel (± SEM) erreichten die Unterschiede zwischen der Kontroll- und der MMF Gruppe für die Fläche der Intima (p = 0,078) und die Fläche der Media (p = 0,016) Signifikanzniveau. Allerdings waren die Messungen durch die postmortale elastische Schrumpfung der Gefäße im Vergleich zur IVUS-Morphometrie nur eingeschränkt verwertbar.


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Die Gesamtfläche der Gefäße im mittleren Transplantatdrittel lag in der Kontrollgruppe bei 10,7 ± 1,1 mm2 und in der MMF Gruppe bei 7,6 ± 0,7 mm2 (p = 0,09). Hierbei war das Lumen zwischen beiden Gruppen vergleichbar (Kontrolle: 4,2 ± 0,5 mm2; MMF: 3,9 ± 0,4 mm2; p = 0,6). Die Unterschiede in den Intimaflächen und den Mediaflächen erreichten Signifikanzniveau: So betrug die mittlere Fläche der Media in der Kontrollgruppe 2,3 ± 0,3 mm2 und in der MMF Gruppe 1,5 ± 1,3 mm2 (p = 0,016). Die mittlere Fläche der Intima in der Kontrollgruppe wurde mit 4,2 ± 0,4 mm2 und in der MMF Gruppe mit 2,9 ± 0,5 mm2 vermessen (p = 0,078). Die mittlere Intimadicke lag in der Kontrollgruppe bei 504 ± 44 μm und in der MMF Gruppe bei 410 ± 47 μm (p = 0,065).

7. Korrelationen zwischen Dosis, PK, PD und Intimahyperplasie

In der Kontrollgruppe bestand keine Korrelation zwischen Ischämiezeit oder der MLR und der Entwicklung der Intimahyperplasie. Auch in der Therapiegruppe hatte die Ischämiezeit keinen Einfluss. Die MLR korrelierte jedoch signifikant mit dem Intimavolumen gemessen mittels IVUS an Tag 105 (Abbildung 60) und der mittleren Intimafläche in der Histomorphometrie (r2 = 0,88, p < 0,02). In der Therapiegruppe zeigte die mittlere MMF-Tagesdosis eine hohe Korrelation mit dem Ausmaß der Intimahyperplasie (r2 = 0,89, p < 0,015) an Tag 105 (Abbildung 61). Die gemessenen pharmakokinetischen Parameter wie mittlerer MPA-Spiegel oder Tage mit MPA-Spiegel unter 2,0 mg/l korrelierten nicht mit der Entwicklung der Intimaproliferation.


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Die absoluten oder relativen pharmakodynamischen Parameter für Lymphozytenproliferation, CD71 und CD25 Expression auf CD3+ Zellen im peripheren Blut zeigten ebenfalls keine Korrelation mit dem Ausmaß der Transplantat-Vaskulopathie. Zieht man dagegen die inter-individuelle Unterschiede in der MPA-Sensitivität in vivo bei den einzelnen Tieren in Betracht, so zeigte sich zwischen der Anzahl der Tage in denen keine annährend vollständige Hemmung der Lymphozytenproliferation erreicht wurde (Emin < 95%) und dem Intimavolumen an Tag 105 (r2 = 0,82, p < 0,046) eine signifikante Korrelation (Tabelle 8).

Abbildung 60: Korrelation zwischen dem Stimulationsindex der „Mixed Leucocyte Reaction“ und der Intimahyperplasie gemessen anhand des Intimavolumens an Tag 105 nach Aortentransplantation

Tabelle 8: Korrelation zwischen MLR, Ischämiezeit, MMF Dosis, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik und dem Ausmaß der Transplantat-Vaskulopathie. In der MMF Behandlungsgruppe korrelierten MLR, mittlere MMF Dosis und das Erreichen des 95% Emin der Lymphozytenproliferationsrate im peripheren Blut mit der Intimahyperplasie statistisch signifikant.

 

IVUS

Tag 105

Intima Volumen

Histologie

Intima

Fläche

 

r 2

p

r 2

p

MLR

0,88

0,02

0,86

0,03

Ischämiezeit

0,18

0,5

0,34

0,3

Mittlere MMF Dosis

0,89

0,015

0,85

0,03

Mittlere MPA Spiegel

0,07

0,9

0,02

0,9

Tage mit Spiegel < 2,0 mg/l

0,15

0,7

0,21

0,6

Mittlere PCNA Expression

0,16

0,7

0,21

0,7

Tage mit PCNA Expression
> 5,0 abs%

0,14

0,7

0,10

0,8

Tage mit PCNA Expression
< 95% E
min

0,82

0,046

0,80

0,058

Mittlere CD25 Expression

0,47

0,4

0,41

0,4

Mittlere CD71 Expression

0,39

0,5

0,35

0,5


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Abbildung 61: Korrelation zwischen der mittleren MMF Dosis pro Tag und dem Ausmaß der Transplantat- Vaskulopathie.


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17.09.2004