Aus der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie
(Direktor: Prof. Dr. med. P. Neuhaus)

Untersuchungen zum Einfluss von
Mycophenolat Mofetil auf Die Transplantat-Vaskulopathie nach Allogener Aorten-transplantation im Primaten-ModelL

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Venia legendi
für das Fach Chirurgie

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von:
Dr. med. Jochen Klupp
geboren am 4. Juli 1964 in Frankenthal / Pfalz

Präsident:
Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan:
Dr. J. W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. H. Reichenspurner
2. Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Oellerich

Tag der Einreichung: 28. November 2001

Tag der Habilitation: 02. Juli 2002

Widmung:

Für Tina, Stephanie und Michaela.

Inhaltsverzeichnis

• I.  Einleitung
  • A. Organ - Transplantationen
  • B.  Chronische Rejektion und Transplantat-Vaskulopathie
  • C.  Mycophenolat Mofetil (MMF)
  • D.  Problem- und Fragestellung
• II.  Material und Methoden
  • A. Versuchsplanung und Studiendesign
    • 1. Studie 101
    • 2.  Studie 102
    • 3. Studie 201
    • 4.  Studie 202
    • 5. Studie 301
  • B. Tiere und Tierhaltung
    • 1. Ratten
    • 2. Cynomolgus Affen
  • C.  Operative Modelle
    • 1. Heterotope Herztransplantation im Rattenmodell
    • 2. Orthotope Aortentransplantation im Primatenmodell
    • 3. Intravaskulärer Ultraschall (IVUS)
      • a) Operative Durchführung
      • b)  Morphometrische Analysen und Datenverarbeitung
  • D. Histologische Analysen
    • 1. Heterotope Herztransplantation im Rattenmodell
    • 2. Orthotope Aortentransplantation im Primatenmodel
      • a) Euthanasie, Transplantat Gewinnung und Präservierung
      • b)  Histologische Färbungen und Immunhistochemie
      • c) Morphometrische Analysen
  • E. Behandlung mit Mycophenolat Mofetil
    • 1. Ratten
    • 2.  Cynomolgus Affen
  • F. Analytische Methoden
    • 1. Pharmakokinetik (PK) der Mycophenolsäure
    • 2. Pharmakodynamik (PD) der Mycophenolsäure
      • a) Reagenzien
      • b)  Mitogen - stimulierte Vollblut Assays
      • c) Analyse der Lymphozyten Proliferation
      • d) Analyse der Lymphozyten Oberflächen Aktivierungs-Antigene
      • e) Analyse der intrazellulären Zytokin-Bestimmung
      • f) Analyse der Monozyten Funktion
      • g)  Durchfluss-Zytometrische Auswertun
    • 3. Hämatologische Analysen und Blutchemie
  • G. Statistik
• III.  Ergebnisse
  • A. Studie 101
    • 1. Allgemeine Ergebnisse
    • 2. Pharmakokinetik nach eintägiger Behandlung mit MMF
      • a) MPAPlasmaspiegel
      • b) MPAG Plasmaspiegel
    • 3.  Pharmakodynamik nach eintägiger Behandlung mit MMF
      • a) DNA Gehalt und PCNA Expression
      • b)  Oberflächen Antigen - Expression auf T Zellen
  • B. Studie 102
    • 1. Allgemeine Ergebnisse
    • 2.  MPA Plasmaspiegel nach 6 Tagen MMF Therapie
    • 3.  Pharmakodynamik von MMF nach wiederholten Dosierungen
      • a) DNA Gehalt und PCNA Expression
      • b) MMF Einfluss auf Lymphozyten Aktivität
    • 4.  Korrelationen zwischen PK, PD und Rejektionsgrad
  • C.  Studie 201
    • 1. Allgemein
    • 2.  MMF Toxizität im Cynomolgus Affen
    • 3.  Pharmakokinetik nach oraler Gabe von MMF
    • 4.  Pharmakodynamik nach oraler QD Gabe von MMF
  • D. Studie 202
    • 1. Allgemein
    • 2. Pharmakokinetik nach subkutaner MMF BID Applikation
    • 3. Toxizität nach subkutaner MMF Applikation
    • 4.  Pharmakokinetik nach oraler Gabe von CellCept-IV®
  • E.  Studie 301
    • 1. Allgemeine Daten und perioperativer Verlauf
    • 2. MMF Therapie und ihre spezifischen Komplikationen
    • 3.  Pharmakokinetische Untersuchungen
    • 4.  Pharmakodynamische Untersuchungen
      • a) In vitro
      • b)  In vivo
    • 5.  IVUS – Morphometrie
      • a) Gefäßvolumina
      • b) Lumenvolumina
      • c) Intimavolumina
    • 6.  Histologische Untersuchungen
      • a) Qualitative Auswertung
      • b)  Morphometrische Messungen
    • 7. Korrelationen zwischen Dosis, PK, PD und Intimahyperplasie
• IV.  Diskussion
  • A. Bisherige experimentelle Arbeiten
    • 1. Einfluss von MMF auf die Transplantat-Vaskulopathie
    • 2. Aortentransplantationsmodell im Primaten
    • 3. MMF Pharmakokinetik und Toxizität im Primaten
  • B.  Optimierung der Tier-experimentellen MMF Gabe
  • C. Einfluss von MMF auf die Transplantat-Vaskulopathie im Primaten
    • 1. Aortenmodell und TVP in der Kontrollgruppe
    • 2. Toxizität, PK und PD in der MMF Gruppe
    • 3. Effekt der MMF Therapie ab Tag 45 nach Transplantation
    • 4. Inter-individuelle Unterschiede in der MMF Wirksamkeit
  • D.  Schlußfolgerungen
• V.  Zusammenfassung
• VI. Literaturverzeichnis
• VII. Anhang
  • A. Abkürzungen
  • D. Eidesstattliche Versicherung
  • E. Lebenslauf
  • F. Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Zusammenfassung der pharmakodynamischen Unterschiede zwischen der 10 mg/kg MMF QD und der 5 mg/kg MMF BID Gruppe; Während sich an pharmakokinetischen Parametern nur die MPA-AUC12-24 nicht aber die AUC0-24 unterschied, führte die Aufteilung der MMF Gesamtdosis in zwei Einzeldosen zu einem signifikant höherem pharmakodynamisch, gemessenen immunsuppressiven Effekt über den gesamten 24 Stunden Zeitraum (Student’s T-Test, Signifikanzniveau 0,05).
• Tabelle 2: Korrelationen zwischen Schwere der Rejektion, pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern 7 Tage nach heterotoper Herztransplantation und MMF Therapie im Rattenmodell.
• Tabelle 3: Demographie der Aortentransplantations-Studie. Die Tiere C1 und C4, C2 und C6, C3 und C5, Rx1 und Rx4, Rx2 und Rx6, sowie Rx3 und Rx5 dienten jeweils als Paare für die Transplantation.
• Tabelle 4: Nebenwirkung der MMF Therapie für jedes Tier individuell aufgeführt: Dargestellt ist die Anzahl der Tage, an denen die unerwünschte Wirkung auftrat bzw. mittels Gavage zugefüttert wurde.
• Tabelle 5: Blutbild und Laborchemie in Kontroll- und MMF-Gruppe Tag 42 und 105
• Tabelle 6: Individuelle Unterschiede im PK/PD Zusammenhang in vivo nach Aortentransplantation; Emin bezeichnet die berechnete, niedrigste mögliche PCNA Expression bei MPA = ∝.
• Tabelle 7: Semiquantitatives Grading der histologischen Veränderungen nach Aortentransplantation. Grad 0: kein Anhalt für TVP; Grad I: minimale Intimaverdickung; Grad II: geringgradige Veränderungen; Grad III: mittelgradige Veränderungen; Grad IV: schwere Veränderungen der TVP.
• Tabelle 8: Korrelation zwischen MLR, Ischämiezeit, MMF Dosis, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik und dem Ausmaß der Transplantat-Vaskulopathie. In der MMF Behandlungsgruppe korrelierten MLR, mittlere MMF Dosis und das Erreichen des 95% Emin der Lymphozytenproliferationsrate im peripheren Blut mit der Intimahyperplasie statistisch signifikant.

Bilder

• Abbildung 1: St. Cosmas und St. Damian praktizierten die Kunst des Heilens im Hafen Aegea, heute Ayash (Türkei). Das Wunder des schwarzen Beines beschreibt die erfolgreiche Transplantation eines Beinesvon einem äthiopischen Mohren auf den Römer Justinian, der seine Extremität aufgrund eines Gangräns oder einer Geschwulst verlor. Der Legende nach konnte der Mann bereits am nächsten Tag zum Grab des Mohren laufen.
• Abbildung 2: Joseph E. Murray führt am 23.12.1954 in Boston die erste erfolgreiche Nierentransplantation durch.
• Abbildung 3: Patienten- (a) und Organüberleben (b) nach Lebertransplantation an der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie des Klinikums Charité – Campus Virchow von 1988 bis heute.
• Abbildung 4: Risikofaktoren, Pathogenese und Mediatoren der chronischen Rejektion (modifiziert nach Fellstrom et al., 1999) . Abkürzungen siehe Text
• Abbildung 5: Metabolismus von Mycophenolat Mofetil (MMF). MMF, biologisch inaktiv, wird rasch und vollständig zur aktiven Wirksubstanz Mycophenolsäure (MPA) hydrolysiert. Der Abbauprozeß erfolgt durch Glucuronisierung zu MPAG (Mycophenolat-Glucuronid). Die Morpholingruppe von MMF ist biologisch inaktiv und wird als Hydroxyethyl-Morpholin (HEM),Hydroxyethyl-Morpholin N-oxid (HEMNO) und Carboxymethyl-Morpholin (CMM) hauptsächlich über den Urin ausgeschieden.
• Abbildung 6: Verschiedene Synthesewege des Purinmetabolismus. Da der Wiederverwertungs-Stoffwechsel („Salvage-Pathway“) zur Herstellung von Guanosinmonophosphat in aktivierten Lymphozyten nicht ausreicht,sind diese Zellen von der de-novo-Synthese abhängig. MPA hemmt hierbei das Schlüsselenzym IMPDH und ist somit ein Lymphozyten-spezifisches Immunsuppressivum. (PRPP: 5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat; IMP: Inosinmonophosphat; AMP: Adenosinmonophosphat; ADP: Adenosindiphosphat; ATP: Adenosintriphosphat; ADA: Adenosin Deaminase; dATP: Deoxyadenosintriphosphat; IMPDH: Inosinmonophosphat-Dehydrogenase; GMP: Guanosinmonophosphat; GDP: Guanosindiphosphat; GTP: Guanosintriphosphat; HGPRTase: Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase). (Modifiziert nach Allison und Eugui, 1994)
• Abbildung 7: Studien Design. Die Studien 101 und 102 wurden im Rattenmodell und die Studien 201 und 202 im Primatenmodell durchgeführt. Sie dienten der Vorbereitung zur Aortentransplantations-Studie 301, um die MMF - Dosis, - Formulierung und - Administration zu optimieren. Ferner wurden die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Methoden im Primatenmodell etabliert. (PK: Pharmakokinetik; PD: Pharmakodynamik; LEW: Lewis Ratten; BN: Brown-Norway Ratten, HTX: Herztransplantation; Tox: Toxikologie
• Abbildung 8: Design Studie 101. Verglichen wurde die einmal tägliche (QD) mit der zwei mal täglichen (BID) Gabe von MMF in einer PK/PD Studie an nicht transplantierten Lewis Ratten über 36 Stunden. In den QD Gruppen A, C und E erfolgte eine einmalige MMF Gabe morgens um 8:00 Uhr, in den Gruppen B und D die Gabe um 8:00 und 20:00 Uhr. Dosierungsangaben in mg/kg. V: Vehikel – Methylcellulose-Lösung
• Abbildung 9: Design Studie 102. Heterotope Herztransplantation von BN zu Lewis Ratten. Die Nachbeobachtungsdauer betrug 7 Tage. Vor der Transplantation und am Tag 6 wurde zu den angegebenen Zeitpunkten Blut für die PK und PD Untersuchungen entnommen und mit der Histologie an Tag 7 verglichen. Die Studie umfaßte zwei Gruppen mit je 6 Tiere, die mit einer Gesamt-Tagesdosis von 10 mg/kg MMF behandelt wurden. (5 mg/kg BID vs. 10 mg/kg QD). Die Studie prüfte die Frage, ob die tierexperimentelle übliche QD Gabe von MMF eine niedrigere Effektivität zur klinisch üblichen BID Gabe aufzeigt.
• Abbildung 10: Heterotope Herztransplantation nach Ono (Ono und Lindsey, 1969) im Rattenmodell. Die Aorta (Ao) des Spenderherzens wird mit der Aorta abdominalis des Empfängers anastomosiert und über diese Verbindung mit arteriellem Blut versorgt. Das aus dem Sinus coronarius (SC) kommende Blut fließt über den rechten Vorhof (RA) und den rechten Ventrikel (RV), die Pulmonalarterie (PA) in die Vena cava inferior des Empfängers. (Modifiziert nach Chapman et al., 1994)
• Abbildung 11: Orthotope Aortentransplantation im Primatenmodell. Ein 3 cm langes infrarenales Segment wird zwischen zwei blutgruppen-identischen, aber histo-inkompatiblen Tieren transplantiert. Hierbei dient jedes Tier gleichzeitig als Spender und Empfänger
• bbildung 12: Operationssitus bei Aortentransplantation. Anastomosen sind mit Pfeilen markiert: a) Durch die Eigenelastizität der Aorta kommt es nach Explantation des Transplantates (Tx) zu einer erheblichen Streckendifferenz. Der Stern (*) markiert die Gefäßklemmen auf den beiden Iliacal-Arterien und die mit einer Bulldog-Klemme versorgte Schwanzarterie. VC: Vena cava. b) Situs nach Reperfusion
• Abbildung 13: Intravaskulärer Ultraschall. Die Femoralarterie wird freigelegt (a) und eine 5F Schleuse eingeführt. Über diese wird ein 2,6F Ultraschallkatheter (b) in die Aorta vorgeschoben und der Scan wird unterkontinuierlichem Rückzug (0,5mm/sec) auf ein S-VHS Videoband aufgezeichnet. c) Verschluß der Arteriotomie mit Prolene 7-0 Einzelknopfnähten
• Abbildung 14: Computerbild der mit Echoplaque® 3-D digitalisierten IVUS-Bilder. Zwischen den manuell bestimmten Flächen für Intima, Lumen und Gefäß interpoliert das System die Zwischenwerte um so eine planare longitudinale Gefäßdarstellung zu berechnen. Rot, die nachgezeichnete Membrana interna elastica, gelb die Grenze der Intima zum Gefäßlumen
• Abbildung 15: Nekropsie und Darstellung des Aortentransplantates (Tx). Truncus coeliacus (TC), A. mesen terica superior (SMA), rechte (ARd) und linke Nierenarterie (ARs), sowie A. iliaca communis (AICs) links und rechts werden vor der in situ Perfusion unterbunden.
• Abbildung 16: Ex vivo Perfusion mit 10% Formalin Lösung für 18 Stunden mit einem intravasalen Druck von100 mm Hg um eine Schrumpfung des Transplantates zu vermindern und somit eine möglichst exakte morphometrische Vermessung zu ermöglichen
• Abbildung 17: Pharmakodynamische Messungen der MMF Aktivität. In vitro wird Vollblut mit unterschiedlichen Konzentrationen von MPA versetzt, in vivo wird nach MMF Gabe zu verschiedenen Zeitpunkten Vollblut entnommen. Nach mitogener Stimulation werden Aktivierung und Proliferation verschiedener Leukozyten mittels Durchfluss-Zytometrie bestimmt.
• Abbildung 18: Analyse der mononucleären Proliferationsrate mittels Durchfluss-Zytometrie. a) FS/SS Scatter; 76% der Zellen wurden für die weitere Analyse (b) mit einbezogen. Hier wurden Zelldoublets und weiterer Debris aussortiert und die verbleibenden Zellen (89,5%) für die Bestimmung der Proliferationsrate benutzt. c) Unstimmulierte unbehandelte Negativ - Kontrolle. Als proliferierende Zellen wurden solche gewertet die FITC-antiPCNA positiv und SG2M positiv sind (1,37%). Nach ConA Stimulation (d) proliferierten 28,5% der Zellen (Positiv - Kontrolle, E0). Bei Zugabe von 0,5 mg/l MPA (e) reduzierte sich die Proliferation um ca. 50% auf14.1% (≈ IC50) und be einer Konzentration von 1,0 mg/l MPA (f) war die Proliferation fast vollständig gehemmt (3,5%).
• Abbildung 19 : Bestimmung der Expression von Zelloberflächen Antigenen hier am Beispiel von CD25, dem Rezeptor von IL-2. Im FS/SS Scatter zeigen die Lymphozyten eine typische Morphologie im unstimulierten (a) und ConA stimulierten(b) Blut. Hieraus werden die Zellen für die weitere Analyse verwendet. Nach Subtypisierung im Histogramm auf CD3 + Zellen (c) wird die CD25 Expression bestimmt (d): Grau dargestellt das Ergebnis der unstimulierten Zellen (Negativ -Kontrolle), blau die stimulierten, unbehandelten Zellen (Positiv - Kontrolle) und rot stimulierte und mit 0,5 mg/l MPA inkubierte Zellen
• Abbildung 20: Sigmoidales pharmakodynamisches Modell zur Berechnung von IC50 und Imax
• Abbildung 21: MPA Plasmaspiegel nach ein- bzw. zweimaliger oraler MMF Gabe in Lewis Ratten. Die MMF Gabe erfolgte nach den 0h und 12h Blutentnahmen. QD (Quaque Die) = einmal täglich, BID (Bis In Die) = zweimal täglich. Zugunsten der Übersichtlichkeit wurde auf die Darstellung des Standardfehlers verzichtet
• Abbildung 22: Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve 0-24h (AUC0-24) als Parameter der MPA Exposition über einen Tag.Die AUC zeigte sich in Abhängigkeit von der Gesamt-Tagesdosis und nicht in Abhängigkeit vom Dosierungsinterval
• Abbildung 23: Mittlere MPAG Plasma Konzentrationen nach eintägiger Behandlung von Lewis Ratten mit MMF. In den QD Gruppen wurde MMF nach den 0h und in den BID Gruppen nach den 0h und 12h Blutentnahmen oral verabreicht. Wie bei den MPA Spiegeln entsprachen die Kurven in den ersten zwölf Stunden der Höhe der Erstdosis. Nach der Zweitgabe in den BID Gruppen lagen dann die jeweiligen BID Kurven höher als die der Gesamt-Tagesdosis entsprechenden QD Kurven.
• Abbildung 24: Hemmung der Proliferation von mononukleären Zellen nach der Gabe von MMF dargestellt als PCNA+/SG2M+ Zellen. Alle Werte wurden zu dem Nullwert vor Behandlungsbeginn normalisiert
• Abbildung 25: MPA Plasma-Spiegel an Tag 6 nach heterotoper Herztransplantation im Rattenmodell. Während den ersten 12 Stunden waren die MPA Spiegel in beiden Gruppen vergleichbar, unterschieden sich dann aber nach dem 12h Zeitpunkt
• Abbildung 26: MPA - AUC nach 6 Tagen MMF Therapie. Während bei gleicher Tagesdosis die Gesamt-AUC in beiden Gruppen identisch war, kam es durch Aufteilung der Gesamtdosis in 2 Einzeldosen zu einer signifikanten Erhöhung der AUC12-24 in der 5mg/kg MMF BID Gruppe
• Abbildung 27: Lymphozyten – Proliferationshemmung durch MMF. Auch nach 6 Tagen Therapie war die MMF Wirkung rasch reversibel. Zum Zeitpunkt des MPA Talspiegels war die PCNA Expression in Zellen, die sich in ihrer S, G2 oder M Phase des Zellzyklus befanden, in der 10 mg/kg QD Gruppe nur noch um 14% reduziert.
• Abbildung 28: Expression des Transferrin Rezeptors CD71 auf T Lymphozyten. Während die Behandlung mit 10 mg/kg MMF QD zu einer insuffizienten Immunsuppression in der zweiten Hälfte des Dosierung - Zeitraumes führte, resultierte aus der Gabe von5 mg/kg MMF BID eine mindestens 50% Reduktion der CD71 Expression zu allen Zeitpunkten
• Abbildung 29: Zusammenhang zwischen den pharmakodynamischen Effekten von MMF und der Schwere des Rejektionsgrades in der Histologie nach heterotoper Herztransplantation im BN – LEW Rattenmodell. Die Abbildungen a) bis c) sind repräsentativ für die 10 mg/kg MMF QD Gruppe, die Abbildungen d) bis f) für die 5 mg/kg MMF BID Gruppe. Nach ConA Stimulation korrelierten zum Zeitpunkt der MPA-Plasma-Talspiegel (E0) die Proliferationsrate (a + d), dargestellt als PCNA+/SG2M+ Zellen, und die Expression von CD71+ auf OX52+ Zellen (b + e) mit dem Rejektionsgrad (c: Grad: 2; f: Grad 1) in der Histologie (HE Färbung, Vergrößerung 100 - 400x).
• Abbildung 30: Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der Studie 201. Für jeden Cynomolgus Affen (P1 – P4) ist ein eigener Graph angelegt, der die individuelle orale MMF Dosis (QD) und die Toxizitätszeichen zeigt. Alle Tiere hatten Gewicht verloren und zeigten eine Diarrhoe. Daher wurde in den Tieren P2 und P3 nach 14 Tagen, und in den restlichen Tieren nach 3 Wochen die initiale Dosis reduziert. Bei P3 mußte die MMF Therapie für einen Tag pausiert werden. Nach Absetzen der Therapie erholten sich alle Tiere rasch.
• Abbildung 31: Erstgabe von 100 mg/kg MMF oral in Form einer MMF Pulver Suspension in Vehikel Lösung. Die Tiere zeigten große Unterschiede in den erzielten MPA Spiegeln
• Abbildung 32: Individuelle MPA Plasmaspiegel nach 7 Tagen oraler MMF Therapie (100 mg/kg QD) zeigte ein Fortbestehen der hohen inter-individuellen Variabilität.
• Abbildung 33: Individuelle MPA Plasmaspiegel am Tag 28 der Studie 201, nach 7 Tagen Therapie mit 50 mg/kg MMF QD.
• Abbildung 34: Vergleich von den oralen MMF Dosisgruppen 50 mg/kg QD und 100 mg/kg QD; oben MPA Plasmaspiegel und unten die Lymphozyten-Proliferationsrate gemessen anhand der SG2M Expression. Während die höhere Dosis zwar zu sehr variablen MPA Plasmaspiegeln, aber zu einem maximalen immunsuppressiven Effekt über den 24 Stunden Zeitraum führte, waren die niedrigeren Plasmaspiegel in der 50 mg/kg QD Gruppe mit einer submaximalen Inhibition der Lymphozytenproliferation vergesellschaftet.
• Abbildung 35: Erstapplikation von 50 mg/kg CellCept-IV® BID subkutan am Primaten. Effektive MPA Plasmaspiegel wurden innerhalb von 2 Stunden erreicht
• Abbildung 36: MMF Pharmakokinetik nach 14 Tagen 50 mg/kg CellCept-IV® subkutaner BID Therapie. Gleichmäßige MPA Plasmaspiegel
• Abbildung 37: MPA Plasmaspiegel nach oraler Gabe von 50 mg/kg CellCept-IVâ BID. Tier P6 zeigte nur minimale Spiegel, während die anderen Tiere anscheinend eine gute Resorption aufwiesen. Die Plasmaspiegel zeigten jedoch eine höhere Variabilität als nach subkutaner Applikation.
• Abbildung 38: Tier Rx1: Rekonstruktion der Aortenbifurkation, nachdem die zunächst durchgeführte End-zu-End-Aorto- Aortostomie zu einer Dissoziation der Iliacalgefäße führte. Zur Vermeidung einer Abgangsstenose wurde eine End-zu-End-Anastomose zwischen Transplantat (Tx) und A. iliaca communis sinistra (AICs) durchgeführt und anschließend die rechte Iliacal- Arterie (AICd) End-zu-Seit (E-S) implantiert. Die Pfeile markieren die Anastomosen. VC: Vena cava
• Abbildung 39: Dünndarm Invagination (Tier Rx1). a) Operationsitus: etwa 30 cm vor der Bauhin’ Klappe war das terminale Ileum bis ins Colon ascendens invaginiert und hatte zu einem Darmverschluß mit Ischämie des terminalen Ileums geführt. Am Resektat (b) zeigte sich eine polypöse Raumforderung als Ursache (Inlay). c) Bei Versuchsende stellte sich die Anastomose reizlos, ohne Stenose und mit Omentum majus abgedeckt dar.
• Abbildung 40: Individuelle tägliche MMF Gesamtdosis verabreicht in zwei Einzeldosen. Die Dosierung richtete sich nach Toxizität, pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern.
• Abbildung 41: Gewichtsverlauf nach Aortentransplantation. Nach initialer Gewichtszunahme nach Tx nahmen die Tiere in der Therapiegruppe nach Beginn der MMF Therapie wieder an Gewicht ab.
• Abbildung 42: Individueller Gewichtsverlauf in der Therapiegruppe. Die Tiere zeigten eine sehr unterschiedliche Sensitivität für die MMF Toxizität
• Abbildung 43: Individuelle MPA Plasma Talspiegel nach MMF Therapie zwischen Tag 45 und 103 nach Aortentransplantation
• Abbildung 44: Korrelation zwischen in vitro MPA Konzentration und PCNA Expressionshemmung in S G2M Zellen (IC50: 0,48 mg/l (0,3 – 0,61 mg/l;, Imax: 91,86 ± 4,5 rel%; r2=0,95), gemessen an den 6 Tieren der Behandlungsgruppe vor Beginn der MMF Therapie an Tag 42 nach Transplantation.
• Abbildung 45: In vitro Einfluss von MPA auf Zelloberflächen-Antigene auf CD3+ Zellen in 6 Cynomolgus Affen (Rx1-Rx6) vor Beginn mit der MMF Therapie. Zur Erhaltung der Übersichtlichkeit wurde auf die Darstellung von Fehlerbalken verzichtet; Einzelheiten im Text
• Abbildung 46: Intrazelluläre Expression von IL-2, Il-4, TNF-α und IFN-γ in CD3+ Zellen. MPA hat keinen Einfluss auf die Zytokin - Expression in vitro
• Abbildung 47: Einfluss von MPA auf die Monozyten- und B Zellfunktion in vitro. Die intrazelluläre TNF-α Expression in CD14+ Zellen und die CD69 bzw. CD86 Expression in CD20+ Zellen bleibt auch bei steigender MPA Konzentration konstant.
• Abbildung 48: Vergleich der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von MMF. Die MPA Plasma Talspiegel zeigten eine höhere Streuung als die korrespondierenden Lymphozyten-Proliferationsraten.
• Abbildung 49: Individuelle Bestimmung der Lymphozytenproliferation jeweils zum Zeitpunkt vor der nächsten MMF Gabe. Schon nach der initialen MMF Gabe wurde die PCNA Expression gehemmt und zeigte im Vergleich zu den MPA Plasmaspiegeln nur eine mäßige Variation. Am Tag 105, zwei Tage nach der letzten MMF Gabe, hatten sich die Werte noch nicht vollständig normalisiert.
• Abbildung 50: Pharmakodynamisch – pharmakokinetische Beziehung in vivo zwischen der PCNA/SG2M Expression und den MPA Plasmaspiegeln in Cynomolgus Affen nach Aortentransplantation. Die geringe Anzahl von MPA – Konzentrationen von weniger als 2 mg/l verhinderten eine valide Bestimmung des IC50.
• Abbildung 51: Mittleres Gefäßvolumen ± SEM im Aortentransplantat. Nur in der Kontrollgruppe und nicht in der Therapiegruppe fiel das Gefäßvolumen von Tag 21 zu Tag 105 signifikant ab (p = 0,02). Die Unterschiede zwischen Kontroll- und Therapiegruppen waren zu keinem Zeitpunkt signifikant.
• Abbildung 52: Individuelle Entwicklung der Gefäßvolumina von Tag 21 bis Tag 105 in Kontroll- und MMF- Gruppe.
• Abbildung 53: Mittlere Lumenfläche im Aortentransplantat. Um Einflüsse der Anastomose zu vermeiden bezog sich die Messung auf das mittlere 1cm-Segment. In beiden Gruppen nahmen die Lumina signifikant ab.
• Abbildung 54: Individuelle Entwicklung der Gefäßflächen in der IVUS Untersuchung
• Abbildung 55: Entwicklung der mittleren Intimahyperplasie, dargestellt anhand der IVUS Messung des Intimavolumens [mm3], an den Tagen 21, 42, 63, 84 und 105 nach Aortentransplantation. Die Messungen fanden im mittleren, 1 cm langen Segment des Transplantates statt, um nicht dem Einfluss der Anastomosen zu unterliegen. In der allgemeinen Auswertung mit dem GLM Modell wiederholter Messungen zeigte sich kein Unterschied zwischen den Gruppen (p = 0,3).
• Abbildung 56: Entwicklung der mittleren Intimahyperplasie, dargestellt anhand der IVUS Messung des Intimavolumens [mm3], an den Tagen 21, 42, 63, 84 und 105 nach Aortentransplantation. Die Messungen fanden im mittleren, 1 cm langen Segment des Transplantates statt, um nicht dem Einfluss der Anastomosen zu unterliegen. In der allgemeinen Auswertung mit dem GLM Model wiederholter Messungen zeigte sich kein Unterschied zwischen den Gruppen (p = 0,3).
• Abbildung 57: Intimahyperplasie in der Kontrollgruppe an Tag 105 nach Aortentransplantation. Ohne jegliche Immunsuppression entwickelte sich eine signifikante Verdickung der Intima, die im histologischen Bild der Transplantat-Vaskulopathie im Menschen entspricht. α-Actin-Färbung (x20 – x30) zur Darstellung der glatten Muskelzellen.
• Abbildung 58: Histologie der Aortentransplantate in der MMF Behandlungsgruppe. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe erhielten die Tiere der Therapie Gruppe vom 45. Tag nach Transplantation an MMF zur Behandlung der bereits fortgeschrittenen Transplantat-Vaskulopathie (TVP). Im Gegensatz zur Kontrollgruppe entwickelte sich hier die TVP nicht in allen Tieren gleichmäßig: Während Rx1 – Rx4 die MMF Therapie gut tolerierten und eine geringere Intimahyperplasie als die Tiere in der Kontrollgruppe aufwiesen, zeigten die Tiere Rx5 und Rx6 bei schlechter MMF Verträglichkeit eine ungehinderte Entwicklung der Intimaverdickung. α-Actin- Färbung (x20 – x30) zur Darstellung der glatten Muskelzellen
• Abbildung 59: Histomorphometrische Bestimmung der mittleren Lumen-, Intima- und Mediaflächen im mittleren Segment des Aortentransplantates. Im Mittel (± SEM) erreichten die Unterschiede zwischen der Kontroll- und der MMF Gruppe für die Fläche der Intima (p = 0,078) und die Fläche der Media (p = 0,016) Signifikanzniveau. Allerdings waren die Messungen durch die postmortale elastische Schrumpfung der Gefäße im Vergleich zur IVUS-Morphometrie nur eingeschränkt verwertbar.
• Abbildung 60: Korrelation zwischen dem Stimulationsindex der „Mixed Leucocyte Reaction“ und der Intimahyperplasie gemessen anhand des Intimavolumens an Tag 105 nach Aortentransplantation
• Abbildung 61: Korrelation zwischen der mittleren MMF Dosis pro Tag und dem Ausmaß der Transplantat- Vaskulopathie.