3 Ergebnisse

3.1 In vivo-Untersuchungen

3.1.1  In vitro-Kolonisierung der Polyesterprothesen

Die mediane Anzahl der vitalen Organismen im Inokulum, das zur in vitro-Kolonisierung eingesetzt wurde, betrug 8.5 x 108 KBE/ml (106-4x109). Ein signifikanter Unterschied zwischen den Versuchsgruppen lag nicht vor. Fünf Hunde verstarben vor der Reoperation. Drei verstarben infolge einer akuten infektionsbedingten Anastomosenruptur fünf bzw. sechs Tage postoperativ (Abb.8), zwei weitere in Folge einer Sepsis am dritten und vierten postoperativen Tag.

Insgesamt konnten 18 Hunde in die Studie eingeschlossen werden.

Abb. 8 : Histologie einer infektionsbedingten Anastomosenruptur 5 Tage nach Implantation einer mit S. epidermidis RP-62 infizierten Gefäßprothese ↑ ­: markiert die Ruptur * polymorphkernige Zellen in der Media aortae.


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3.1.2  Makroskopisch-anatomische Befunde

Zum Zeitpunkt der Reoperation zeigten alle 18 initial implantierten Polyesterprothesen und alle sechs Polyesterprothesen der Kontrollgruppe (Gruppe I) makroskopisch anatomische Zeichen einer floriden Infektion (Tabelle 6). Alle Prothesen, mit Ausnahmen einer in der Versuchsgruppe II, waren durchgängig. Das Retroperitoneum sowie die anliegenden Strukturen bei allen 24 Polyesterprothesen wiesen die Zeichen einer akuten Inflammation auf. Keine dieser Prothesen war inkorporiert. Alle Prothesen waren von einer bis in die Anastomosenbereiche hineinreichenden Abszeßhöhle, die ein eitriges Exsudat enthielt, umgeben. Insgesamt fanden sich 17 Pseudoaneurysmen.

In der Kontrollgruppe verstarben zwei Versuchstiere vor dem geplanten Versuchsende, einer an den Folgen einer Sepsis und ein anderer an den Folgen einer akuten infektionsbedingten Aortenruptur. Hingegen waren alle mit Aortenallografts behandelten Tiere am Versuchsende klinisch gesund. 50% der unbehandelten Aortenallografts waren zum Zeitpunkt der Explantation nicht inkorporiert und zeigten eine deutliche Perigraftinflammation (Abb. 9). Alle mit Antibiotika behandelten Allografts waren makroskopisch komplett eingeheilt. Wundheilungsstörungen traten nicht auf.


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Tabelle 6 : Makroskopische Befunde der Gefäßprothesen und Allografts

 

Patencyrate

Pseudo-aneurysmen

Anastomosen-ruptur

Perigraft-Inflammation

Graft-Inkorporation

Mean Score*

Gruppe I

Initiale Prothese

6/6

6/6

0/6

6/6

0/6

12/18

Kontrollprothese

6/6

4/6

1/6

6/6

0/6

11/18 (NS)

Gruppe II

Initiale Prothese

5/6

3/6

0/6

6/6

0/6

9/18

Unbehandeltes Allograft

5/6

0/6 (NS)

0/6

3/6 (NS)

3/6 (NS)

3/18(p <0.04)

Gruppe III

Initiale Prothese

6/6

4/6

0/6

6/6

0/6

10/18

AB-behandeltes Allograft

6/6

0/6 (p< 0.03)

0/6

0/6 (p<0.01)

6/6 (p<0.01)

0/18 (p<0.002)

*Mean score = Pseudoaneurysmen + Anastomosenruptur + Perigraftinflammation Initiale Prothese: mit S.epidermidis RP-62 beimpfte Polyesterprothese ; Kontrollprothese: unbehandelte Polyesterprothese; Unbehandeltes Allograft: ohne Zusatz von Antibiotika kryokonserviertes Allograft; AB-behandeltes Allograft: mit Antibiotika behandeltes Allograft; NS: nicht signifikant. p–Werte gelten für Allograft versus initiale Prothese.


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Abb. 9 : Infiziertes Aortenallograft der Versuchsgruppe II


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3.1.3  Mikroskopische Befunde

Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigte sich im Perigraftgewebe aller initial implantierten Prothesen eine inflammatorische Infiltration von Lymphozyten und Makrophagen (Abb. 10). Polmorphkernige Zelle fanden sich in 72 % der Proben, eine eitrige Nekrose in 17% (Tabelle 7). Im Perigraftgewebe der unbehandelten Allografts fand sich eine enzündliche Infiltration in vier von sechs Proben. In drei Fällen fanden sich polymorphkernige Zellen. Makroskopisch waren diese Prothesen nicht inkorporiert. In der Gruppe der mit Antibiotika behandelten Allografts (Gruppe III) zeigte sich in zwei von sechs Proben eine entzündliche Infiltration. Polymorphkernige Zellen fanden sich in einer von ihnen. Bei den anderen Versuchsproben gab es keine histologischen Entzündungszeichen (Abb. 11). Nach drei Wochen blieb die Gesamtanzahl der eitrigen Nekrosen in den Versuchsgruppen verglichen mit den initialen Prothesen unverändert (p= NS).

Tabelle 7 : Mikroskopische Befunde des Perigraftgewebes der Polyesterprothesen und der Allografts

 

Entzündliche Infiltration

Polymorphkernige Zellen

Eitrige Nekrose

Mean score*

 

Gruppe I

Initiale Prothese

6/6

4/6

2/6

12/18

 

Kontrollprothese

6/6

5/6 (NS)

2/6

13/18 (NS)

 

Gruppe II

Initiale Prothese

6/6

4/6

0/6

10/18

 

Unbehandeltes Allograft

4/6

3/6 (NS)

2/6 (NS)

9/18 (NS)

 

Gruppe III

Initiale Prothese

6/6

5/6

1/6

12/18

 

AB-behandeltes Allograft

2/6 (p < 0.03)

1/6 (p < 0.05)

1/6

4/18 (p < 0.01)

 

*Mean score = Entzündliche Infiltration + Polymorphkernige Zellen + Eitrige Nekrose. Initiale Prothese: mit S.epidermidis RP-62 beimpfte Polyesterprothese; Kontrollprothese: unbehandelte Polyesterprothese; Unbehandeltes Allograft: ohne Zusatz von Antibiotika kryokonserviertes Allograft; AB-behandeltes Allograft: mit Antibiotika behandeltes Allograft; NS: nicht signifikant. p–Werte gelten für Allograft versus initiale Prothese.


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Abb. 10 : Perigraftgewebe eines Hundes 7 Tage nach Implantation einer infizierten gelatinebeschichteten Polyesterprothese. Es findet sich eine inflammatorische Infiltration des Gewebes mit polymorphkernigen Zellen. Hematoxylin-Eosin, x80

Abb. 11 : Perigraftgewebe eines Hundes 21 Tage nach Implantation eines mit Antibiotika behandelten Allografts. Es findet sich fibrotisches Gewebe ohne Hinweis auf eine Inflammation, Hematoxylin-Eosin, x80.


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Die Adventitia im Anastomosenbereich der initial implantierten Prothesen zeigte in 83% der Fälle eine entzündliche Infiltration (Abb. 12). In 61% von ihnen enthielt dieses Infiltrat polymorphkernige Zellen (Tabelle 8). In den Gruppen II und III betrug die Inzidenz der entzündlichen Infiltration im Anastomosenbereich 67% (8 von 12 in jeder Gruppe). Polymorphkernige Zellen fanden sich dabei in 37.5% (3 von 12 in jeder Gruppe). Die anderen explantierten Allografts zeigten histologisch keine Hinweise auf eine Entzündung (Abb. 13).

Tabelle 8 : Mikroskopische Befunde im Anastomosenbereich der Polyesterprothesen und der Allografts

 

Perianastomotische Entzündliche Infiltration

Polymorph-kernige Zellen

Eitrige Nekrose

Aortitis

Mean score*

 

Gruppe I

Initiale Prothese

10/12

7/12

2/12

1/12

20/48

 

Kontrollprothese

10/12

8/12

4/12

3/12

25/48 (NS)

 

Gruppe II

Initiale Prothese

10/12

7/12

1/12

0/12

18/48

 

Unbehandeltes Allograft

8/12

3/12 (NS)

1/12

2/12 (NS)

14/48 (NS)

 

Gruppe III

Initiale Prothese

10/12

8/12

3/12

1/12

22/48

 

AB-behandeltes Allograft

8/12

3/12 (p < 0.05)

0/12 (NS)

0/12 (NS)

11/48 (p < 0.01)

 

*Mean score = Perianastomotische Entzündliche Infiltration + Polymorphkernige Zellen + Eitrige Nekrose + Aortitis.
Initiale Prothese: mit S.epidermidis RP-62 beimpfte Polyesterprothese; Kontrollprothese: unbehandelte Polyesterprothese; Unbehandeltes Allograft: ohne Zusatz von Antibiotika kryokonserviertes Allograft; AB-behandeltes Allograft: mit Antibiotika behandeltes Allograft; NS: nicht signifikant.

p –Werte gelten für Allograft versus initiale Prothese.

 


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Abb. 12 : Perianastomotisches Gewebe eines Hundes sieben Tage nach Implantation einer infizierten Polyesterprothese. Es finden sich eitrige Nekrosen (*) im Bereich der perianastomotischen Fibrose, M= Media aortae, Hematoxylin-Eosin, x80.

Abb. 13 : Perianastomotisches Gewebe eines Hundes 21 Tage nach Implantation eines mit Antibiotika behandelten Allografts. Es zeigen sich weder in der Adventitia noch im umgebenden fibrotischen Gewebe (*) Hinweise auf eine Inflammation, M= Media aortae, Hematoxylin-Eosin, x80.


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3.1.4  Bakteriologische Untersuchungen

Die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchungen sind in Tabelle 9 wiedergegeben. Bei der Reoperation waren alle initial implantierten Gefäßprothesen mit S. epidermidis RP-62 infiziert. Hinsichtlich der Bakteriendichte auf den Gefäßprothesen bestand in den verschiedenen Versuchsgruppen kein signifikanter Unterschied (p = NS). In der Gruppe I waren zum Versuchsende alle implantierten Prothesen infiziert. In der Gruppe II wurde der Studienkeim auf einer Gefäßprothese gefunden (Tabelle 9). In dieser Versuchsgruppe fand sich bei zwei weiteren Prothesen ein Bakterienwachstum. Diese waren auch makroskopisch nicht inkorporiert. In einem Falle fanden sich β-hämolysierende Streptokokken der Serogruppe C in einer Konzentration von 3.5 x 104 KBE/cm2, bei einer weiteren Prothese Staphylococcus chromogenes in einer Konzentration von 3.34 x 105 KBE/cm2. Während die Kulturen der mit Antibiotika behandelten Allografts der Gruppe III steril waren, waren alle Prothesen der Kontrollgruppe (Gruppe I) mit S.epidermidis RP-62 infiziert (p <0.01 im Vergleich zur Gruppe III). In der Gruppe III wurde kein Begleitwachstum von anderen Keimen gefunden.

Die Perigraftflüssigkeit und das Perigraftgewebe, die während der Reoperation und am Versuchsende gewonnen wurden, waren in der Kontrollgruppe in 50%, respektive in 25% positiv für den Studienkeim, während die bei den Allografts gewonnen Proben komplett steril waren. Bei diesen Untersuchungen waren alle Organproben und Blutkulturen steril. Während der gesamten Versuchsdauer wurde bei dem Studienkeim zu keinem Zeitpunkt eine Änderung seines Resistenzspektrums gefunden.


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Tabelle 9 : Mikrobiologische Ergebnisse der durch S. epidermidis RP-62 verursachten Protheseninfektionen

 

Anzahl der positiven Kulturen

/Anzahl der Untersuchungen

Viable Keime

Median (Range) (KBE/ cm2)

Prothesen

Fragmente

Gruppe I

Initiale Prothese

6/6

12/12

7.9 × 104 (6 × 103 - 1 × 106)

Kontrollprothese

6/6

12/12

9.8 × 104 (1.6 × 104 - 1.1 × 106)

Gruppe II

Initiale Prothese

6/6

12/12

2.03 × 104 (1.94 × 103 - 4.61 × 105)

Unbehandeltes Allograft

1/6*

2/12†

5.54 × 104

Gruppe III

Initiale Prothese

6/6

12/12

3.32 × 103 (1.03 × 103 - 2.95 × 104)

AB-behandeltes Allograft

0/6*

0/12‡

0

___________________________________________________________________________________
Initiale Prothese = mit S.epidermidis RP-62 beimpfte Polyesterprothese; Kontrollprothese = unbehandelte Polyesterprothese; Unbehandeltes Allograft: ohne Zusatz von Antibiotika kryokonserviertes Allograft; AB-behandeltes Allograft: Antibiotika behandeltes Allograft;

*p < 0.01 Allograft versus initiale und Kontrollprothese.
p < 0.001 Allograft versus initiale und Kontrollprothese.
p <0.0001 Allograft versus initiale und Kontrollprothese.

 


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3.2  In vitro-Untersuchungen

Im Rahmen der in vitro-Untersuchungen wurden die Vancomycinspiegel in der Kryokonservierungslösung, in den Waschlösungen, in den Aortenallografts und den Inkubationsmedien mittels HPLC oder FPI ermittelt.

3.2.1  Vancomycinkonzentration in der Kryokonservierungslösung

Die mittlere Vancomycinkonzentration in den Kryokonservierungslösungen betrug 33.4 mg/l (+/-5.3mg/l). Bezogen auf die Gesamtwiederfindung von Vancomycin in den Aortenallografts, den Konservierungs-,Wasch- und Humanalbuminlösungen entsprach dies einem aus den Allografts freigesetzten Anteil von 39.5%.

3.2.2  Vancomycinkonzentration in den Waschlösungen

Durch das Auswaschen von DMSO aus den Aortenallografts kam es zu einer Freisetzung von Vancomycin aus dem Gewebe. Bezogen auf die Gesamtwiederfindung von Vancomycin entsprach dies einem prozentualem Freisetzungsanteil von 3.6% für die Waschlösung mit 8%DMSO, 2.4% mit 4% DMSO, 1.5% mit 2% DMSO, und 1.6% für NaCl 0.9%.

3.2.3  Vancomycinkonzentration in den porcinen Aortenallografts

Nach der Kryokonservierung, dem Auftauen und Waschen verbleiben im Mittel 51.4 % des Vancomycins in den Aortenallografts. Dies entspricht einer mittleren Vancomycinkonzentration von 186.5 mg/kg.

3.2.4  Freisetzung von Vancomycin aus den porcinen Aortenallografts

In Protokoll 1 ist nach 24 Stunden ca. die Hälfte der Vancomycingehaltes der Allografts in die Humanalbuminlösung freigesetzt. Bei einer mittleren Vancomycinkonzentration von 13.7 mg/l (+/-0.68) in der Humanalbuminlösung zeigte sich eine Sättigungskinetik. Die mittlere Vancomycinkonzentration in den Allograftfragmenten betrug 84.4 mg/kg (+/-19.9 mg/kg), ohne signifikanten Abfall über die Zeit (p=NS) (Abb.14).


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Abb. 14 : Desorption von Vancomycin aus porcinen Aortenallografts nach Versuchsprotokoll 1 in 5%-Humanalbumin (37°C, pH 7.4). Aufgetragen sind die Gewebekonzentrationen und die Konzentrationen in der Inkubationslösung.

Die Desorption von Vancomyin aus den porcinen Aortenallografts gemäß Versuchsprotokoll 2 ist in Abb.15 wiedergegeben

In Versuch 2 kam es mit jedem Wechsel der Inkubationslösung zu einem exponentiellen Abfall der Vancomycinkonzentration in den Aortenallografts. Nach mehr als 72 Stunden, entsprechend einem dreimaligem Wechsel der Inkubationslösung, kam es zu keiner weiteren Freisetzung von Vancomycin. Nach 96 Stunden ließ sich in der Humanalbuminlösung kein Vancomycin nachweisen. Zu diesem Zeitpunkt betrug die mittlere Vancomycinkonzentration in den Allograftfragmenten 21.4 mg/kg.


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Abb. 15 : Desorption von Vancomycin aus porcinen Aortenallografts nach Versuchsprotokoll 2 in 5%-Humanalbumin (37°C, pH 7.4). Aufgetragen sind die Gewebekonzentrationen gemittelt aus Doppelbestimmungen und die Konzentrationen in den Inkubationslösungen.


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HTML-Version erstellt am:
07.10.2004