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I.  Ausführliche Zusammenfassung der zugrundeliegenden Publikationen

I.1. Zusammenfassung

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Identifikation, Klonierung und funktionelle Cha­rakterisierung neuer humaner Importin α Isoformen. Die zentrale Bedeutung der Transloka­tion diverser Proteine aus dem Zytoplasma in den Zellkern für das weitere Schicksal der Zelle ist intensiv untersucht. Aktivierte Transkriptionsfaktoren, aber auch andere Proteine wie Kernrezeptoren, Histone, ribosomale und virale Proteine können erst im Zellkern ihre wichti­gen Funktionen wie z. B. die Regulation der Expression unterschiedlicher Gene erfüllen. Die Faktoren, welche den eigentlichen Transport in den Zellkern steuern, ist jedoch erst seit kur­zem Gegenstand der Forschung. Der „klassische“ Proteinimport in den Zellkern erfolgt in Abhängigkeit der Importine α und β. Während jedoch nur ein Importin β existiert, waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit bereits zwei humane α-Importine bekannt. Datenbankanaly­sen ergaben Hinweise auf die Existenz weiterer humaner Isoformen. Im ersten Teil der Arbeit konnten vier neue humane α-Importine identifi­ziert, ihre komplette kodierende DNA kloniert und sequenziert werden. Anhand ihrer Primär­struktur konnten die sechs humanen α-Importine in drei Subfamilien unterteilt werden. Die Frage, warum so viele humane α-Importine existie­ren, während es in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nur eine Isoform gibt, stand im Zen­trum der weiteren Untersuchungen. Es sollte die Hypo­these getestet werden, dass sich die verschiedenen humanen α-Importine in ihren spezifischen Funktionen unterscheiden und sich nicht gegenseitig ersetzen können. Analysen der Expres­sion mittels Northern blot auf RNA-Ebene sowie im Western blot auf Proteinebene mittels selbst generierter polyklonaler, affini­tätsgereinigter Antikörper zeigten differentielle Expres­sionsmuster der verschiedenen α-Importine. Dabei ließen sich alle Isoformen außer dem testisspezifischen Importin α6 in zahl­reichen Geweben und Zellen nachweisen, wobei ihre relativen Expressionsstärken zum Teil deutlich untereinander differierten. Mittels eines in vitro Kernimport-Versuchssystems konnte der Nachweis erbracht werden, dass alle ubiquitär exprimierten humanen α-Importine tat­sächlich als Kernimportfaktoren für diverse Proteine fungieren können. Mehrere neue Sub­strate wurden hierbei für den klassischen Importweg entdeckt. Besonders intensiv untersucht wurden die Mechanismen, welche die Translokation der verschiedenen Untereinheiten des Hefe-NAC-Komplexes in den Zellkern regulieren. Neben dem Nachweis der tatsächlichen Kernlokalisation von NAC konnte nachgewiesen werden, dass die unterschiedlichen NAC-Untereinheiten sowohl via den klassischen Importin α/β-abhängigen Importweg als auch über zwei andere Importin β-verwandte Importfaktoren aus dem Zytoplasma in den Zellkern [Seite 5↓] translozieren können. Die Region, in der sich die hierfür verantwortliche Signalsequenz (nuclear localization signal, NLS) befindet, konnte ebenfalls bestimmt werden. Neben der differierenden Zell- und Gewebeverteilung konnte vor allem durch den Nachweis unter­schiedlicher Substratspezifitäten in vitro ein weiterer wichtiger Hinweis für die postulierten spezifischen Funktionen der α-Importine in vivo gefunden werden. Interessanterweise fanden sich Hinweise auf substratspezifische Unterschiede der humanen α-Importine sowohl für zelleigene Proteine (z.B. RCC1, RanBP3) als auch für virale Proteine (adenovirales E1A). Der Nachweis von Unterschieden in der Expressionsregulation der α-Importine in verschiede­nen Modellen von Zellproliferation und Zelldifferenzierung wurde als ein weiteres Indiz für spezifische Funktionen der verschiedenen Isoformen in vivo gewertet. Erste Unter­suchungen bzgl. möglicher pathophysiologischer Rollen der α-Importine wurden an zwei un­terschiedli­chen diabetischen Rattenmodellen durchgeführt. Durch Immunfluoreszenz- und Western blot-Analysen konnte ein deutlicher Anstieg insbesondere der Importin α7-Expres­sion in Nieren diabetischer Ratten nachgewiesen werden. Mit Hilfe der neu beschriebenen RNA-Interferenz Methode konnten schließlich die einzelnen α-Importine selektiv in kulti­vierten HeLa-Zellen in ihrem Expressionsniveau stark reduziert werden. Die Inhibition der Expression von Impor­tin α3, α5 und α7 sowie der Positivkontrolle Importin β führte zu je­weils ausgeprägten Inhibi­tionen der zellulären Proliferation. Die Inhibition von Importin α1 hatte dagegen nur einen geringen, die Inibition von Importin α4 überhaupt keinen inhibitori­schen Effekt auf das Wachstum der analysierten Zellen. Damit konnte zum ersten Mal der Nachweis erbracht wer­den, dass die humanen α-Importine in lebenden Zellen essentielle Funktionen innehaben und sich trotz ihrer teilweise sehr hohen Homologie nicht vollständig gegenseitig ersetzen können. Weitere Untersuchungen, durch welche die Ursachen der unter­schiedlichen Substratspezifitä­ten genauer analysiert werden sollen, Untersuchungen über die Rolle der humanen α-Impor­tine bei der Pathogenese von Erkrankungen sowie über die Rolle der α-Importine in Gesamt­organismen („knock-out Mäuse“) sind derzeit in Arbeit.


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I.2.  Einleitung

I.2.1 Bedeutung und Mechanismen des nukleozytoplasmatischen Proteintransports

Die Trennung von nukleärem und zytoplasmatischem Kompartiment durch die Kernmembran ist das Charakteristikum eukaryoter Zellen. Diese Kompartimentierung erfordert die Existenz von Mechanismen, welche einen Stoffaustausch von Makromolekülen zwischen Nukleoplasma und Zytoplasma ermöglichen. Eine Vielzahl von Faktoren unterliegen dem nukleozytoplasmatischen Transport: Transkriptionsfaktoren, Kernrezeptoren, Histone, ribo­somale Proteine, aber auch virale Proteine translozieren aus dem Zytoplasma in den Zellkern, um dort diverse Funktionen wie z. B. die Regulation der Expression unterschiedlichster Gene auszuüben. Einige dieser Proteine, aber auch die verschiedenen transfer, ribosomalen und messenger RNAs müssen aus dem Zellkern in das Zytoplasma exportiert werden. Die Mecha­nismen, welche über extrazelluläre Stimuli via membrangebundene Rezeptoren zu einer Akti­vierung intrazellulärer Signaltransduktionskaskaden mit nachfolgender nukleärer Transloka­tion diverser Transkriptionsfaktoren und daraus resultierender Genregulation führen, sind bereits seit längerer Zeit Gegenstand intensiver zellbiologischer und medizinischer For­schung. Eine Vielzahl von wissenschaftlichen Arbeiten hat die Bedeutung von nukleären Proteinen wie NFκ B, Cyclinen, Stat- und Smad-Proteinen für die Regulation von Zellprolife­ration und -differenzierung sowie bei der Pathogenese chronisch-entzündlicher Erkrankungen unterstrichen. Demgegenüber ist die Erforschung der Faktoren, welche den nukleozytoplas­matischen Transport von Makromolekülen regulieren, ein sehr junges Forschungsgebiet, auf dem jedoch in der letzten Dekade ein explosiver Wissenszuwachs erfolgte.

1958 beschrieb L. Goldstein eine damals überraschende Beobachtung: Er transplan­tierte Zellkerne von Amöben, die radioaktiv-markierte Proteine enthielten, in Amöben mit unmarkierten Zellkernen. Bereits nach vier Stunden waren in den vormals unmarkierten Zell­kernen radioaktive Signale nachweisbar, während im Zytoplasma nur eine geringe Radioakti­vität erkennbar war. Goldstein folgerte richtig daraus, dass es eines oder mehrere nukleäre Proteine geben müsse, „die vom Zellkern in das Zytoplasma migrieren, dort kurz verweilen, um dann rasch wieder in den Nukleus zurückzukehren“ (Goldstein, 1958). Mehr als 20 Jahre später konnte erstmals eine Signalsequenz beschrieben werden, die für den Transport eines Proteins in den Zellkern essentiell ist: Eine Mutation in einer kurzen Folge basischer Ami­nosäuren des großen SV40 T Antigens verhindert dessen nukleäre Translokation. Umgekehrt führt die Fusion dieser als „klassischen“ NLS (nukleäres Lokalisationssignal) bezeichneten Signalsequenz an ein sonst zytoplasmatisches Protein zu dessen Akkumulation im Zellkern [Seite 7↓] (Kalderon et al., 1984, Lanford und Butel, 1984). Der zweite, sogenannte zweigeteilte Proto­typ einer „klassischen“ NLS wurde erstmals in dem Xenopus laevis Protein Nucleoplasmin beschrieben und besteht aus zwei kurzen basischen Sequenzen, die durch eine Folge von ca. zehn Aminosäuren voneinander getrennt sind (Robbins et al., 1991). Mittlerweile wurden auch andere „nicht-klassische“ NLS beschrieben, die sich von den klassischen NLS deutlich unterscheiden, aber ebenfalls den Transport von Proteinen in den Zellkern ermöglichen. Zur systematischen Übersicht über die bekannten NLS siehe Christophe et al., 2000 und Jans et al., 2000.

Der Transport von Makromolekülen zwischen Zytoplasma und Zellkern erfolgt durch die sogenannten Kernporenkomplexe (NPC), welche die Kernmembran durchsetzen. Etwa 3000 – 5000 solcher NPC existieren in einer proliferierenden humanen Zelle (Cordes et al., 1995). Die NPC höherer Eukaryonten sind ca. 125 MDa große Proteinkomplexe, die aus ca. 50 – 100 Proteinen, sog. Nucleoporinen, bestehen (zur Übersicht s. Allen et al., 2000, Conti und Izaurralde, 2001, Vasu und Forbes, 2001). Durch einen NPC können pro Sekunde etwa 800 Proteine von einer Größe von 100 kDa in den Zellkern translozieren (Ribbeck und Gor­lich, 2001). Während kleinere Moleküle passiv durch die NPC diffundieren können, ist der Transport von Proteinen ab einer Grösse von ca. 20 kDa ein aktiver, energieabhängiger Pro­zess (Newmeyer und Forbes, 1988, Richardson et al., 1988, Gorlich und Kutay, 1999).

Die Entwicklung eines in vitro Kernimport-Versuchssystems durch Adam et al. war ein wichtiger Meilenstein, der seither die Identifikation einer Reihe löslicher Kerntransport­faktoren, sog. Karyopherine, die je nach Import- oder Exportfunktion in Importine und Exportine unterteilt werden, ermöglichte (Adam et al., 1990). Folgende Faktoren des sog. „klassischen“ Importin α/β-abhängigen Importwegs für NLS-tragende Proteine wurden bisher identifiziert: Importin α (Gorlich et al., 1994, Imamoto et al., 1995), Importin β (Gorlich et al., 1995a, Radu et al., 1995), die GTPase Ran (Moore und Blobel, 1993, Melchior et al., 1993) und NTF2 (nuclear transport factor, (Paschal et al., 1996)). Zur Übersicht über den klassi­schen nukleozytoplasmatischen Importweg siehe V3, Fig. 1 und Gorlich und Kutay, 1999, Kohler et al., 1999a, Kuersten et al., 2001, Macara, 2001. Importin α fungiert als ein Adap­terprotein, welches im Zytoplasma einerseits NLS-tragende Substrate, zum anderen über seine Importin β-bindende Domäne (IBB) Importin β bindet (Gorlich et al., 1996a, Weis et al., 1996). Durch Bindung von Importin β an eine in der IBB von Importin α lokalisierte autoin­hibitorische Domäne findet eine Konversion von einer niedrigaffinen zu einer hochaffinen Form von Importin α für die Bindung NLS-tragender Substrate statt (Kobe, 1999, Catimel et al., 2001). Der trimere Importin α/β/Substrat-Komplex dockt via Importin β, den eigentlichen [Seite 8↓] Importfaktor, an die Kernpore (Gorlich et al., 1995b, Moroianu et al., 1995). Der Mechanis­mus der eigentlichen Translokation durch die Kernpore ist bisher nicht geklärt. Zwei unter­schiedliche Modelle, die zur Grundlage die Brownsche Molekularbewegung bzw. ein selekti­ves Phasenmodell haben, werden derzeit diskutiert (Rout et al., 2000, Ribbeck und Gorlich, 2001). Im Zellkern bindet Importin β an RanGTP, was zur Dissoziation des Importkomplexes führt (Gorlich et al., 1996b). Das importierte Substrat kann so seine Funktion im Zellkern erfüllen. Die beiden Importin-Untereinheiten werden separat wieder in das Zytoplasma ex­portiert, wobei der Export von Importin α in einem Komplex mit RanGTP und seinem Exportfaktor CAS (cellular apoptosis susceptibility gene) erfolgt (Kutay et al., 1997). Ent­gegen früherer Meinungen weiß man heute, dass der eigentliche Translokationsschritt durch die Kernpore energieunabhängig ist, dass jedoch die Hydrolyse von RanGTP für das „Recy­cling“ der Importfaktoren sowie für Assoziation und Dissoziation von Importfaktor-Substrat-Komplexen verantwortlich ist (Ribbeck et al., 1999, Englmeier et al., 1999). Ran existiert in einer GDP- und einer GTP-gebundenen Form. Während im Zellkern das chromatingebundene Protein RCC1 (Regulator of chromosome condensation) die Umwandlung von RanGDP in RanGTP katalysiert (Bischoff und Ponstingl, 1991, Klebe et al., 1995), wird die Hydrolyse von RanGTP in RanGDP durch die zytoplasmatischen Proteine RanGAP1 (RanGTPase acti­vating protein) und RanBP1 (Ran binding protein) mediiert (Bischoff et al., 1995, Mahajan et al., 1997, Matunis et al., 1996, Richards et al., 1996, Schlenstedt et al., 1997). Der Import von Ran in den Zellkern erfolgt in Abhängigkeit von dem kleinen Protein NTF2 (Ribbeck et al., 1998, Smith et al., 1998). Der so postulierte Gradient zwischen nukleärem RanGTP und zytoplasmatischem RanGDP, welcher die Triebkraft des Kerntransports darstellt, konnte kürzlich auch experimentell nachgewiesen werden (Kalab et al., 2002). Neben dem „klassi­schen“ Importin α/β-abhängigen nukleozytoplasmatischen Proteinimportweg existieren meh­rere andere Wege. So können z. B. ribosomale Proteine oder Histone ohne Importin α alleine durch Importin β, aber auch durch andere, Importin β-verwandte Importfaktoren in den Zell­kern importiert werden (Jakel und Gorlich, 1998, Muhlhausser et al., 2001). Auf diese durch Importin β-verwandte Proteine vermittelten Importwege soll in der vorliegenden Arbeit je­doch nicht weiter eingegangen werden. Zur Übersicht hierzu siehe Gorlich und Kutay, 1999, Kohler et al., 1999a, Kuersten et al., 2001, Macara, 2001.


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I.2.2  Zielstellungen

Sowohl Importin α als auch Importin β konnten in allen bisher untersuchten eukaryontischen Organismen nachgewiesen werden. Während ySRP1p (suppressor of temperature-sensitive RNA polymerase I mutations) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae für das einzige und da­her essentielle Importin α-Homologe kodiert, waren zu Beginn der hier im Folgenden be­schriebenen Untersuchungen bereits zwei humane Importin α-Gene bekannt, nämlich Impor­tin α1/Rch1 (Rag cohort interacting protein) und Importin α5/hSRP1 (Cortes et al., 1994, Cuomo et al., 1994, Yano et al., 1992). Das Screening von Datenbanken ergab jedoch Hin­weise auf die Existenz von weiteren humanen α-Importinen, eine zweite Importin β-Isoform konnte dagegen bisher nicht gefunden werden. Die Bedeutung der Existenz einer ganzen Fa­milie von α-Importinen war zu Beginn dieser Arbeit unklar. Um die Hypothese zu testen, dass sich die verschiedenen humanen α -Importine in ihren spezifischen Funktionen unterscheiden und sich nicht gegenseitig ersetzen können, ergaben sich folgende Zielstellungen, die dieser Arbeit zu Grunde liegen:


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I.3.  Ergebnisse

Die in der vorliegenden Arbeit zusammengefassten Ergebnisse beruhen auf folgenden Arbeiten:

V1

Köhler, M., Ansieau, S., Prehn, S., Leutz, A., Haller, H., Hartmann, E.: Cloning of two novel importin-α subunits and analysis of the expression pattern of the importin-α protein family. FEBS Letters 417: 104 - 108, 1997

V2

Köhler, M., Speck, C., Christiansen, M., Bischoff, F.R., Prehn, S., Haller, H., Görlich, D., Hartmann, E.: Evidence for distinct substrate specifities of importin α -family members in nuclear protein import. Molecular and Cellular Biology 19: 7782 - 7791, 1999

V3

Köhler, M., Haller, H., Hartmann, E.: Nuclear protein transport pathways. Experimental Nephrology 7: 290 - 294, 1999

V4

Welch, K., Franke, J., Köhler, M., Macara, I.A.: RanBP3 contains an unusual nuclear localization signal that is imported preferentially by importin α 3. Molecular and Cellular Biology 19: 8400 - 8411, 1999

V5

Franke, J., Reimann, B., Hartmann, E., Köhler, M., and Wiedmann, B.: Evidence for a nuclear passage of nascent polypeptide-associated complex subunits in yeast. Journal of Cell Science 114: 2641 - 2648, 2001

V6

Köhler, M., Buchwalow, I.B., Alexander, G., Christiansen, M., Shagdarsuren, E., Samoilova, V., Hartmann, E., Meervala, E.M.A., and Haller, H.: Increased Importin α Protein Expression in Diabetic Nephropathy. Kidney International 60: 2263 - 2273, 2001

V7

Köhler, M., Görlich, D., Hartmann, E., and Franke, J.: Adenoviral E1A protein nuclear import is preferentially mediated by importin α 3 in vitro. Virology 289: 186 - 191, 2001

V8

Köhler, M., Fiebeler, A., Hartwig, M., Thiel, S., Prehn, S., Kettritz, R., Luft, F.C., and Hartmann, E.: Differential expression of classical nuclear transport factors during cellular proliferation and differentiation. Cellular Physiology and Biochemistry 12: 335 - 344, 2002

V9

Quensel, C., Friedrich, B., Sommer, T., Hartmann, E., and Köhler, M.: Distinct α importins are essential for proliferation of cultured human cells. eingereicht


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I.3.1  Identifikation, Klonierung und Sequenzierung neuer humaner Importin α Iso­formen (V1, V2)

Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren mit Importin α1/Rch1 und Importin α5/hSRP1 nur zwei humane Importin α-Proteine bekannt. Beim Screenen der GenBank Datenbank fanden sich jedoch Hinweise auf die Existenz von vier weiteren humanen Genen mit Homologie zu zu Rch1 und hSRP1. Um die kompletten kodierenden Sequenzen dieser neuen α-Importine zu identifizieren, wurden zunächst die bekannten Teilklone über die Reference Library ICRF erworben. Ein Teilklon des vermuteten Importin α3 wurde als Grundlage für die Herstellung einer [α-32 P]dCTP markierten Sonde verwendet. Durch Screenen einer HeLa pUEX cDNA Bibliothek mit dieser Sonde wurde ein ca. 1.3 kilo Basenpaare langer Klon isoliert, der das vermutete Startkodon von Importin α3 enthielt. Das 3’-Ende der kodierenden Sequenz wurde mittels RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) aus einer HeLa Marathon-cDNA gewonnen. Zwei unabhängige positive Klone wurden isoliert und sequenziert. Die komplette cDNA des humanen Importin α3 wurde mittels PCR aus zwei überlappenden Teilklonen ge­neriert und sequenziert. Humanes Importin α4 wurde im Rahmen eines „yeast two-hybrid screens“ aus einer Lungen-Bibliothek isoliert. Humanes Importin α6 wurde mittels RACE-PCR aus einer HeLa Marathon-cDNA isoliert. Die verwendeten Primer korrespondierten zu einem bekannten Teilklon von Importin α6. Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequen­ziert. Mehrere überlappende positive Klone, welche die erwarteten Start- bzw. Stopkodons enthielten, wurden identifiziert. Mittels PCR wurde aus diesen die komplette cDNA von hu­manem Importin α6 generiert und via Sequenzierung kontrolliert. Auch die humane Importin α7 cDNA wurde mittels PCR gewonnen. Via RACE-PCR mit Primern, die zu bekannten Teilklonen korrespondierten, wurden mehrere positive Teilklone, welche die erwarteten Start- und Stopkodons enthielten, isoliert und sequenziert. Mittels PCR wurde aus überlappenden Teilklonen die komplette cDNA von humanem Importin α7 generiert. Die Sequenzen der neu identifizierten humanen α-Importine wurden in der GenBank Datenbank unter folgenden Zu­gangsnummern deponiert:

Um für die folgenden Untersuchungen sämtliche humanen α-Importine zur Verfügung zu haben, wurde auch das bereits bekannte Importin α5/hSRP1 mittels PCR aus einer HeLa [Seite 12↓] Marathon-cDNA gewonnen. Die cDNA des humanen Importin α1/Rch1 wurde von Dr. Dirk Görlich, ZMBH Heidelberg, zur Verfügung gestellt.

Die cDNAs der humanen α-Importine kodieren für Proteine von 521 bis 536 Ami­nosäuren Länge und haben daher alle ein geschätztes Molekulargewicht von ca. knapp 60 kDa. Die Analyse der Sequenzen der sechs humanen α-Importine zeigte, dass alle Isoformen die für Importin α charakteristischen Domänen beinhalten (s. V1, Fig. 1; V2, Fig. 1):

I.3.2 Einteilung der humanen Importin α Isoformen in unterschiedliche Subfamilien (V1, V2)

Infolge unterschiedlicher Homologien ihrer Primärstrukturen konnten die sechs humanen α-Importine in drei Subfamilien unterteilt werden:

  1. Die erste Subfamilie besteht aus Importin α1 und Importin α2. Da jedoch Importin α2 bisher nur im Frosch Xenopus laevis nachgewiesen wurde, ist Importin α1 die einzige humane Isoform dieser Subfamilie.
  2. Die zweite Subfamilie beinhaltet die Importine α3 und α4.
  3. Mitglieder der dritten Subfamilie sind die Importine α5, α6 und α7.

Mitglieder einer Subfamilie sind in ihren Proteinsequenzen zu ca. 80% identisch. Proteinse­quenzen humaner α-Importine unterschiedlicher Subfamilien stimmen dagegen nur zu ca. 50% überein.

Ein Vergleich der humanen α-Importine mit Homologen anderer Spezies ergab, dass die drei Subfamilien hochkonserviert sind. Auch in der Fliege Drosophila melanogaster ist mittlerweile je Subfamilie ein α-Importin beschrieben (V1, Fig. 2; V2, Fig. 1). Die Maus be­sitzt fünf α-Importine, die ca. 99% identisch mit ihren jeweiligen humanen Homologen sind. Einzig für das humane Importin α6 konnte keine homologe Isoform in der Maus identifiziert werden.


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I.3.3  Analyse der Importin α Expression in humanen Zellen und Geweben (V1, V2, V6, V8)

Um die Gewebeverteilung der neu identifizierten humanen α-Importine auf RNA-Ebene zu untersuchen, wurden Northern blot Analysen durchgeführt. Northern blots, die RNAs unter­schiedlicher humaner Gewebe enthielten (Human multiple tissue Northern blots, Clontech), wurden mit Sonden inkubiert, die aus radioaktiv markierten Teilsequenzen der verschiedenen α-Importine hergestellt wurden. Als Kontrolle für die geladenen RNA-Mengen diente eine Sonde gegen GAPDH. Es konnten Transkripte für die neu identifizierten Importine α3, α4 und α7 in nahezu allen untersuchten Geweben nachgewiesen werden. Allerdings unterschie­den sich sowohl die Expressionsstärken der einzelnen α-Importine in verschiedenen Geweben als auch die relativen Expressionstärken der verschiedenen α-Importine untereinander. Wäh­rend z. B. Importin α3 eine deutlich stärkere Expression im Dünndarm als im Kolon zeigte, wies das nächstverwandte Importin α4 in beiden Geweben vergleichbare Expressionsstärken auf. Im Gegensatz zu den anderen humanen α-Importinen konnte eine Expression von Impor­tin α6 nur in Testisgewebe nachgewiesen werden (V1, Fig. 3; V2, Fig. 2).

Um die Expression der α-Importine in verschiedenen humanen Zellen und Geweben auf Proteinebene untersuchen zu können, wurden spezifische polyklonale Antikörper herge­stellt. Hierfür wurden synthetische Peptide, die Sequenzen der verschiedenen α-Importine von 10 bis 14 Aminosäuren Länge entsprachen, in Kaninchen injiziert. Aus den gewonnenen Se­ren wurden die entsprechenden Antikörper über zugehörige Peptidsäulen affinitätsgereinigt und für Western blots verwendet. Die Spezifität der Antikörper wurde mittels rekombinant exprimierter und gereinigter Importin α Proteine überprüft. Da die humanen Importine α6 und α7 sowohl am Amino- als auch am Carboxyterminus nahezu identisch sind, erkennen die bei­den gegen diese generierten Antikörper auch beide Proteine. Da jedoch auf RNA-Ebene die Expression von Importin α6 auf Testis beschränkt war, sollten die nachgewiesenen Banden die Importin α7-Expression repräsentieren. Mittels Western blot Analysen ließen sich die humanen Importine α1, α3, α4, α5 und α7 in einer Vielzahl humaner Zelllysate nachweisen. Analog zu den Ergebnissen auf RNA-Ebene zeigten die verschiedenen Isoformen jedoch auch auf Proteinebene differentielle Expressionsmuster (V1, Fig. 5; V6, Fig. 6; V8, Fig. 1). So konnte z. B. für Importin α3 im Gegensatz zu Importin α4 eine deutlich stärkere Expression in renalen 293 Zellen als in hepatischen HepG2-Zellen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit Proteinlysaten von humanen Geweben zeigten ein ähnliches Bild: Alle untersuchten Importine ließen sich in unterschiedlicher Stärke in verschiedenen Geweben nachweisen, wo­bei das relative Expressionsniveau der verschiedenen Isoformen zum Teil deutlich unter­[Seite 14↓] schiedlich war (V1, Fig. 4; V2, Fig. 3). Um eine möglichst umfassende Analyse zu ermögli­chen, wurde parallel die Expression anderer Faktoren des klassischen Importwegs in humanen Geweben untersucht. Wie erwartet konnten ubiquitäre Expressionsmuster auch für diese Faktoren (Importin β, CAS und Ran) nachgewiesen werden. Überraschenderweise zeigte sich jedoch, dass in den Geweben, in denen die verschiedenen α-Importine am stärksten exprimiert waren, nämlich Ovar und Lunge, die Expression von Importin β, CAS und Ran weniger stark als in manchen anderen Geweben war (V2, Fig. 3). Die Antikörper gegen diese Proteine wur­den von Dr. Dirk Görlich, ZMBH Heidelberg, zur Verfügung gestellt.

I.3.4 Rekombinante Expression und Aufreinigung der humanen α-Importine (V2)

Ein wichtiger Schritt für die geplanten funktionellen Analysen der verschiedenen Importin α Proteine war deren rekombinante Expression in E. coli. Hierzu wurden die cDNAs zunächst mittels spezieller Primer via PCR mit Restriktionsstellen versehen, die eine anschließende Ligation in Expressionsvektoren und nachfolgende Transformation in kompetente E. coli er­möglichten. Die Aufreinigung der Proteine, welche mit einem sog. Histidin-tag versehen wurden, erfolgte nach Ultrazentrifugation des bakteriellen Lysats und Bindung der Proteine an eine Nickel-Säule zunächst mittels eines Imidazol-Gradienten. Die Fraktionen mit dem höchsten Importin α Gehalt wurden gesammelt, auf eine Mono Q-Säule geladen und mit ei­nem NaCL-Gradienten eluiert. Die Fraktionen mit dem höchsten Importin α Gehalt wurden erneut gesammelt und unter Zugabe von 250 mM Sacharose bei -80° C gelagert. Die Protein­konzentrationen wurden photometrisch bei 280 nM Wellenlänge durch den molaren Extinkti­onskoeffizienten, wie bei Edelhoch beschrieben, bestimmt (Edelhoch, 1967). Die Reinheit der Proteine wurde mittels Gelelektrophorese (SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate-polyacryla­mide gel electrophoresis) überprüft (V2, Fig. 4). Neben den ubiquitär exprimierten humanen Importinen α1, α3, α4, α5 und α7 konnten für Kontrollexperimente auch die Xenopus Isoform Importin α2 und das Hefe Importin α ySRP1p aufgereinigt werden. Die Klone hierfür wurden von Dr. Dirk Görlich, ZMBH Heidelberg, zur Verfügung gestellt. Lediglich das nur in Testis­gewebe exprimierte humane Importin α6 war unlöslich und konnte daher nicht aufgereinigt werden. Es zeigte sich, dass alle gereinigten humanen α-Importine in der Gelelektrophorese wie erwartet bei ca. 60 kDa migrierten.


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I.3.5  In vitro Funktionsanalysen der humanen α-Importine

I.3.5.1 Vergleich der Bindungsaffinitäten der neu beschriebenen humanen α-Importine zu Importin β und CAS in vitro (V2)

Für die Importine α1 und α5 waren bereits die Interaktionen mit ihrem Importfaktor Importin β bzw. mit ihrem Exportfaktor CAS nachgewiesen (Gorlich et al., 1995a, Kutay et al., 1997). Um die erwarteten Interaktionen der neu beschriebenen humanen α-Importine mit Importin β und CAS nachzuweisen und miteinander vergleichen zu können, wurden zwei unterschiedli­che Ansätze ausgewählt. Rekombinante Expression und Aufreinigung von Importin β und CAS erfolgten mit von Dr. Dirk Görlich zur Verfügung gestell­ten Klonen (Gorlich et al., 1995b, Kutay et al., 1997).

Um die Bindungsaffinitäten der verschiedenen α-Importine zu CAS zu quantifizieren, machten wir uns die Tatsache zu Nutze, dass die Bindungsaffinität von CAS zu RanGTP durch die Anwesenheit von Importin α enorm verstärkt wird. Des weiteren resultiert die Bin­dung in einem Schutz gegen die Aktivierung der RanGTPase durch RanGAP1 (Kutay et al., 1997). Für die CAS-Bindungsstudien wurden daher [γ-32 P] markiertes RanGTP in einem Puf­fergemisch entweder mit rekombinantem CAS alleine oder mit einem Gemisch aus rekombi­nantem CAS und den verschiedenen α-Importinen inkubiert. Nach 30 Minuten wurde rekom­binantes Rna1p, das Hefe-Homologe von RanGAP1, für 30 Sekunden zugegeben und die Hy­drolyse von Ran-gebundenem GTP als freigesetztes [32 P] bestimmt. Die daraus berechneten Bindungsaffinitäten ergaben starke Affinitäten für CAS zu den humanen Importinen α1, α3, und α5 (Dissoziationskonstante KD < 2 nM; V2, Fig. 4). Erstaunlicherweise war die Bindung des Xenopus Kontrollproteins Importin α2 an CAS stärker als die Affinität der humanen Iso­formen α4 und α7 (KD > 3 nM vs. > 5 nM). Nur die Affinität von CAS zu der Importin α Kontrolle der Hefe, ySRP1p, war deutlich schwächer (KD > 20 nM).

Zur Bestimmung der Bindungsaffinitäten der α-Importine an Importin β wurde ein Biacore 2000 Instrument verwendet. Die rekombinanten α-Importine sowie die Negativkon­trolle BSA wurden auf sog. sensor chips immobilisiert und verschiedene Konzentrationen von rekombinantem Importin β injiziert. Die surface plasmon resonance (SPR) wurde mittels Bia­core Apparatur bestimmt und die Dissoziationskonstante daraus berechnet. Mit dieser Me­thode konnte nachgewiesen werden, dass alle untersuchten α-Importine an Importin β binden können (V2, Tab. 1). Die gemessenen Unterschiede in den Bindungsaffinitäten der humanen α-Importine zu Importin β waren marginal und lagen alle zwischen 5 und 18 nM. Interessan­terweise lagen die Affinitäten der Kontroll-α-Importine Xenopus α2 und ySRP1p zu huma­[Seite 16↓] nem Importin β im gleichen Bereich (KD 3 bzw. 5 nM). Die Negativkontrolle BSA dagegen zeigte keine signifikante Bindung an Importin β, was für die Spezifität der nachgewiesenen Bindungen spricht.

I.3.5.2 Nachweis der Importfunktion und unterschiedlicher Substratspezifitäten der humanen α-Importine in vitro (V2, V4, V5, V7)

Für die humanen Importine α1 und α5 war bereits die Importfunktion in vitro nachgewiesen. Um auch für die neu identifizierten α-Importine die Importfunktionen beweisen zu können, wurden in vitro Kernimport-Versuche durchgeführt, die auf dem von Adam et al. beschriebe­nen Versuchssystem beruhten (Adam et al., 1990). Hierfür wurden kultivierte HeLa-Zellen mit Digitonin inkubiert, was zur Permeabilisierung der Zellmembran und zum Auswaschen des Zytosols führt, während die Kernmembran intakt bleibt. Nach Inkubation der permeabili­sierten Zellen mit der Importreaktionsmixtur für acht Minuten wurden die Reaktionen mit Paraformaldehyd gestoppt und im konfokalen Mikroskop ausgewertet. Die Importreaktions­mixtur bestand aus einem energieregenerierenden System, einem Nucleoplasmin core-Protein enthaltenden Puffersystem, 10% Retikulozytenlysat, einem Fluorescein- oder Texas red-markierten Importsubstrat sowie den rekombinant exprimierten und aufgereinigten Import­faktoren des klassischen Importweges (RanGDP, RanGAP1, RanBP1, NTF2, Importin β, so­wie die jeweiligen Importin α Proteine).

Zunächst sollte mit diesem in vitro Versuchssystem gezeigt werden, dass alle humanen α-Importine bekannte Standardsubstrate des klassischen Importweges importieren können. Sowohl ein Fusionprotein aus Rinderserumalbumin (BSA) und der NLS des großen T-Anti­gens des SV40 Virus (NLS-BSA) als Standardsubstrat der einteiligen klassischen NLS-Sub­strate als auch Nucleoplasmin, das klassische Importsubstrat mit einer zweigeteilten NLS, wurden von allen untersuchten humanen α-Importinen wie auch von den mitgeführten Kon­troll-Importinen Xenopus α2 und ySRP1p importiert (V2, Fig. 5). Im Gegensatz dazu fand in den Negativkon­trollen ohne Importin α keine nukleäre Akkumulation eines der beiden Importsubstrate statt. Auffälligerweise fanden sich, obwohl für jedes Substrat die Experi­mente mit den unter­schiedlichen α-Importinen jeweils parallel unter identischen Bedingungen durchgeführt wur­den, deutliche Unterschiede in der Intensität der nukleären Akkumulation. So zeigten die humanen Importine α3, α5, α7 und Xenopus α2 die besten Importeffektivitäten für NLS-BSA. Nucleoplasmin wurde am besten von Importin α5 importiert, gefolgt von den humanen Importinen α3 und α4 sowie Xenopus α2.


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Um zu untersuchen, ob die unterschiedlichen Importeffizienzen auf einer Aufreini­gung unterschiedlich effektiver α-Importine beruhten oder ob diese in tatsächlichen Unter­schieden der Substratspezifitäten der α-Importine begründet seien, wurden weitere Importsub­strate zu­nächst alleine und dann in Kombination mit einem zweiten, kompetitiven Substrat durchge­führt. Diese Untersuchungen ergaben, dass das RNA-bindende Ribonukleoprotein hnRNP K im Prinzip von allen humanen α-Importinen, am besten jedoch von α1, α3 und α5 importiert wurde (V2, Fig. 6). Die Zugabe von Nucleoplasmin als kompetitives zweites Sub­strat änderte an diesen Unterschieden nichts, die erneute geringe Importeffektivität von Importin α1 für Nucleoplasmin konnte hier jedoch nicht in einem generell inaktiven Protein begründet sein. Während gereinigtes und Fluorescein-markiertes P/CAF, einem Stimulator des Rous Sarcoma Virus Promotors, bei alleiniger Zugabe im Kernimport-Versuchssystem von allen humanen α-Importinen ohne nennenswerte Unterschiede importiert werden konnte, führte die gleichzei­tige Zugabe von Texas red-markiertem Nucleoplasmin dazu, dass P/CAF nur noch von Importin α3 und in deutlich schwächerer Intensität von Importin α4 importiert werden konnte (V2, Fig. 7). Diese ersten Hinweise auf unterschiedliche Substratspezifitäten der humanen α-Importine in vitro wurden bestätigt durch die Verwendung des Chromatin-gebundenen RanGTP/GDP exchange factor RCC1 als Importsubstrat. Erstmals zeigte sich schon bei Zu­gabe dieses alleinigen Substrates, dass eine Isoform, Importin α3, mit Abstand die beste Importeffizienz für dieses Substrat aufwies (V2, Fig. 8). Lediglich Importin α4 konnte eine nukleäre RCC1-Akkumulation bewirken, die über der der Negativkontrolle ohne Importin α lag. Die Zugabe von Nucleoplasmin als kompetitivem Zweitsubstrat änderte an der fehlenden Importwirkung der anderen α-Importine für RCC1 erwartungsgemäß nichts, belegte jedoch, dass diese auch in diesem Versuchsansatz im Prinzip funktionell waren.

I.3.5.3 Identifikation weiterer Importin α-Substrate und in vitro Analyse ihres nukleo­zytoplasmatischen Importmechanismus

In weiteren Untersuchungen konnten zum Teil in Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen mittels des oben beschriebenen in vitro Kernimport-Versuchssystems neue Importin α Sub­strate identifiziert und der Mechanismus ihrer Translokation in den Zellkern im Detail analy­siert werden. Hierbei ergaben sich weitere Hinweise auf substratspezifische Unterschiede der humanen α-Importine in vitro.


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I.3.5.3.1  In vitro Analyse des Importmechanismus von RanBP3 (V4)

In Zusammenarbeit mit der AG I.G. Macara, Charlottesville / USA, konnte RanBP3 als ein neues Substrat von Importin α identifiziert werden. Während der Durchführung dieser Unter­suchungen war die funktionelle Bedeutung von RanBP3 noch unklar. Mittlerweile ist bekannt, dass RanBP3 ein Kofaktor des Crm1-abhängigen Exports von Proteinen aus dem Zellkern ist (Englmeier et al., 2001, Nemergut et al., 2002). Zunächst konnte mittels spezifischer Antikör­per im Immunfluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden, dass RanBP3 überwiegend in Zellkern lokalisiert ist (V4, Fig. 1). Durch Mikroinjektion unterschiedlicher Fragmente eines Glutathion S-Transferase-grünfluoreszierendes Protein-RanBP3 Fusionsproteins (GST-GFP-RanBP3) konnte zunächst gezeigt werden, dass eine Region am Aminoterminus für die Kernlokalisation des Proteins sowohl essentiell als auch ausreichend ist (V4, Fig. 2). Weitere Deletionsanalysen ergaben, dass sich die NLS von RanBP3 von den Aminosäuren 40 bis 57 erstreckt (V4, Fig. 3 und 4). In vitro Kernimport-Versuche mittels Digitonin-permeabilisierter Zellen zeigten, dass sowohl durch Inhibition von Importin α als auch durch Inhibition von Importin β die nukleäre Translokation von RanBP3 inhibiert werden konnte (V4, Fig. 5 und 6). Dies war ein überraschender Befund, da die NLS von RanBP3 nur eine sehr geringe Iden­tität mit der klassischen NLS des SV40 Virus aufwies und daher einer atypischen nicht-klassi­schen NLS entsprach. In vitro Bindungsstudien, bei denen die verschiedenen humanen α-Importine mit einem an eine GST-Säule gekoppelten RanBP3-Fusionsprotein inkubiert wur­den, ergaben, dass die Importine α3 und α4 signifikant mit RanBP3 interagieren konnten. Die Bindung von Importin α5 war deutlich schwächer und die Importine α1 und α7 zeigten keine über dem Niveau der Negativkontrolle liegende Bindung (V4, Fig. 7). Durch kompetitive in vitro Kernimport-Versuche konnte schließlich nachgewiesen werden, dass RanBP3 tatsäch­lich über den klassischen Importin α/β-abhängigen Importweg in den Zellkern transportiert werden kann, wobei Importin α3 die höchste Importeffizienz für RanBP3 zeigte (V4, Fig. 7).

I.3.5.3.2 In vitro Analyse des nukleären Imports von Untereinheiten des nascent polypep­tide-associated complex (NAC) in der Hefe (V5)

Der nascent polypeptide-associated complex (NAC) ist ein evolutionär konservierter Kom­plex, der in der Hefe aus den drei Untereinheiten Egd2p, Btt1p und Egd1p besteht. Der Ge­samtkomplex schützt am Ribosom wachsende Polypeptide vor frühzeitigen Interaktionen mit zytosolischen Proteinen. Daneben gab es aber auch Berichte über eine Rolle einzelner NAC-Untereinheiten als Transkriptionsregulatoren via DNA-Interaktionen, was eine nukleäre [Seite 19↓] Translokation zumindest von Untereinheiten des NAC-Komplexes zur Voraussetzung hätte. Daten bzgl. einer nukleären Lokalisation von NAC waren aber bisher widersprüchlich (s. V5).

In Zusammenarbeit mit der AG von Dr. B. Wiedmann, Institut für Biochemie der Charité Berlin, wurden die Mechanismen, welche den nukleären Import der NAC-Unterein­heiten in der Hefe kontrollieren, eingehend untersucht. Durch Herstellung von GFP-Fusions­proteinen und deren Expression in NAC-knockout Stämmen konnte eine nukleäre Lokalisa­tion von Egd2p in der Hefe nachgewiesen werden, während das Egd1p-GFP Protein vom Zellkern ausgeschlossen blieb (V5, Fig. 1). Im Gegensatz dazu zeigte sich für ein Egd1p-GFP Fusions­protein, dessen aminoterminale Ribosomenbindungsstelle deletiert worden war (Δ N11-Egd1p-2GFP), eine deutliche Akkumulation im Zellkern (V5, Fig.1). In vitro Kern­import-Versuche zeigten, dass sowohl das Hefe-Importin α ySRP1p als auch die humanen Importine α1, α3 und α7 Egd1p und Egd2p importieren konnten, wobei die Importeffizienz von Impor­tin α3 für Egd2p deutlich schwächer war als für Egd1p. Im Gegensatz dazu konnten die humanen Importine α4 und α5 keine Translokation von Egd1p oder Egd2p in den Zellkern bewirken (V5, Fig. 3). Der in vitro Kernimport von Egd2p via Importin α1 konnte blockiert werden durch Zugabe eines Überschusses an Nucleoplasmin, was die Spezifität dieses Importweges in vitro nachwies (V5, Fig. 4). Um den Importmechanismus der NAC-Unterein­heit Egd1p in lebenden Hefen zu untersuchen, wurde zunächst die Lokalisation des Egd1p-GFP Fusionsproteins mit deletierter aminoterminaler Ribosomenbindungsstelle (Δ N11-Egd1p-2GFP) in verschiedenen ySRP1p-knockout Stämmen analysiert. Hier zeigte sich nur eine leichte Abschwächung der nukleären Akkumulation von Δ N11-Egd1p-2GFP (V5, Fig. 5A). Interessanterweise ergaben die Versuche in Hefen, denen die Importin β-verwandten Importfaktoren kap123p bzw. pse1p fehlten, ebenfalls eine Inhibition der Anreicherung von Δ N11-Egd1p-2GFP im Zellkern (V5, Fig. 5B). Die Domäne, die für den kap123p sowie für den pse1p-vermittelten nukleozytoplasmatischen Import von Egd1p verantwortlich ist, konnte mittels weiterer Deletionsmutanten im Bereich der Aminosäuren 11 bis 27 lokalisiert werden (V5, Fig. 6).

I.3.5.3.3 In vitro Analyse des Importmechanismus viraler Proteine (V7)

Mittels in vitro Kernimport-Versuchen wurden auch die nukleozytoplasmatischen Transport­mechanismen zweier viraler Proteine untersucht. Für das adenovirale E1A-Protein war die NLS bereits bekannt (Lyons et al., 1987), die Importfaktoren jedoch noch nicht identifiziert. Für das influenzavirale Nucleoprotein (NP) waren zwei unterschiedliche NLS identifiziert (Wang et al., 1997, Weber et al., 1998). Auch war für NP bereits zuvor ein via Importin α1 [Seite 20↓] und α5 vermittelter nukleärer Import in vitro beschrieben worden (O'Neill et al., 1995). In vitro Kernimport-Versuche mit einem maltosebindenden NP-Fusionsprotein ergaben keine Hinweise auf Präferenzen bestimmter α-Importine für dieses Substrat, da alle untersuchten humanen Isoformen auch nach Zugabe eines kompetitiven zweiten Substrates das NP-Fusi­onsprotein mit gleicher Effektivität importieren konnten. Für ein Fusionsprotein aus BSA und der NLS des E1A-Proteins konnte dagegen erstmals eine Importin α/β-abhängige nukle­äre Translokation in vitro nachgewiesen werden (V7, Fig. 1). Dabei zeigte sich, dass im Prin­zip alle ubiquitär exprimierten humanen α-Importine in vitro dieses E1A-Fusionsprotein in den Zellkern importieren konnten. Die Zugabe von Nucleoplasmin als kompetitives Substrat führte jedoch dazu, dass ähnlich wie vorbeschrieben für P/CAF Importin α3 noch eine gute Importeffizienz aufwies, während die Effizienz von Importin α4 für E1A schwächer, die der anderen α-Importine sogar kaum oder gar nicht von der Negativkontrolle ohne α-Importin verschieden waren.

I.3.6 Untersuchungen zur Regulation der α-Importin Expression in Abhängigkeit von Zellproliferation, -differenzierung und pathophysiologischen Zuständen

Nachdem erste in vitro Versuche Hinweise für substratspezifische Unterschiede der humanen α-Importine ergeben hatten (s. 3.5), war die Frage nach der Bedeutung der Existenz so vieler Isoformen in vivo aber weiterhin unklar. Als Ausgangsbasis für weitere geplante funktionelle Analysen sollte daher in verschiedenen Untersuchungen nach möglichen Regulationen der Importin α Expression in Abhängigkeit von pathophysiologischen Zuständen, sowie von zellulärer Proliferation und Differenzierung gesucht werden.

I.3.6.1 Analyse der Importin α Expression bei diabetischer Nephropathie (V6)

Es ist bekannt, dass Diabetes mellitus und erhöhte Glukosekonzentrationen mit einer Aktivie­rung verschiedener Faktoren intrazellulärer Signaltransduktionskaskaden involviert sind (s. V6). Um eine mögliche Rolle der Importine bei der Pathogenese von Erkrankungen zu identi­fizieren wurde in einer ersten Arbeit die Expression in unterschiedlichen diabetischen Rat­tenmodellen untersucht. Zunächst wurde die Expression der α-Importine in Nieren gesunder Ratten mittels der bereits beschriebenen Antikörper im Immunfluoreszenzmikroskop analy­siert. Importin α1 konnte in starker Expression in Epithelzellen distaler Tubuli nachgewiesen werden. Demgegenüber waren die Signale für Importin α1 in proximalen Tubuli schwach ausgeprägt, die Glomeruli waren negativ (V6, Fig. 1A und C). In Nieren von Ratten, die in­folge Streptozotocinbehandlung diabetisch geworden waren, wurde ein signifikanter Anstieg [Seite 21↓] der Importin α1 Expression nachgewiesen (V6, Fig. 1B und D; V6, Tab. 1). Die Importin α1 Expression bei diabetischen Ratten war am stärksten im Zytoplasma tubulärer Zellen ausge­prägt, fand sich jedoch im Gegensatz zu normalen Ratten auch in geringerem Maße im Zytoplasma glomerulärer Zellen und in tubulären Zellkernen. Importin α5 war in den Kernen glomerulärer und tubulärer Nierenzellen gesunder Ratten nachweisbar (V6, Fig. 3A und C). In Nieren streptozotocinbehandelter diabetischer Ratten waren signifikante Anstiege der Impor­tin α5 Expression in Zytoplasma und Kernen tubulärer wie glomerulärer Zellen zu erkennen (V6, Fig. 3B und D; V6, Tab. 1). Importin α7 war in Glomeruli gesunder Rattennieren nur schwach, im Zytoplasma tubulärer Zellen mäßig nachweisbar (V6, Fig. 2A). Demgegenüber fand sich in Nieren streptozotocinbehandelter Ratten eine deutliche Hochregulation der Expression von Importin α7 (V6, Fig. 2B). Diese war am stärksten ausgeprägt in den Tubuli zu finden, zeigte sich jedoch auch in glomerulären Zellen. Charakteristischerweise war die Expression in den Zellen perinukleär lokalisiert. Durch Doppelmarkierung mit einem endothelzellspezifischen Anti-CD 31 Antikörper konnte die Expression von Importin α7 in streptozotocinbehandelten Tieren sowohl in glomerulären und peritubulären Endothelzellen als auch in glomerulären Mesangiumzellen lokalisiert werden (V6, Fig. 2C und D). Da die Expressionsunterschiede zwischen gesunden und streptozotocinbehandelten diabetischen Rattennieren am stärksten für Importin α7 ausgeprägt waren, wurde die glomeruläre Expres­sion von Importin α7 semiquantitativ zwischen den verschiedenen Tieren verglichen. Es erga­b sich in diabetischen Nieren ein signifikanter Anstieg der positiven Kerne pro Glomerulus von 0 auf im Mittel 7 sowie der zytoplasmatisch positiven Zellen von 16 auf 34 (V6, Tab. 2).

Um unspezifische Effekte durch die Streptozotocinbehandlung als Ursache für den Importin α-Anstieg in diabetischen Rattennieren auszuschließen, wurde ein zweites diabeti­sches Rattenmodell untersucht. Im Gegensatz zu streptozotocinbehandelten Ratten wurden hierfür spontan diabetische Goto-Kakizaki Ratten verwendet. Die Ergebnisse waren ver­gleichbar (V6, Fig. 2 E – J): Während in gesunden Wistar Ratten kaum nukleäre und nur mäßige perinukleäre Reaktionen für Importin α7 in tubulären und glomerulären Zellen nach­weisbar waren, zeigte sich eine diffuse nukleäre Färbung für Importin α7 in vielen tubulären und glomerulären Zellen Typ 2 diabetischer Goto-Kakizaki Ratten. Auch ein Anstieg der perinukleären Importin α7 Signale insbesondere in medullären Tubuluszellen im Vergleich zu gesunden Nieren war offensichtlich.

Zur Bestätigung der immunhistologischen Ergebnisse wurden parallel Western blots mit Gesamtproteinlysaten homogenisierter Nieren von gesunden und diabetischen Ratten bei­der Diabetesmodelle durchgeführt. Während die Antikörper gegen die Importine α1, α3, α4 [Seite 22↓] und α5 nur geringe oder keine Unterschiede zwischen gesunden und diabetischen Rattennie­ren ergaben, konnte der starke Anstieg der Importin α7 Expression in beiden diabetischen Rattennieren im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen im Western blot verifiziert werden (V6, Fig. 4).

Da noch kaum Daten über die Regulation der Importin α Protein Expression bekannt waren, wurde untersucht, ob kurzzeitige Exposition kultivierter Zellen zu hohen Glukosekon­zentrationen zu Veränderungen der Expressionsniveaus der verschiedenen α-Importine führen könnten. Untersuchungen an glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte mittels konfokaler Mikro­skopie ergaben nach dreistündiger Inkubation mit hochmolarer Glukosekonzentration (25 mmol/l) keine signifikanten Unterschiede im Expressionsniveau wie in der subzellulären Ver­teilung von Importin α1 im Vergleich zu Kontrollzellen (V6, Fig. 5). Im Gegensatz dazu zeigte Importin α5 einen mäßigen Anstieg und Importin α7 einen starken Anstieg mit über­wiegend nukleärer Lokalisation nach Behandlung mit hochmolarer Glukosekonzentration. In Western blots mit Zelllysaten glatter Gefäßmuskelzellen der Ratte fanden sich keine erwäh­nenswerten Unterschiede in den Expressionsstärken der Importine α1 und α4 zwischen hoch- und niedrigmolaren Glukosekonzentrationen (V6, Fig. 6A). Demgegenüber konnten neben einem mäßigen Anstieg der Importin α3 Expression der mäßige Anstieg von Importin α5 so­wie der starke Anstieg von Importin α7 nach dreistündiger Inkubation mit 25 mmol/l Glukose bestätigt werden. Allerdings fanden sich keine nennenswerten Unterschiede der Importin α Expressionen zwischen 25 mmol/l Glukose-Behandlung und den osmotischen Kontrollen mit äquimolarer Mannose. Da die beeindruckendsten Unterschiede der Importin α7 Expression in den Immunfluoreszenzuntersuchungen in Endothelzellen und glomerulären Zellen gefunden worden waren, wurden auch Western blots mit Zelllysaten von Mesangiumzellen der Ratte und von humanen Nabelschnurendothelzellen nach Behandlung mit 5 bzw. 25 mmol/l Glu­kose durchgeführt (V6, Fig. 6B und C). Während sich in den Mesangiumzellen nach Behandlung mit hoher Glukosekonzentration ähnlich wie bei den glatten Gefäßmuskelzellen keine An­stiege in der Importin α1 und α4 Expression, dagegen aber Anstiege in den α3, α5 und α7 Ex­pressionen nachweisen ließen, zeigten sich in den Endothelzellen nur leichte durch hohe Glu­kosekonzentrationen induzierte Anstiege für die Importine α4 und α5, nicht aber für die ande­ren Isoformen. Wie in den glatten Gefäßmuskelzellen auch, fanden sich keine Unter­schiede in den Importin α Expressionsstärken in Mesangium- und Endothelzellen zwischen hochmolarer Glukosekonzentration und der Osmosekontrolle Mannose.


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I.3.6.2  Analyse der Regulation der Importin α Expression in Abhängigkeit von Zellpro­liferation und -differenzierung (V8)

Da kaum Daten bezüglich möglicher Regulationen der verschiedenen α-Importine bekannt waren, sollte als Ausgangspunkt für geplante weitere funktionelle Untersuchungen die Hypo­these getestet werden, dass die Importin α Expression in Abhängigkeit von Zellproliferation und Zelldifferenzierung unterschiedlich reguliert wird.

Bisher war nicht bekannt, ob sich die humanen α-Importine in ihren absoluten Expres­sionsstärken signifikant unterscheiden. Daher wurden zunächst die Absolutmengen der ver­schiedenen α-Importine sowie von Importin β in vier verschiedenen humanen Zelllinien per Western blot durch Mitführung von Standardkurven rekombinant exprimierter und gereinigter Importine mit bekannten Konzentrationen bestimmt (V8, Fig. 1). In den vier analysierten Zelllinien war Importin α1 stets die am stärksten exprimierte Isoform. Die absolute Menge an Importin α1 war sogar in den meisten Zellen größer als die Menge an Importin β. In Matu (Mamma-Tumor) und ECV (Endothelzelllinie) Zellen war Importin α1 10 – 30-fach stärker exprimiert als die verschiedenen anderen α-Importine. Demgegenüber waren die Unterschiede der absoluten Expressionsniveaus zwischen den übrigen α-Importinen weniger als vierfach. Ähnlich wie in vorangegangenen Untersuchungen unterschieden sich die α-Importine in den relativen Expressionsstärken zwischen den verschiedenen Zellen. So war in Matu-Zellen mehr Importin α7 nachweisbar als Importin α5, welches selbst wiederum stärker exprimiert war als α4. In Jurkat (T-Zelllinie) Zellen dagegen waren die Verhältnisse der Expressionsstärken die­ser Isoformen genau umgekehrt. Während die Unterschiede in den Absolutmengen zwischen den verschiedenen Zellen für die Importine α3, α5 und α7 maximal zweifach waren, schwankte die Expressionsstärke von Importin α1 um mehr als Faktor zehn. Die Gesamt­menge aller α-Importine variierte zwischen den verschiedenen Zelllinien zwischen 7 und 47 nmol/g Gesamtprotein, wobei in drei der untersuchten Zelllinien ein mehr als dreifacher mola­rer Überschuß der α-Importine im Vergleich zu Importin β beobachtet werden konnte.

Um den Effekt einer Proliferationsinhibition auf die Regulation der Importin α Expression zu untersuchen wurden zunächst HeLa-Zellen für 24 und 72 Stunden serumde­pletiert. Western blots der von diesen Zellen gewonnenen Proteinlysate zeigten, dass Serum­depletion zu einer Reduktion aller α-Importine inklusive ihrer Import- und Exportfaktoren Importin β und CAS geführt hatte (V8, Fig. 2A und C). Die stärksten Abnahmen der Expres­sionsstärken waren dabei für die Importine α1 und α7 nachweisbar. Um zu untersuchen, ob dieser Effekt HeLa-spezifisch sei, führten wir analoge Experimente mit humanen Fibroblasten (HaCaT-Zellen) durch, welche jedoch wegen ihrer größeren Empfindlichkeit nur 48 Stunden [Seite 24↓] ohne Serum gehalten werden konnten. Ähnlich wie bei den Experimenten mit HeLa-Zellen kam es zu einer starken Abnahme des Expressionsniveaus von Importin α1 (V8, Fig. 2B und D). Während auch für CAS wiederholt eine mäßige Abnahme des Proteinlevels nachweisbar war, änderten sich jedoch die Expressionsstärken der anderen α-Importine ebenso wie die von Importin β kaum.

Um zu kontrollieren, dass HeLa-Zellen 72 Stunden nach Serumentzug noch nicht ab­gestorben, sondern weiterhin wachstumsfähig sind, wurde für bis zu 24 Stunden erneut Serum in das Kulturmedium zurückgegeben und dann die Expressionslevel der verschiedenen Importine analysiert. Wie erwartet führte die erneute Zugabe von Serum zu einem Anstieg der Expressionsniveaus aller untersuchten Importine, wobei der Effekt für Importin α1, α3, α7 und β stärker ausgeprägt war, als für Importin α4 und α5 (V8, Fig. 3). Die schnellsten Expres­sionsanstiege wurden für die Importine α3 und α7 gefunden, welche bereits nach einer Stunde Serumzugabe nachweisbar waren.

Als nächstes wurde der Einfluß der Induktion von Zelldifferenzierung pankreatischer AR42J-Zellen der Ratte auf die Expressionsregulation der klassischen Importfaktoren im Western blot untersucht. Bei dieser Zelllinie handelt es sich um ein etabliertes Modell für die Differenzierung in Richtung neuroendokriner Phänotyp durch Aktivin A bzw. in Richtung azinärer Phänotyp mit Dexamethason (s. V8). Zunächst war bemerkenswert, dass weder in unbehandelten noch in Aktivin A oder Dexamethason behandelten AR42J-Zellen das sonst am stärksten exprimierte Importin α1 nachweisbar war (V8, Fig. 4). Die parallele Durchfüh­rung von Western blots mit Zytosol der Rattenzelllinie L6E9 zeigte, dass der verwendete An­tikörper generell das Importin α1 Homologe der Ratte erkennen konnte. Während die Inkuba­tion sowohl mit Aktivin A als auch mit Dexamethason zu einem Anstieg der Importin α3 und α4 Expression führte, ließen sich keine nennenswerten Expressionsunterschiede für die an­deren Importfaktoren nachweisen.

Als nächstes Zelldifferenzierungsmodell wurden promyelozytische HL60 Zellen ana­lysiert. Diese lassen sich mit dem Phorbolester PMA in Richtung Makrophagen, mit DMSO dagegen in Richtung neutrophile Granulozyten differenzieren (s. V8). Western blot Analysen zeigten, dass nach 72-stündiger Behandlung mit PMA die Expression der Importine α1, α4, α7, β und CAS abgenommen hatten (V8, Fig. 5). Für die Importine α3 und α5 dagegen fand sich ein transienter Anstieg nach 24 Stunden PMA-Behandlung. Um sicher zu sein, dass die Zellen vor dem Ernten noch intakt waren und dass gleiche Proteinmengen im Gel geladen und im Western blot übertragen worden waren, führten wir Western blots mit einem Kontroll-Antikörper gegen das im endoplasmatischen Retikulum lokalisierte Protein TRAPα durch. Es [Seite 25↓] konnten wie erwartet keine relevanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Zeitpunkten beobachtet werden. Die Differenzierungsexperimente der HL60 Zellen mit DMSO zeigten ähnliche Ergebnisse wie die mit PMA: Es wurden Abnahmen für die Importine α1, α4, α7 und β nach fünftägiger DMSO-Behandlung beobachtet. Die stärkste Abnahme war für Impor­tin α1 drei und fünf Tage nach Beginn der DMSO-Behandlung nachweisbar. Im Gegensatz dazu zeigten die Expressionslevel von Importin α3, α5 und CAS keine signifikanten Unter­schiede nach DMSO-Behandlung. Auch hier zeigten die Kontroll-Western blots mit dem TRAPα-Antikörper, dass identische Mengen an Proteinlysaten aufgetragen waren.

I.3.7 Einfluss der spezifischen Inhibition einzelner Importin α Isoformen auf die Pro­liferation kultivierter humaner Zellen (V9)

Um die Frage beantworten zu können, ob die verschiedenen humanen α-Importine spezifische zelluläre Funktionen ausüben und damit essentiell sind, testeten wir die Hypothese, dass eine Inhibition der Importin α Expression das Wachstumsverhalten kultivierter Zellen beeinflusst. Für die Inhibition der Importine in kultivierten humanen Zellen wurde die neu beschriebene RNA-Interferenz Methode verwendet (Elbashir et al., 2001). Hierfür werden die Zellen mit für das Zielgen spezifischen doppelsträngigen RNA-Oligonukleotiden, sog. siRNAs (small interfering RNAs), von genau definierter Länge transfiziert. Mit Unterstützung eines intranu­kleär lokalisierten Nukleasekomplexes, RISC (RNA induced silencing complex), erfolgt die Bindung der siRNAs an die Ziel-mRNA. Die so entstandenen RNA-Komplexe werden über die Endonuklease Dicer in kurze RNA-Fragmente abgebaut (zur Übersicht s. Hannon, 2002).

Zunächst wurde die Halbwertszeit der humanen Importine mittels eines sogenannten cycloheximide decay assays bestimmt. In diesem Versuchsansatz wurde die Translation durch Cycloheximid blockiert und die Abnahme der zellulären Proteinmenge der verschiedenen Importine durch Western blots analysiert. Es zeigten sich für die Importine α1 und α5 Ab­nahmen der Proteinmengen auf 50% bzw. 70% nach 6 Stunden und auf 25% bzw. 50% nach 24 Stunden (V9, Fig. 1). Diese Effekte konnten durch Zugabe des Ubiquitin-Proteasom Inhi­bitors ALLN weitestgehend aufgehoben werden. Im Gegensatz zu den Importinen α1 und α5 war für die anderen Isoformen sowie für Importin β keine Degradation nachweisbar.

Um die Rolle der humanen α-Importine auf das Zellwachstum zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen mit spezifischen, gegen die verschiedenen Isoformen gerichteten siRNAs trans­fi­ziert. Da die Vorexperimente ergeben hatten, dass die meisten Importine sehr stabile Pro­teine sind, wurden die ersten Analysen der Importin α Proteinmengen nach drei- und sieben­tägiger siRNA-Behandlung durchgeführt. Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden [Seite 26↓] HeLa-Zellen mit einer Kontroll-siRNA gegen ein nicht-verwandtes Protein, TRAPα, transfi­ziert. Immunfluoreszenzuntersuchungen ergaben, dass in mehr als 95% der Zellen eine deutli­che Signalreduktion nachweisbar war, während in weniger als 5% der Zellen die Signalinten­sitä­ten denen unbehandelter Zellen glich (V9, suplementary Fig. 1).

Drei Tage nach siRNA-Behandlung konnte nur für Importin α1 eine deutliche Ab­nahme der Proteinmenge nachgewiesen werden, während die Expression der anderen Isofor­men im wesentlichen unverändert war (V9, Fig. 2B). Nach siebentägiger Transfektion war jedoch eine deutliche Abnahme für alle α-Importine nachweisbar (V9, Fig. 2C). Quantifizie­rung durch Vergleich mit Verdünnungskurven von Zelllysaten untransfizierter Zellen zeigten, dass die zelluläre Proteinmenge der verschiedenen Isoformen auf im Mittel 15 bis 30% ihrer Ausgangsmenge herunterreguliert werden konnte. Um zu überprüfen, ob die Ergebnisse nicht durch unspezifische Effekte der jeweiligen siRNAs verursacht waren, wurde für Importin α3 eine zweite siRNA verwendet. Es fanden sich keine nennenswerten Unterschiede im Niveau der Proteinabnahme für Importin α3 zwischen den beiden siRNAs (im Mittel 21% vs. 27%). Im Gegensatz zu den α-Importinen fand sich nur eine geringe, aber reproduzierbare Abnahme der Proteinmenge von Importin β in überlebenden Zellen.

Um den Einfluß der Importin α-Abnahme auf das Wachstum der Zellen zu untersu­chen, wurden die Zellzahlen untransfizierter und transfizierter Zellen nach sieben Tagen be­stimmt und miteinander verglichen. Die Abnahme der Importine α3, α5 und α7 führte zu deutlichen Abnahmen der HeLa-Zellproliferation (V9, Fig. 3). Sieben Tage nach Beginn der siRNA-Transfektionen gegen diese Isoformen waren im Mittel nur weniger als 30% der Zel­len im Vergleich zu nicht mit siRNA transfizierten Kontrollzellen vorhanden. Auch hier zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden verwendeten siRNAs ge­gen Importin α3 (im Mittel 25% vs. 32% der Negativkontrolle). Eine geringe, aber reprodu­zierbare Inhibition der Zellproliferation war auch für die Importin α1-Abnahme nachweisbar. Demgegenüber war nach Abnahme von Importin α4 keine Inhibition der Zellproliferation nachweisbar. Die Hemmung der Importin β Expression führte zu einer den Importinen α3, α5 und α7 vergleichbaren Inhibition des HeLa-Zellwachstums.


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I.4.  Diskussion und Ausblick

Die Aktivierung spezifischer membranständiger Rezeptoren durch extrazelluläre Faktoren wie z. B. Mitogene oder Chemokine resultiert in der Aktivierung diverser intrazellulärer Signal­transduktionskaskaden mit komplexen Kettenreaktionen. Transkriptionsfaktoren werden akti­viert, translozieren in den Zellkern und regulieren die Expression unterschiedlicher Zielgene. Die entstehende mRNA transloziert aus dem Zellkern in das Zytoplasma, um an den Riboso­men in Proteine translatiert zu werden. Diese wiederum können regulatorisch in das Schicksal der jeweiligen Zelle eingreifen und bestimmte Antworten der Zelle wie Proliferation, Apop­tose, Differenzierung etc. verursachen. Die verschiedenen regulatorischen Schritte intrazellu­lärer Signaltransduktionskaskaden sind seit Jahren Gegenstand intensiver Forschung in Medi­zin und Zellbiologie. Eine Vielzahl zentraler regulatorischer Funktionen der unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren für Mechanismen wie Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Pa­thogenese diverser Erkrankungen sind mittlerweile identifiziert. Demgegenüber ist die Unter­suchung der Mechanismen, welche die Translokation von Transkriptionsfaktoren und anderen Makromolekülen zwischen Zytoplasma und Zellkern regulieren, ein sehr junges Forschungs­gebiet.

Der am intensivsten untersuchte nukleozytoplasmatische Importweg ist der „klassi­sche“ Importin α/β-abhängige Importweg. Zwar existieren verschiedene andere, über diverse Importin β-verwandte Faktoren vermittelte Importwege aus dem Zytoplasma durch die Kern­poren in den Zellkern, auf die in dieser Arbeit nicht näher eingegangen wurde, es ist jedoch nur ein humanes Importin β bekannt. Im Gegensatz dazu waren am Anfang der hier vorge­legten Arbeit bereits zwei humane α-Importine beschrieben (Cortes et al., 1994, Cuomo et al., 1994). Da Datenbankrecherchen zeigten, dass noch weitere humane Isoformen existieren mussten, stand am Beginn dieser Arbeit die Identifikation dieser neuen humanen α-Importine. Nach vollständiger Klonierung und Sequenzierung der kompletten cDNAs konnten die vier neu identifizierten und als Importin α3, α4, α6 und α7 bezeichneten Gene zusammen mit den bekannten humanen Importinen α1 und α5 in drei Subfamilien unterteilt werden. Wenige Zeit vor bzw. nach unserer ersten Veröffentlichung über diese neuen Proteine wurden die humanen Importine α3 und α4 als Qip1 bzw. hSRP1γ auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben (Seki et al., 1997, Nachury et al., 1998). Mittlerweile ist bekannt, dass die α-Importine und ihre Subfamilien in höheren Eukaryonten hochkonserviert sind. So konnten für alle humanen α-Importine außer für α6 in der Maus homologe Isoformen mit Identitäten von über 99% nachgewiesen werden (Tsuji et al., 1997). Auch in Drosophila melanogaster und Caenorhab­ditis elegans konnte mittlerweile für jede Subfamilie eine Importin α Isoform identifiziert [Seite 28↓] werden. Demgegenüber ist in der Bierhefe Saccharomyces cerevisiae mit ySRP1p nur ein α-Importin bekannt, dessen Fehlen letal ist (Yano et al., 1992, Yano et al., 1994). Die sich dar­aus ergebende zentrale Frage, welche den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit bildet, war und ist die, ob und wenn ja welche spezifischen Funktionen die verschiedenen humanen α-Importine ausüben oder ob diese redundant sind und sich gegenseitig ersetzen können.

Ein erster Schritt zur Beantwortung dieser Frage waren die Analyse und der Vergleich der zell- und gewebespezifischen Expressionsmuster der Importine. Via Northern blots und Western blots mit selbst hergestellten Antikörpern zeigte sich, dass außer dem testisspezifi­schen Importin α6 alle anderen α-Importine ebenso wie weitere am klassischen Importweg beteiligte Faktoren (Importin β, CAS und Ran) in den meisten Zellen und Geweben nach­weisbar sind. Jedoch unterscheiden sich die relativen Expressionsmuster der verschiedenen α-Importine zum Teil erheblich voneinander. Unterschiede in den Expressionsmustern ver­schiedener α-Importine wurden auch von anderen Arbeitsgruppen berichtet (Kamei et al., 1999, Nachury et al., 1998, Prieve et al., 1996, Tsuji et al., 1997). Diese differentiellen Expressionsmuster der verschiedenen α-Importine waren als ein erster Hinweis auf unter­schiedliche spezifische Funktionen der verschiedenen Isoformen zu werten. Etwas überra­schend war der Befund, dass in manchen Geweben mit relativ starker Expression der α-Importine die Faktoren Importin β, CAS und Ran relativ schwach exprimiert waren und um­gekehrt. Dies könnte darin begründet sein, dass zwar nicht für CAS, jedoch für Ran, Importin β und Importin α mittlerweile andere Funktionen als die der Beteiligung am klassischen nukleozytoplasmatischen Proteinimportweg beschrieben wurden. So ist Ran als Triebkraft für die meisten nukleozytoplasmatischen Import- und Exportwege von essentieller Bedeutung (Moore, 1998). Importin β kann verschiedene Proteine auch ohne Importin α importieren (Jakel und Gorlich, 1998, Muhlhausser et al., 2001). Für Importin α wurde u. a. eine Rolle bei der mRNA Biogenese auf der Stufe der Cap-Methylierung berichtet (Wen und Shatkin, 2000). Alle drei Faktoren, Importin α, β und Ran, scheinen eine wichtige Rolle bei der Formation von Spindel und Kernmembran in der Mitose zu spielen (Askjaer et al., 2002, Geles et al., 2002, Gruss et al., 2001, Nachury et al., 2001, Timinszky et al., 2002, Wiese et al., 2001, Wilde und Zheng, 1999, Zhang et al., 2002). Es ist daher denkbar, dass die differentiellen Expressionsmuster zwischen den α-Importinen einerseits und Importin β und Ran andererseits in den unterschiedlichen Alternativ-Funktionen dieser Faktoren in verschiedenen Geweben begründet sind.

Die rekombinante Expression und Aufreinigung aller fünf ubiquitär exprimierten humanen α-Importine ermöglichte es, ihre Importfunktion mittels eines Kernimport-[Seite 29↓] Versuchssystems in vitro tatsächlich nachzuweisen. Mit diesem Versuchsansatz konnten auch mehrere neue Substrate der α-Importine identifiziert werden. Die spannende Frage war je­doch, ob sich unterschiedliche Substratspezifitäten für die α-Importine nachweisen lassen würden. Zwar konnten in vitro die meisten untersuchten Faktoren, die über den klassischen Importweg in den Zellkern translozieren, prinzipiell von mehreren oder allen humanen α-Importinen in den Kern transportiert werden. RCC1 zeigte jedoch dagegen eine ausgeprägte Präferenz für Importin α3. Durch Kompetitionsversuche mit der gleichzeitigen Zugabe von zwei unter­schiedlich markierten Substraten konnten auch für mehrere andere Substrate unter­schiedliche Importin α-Spezifitäten nachgewiesen werden. Auch andere Arbeitsgruppen fan­den Hinweise für solche substratspezifischen Unterschiede der α-Importine (Nachury et al., 1998, Miyamoto et al., 1997, Nadler et al., 1997, Sekimoto et al., 1997). Allerdings basierten die Daten fast ausnahmslos ebenfalls auf in vitro Versuchen. Lediglich Sekimoto und Mitar­beiter fanden, dass die Injektion eines gegen Importin α5 gerichteten Antikörers in kultivierte Zellen die Interferon α induzierte Translokation des Transkriptionsfaktors Stat1 in den Zell­kern inhi­bierte während die Injektion eines gegen Importin α1 gerichteten Antikörpers keinen Effekt hatte (Sekimoto et al., 1997). In dieser Arbeit wurden jedoch nur zwei der humanen α-Impor­tine analysiert. Zum anderen ist nicht mit Sicherheit auszuschließen, dass es sich um einen unspezifischen Effekt des Antikörpers handelte.

Ein überraschender Befund der in vitro Kernimport-Versuche war, dass RanBP3 trotz einer atypischen nicht-klassischen NLS über den klassischen Importweg in den Zellkern im­portiert werden konnte. Es gibt jedoch auch andere Proteine mit nicht-klassischer NLS, wie z. B. Stat1 oder das Influenza Nucleoprotein, für die eine Importin α/β-abhängige Translokation in den Zellkern beschrieben ist (Sekimoto et al., 1997, Wang et al., 1997). Umgekehrt gibt es Hinweise dafür, dass Proteine mit sehr großer Ähnlichkeit ihrer NLSs, wie die zum Wnt-signaling zählenden Transkriptionsfaktoren LEF-1 und TCF-1, trotzdem über unterschiedliche Transportfaktoren importiert werden können (Prieve et al., 1998).

Zu den hier untersuchten Substraten zählten u. a. auch je ein adeno- und influenzavi­rales Fusionsprotein. Für eine Reihe viraler Proteine sind die Faktoren, die den Import in den Zellkern regulieren, mittlerweile beschrieben. Für die meisten von ihnen wird eine Importin α-abhängige Translokation in den Zellkern vermutet (Chou et al., 1998, Fischer et al., 1997, Fontes et al., 2000, Gallay et al., 1996, Giesen et al., 2000, Goodwin und Whitehouse, 2001, Kann et al., 1999, Kim et al., 1997, La Boissiere et al., 1999, Merle et al., 1999, Nelson et al., 2002, O'Neill et al., 1995, Popov et al., 1998, Wang et al., 1997). Andere virale Proteine da­gegen scheinen unabhängig von Importin α in den Zellnukleus zu translozieren (Efthymiadis [Seite 30↓] et al., 1998, Gallay et al., 1996, Ojala et al., 2000, Palmeri und Malim, 1999, Sherman et al., 2001, Truant und Cullen, 1999). Bisher war jedoch noch für kein virales Protein eine Präfe­renz für eines der α-Importine beschrieben. Während in den hier dargelegten Versuchen für das Influenza Nucleoprotein keine Importin α-Spezifität nachweisbar war, konnte eine Präfe­renz des adenoviralen E1A für Importin α3 gezeigt werden. Diese Spezifität des nukleo­zytoplasmatischen E1A-Imports lässt die Notwendigkeit einer besonderen Regulation dieses Virusproteins vermuten.

Die hier gezeigten Untersuchungen der Hefe-Untereinheiten des NAC-Komplexes führten zu folgenden Hauptbefunden: 1) NAC-Untereinheiten können tatsächlich zwischen Zytoplasma und Zellkern translozieren. 2) Der Import von NAC-Untereinheiten kann über verschiedene Importwege stattfinden. 3) Die NAC-NLS, über die der Kap123p/Pse1p ver­mittelte Import der NAC-Untereinheit Egd1p stattfindet, ist zwischen den Aminosäuren 11 und 17 lokalisiert. Bis dato war bekannt, dass der NAC-Komplex wichtige Funktionen am Ribosom bei der Proteinsynthese ausübt. Es gab jedoch vereinzelte Hinweise auf zusätzliche Funktionen der NAC-Proteine im Zellkern. Die hier vorgelegten Daten lassen vermuten, dass die NAC-Proteine in den Kern translozieren, um dort an ribosomale Proteine zu binden und mit diesen zusammen zu ihrem eigentlichen Ziel, den Ribosomen, zu gelangen. Zwar ist für mehrere Proteine wie Histone und ribosomale Proteine bekannt, dass sie in Abhängigkeit von verschiedenen β-homologen Importinen in den Zellkern translozieren können (Jakel und Gor­lich, 1998, Muhlhausser et al., 2001); Berichte über Substrate, die wie hier berichtet sowohl über den klassischen Importin α/β-vermittelten Importweg als auch über alternative Wege in den Zellkern importiert werden können, sind jedoch bisher rar (Savory et al., 1999). Diese Daten deuten in der Gesamtschau darauf hin, dass es einerseits überreichlich in der Zelle vor­handene essentielle Proteine gibt, deren Transport in den Zellkern über verschiedene Import­wege sichergestellt ist. Demgegenüber stehen andere Faktoren, deren nukleozytoplasmatische Translokation durch hohe Spezifität für wenige oder sogar nur einen bestimmten Importfaktor eng kontrolliert und damit auch stärker regulierbar erscheint.

Die Ergebnisse der hier vorgelegten in vitro Studien sowie der Arbeiten anderer Grup­pen bzgl. differentieller Expressionsmuster und unterschiedlicher Substratspezifitäten der α-Importine ließen spezifische Funktionen der verschiedenen Isoformen in vivo vermuten. Um in späteren Untersuchungen die Hypothese zu testen, dass verschiedene α-Importine an der Regulation von Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Pathogenese von Krankheiten be­teiligt sind, wurde in ersten hier vorgelegten Untersuchungen analysiert, ob die α-Importine in verschiedenen Zellkultur- und Tiermodellen differentiell reguliert sind. In diesen Arbeiten [Seite 31↓] konnte zum einen gezeigt werden, dass sich die humanen α-Importine nicht nur in ihren rela­tiven, sondern auch in ihren absoluten Expressionsstärken in verschiedenen Zellen zum Teil deutlich voneinander unterscheiden. Des weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Expressionsmuster der verschiedenen Isoformen durch diverse externe Stimuli in unter­schiedlichen Zellkulturmodellen für Proliferation und Differenzierung differentiell reguliert werden. Dabei zeigte sich, dass manche Importine wie α3 und α5 nur wenig reguliert wurden und sich eher wie „housekeeping“ Gene verhielten. Andere Isoformen wie α1, α4 und α7 da­gegen schienen stärker und rascher durch externe Stimuli reguliert zu sein, was sie als Ziele für die Regulation zellulärer Prozesse wahrscheinlicher erscheinen lässt. Erste Hinweise für eine mögliche Rolle von α-Importinen bei der Pathogenese von Krankheiten ergaben sich bei den vorgelegten Studien über die Regulation der α-Importine in unterschiedlichen Diabetes-Modellen der Ratte sowie in Abhängigkeit von hohen Glukosekonzentrationen in verschiede­nen kultivierten Zellen. Da die hier gezeigten diesbezüglichen Daten jedoch noch rein de­skriptiver Natur sind, müssen nachfolgende funktionelle Analysen abgewartet werden, um beurteilen zu können, ob und wenn ja welche regulatorischen Rollen die diversen Importin α Isoformen bei der Pathogenese von Erkrankungen wie dem Diabetes mellitus tatsächlich spielen.

Diese zuletzt erwähnten deskriptiven Studien sind jedoch besonders interessant vor dem Hintergrund neuester Daten der eigenen wie auch anderer Arbeitsgruppen über die Ef­fekte der Inhibition einzelner α-Importine in lebenden humanen Zellen bzw. in ganzen Orga­nismen (Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans). Wie unter 3.7 dargelegt, führte die Herunterregulation der Proteinniveaus der Importine α3, α5 sowie α7 in humanen HeLa-Zellen mit Hilfe der kürzlich beschriebenen RNA-Interferenz Methode auf im Mittel ca. 20% jeweils zu einer deutlichen Inhibition der Zellproliferation. Diese Daten deuten dar­auf hin, dass die Importine α3, α5 und α7 essentiell für die Proliferation von HeLa-Zellen sind. Das würde auch bedeuten, dass interessanterweise weder die stark homologen Isoformen α5 und α7, noch die zu einer gemeinsamen Subfamilie zählenden Importine α3 und α4 sich gegenseitig in ihren Funktionen ersetzen könnten. Da sich in ersten Experimenten auch zeigte, dass die Inhibition der Importin α3 Expression in humanen renalen Mesangiumzellen eben­falls zu einer Proliferationsinhibition führen, scheinen die α-Importine auch für andere humane Zellen essentiell zu sein (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu den anderen Isofor­men waren die inhibitorischen Einflüsse auf die HeLa-Zellproliferation nach Herunterregula­tion von Importin α1 und α4 nur gering bzw. gar nicht nachweisbar. Selbst eine Herunterre­gulation des Proteinniveaus von Importin α4 auf 10% in einem der Experimente, was in etwa [Seite 32↓] der Zahl der untransfizierten Zellen entsprechen dürfte, führte nicht zu einem signifikanten Abfall der Zellzahl. Es ist daher anzunehmen, dass Importin α4 keine größere Rolle bei der Regulation der Proliferation von HeLa-Zellen spielt. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass eine komplette Inhibition von Importin α4 ebenfalls einen Einfluß auf die zelluläre Prolifera­tion hat. Die Inhibition der Importin β Expression war als Positivkontrolle gedacht, da Impor­tin β neben seiner Rolle als zentraler Importfaktor des klassischen nukleozytoplasmatischen Proteinimportweges verschiedene Substrate auch ohne Importin α importieren kann (Gorlich und Kutay, 1999). Der Effekt der Inhibition der Zellproliferation durch Hemmung der Impor­tin β Expression, der vergleichbar war mit den Effekten von Importin α3, α5 und α7, war da­her erwartet. Allerdings deutete die nur geringe Abnahme der Menge an Importin β in den noch verbliebenen überlebenden Zellen darauf hin, dass im Gegensatz zu den α-Importinen bereits eine geringe Abnahme der Menge an Importin β das Wachstum der jeweiligen Zelle verhinderte.

Bis dato ist wenig bekannt über die Bedeutung der Existenz verschiedener α-Importine in vivo. Die bisher verfügbaren Informationen waren auf Nicht-Vertebraten beschränkt. Die essentielle Bedeutung des einzigen α-Importins in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, ySRP1p, war schon vor seiner Identifikation als nukleozytoplasmatischer Importfaktor be­kannt (Yano et al., 1994). Mathe und Mitarbeiter zeigten, dass die Mutation von Drosophila-Importin α3 zum Absterben bzw. zum Stillstand der Oogenese überlebender Fliegen führt (Mathe et al., 2000). Eine ähnliche Rolle von Importin α3 wurde für die Embryonal- und Lar­venentwicklung in C. elegans beschrieben (Geles und Adam, 2001). Drosophila Importin α2, welches das Homologe des humanen α1-Importins ist, scheint wegen seiner zentralen Rolle bei der Assemblierung des Ringkanals für die Oogenese von essentieller Bedeutung zu sein, während seine Funktion bei der Spermatogenese von den beiden anderen Drosophila Importin α Proteinen übernommen werden kann (Gorjanacz et al., 2002, Mason et al., 2002). Kürzlich wurde eine Rolle des C. elegans α Importins IMA-2 für den Zusammenbau der Kernmembran beschrieben (Askjaer et al., 2002, Geles et al., 2002). So können also das Fehlen oder die In­hibition einer der drei Importin α-Isoformen, die jeweils in D. melanogaster und C. elegans vorhanden sind, unterschiedliche Phänotypen verursachen. Obwohl sie aber nur ca. 50% Identität zueinander besitzen, scheinen sie sich dennoch zumindest zum Teil in ihren Funktio­nen ersetzen zu können. Es war daher ein überraschender Befund, dass ein Mangel eines humanen α-Importins bei den meisten Isoformen so dramatische Effekte auf die HeLa-Zell­proliferation bewirkte. Sogar Isoformen der gleichen Subfamilie mit hohen Homologien wie die Importine α5 und α7 konnten einander in ihrer Funktion nicht ersetzen. Verschiedene in [Seite 33↓] vitro Studien hatten gezeigt, dass sich die α-Importine in ihren Substratspezifitäten unter­scheiden, dass sie aber ebenso fähig waren, identische Substrate zu importieren (Franke et al., 2001, Kohler et al., 1999b, Kohler et al., 2001, Nachury et al., 1998, Miyamoto et al., 1997, Welch et al., 1999). Es ist daher anzunehmen, dass für die beschriebenen Effekte Importspezi­fitäten der verschiedenen α-Importine für bestimmte Substrate, welche essentielle Funktionen bei der Regulation der Zellpro­liferation ausüben, verantwortlich sind. Diese Befunde deuten auf eine zunehmende Spezifität der α-Importine während der Evolution hin, die in einer zu­sätzlichen Stufe der Regulation der Signaltransduktionskaskaden resultiert haben könnte. Das Fehlen einer kompensatorischen Hochregulation anderer α-Importine unterstützt diese Hypo­these. Man könnte spekulieren, dass die Plastizität der nukleozytoplasmatischen Importwege während der Evolution verloren gegangen ist und dafür ein höherer Grad an Spezialisierung erreicht wurde. Dies dürfte ein generelles Phänomen von Zellen höherer Eukaryonten sein.

Derzeit sind die Mechanismen, welche die durch Importin α-Mangel verursachte Ab­nahme der Zellzahl verursachen, unklar. Ein klarer Apoptosenachweis nach RNA-Interferenz induzierter Importin α Inhibition konnte nicht gezeigt werden (V9, Daten nicht gezeigt). Zum einen wurden jedoch auch keine nennenswerten Mengen an abgelösten toten Zellen nach Importin α Inhibition nachgewiesen. Des weiteren wurde berichtet, dass die Überexpression von Importin α1 zu einem Anstieg der zellulären Apoptose führt (Kim et al., 2000), so dass der fehlende Nachweis einer gesteigerten Apoptose in Importin α depletierten Zellen keine Überraschung darstellte.

Zusammenfassend lässt sich resümieren, dass in der vorliegenden Arbeit die Identifi­kation und Klonierung neuer Isoformen der humanen Importin α Proteinfamilie beschrieben wurde. Nach der Analyse der Gewebeverteilung konnte in vitro die tatsächliche Importfunk­tion der neu identifizierten α-Importine verifiziert sowie unterschiedliche Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Neueste Untersuchungen in kultivierten Zellen zeigen, dass sich die meisten Importin α Isoformen nicht generell ersetzen können, sondern spezifische Funktionen auszuüben scheinen. Differentielle Expressionsmuster deuten daraufhin, dass die α-Importine zentrale Bedeutung nicht nur für Zellproliferation, sondern auch für Zelldifferenzierung und Pathogenese von Krankheiten haben könnten.

In weiterführenden Experimenten sollen zum einen die Ursachen für die Inhibition der Zellproliferation bei Importin α-Mangel geklärt werden. Durch sogenannte yeast two-hybrid Versuche sollen neue Substrate der humanen α-Importine identifiziert werden, um die Frage zu klären, welche Faktoren die unterschiedlichen Substratspezifitäten begründen. Bindungs­studien mit verschiedenen Substraten und unterschiedlichen Teilsequenzen diverser humaner [Seite 34↓] α-Importine, die in Zusammenarbeit mit einer finnischen Arbeitsgruppe um Dr. I. Julkunen stattfinden, liefern diesbezüglich aktuell neue Einsichten (Melen et al., eingereicht). Zu­sätzli­che Antwort auf diese Frage sollten Untersuchungen bzgl. der Strukturunterschiede der ver­schiedenen α-Importine durch Kristallisierungsexperimente ergeben, welche derzeit in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. B. Kobe, Australien, durchgeführt werden. Der Frage, welche Rolle einzelne α-Importine für die Funktion des Gesamtorganismus höherer Eukaryonten spielen, wird derzeit durch Generierung unterschiedlicher knock-out Mäuse in Zusammenarbeit mit PD Dr. M. Bader am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin untersucht. Aktuell gefundene Hinweise auf eine zentrale Bedeutung der α-Importine für in­trazelluläre Signalmechanismen in verletzten Neuronen sind ein weiteres Indiz für die wich­tige Bedeutung der Importine in vivo (Hanz et al., eingereicht).


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12.02.2004