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2  Material und Methoden

2.1 In vivo-Untersuchung am Tiermodell

2.1.1  Auswahl der Tiere und Tierhaltung

Die Untersuchungen wurden an weiblichen Mischlingshunden durchgeführt. Diese wurden über die Versuchstiereinrichtungen des Centre Médico-Chirurgical Foch in Surèsnes, Frankreich von einem Versuchstierzüchter bezogen. Das Körpergewicht lag bei 15-20 kg. Den Tieren wurden eine bis zwei Wochen zur Gewöhnung an die Haltungsbedingungen gewährt, bevor sie operiert und nachuntersucht wurden. Außerhalb der Untersuchungen und der operativen Maßnahmen wurden die Hunde in einstreulosen Einzelboxen gehalten, erhielten jedoch bis zu 10 Stunden Auslauf in einem gemeinsamen Laufraum. Betreuung und Haltungsbedingungen entsprachen den „Principles of Laboratory Animal Care“ des „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ (NIH Publication No. 80-23, überarbeitet 1985). Die Unterbringung und Versuchsdurchführung erfolgte in den Versuchstiereinrichtungen des Centre Médico-Chirurgical Foch in Surèsnes, Frankreich.

2.1.2  Graft-Material

Es wurden handelsübliche gelatinebeschichtete Polyesterprothesen (Gelsoft ® , Vascutek Limeted, Inichinnan, Schottland) mit einem Durchmesser von 6 mm verwendet.

2.1.3  Infektionserreger

In dieser Studie wurde als Infektionserreger Staphylococcus epidermidis RP-62 verwandt. Es handelt sich um ein klinisches Isolat, das vom Departement für Genetik und Mikrobiologie der Medizinischen Fakultät der Universität Genf, Schweiz bezogen wurde. Dieser Wildtyp produziert nach einer 18 stündigen Inkubation bei 37°C in einer in 1%iger-Dextrose gelösten Trypticasesojabouillion (TSB) eine mucopolysaccharidhaltige extrazelluläre Matrix (sog.„slime“). Er ist empfindlich auf Vancomycin (minimale Hemmkonzentration (MHK) 2,0mg/l) und resistent gegen Lincomycin (MHK>1024mg/l). Entsprechend der Agardiffusionsmethode nach den Empfehlungen des Französischen Komitees für Antibiogramme ist der Keim empfindlich auf Tetracyclin, Chloramphenicol, [Seite 38↓]Pristinamycin, Rifampicin, Vancomycin, Teicoplanin, Fusidinsäure, Pefloxacin und Fosfomycin, jedoch resistent gegen Penicillin G, Methicillin (heterolog), Gentamycin, Tobramycin, Kanamycin, Erythromycin, Lincomycin und Trimethoprin, unabhängig ob Sulfonamid zugesetzt ist oder nicht (Comité de l’Antibiogramme de la Socitieté Française de Microbiologie, 1994).

Bei der Identifizierung mit einem Api-Staph-System (Apisystem, La Balme-les Grottes, Frankreich) fermentierte S.epidermidis RP-62 Glucose, Fructose, Maltose, Lactose und zeigte eine positive Nitrat-Reduktase-, Voges-Proskauer-, Saccharose-, ADH- und Harnstoff- Reaktion.

Zur Präparation des Inokulum wurde S. epidermidis RP-62 auf einem Schafsblutagar (SBA) (BioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) in anaerober Atmosphäre bei 37 °C für 18 Stunden inkubiert. Dann wurden vier frisch gewachsene Kolonien in TSB mit 1%iger Dextrose für weitere 18 Stunden inkubiert. Die Anzahl der nach 18 Stunden Inkubation vorhandenen viablen Organismen wurde als Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) pro Milliliter Nährlösung bestimmt.

2.1.4  In vitro-Kolonisation der Gefäßprothesen

Die unbehandelten Dacron-Prothesen wurden vor Implantation in vitro mit dem Studienkeim beimpft. Zu diesem Zwecke wurden die Prothesen für 15 min bei Raumtemperatur in einer Suspension mit S.epidermidis RP-62 inkubiert. Anschließend wurden die Prothese mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung gespült, um nichtadhärente Keime zu entfernen.

2.1.5  Gewinnung der Aortenallografts (Spenderoperation)

Bei vier Hunden wurde zur Gewinnung der Aortenallografts die Aorta descendens und Aorta abdominalis in toto explantiert (Abb.3).


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Abb. 3 : Explantierte Hundeaorta in toto

2.1.5.1  Vorbereitung und Anästhesie

Die Narkose wurde durch intravenöse Applikation von Thiobarbital (30 mg/kg KG) eingeleitet und nach oraler Intubation mit einem Isofluran-Lachgasgemisch aus dem Narkosegerät fortgesetzt.

Anschließend wurde das Versuchstier in Rechtsseitenlage gebracht, und die linke Thoraxhälfte des Tieres rasiert. Im Operationssaal erfolgte die Hautdesinfektion und das sterile Abdecken in üblicher Weise.


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2.1.5.2  Entnahme der Aortenallografts

Im siebten Interkostalraum links wurde eine posterolaterale Thorakotomie durchgeführt. Nach Durchtrennen der Cutis und Subcutis wurden sukzessive der M. latissimus dorsi, der M. serratus anterior sowie die innere und äußere Interkostalmuskulatur durchschnitten. Danach erfolgte die Eröffnung der Pleura auf ganzer Länge. Nach Einsetzen des Rippensperrers wurde die linke Lunge mit einem Lungenspatel nach ventral komprimiertund die Pleura parietalis in Richtung der Längsachse entlang der Aorta descendens eröffnet. Nun erfolgte die Darstellung der Aorta descendens vom Aortenbogen bis zum Durchtritt durch das Zwerchfell. Die Inzision wurde zu einer medianen Laparatomie verlängert. Das große Netz und das Colon transversum wurden, nachdem sie in ein feuchtes Bauchtuch eingeschlagen wurden, nach kranial und der gesamte Dünndarm nach rechts eventriert. Durch Einlegen eines selbsthaltenden Retraktors nach Gosset wurde das Operationsfeld freigehalten. Es erfolgte nun die Ablösung der Flexura duodenujejunalis nach rechts und die Längsspaltung des Peritoneums über der Ventralfläche der Aorta. Das Zwerchfell wurde ausgehend von der Hautinzision zur Aorta hin radiär eingeschnitten. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte die intravenöse Gabe von Heparin (100IE/kg KG). Schließlich erfolgte nach Klemmung distal des Aortenbogens und oberhalb der Trifurkation die Exzision der Aorta descendens und Aorta abdominalis in toto (Abb.3).

Das gewonnene Aortensegment wurde umgehend in eine eiskalte (4°C) Konservierungs-lösung vom Typ S.C.O.T Saint-Louis (Solution de Transport et de Conservation d’Organ et de Tissue pour la Transplantation; Mircoval ® , Braun Medical S.A. Boulogne, Frankreich) gebracht. Es handelt sich um eine für die Herzkonservierung entwickelte und an das extrazelluläre Milieu angepaßte Polyethylenglycol-haltige Elektrolytlösung.


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Sie setzt sich wie folgt zusammen ( g/ l):

NaCl

6.94

KCl

0.45

CaCl2

0.26

MgCl2

0.24

EDTA

0.19

D+ Glucose

1.98

2-3 Butanedion monoxime

3.03

Polyethylenglycol 20.000

25.0

entsprechend einer molaren Konzentration der Elektrolyte (vor Zugabe von Bicarbonat):

Na++

118.0 mmol / l

 

Ka+

6.0 mmol / l

 

Mg++

1.4 mmol / l

 

Ca++

3.5 mmol / l

 

Cl-

130.0 mmol / l

 

Osmolarität

301.0 mosmol / kg H2O

pH (vor Zugabe von Bicarbonat)

3.2

pH (nach Zugabe von 25mmol Bicarbonat)

7.5


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Anschließend wurden die Allografts in einem eisgefüllten Styroporbehälter in die Gewebebank zur Weiterverarbeitung gebracht.

2.1.6  Zubereitung der Allografts

Nach einer maximalen Zeitdauer von 4 Stunden nach Explantation wurden die Aortenallografts in der Gewebebank (Banque de Tissu HP-AP, Hôptial St.Louis, Paris) steril in einer Laminar-Flow-Kabine erster Güte bearbeitet (EUGENE u. GEROTA, 1998). Das Aortenpräparat wurde hier in drei Segmente von je 6 cm Länge geteilt. Die Verarbeitung der Segmente erfolgte randomisiert entsprechend den beiden Versuchsgruppen.

Die Allografts wurden in einer großmolekularen Nährlösung Plasmagel® (Bellon, Neuilly sur Seine, Frankreich), bestehend aus:

Gelatine

30 g / l

Na+

150 mmol/l

K+

5 mmol/l

Mg2+

1.5 mmol/l

Cl-

100 mmol/l

Laktat

30 mmol/l

für 48 Stunden inkubiert.

Der Lösung war bei den Allografts der Gruppe III eine Lösung der Breitspektrumantibiotika Vancomycin 300 mg/l und Lincomycin 125 mg/l zugesetzt.

Vor der Inkubation wurden Proben des Transportmediums und der Allografts entnommen und mikrobiologisch untersucht, um eine mögliche Kontamination bei der Entnahme oder während des Transportes auszuschließen.


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2.1.7  Kryokonservierung

Die zur Kryokonservierung vorgesehenen Allografts wurden nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden unter sterilen Kautelen in einer Laminar-Flow-Kabine erster Ordnung weiterverarbeitet.

Das Einfrieren erfolgte in einer kryoprotektiven Lösung, bestehend aus einer Ringerlösung, der Polyethylenglycol (20.000 Dalton) in einer Konzentration von 30 g/l und 12.5 % DSMO (Dimethylsulfoxid) (B. Braun Medical SA, Boulogne, Frankreich) zugesetzt war. Die Kryokonservierung fand in einem computergesteuerten Gefriergerät statt, das die Temperatur linear um 1 °C pro Minute senkt bis eine Gewebetemperatur von -40 °C erreicht ist und dann 5°C pro Minute bis auf -130°C senkt (Abb.4). Anschließend wird der Allograft in der Dampfphase des flüssigen Stickstoffs bei etwa -190 °C gelagert.

Abb. 4 : Originalregistrierung des computergesteuerten Einfrierungsprozesses eines Aortenallografts. Legende: P = Programmierte Temperatur, A = Temperatur des Aortenallografts, KP = Kristallisationspunkt.

Für die Implantation wurden die kryokonservierten Allografts in einem Spezialkontainer, der eine Temperatur von mindestens -140°C garantierte, zum Operationssaal transportiert. Zum Auftauen wurde der Allograft in ein 42°C warmes thermostatgesteuertes Wasserbad gebracht. Nach vollständigem Auftauen wurde das Allograft jeweils für 1 min in 8%iger, [Seite 44↓]4%iger und 2%iger DMSO-Lösung und schließlich in physiologischer Kochsalzlösung gespült, um das DMSO, welches ab einer Temperatur von 10°C zytotoxisch wirkt, aus dem Gewebe herauszuwaschen. In keinem Falle wurden Gewebsfrakturen beobachtet.

2.1.8  Infrarenaler Bauchaortenersatz

Bei 23 Mischlingshunden wurde ein infrarenaler Bauchaortenersatz in der auch klinisch angewandten Standardtechnik durchgeführt.

2.1.8.1  Vorbereitung und Anästhesie

Der infrarenale Bauchaortenersatz wurde ebenfalls, wie unter 2.1.5.1 ausgeführt, in oraler Intubationsnarkose durchführt. Der Hydratationszustand des Tieres wurde während der Operation durch die intravenöse Gabe von Ringer-Lactat-Lösung (15ml/kgKG/h) aufrechterhalten.

Das Versuchstier wurde in Rückenlage gebracht, und die Bauchseite des Tieres rasiert. Im Operationssaal erfolgte die Hautdesinfektion und das sterile Abdecken in üblicher Weise.

2.1.8.2  Operation

Nach medianer Laparatomie wurden das große Netz und der gesamte Dünndarm nach rechts eventriert und in ein feuchtes Bauchtuch eingeschlagen. Durch Einlegen eines selbsthaltenden Retraktors nach Gosset wurde das Operationsfeld freigehalten. Es erfolgte die Ablösung der Flexura duodenujejunalis nach rechts und die Längsspaltung des Peritoneums über der Ventralfläche der Aorta in Richtung auf die Trifurkation. Nun erfolgte die komplette Darstellung der infrarenalen Aorta: nach kranial bis zur kreuzenden V. renalis sinistra nach kaudal bis zur Trifurkation. Nach Heparingabe (100 IE/ kgKG) erfolgte nun das Klemmen der Aorta unterhalb der Nierenarterien und distal unmittelbar oberhalb der Trifurkation. Die A. mesenterica inferior wurde ligiert. Nach Durchtrennen der infrarenalen Aorta und Ligatur anastomosennaher Lumbalgefäße erfolgte die Insertion einer 5cm langen und 6mm im Durchmesser betragenden Gefäßprothese (Gelsoft ® ; Vascutek Limeted, Inchinnan, Schottland). Vor der Implantation war die Prothese wie in 2.1.4. in vitro mit S. epidermidis RP-62 kolonialisiert worden. Die End-zu-End-[Seite 45↓]Anastomose wurde an der Hinterwand beginnend mit einer überwendlichen 6-0 Prolene-Naht (Ethicon ® , Neuilly sur Seine, Frankreich) fortlaufend durchgeführt (Abb.5).

Abb. 5 Fertigung der distalen Anastomose.

Nach Fertigstellung der Anastomose wurde die Gefäßprothese mit einer geraden Gefäßklemme abgeklemmt, und durch Freigabe des proximalen Blutflusses die Nahtdichtigkeit überprüft. Die distale Anastomose wurde in gleicher Weise durchgeführt.


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Abb. 6 : Gefäßprothese in situ.

Nach Überprüfen des Blutflusses und der Bluttrockenheit erfolgte der Verschluß des Peritoneums über der Prothese mit 6-0 Prolene-Naht (Abb.6). Abschließend erfolgte der Wundverschluß in den anatomischen Schichten mit Einzelknopfnähten.

Nach einer Woche wurden die Versuchstiere reoperiert. Über denselben Zugang erfolgte unter sterilen Bedingungen die Freilegung der Implantate. Nach Kontrolle der proximalen und distalen Aorta erfolgte die Beschreibung und Protokollierung der makroskopisch-anatomischen Veränderungen. Anschließend wurde die Prothese komplett unter Mitnahme von jeweils ca.5 mm nativen Aortengewebes im Bereich der Anastomosen exzidiert, und ein vorsichtiges Débridement des Retroperitoneums durchgeführt. Entsprechend der Randomisierung erfolgte bei den Versuchstieren der Versuchsgruppe I (Kontrollgruppe) die Implantation einer sterilen Polyesterprothese, bei den Versuchtieren der Versuchsgruppe II die Implantation eines ohne Antibiotikazusatz kryokonservierten Aortenallografts und in Versuchsgruppe III die Implantation eines mit Antibiotika behandelten Aortenallograft (Abb. 7). In allen Gruppen betrug die Länge der implantierten Grafts 6 cm. Die Anastomosierung wurde wie bei der Primäroperation mit einer [Seite 47↓]überwendlichen 6-0 Prolene-Naht fortlaufend durchgeführt. Der Verschluß des Peritoneums und der Wunde erfolgten wie bei der Primäroperation.

Abb. 7 : Kryokonserviertes Aortenallograft in situ.

2.1.9  Beschreibung der makroskopisch-anatomischen Veränderungen

Bei der Reoperation nach einer Woche - sowie am Versuchsende - wurden die makroskopisch-anatomischen Veränderungen beschrieben und protokolliert, namentlich das Vorhandensein entzündlicher Veränderungen des Perigraftgewebes, das Vorhandensein von Perigraftflüssigkeit und Abzeßhöhlen, Fehlen der vollständigen Graftinkorporation, Vorhandensein von Anastomosenrupturen oder falscher Aneurysmen. Falsche Aneurysmen wurden als exzentrischen Dilatation der Aorta definiert, die sich als Folge eines Gefäßwanddefektes entwickelten (VOLLMAR, 1996).

2.1.10  Histologische Beschreibungen

Bei der Explantation der Prothesen und Allografts wurden Gewebeproben des Perigraftgewebes sowie der proximalen und distalen Anastomosen entnommen. Nach Fixierung in einer 10%igen gepufferten Formollösung wurden die Proben in Paraffin eingebettet, geschnitten und einer Hematoxylin-Eosin-Färbung unterzogen. Als histologische Parameter einer Inflammation wurden die Dichte der zellulären Infiltration, die Zahl polymorphkerniger Zellen sowie die Abwesenheit oder Präsenz eitriger Nekrosen herangezogen. Eine Aortitis wurde definiert als eine entzündliche Infiltration der Media aortae mit polymorphkernige Zellen.

2.1.11  Mirkobiologische Untersuchungen

Alle eingesetzten Gefäßprothesen und Aortenallografts wurden einer quantitativen mikrobiologischen Untersuchung zugeführt. Zu diesem Zwecke wurden die explantierten Prothesen oder Allografts in zwei gleiche Teile geschnitten. Die Messung der Länge und des Gewichtes der Präparate erlaubte eine Bestimmung der endoluminalen Oberfläche eines jeden Fragmentes. Sodann wurden die Fragmente für 2 Minuten unter Zugabe von 2 ml physiologischer Kochsalzlösung in einem Handmörser bearbeitet. Die gewonnene Effluenz wurde in eine adäquate Zehner-Verdünnungsreihe aufgeteilt. Anschließend wurden Anteile von je 0.1ml auf Schafsblutagar (SBA) bei 37°C für 48 Stunden kultiviert. Der Grad der Kolonialisierung wurde in koloniebildenden Einheiten (KBE) pro cm2 des Graftmaterials angegeben.

Venenblut, das unmittelbar vor der Explantation der Prothesen oder Allografts unter [Seite 49↓]sterilen Kautelen aus der Vena femoralis entnommen worden war, wurde in einer Bluttkulturflasche (Hemoline Performance Diphasique, BioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Das Perigraftgewebe wurde unter Zugabe von 2 ml physiologischer Kochsalzlösung für 2 Minuten in einem Handmörser bearbeitet und auf SBA bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Gewebeproben von Lunge, Milz, Leber und Nieren sowie die Perigraftflüssigkeit wurden in einem gepufferten Dextrose-Bouillon (Buffered Dextrose Broth, Sanofi Diagnostics Pasteur, Marne la Coquette, Frankreich) für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Subkulturen einer jeden Bouillon wurden auf SBA bei 37°C ebenfalls für 48 Stunden inkubiert und anschließend analysiert. Im Falle des Wachstums von grampositiven Kokken erfolgte deren Differenzierung mit dem artspezifischen Apisystem (Apisystem, La Balme-les-Grottes, Frankreich) sowie die Bestimmung des Resistogramms mittels der Agardiffusionsmethode.

2.1.12  Experimentelles Protokoll

Allen Versuchstieren wurde eine gelatinebeschichtete Polyesterprothese, die zuvor in vitro mit S. epidermidis R-62 kontaminiert wurde, in infrarenaler Aortenposition implantiert. Nach einer Woche erfolgte die Reoperation und Randomisierung in drei Versuchsgruppen. Die makroskopischen Veränderungen wurden beschrieben und protokolliert. Anschließend wurden die Prothesen komplett exzidiert, einschließlich von 5 mm Aortengewebe der proximalen und distalen Aorta. Die Aortenanteile der Anastomosen sowie Gewebeproben des Perigraftgewebes wurden in 10% Formollösung verbracht und anschließend nach entsprechender Verarbeitung histologisch untersucht. Die explantierten Prothesen, Proben der Perigraftflüssigkeit und des Perigraftgewebes wurden unter sterilen Konditionen entnommen und umgehend mikrobiologisch untersucht. Die mikrobiologischen Untersuchungen der Prothesen erfolgte quantitativ, die der Perigraftflüssigkeit und des Perigraftgewebes qualitativ.

Entsprechend der Randomisierung erfolgte bei den Versuchstieren der Versuchsgruppe I (Kontrollgruppe) die Implantation einer sterilen Polyesterprothese, bei den Versuchtieren der Versuchsgruppe II die Implantation eines ohne Antibiotikazusatz kryokonservierten Aortenallografts und in Versuchsgruppe III die Implantation eines mit Antibiotika behandelten Aortenallograft. Nach weiteren drei Wochen wurden alle Versuchstiere unter Gabe von Thiopental (80mg/kgKG) und 40mval Kalium tierschutzgerecht getötet. Die [Seite 50↓]makroskopischen Veränderungen wurden beschrieben und protokolliert (s.2.1.9.). Anschließend wurden die Prothesen bzw. die Allografts komplett exzidiert, einschließlich eines 5 mm breiten Segmentes der proximalen und distalen Aorta. Die Aortenanteile der Anastomosen sowie Gewebeproben des Perigraftgewebes wurden in 10% Formollösung verbracht und anschließend nach entsprechender Verarbeitung histologisch untersucht. Die explantierten Prothesen bzw. Allografts, Proben der Perigraftflüssigkeit, des Perigraftgewebes, der Leber, den Nieren, der Milz und den Lunge wurden unter sterilen Konditionen entnommen und umgehend mikrobiologisch untersucht. Darüber hinaus wurden vor dem Einsetzen des Herzstillstandes unter sterilen Kautelen 10ml Blut aus der Vena femoralis für kulturellen Untersuchungen entnommen. Die mikrobiologischen Untersuchungen der Prothesen erfolgte quantitativ, die der Perigraftflüssigkeit, des Venenblutes und der Gewebeproben qualitativ.

2.1.13  Statistische Analyse

Die Ergebnisse der makroskopischen Beurteilung (falsche Aneurysmen, Anastomosenruptur, Inflammation des Perigraftgewebes) (Tabelle I) und alle Resultate der mikroskopischen Untersuchung des Perigraftgewebes (Tabelle II) und der Anastomosen wurden summiert und in jeder Versuchsgruppe als Mean Score der initialen Prothesen und der Folgeprothese angegeben.

Die Daten dieser Untersuchung wurden nach einem Chi2-Test und einem einpaarigen exakten Fisher-Test für kleine Gruppen oder Mann-Whitney-Wilcoxon Test ausgewertet. Das Signifikanzniveau wurde bei einem p-Wert < oder = 0.05 gewählt.


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2.2  In vitro-Untersuchungen

2.2.1  Gewinnung der Allografts

Die invitro-Untersuchungen wurden an Schweineaorten durchgeführt. Diese wurden nach der Beendigung von Akutversuchen und nach tierschutzgerechter Tötung im Forschungshaus des Universitätsklinikums Charité-Campus Virchow gewonnen. Die chirurgische Entnahme-technik entsprach der in den invivo-Versuchen (Kap. 2.1.5).

2.2.2  Zubereitung der Allografts

Nach der Entnahme wurden die Allografts in Fragmente von 2 cm Länge geschnitten und für 48 Stunden in einer Konservierungslösung (Gelafundin®), die entsprechend den in vivo-Untersuchungen Vancomycin in einer Konzentration von 300 mg/l enthielt, inkubiert.

2.2.3  Kryokonservierung

Nach Beendigung der Inkubation wurden die Allografts in eine mit 10% DMSO angereicherte Lösung (Medium 199 EARLE mit 20 mM HEPES (Cat. No. F 0665) der Firma Biochrom KG) verbracht und computergestützt kryokonserviert.

2.2.4  Versuchsprotokoll der Vancomycinfreisetzung aus den Aortenallografts

Anschließend wurden die Allografts in flüssigem Stickstoff gelagert in das Institut für Klinische Chemie und Biochemie des Universitätsklinikums Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin transportiert, wo sie bei –80°C gelagert wurden.

Vor der quantitativen Bestimmung wurden die Allografts in einem 42°C warmen thermostatgesteuerten Wasserbad aufgetaut. Nach vollständigem Auftauen wurden die Allograftfragmente jeweils für eine Minute in je 50 ml 8%iger, 4%iger und 2%iger DMSO-Lösung und schließlich in physiologischer Kochsalzlösung gespült. Aus der Konservierungslösung sowie aus den vier Waschlösungen wurden Proben entnommen, in denen mittels Fluorescence Polarisations Immunoassay (FPIA) die jeweiligen Vancomycinkonzentrationen bestimmt wurden.

Zur Bestimmung der Ausgangskonzentration wurde ein Allograftfragment entnommen und wie unter 2.2.4.1 zu Bestimmung der Vancomycinkonzentration weiterverarbeitet.


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Die anderen Fragmente wurden in 200 ml Humanalbumin-Lösung 5% bei 37°C inkubiert und mit einem Heidolph-Magnet-Rührer bei 250 U/min gerührt.

2.2.4.1  Verarbeitung der Allograftfragmente zur Vancomycin-Bestimmung

Hierzu wurde das Aortenfragment für 5 Minuten in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend unter Verwendung eines Stahlbehälters und eines Stahlkolbens zerkleinert. Das Aortenfragment wurde gewogen. Nach Überführung in ein Dragee-Röhrchen wurden 10 Teile 0.1 M H3PO4–Lösung hinzugefügt und 24 Std. in einem rotierenden Heidolph-Mischer extrahiert. Anschließend wurde der Extrakt für 10 Minuten bei 3600 Umdrehungen/min bei 10°C zentrifugiert. Ein Teil des klaren Überstandes wurde mit PIC B7 (Heptansulfonsäure)-Lösung im Verhältnis 1:1 versetzt.

2.2.4.2  High-performance liquid Chromatographie (HPLC)

Die Konzentration von Vancomycin in den Aortenallografts wurden mittels High-performance liquid Chromatographie (HPLC) bestimmt. Das Prinzip der Methode besteht in einer Fällung der Serumproteine mit Trichloressigsäure, gefolgt von der Extraktion des Fällungsmittels mit Chloroform. Der wäßrige Überstand wurde an einer Reversed-Phase Säule (Nucleosil 5C18) getrennt. Die Licht-Absorption des Eluates wurde bei 280 nm registriert. Die Präzision des HPLC-Assays von Vancomycin lag bei 4% bei 117 mg/l (Variationskoeffizient) (BOECKH et al., 1988). Die Nachweisgrenze lag bei 0.8 μg/ml. Die Wiederfindung betrug 96 bis 106%.

2.2.4.3  Fluorescence Polarisations Immunoassay (FPIA)

Die Konzentration von Vancomycin in den Lösungen wurden mittels des Fluorescence Polarisations Immunoassay in der von Schwenzer beschriebenen Technik unter Verwendung des TDx-Systems (Abbott, Wiesbaden) nachgewiesen (SCHWENZER et al., 1983). Der Variationskoeffizient dieser Methode wurde mit 4.3 bis 7.2% ermittelt (BOECKH et al., 1988). Die Wiederfindung betrug 93 bis 107%.


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2.2.4.4  Versuchsprotokolle der Vancomycindesorption

Im Protokoll 1 wurde in 24 stündlichen Abständen über 10 Tage je ein Segment entnommen und wie unter 2.2.4.1. zu Bestimmung der Vancomycinkonzentration weiterverarbeitet.

In Protokoll 2 wurden ebenfalls in 24 stündlichen Abständen die Aortenfragmente entnommen und die Humanalbuminlösung komplett ausgetauscht. In beiden Gruppen wurden parallel zu den Entnahmen der Aortenallografts 800μl aus der Humanalbuminlösung entnommen, und es wurde mittels FPIA die Vancomycinkonzentration bestimmt.

Nach 24, 48, 72, 96, 168, 240 Std. wurde ein Aortenfragment aus der Lösung entnommen und die Vamcomycinkonzentration bestimmt. Parallel wurde stets eine Probe der Albumin-Lösung entnommen und auch in ihr die Vancomycinkonzentration bestimmt.


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HTML-Version erstellt am:
07.10.2004