König, Frank : Minimal-invasive Diagnostik des UrothelKarzinoms mit dem Schwerpunkt Anwendung neuer bildgebender Techniken in der Endoskopie

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Kapitel 3. Orientierende Verfahren

3.1 URIN- DIAGNOSTIK

Urin ist leicht zu gewinnen und stellt somit ein ideales Medium zur nicht- invasiven Diagnostik und Nachkontrolle von Patienten mit Karzinomen der ableitenden Harnwege dar.

Die zytologische Untersuchung gilt derzeit nach wie vor als Standardverfahren in der Urin- Diagnostik des Urothelkarzinoms, an welchem alle neuen Methoden gemessen werden. Die abgeschilferten Urothelzellen, welche im Urin erscheinen, werden durch den Zytologen hinsichtlich ihrer morphologischen Abnormalitäten analysiert. Dabei spielen u.a. Zellform, Größe, Chromatinstruktur, prominente Nucleoli, Mitosefiguren und Kern- Plasma- Relationen eine wesentliche Rolle. Da diese Abnormalitäten bei hoch-differenzierten G1- Zellen jedoch kaum nachweisbar sind, schwankt die Detektionsrate von Urothelkarzinomen zwischen 50% und 90% in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad der Zellen. Hochmaligne niedrig- und entdifferenzierte Zellen einschließlich das CIS werden mit einer bis zu 90%igen Sicherheit durch die Urin- Zytologie erfasst. Die Flow- Zytometrie, welche den DNA- Gehalt und dadurch den Anteil von aneuploiden Zellen im Urin bestimmt, zeigt keine signifikanten Vorteile gegenüber der konventionellen Zytologie. Hochdifferenzierte oberflächliche Urothelkarzinome sind oft diploid und führen daher zu falsch negativen Ergebnissen. Ob mit der Bestimmung weiterer Parameter das diagnostische Potential der Flowzytometrie verbessert werden kann, bleibt abzuwarten.

Auf Grund der unbefriedigenden Situation in der Urin- Diagnostik ist die Bestimmung von neuen Tumormarkern Gegenstand einer weltweiten intensiven Forschung. Zusammenfassend lässt sich jedoch feststellen, dass bisher keiner der neuen Marker in der klinischen Routinediagnostik angewendet wird [Artikel E1]. Trotz vielversprechender Ansätze und Ergebnisse liegen meist nur kleine Fallzahlen eines selektierten Patientengutes vor bzw. es fehlen vergleichende prospektiv- randomisierte Studien. Oft sind die entsprechenden Tests für den täglichen Gebrauch zu teuer und/oder zu aufwendig. Zusätzlich erschwert die fehlende Standardisierung der einzelnen Verfahren (Präanalytik, verwendete Antikörper und Reagenzien, Testablauf, Interpretation der Ergebnisse) den


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Vergleich der zahlreichen Studien. Bevor ein Verfahren in der Routinediagnostik eingesetzt werden kann, sollte die neue Methode verschiedenen Anforderungen genügen. Der Urintest sollte

Prinzipiell können am zentrifugierten Urin der Überstand und das Zellsediment analysiert werden. Als Methoden stehen z.B. die Immunhistochemie, die DNA- Sequenzanalyse und die Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Verfügung. Bestimmt werden u.a. Tumor- assoziierte Antigene; Blutgruppenantigene; Proliferationsmarker; Gene und Genprodukte, welche den Zellzyklus und die Apoptose regulieren sowie Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren [Artikel E1]. In eigenen Studien untersuchten wir im Urin die potentiellen Tumormarker MMP 2 und 9 sowie die Cathepsine B,H,L [Artikel K1-K3].

MMP‘s gehören zu einer Gruppe von Enzymen, welche am Abbau und der Neuformierung extrazellulärer Matrix beteiligt sind. In verschiedenen Studien konnte ihre Bedeutung beim Invasions- und Metastasierungsprozess von Tumoren (Brust, Ovar, Magen, Lunge, Gehirn) nachgewiesen werden.1-4 Für Tumore der Blase konnte eine erhöhte Urin- Expression für MMP 2 und 9 nachgewiesen werden.5-7 Unserer Kenntnis nach wurde jedoch bisher keine vergleichende Studie von MMP 2 und 9 bei Patienten mit Tumoren, Entzündungen und gesunden Probanden durchgeführt.

Cathepsine sind lysosomale proteolytische Enzyme, welche zur Gruppe der Cystein- Proteinasen gehören. Sie bauen u.a. Bestandteile von Basalmembranen ab, wie z.B. Laminin, Collagen oder Elastin. Cathepsine wurden verstärkt bei invasiven und metastasierten Tumoren in verschiedenen Organen einschließlich Prostata und Niere gefunden.8-11 In einer kleinen Studie mit 22 Blasentumor- Patienten wurde lediglich Cathepsin B im Urin untersucht und eine erhöhte Expression bei Karzinomen festgestellt.12


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In der eigenen Studie zu den MMP‘s wurden insgesamt 85 Patienten mit Blasentumoren unterschiedlichen Stadiums oder entzündlichen Veränderungen der Blase (43 x Ta-1, 18 x T2, 10 x T3-4, 14 Blasenentzündungen) sowie 44 Probanden ohne Blasenläsionen untersucht. In die Studie zu den Cathepsinen wurden 43 Patienten mit oberflächlichen Tumoren (Ta/1) und 27 Patienten mit muskelinvasiven Tumoren (geT2) eingeschlossen. Zum Vergleich wurden auch 14 Urinproben von Patienten mit entzündlichen Veränderungen und 43 gesunde Probanden untersucht. Im Ergebnis der Studien zeigte sich, dass die Expression von MMP 2 und 9 sowie Cathepsin L im Urin deutlich mit der Invasionstiefe (Staging) und dem Differenzierungsgrad (Grading) der untersuchten Tumore korrelierte. Dies weist auf eine mögliche Bedeutung als Progressionsmarker hin. Weitere prospektive Untersuchungen an einem größeren Patientenkollektiv sind jedoch nötig, um dass diagnostische Potential dieser Urin- Marker zu bestätigen.

3.2 ALS- Fluoreszenzzystoskopie

Die auf der 5-Aminolävulinsäure (ALS)- induzierten Protoporphyrin IX (PPIX)- Fluoreszenz basierende Fluoreszenzzystoskopie ist ein vielversprechendes sehr sensitives diagnostisches Verfahren, welches an mehreren Zentren bereits klinisch routinemäßig eingesetzt wird. Dieses Verfahren wurde erstmals 1993 durch BAUMGARTNER et al. beschrieben und beruht auf der Anreicherung von PPIX in neoplastischen Zellen nach intravesikaler Instillation einer ALA-Lösung.13 ALA und PPIX sind körpereigene Substanzen und Vorstufen des roten Blutfarbstoffs Häm. Die Methode ist dadurch praktisch frei von Nebenwirkungen. Dies ist auch darauf zurückzuführen, dass die PPIX- Anreicherung nachweislich (fluoreszenzmikroskopisch, [Artikel K4]) auf das Urothel beschränkt ist und somit keine systemischen phototoxischen Reaktionen auftreten. Im Gegensatz zu ALS ist PPIX ein sog. Photosensitizer, welcher unter Bestrahlung mit blauem Licht rot fluoresziert und dadurch für die Photodiagnostik nicht nur des Blasenkarzinoms eingesetzt werden kann. Der technische Aufwand ist vergleichsweise gering und bedarf einer modifizierten Xenon-Lichtquelle mit eingebauten Filtern für die wahlweise Benutzung von Weiß- oder Blaulicht. Zusätzlich ist der Einsatz spezieller Optiken notwendig, welche durch eingebaute Filter die Ausblendung des


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größten Teils des intensiven blauen Anregungslichtes bei gleichzeitiger Durchlässigkeit für die schwache Rotfluoreszenz erlauben [Artikel E2].

Kürzlich veröffentlichten Zaak et al. Untersuchungen mit insgesamt 2.475 Blasenbiopsien (1.012 Fluoreszenzzystoskopien in 605 Patienten), welche zeigten, dass in 34% der Zystoskopien neoplastische Läsionen durch die Standard- Weißlichtzystoskopie übersehen und nur aufgrund der PPIX- Fluoreszenz entdeckt wurden.14

Eigene Untersuchungen bestätigten das diagnostische Potential dieser Methode [Artikel E3]. Das Anliegen dieser initialen Zulassungsstudie in den USA war die Bestimmung der diagnostischen Validität von 5-ALS-induzierter PPIX- Fluoreszenz für die Früherkennung des Blasenkarzinoms.

In die Studie wurden 55 Patienten mit bekanntem oder mit Verdacht auf ein Blasenkarzinom eingeschlossen. Bei allen Patienten wurden präoperativ 50 ml einer 3% ALS- Lösung intravesikal appliziert. Die nachfolgende Zystoskopie wurde unter weißem (Standard) sowie unter blauem Licht mittels einer modifizierten Xenon- Lichtquelle durchgeführt. Bei 49 Patienten wurden insgesamt 130 Blasenbiopsien durchgeführt. Die Gewebeproben wurde in Formalin fixiert und zur pathologischen Untersuchung eingesandt.

Fluoreszenzuntersuchungen wurden an 63 nichtmalignen sowie an 67 malignen/dysplastischen Blasenarealen durchgeführt. Zehn maligne/dysplastische Läsionen (4 Karzinome, 2 CIS, 4 Dysplasien) wurden während der Weißlichtzystoskopie übersehen und konnten nur mit Hilfe der Fluoreszenzmethode gefunden werden. Die Fluoreszenzzystoskopie verbessert damit im Vergleich zur Standard- Weißlichtzystoskopie die Diagnostik von malignen/ dysplastischen Läsionen um 18%. Betrachtet man ausschließlich dysplastische Veränderungen und das CIS, so wird die Diagnostik dieser Läsionen um 50% verbessert. Insgesamt hat das Verfahren bezüglich der Detektion von malignen/ dysplastischen Blasenveränderungen eine Sensitivität von 87% und eine Spezifität von 59%. Bei kombinierter Anwendung von Weiß- und Blaulichtzystoskopie erhöht sich die Sensitivität auf 99%. Nach intravesikaler Instillation von ALS wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit der vorgestellten Methode die


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Diagnostik des Blasenkarzinoms deutlich verbessert werden kann. Die Vorteile des Verfahrens sind:

Damit stellt die ALS- induzierte PPIX- Fluoreszenzzystoskopie ein hoch-sensitives orientierendes bildgebendes Verfahren dar, welches derzeit die einzige klinisch anwendbare Alternative zur Standard- Weißlichtzystoskopie ist. In einer derzeit laufenden prospektiv- randomisierten Studie konnte für die Fluoreszenzmethode im Vergleich zur Standard- TURB bereits eine Senkung der Residualtumorrate um 59% gezeigt werden [Artikel K5]. Erste Auswertungen 3 und 6 Monate nach primärer Fluoreszenzresektion lassen auch eine deutliche Senkung der Rezidivrate erwarten.

3.3 Autofluoreszenz

Bestimmte Biomoleküle im Gewebe sog. Fluorophore sind nach Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge in der Lage, die aufgenommene Energie wieder als Licht abzustrahlen (Autofluoreszenz). Die Wellenlänge dieses Fluoreszenzlichtes ist charakteristisch für das angeregte Molekül. Die Intensität der abgestrahlten Gewebefluoreszenz ist von der Konzentration der Fluorophore sowie von der Blutabsorption abhängig. Bekannte Fluorophore des menschlichen Organismus sind z.B. Kollagen, NADH (reduzierte Form des Nicotinsäureamid-adenin-dinucleotid), Flavine, Porphyrine oder Tryptophan. In der Blase wird vor allem Kollagen und NADH eine Bedeutung beigemessen. Licht im Wellenlängenbereich von 300-365 nm (ultraviolettes Licht) entspricht dem Absorptionsverhalten dieser Biomoleküle und ist daher zur Anregung der Autofluoreszenz von Blasengewebe geeignet. Es stellt sich die Frage, ob die im Rahmen der Tumorentwicklung möglicherweise auftretenden Konzentrations- änderungen von Fluorophoren oder morphologische Veränderungen des


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Blasengewebes durch Messung der Autofluoreszenz nachweisbar sind.

In eigenen Untersuchungen haben wir das diagnostische Potential der Laser- induzierten Autofluoreszenz (LIF) unter Verwendung eines N2 - Lasers bei 130 verdächtigen Zystoskopiebefunden getestet [Artikel E4, E5]. Nach Etablierung eines diagnostischen Algorithmus während einer initialen Studie [Artikel E4] erfolgte die Validierung in einer prospektiven Studie [Artikel E5]. Bei den untersuchten Blasenarealen war intraoperativ mit der Standard-Weißlichtzystoskopie keine eindeutige Zuordnung (maligne, nichtmaligne) möglich, so dass Biopsien durchgeführt wurden.

Der histologischen Untersuchung zufolge waren über 80% der unter Weißlicht verdächtigen Läsionen gutartige Veränderungen des Urothels. Die gemittelten LIF- Spektren von normalem Urothel, CIS und Karzinomen zeigten signifikante Unterschiede. Der berechnete Mittelwert der Fluoreszenzmaxima normaler Schleimhaut liegt bei 385 nm und der von Karzinomen bei 455 nm. Aufgrund der gefundenen Ergebnisse wurde der Quotient der Fluoreszenzintensitäten (LIF- Quotient) bei den o. g. Wellenlängen (I385/I455) als Parameter zur Differenzierung der verschiedenen Gewebeveränderungen verwendet. Die Mittelwerte der LIF- Quotienten von nichtmalignen Arealen unterscheiden sich signifikant (p< 0.001) von denen der malignen Bezirke. Der Unterschied zwischen Karzinomen und CIS war nicht signifikant (p = 0.47). Es fand sich jedoch ein signifikanter Unterschied zwischen CIS und nichtmalignem Gewebe (p < 0.005), zwischen CIS und akut/chronischen Entzündungen der Blase (p < 0.003) sowie zwischen CIS und proliferativen nichtmalignen Arealen (p < 0.05). Die statistische Analyse der Daten zeigte, dass 95% der malignen Blasenareale LIF- Quotienten unter 1.78 aufwiesen. Bei der Anwendung dieses Wertes als diagnostisches Kriterium zur Differenzierung von malignen und nichtmalignen Läsionen könnte die Zahl der Biopsien von nichtmalignen Arealen um 72% verringert werden.

Es handelt sich bei der Methode um einen simplen quantitativen Test, welcher Daten in Echtzeit während der Zystoskopie liefert. Damit steht dem Untersucher ein objektiver Parameter zur Verfügung, welcher die Entscheidung zur Biopsie eines verdächtigen Areals erleichtert. Da der diagnostische Algorithmus lediglich auf zwei Wellenlängen basiert, ist die Entwicklung eines bildgebenden Verfahrens


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möglich. Die praktische Umsetzung eines patentierten optischen Systems (siehe Abbildung S.14) ist zur Zeit Gegenstand der Forschung [Zitat E12]. Auch die LIF könnte als orientierendes bildgebendes Verfahren zur Diagnostik von epithelialen Tumoren eingesetzt werden; ob als alleiniges diagnostisches System oder in Verbindung mit der ALS- Fluoreszenzmethode müssen zukünftige klinische Studien zeigen.

3.4 Reflektion

In Tierstudien konnte gezeigt werden, dass sich normales Blasengewebe sowie entzündliche und maligne Blasenläsionen hinsichtlich ihres Blutgefäßmusters und ihrer Durchblutung deutlich voneinander unterscheiden.15-17 Des weiteren konnte eine Korrelation zwischen Gefäßdichte des Tumors und dem Risiko von Fernmetastasen nachgewiesen werden.18 Durch spektroskopische Messung der diffusen Reflektion von Weißlicht im Bereich von 450 nm bis 700 nm können verschiedene Parameter der Gewebedurchblutung auf einfache Weise gemessen werden. Dazu gehören die Blutabsorption, die Gesamtblutmenge, die Lichtstreuung, die Hämoglobinkonzentration und die Sauerstoffsättigung.

Zur Einschätzung des diagnostischen Potentials der o.g. Parameter für die Detektion des Urothelkarzinoms haben wir erstmals in- vivo- Untersuchungen in der humanen Blase durchgeführt [Artikel E6]. Als Lichtquelle diente Standard- Weißlicht, welches üblicherweise zur Ausleuchtung der Blase während der Zystoskopie genutzt wird. Über eine Quarzfaser (0.6 mm im Durchmesser), welche über den Arbeitskanal des Zystoskopes in die Blase eingeführt wurde, erfolgte die spektroskopische Analyse des von der Blasenschleimhaut reflektierten Weißlichtes.

Insgesamt wurden 14 Patienten mit bekannten Blasentumoren in die Studie eingeschlossen. Untersucht wurden 26 verschiedene Blasenareale, von welchen nach der Messung Gewebeproben entnommen worden sind. Der histologischen Analyse zu Folge erfolgten die spektroskopischen Messungen an 6 normalen und 7 entzündlich veränderten Arealen sowie an 2 Plattenepithelmetaplasien, 2 Dysplasien und 9 Karzinomen (2xTaG2, 1xT1G3, 2xT2G3, 4xCIS). Von allen untersuchten Parametern der Durchblutung zeigte lediglich die Gesamtblutmenge


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signifikante Unterschiede (p=0.005) beim Vergleich von malignen und nicht-malignen Veränderungen der Blasenschleimhaut.

Abbildung 1: Schematische Abbildung eines bildgebenden LIF- Systems bestehend aus zwei Schwarz- Weiss- CCD (charged coupled device)- Kameras zur getrennten Aufnahme der Fluoreszenzbilder bei 385 nm und 455 nm und einer dritten Farb- CCD- Kamera für das normale Zystoskopiebild. Der Frame Integrator und der Image Divider dienen zur Integration (syn. Ratio, Quotient) der beiden Fluoreszenzbilder zu einem resultierendem LIF- Bild (aus Publikation E12).

In der Gruppe der malignen Läsionen zeigten muskelinvasive Karzinome (geT2) und das CIS erwartungsgemäß eine signifikant höhere Blutkonzentration im Vergleich zu oberflächlichen Tumoren (Ta, T1). Keine signifikanten Unterschiede ergab der Vergleich von Karzinomen und entzündlichen Veränderungen.

Die spektroskopische Analyse von reflektiertem Weißlicht ist einfach und ohne größeren technischen Aufwand während der zystoskopischen Untersuchung durchzuführen. Die Ergebnisse stehen in Echtzeit zur Verfügung und können


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somit noch im OP in den diagnostischen Entscheidungsprozess einfließen. In unserer Studie konnten 10 von 11 malignen Tumoren als solche durch die Messung der Blutkonzentration identifiziert werden. Das CIS konnte in jedem der vier Fälle als maligne eingestuft werden. Auf Grund der kleinen Fallzahl, kann derzeit nicht beurteilt werden, inwiefern eine Differenzierung von flachen malignen und entzündlichen Blasenveränderungen möglich ist. Basierend auf unseren Ergebnissen und der leichten technischen Durchführbarkeit der Reflektionsmessungen sollte in größeren prospektiven Studien die klinische Anwendbarkeit der Methode überprüft werden. Dies schließt auch die Evaluierung der möglichen prognostischen und prediktiven Aussagekraft hinsichtlich des Auftretens von Fernmetastasen ein.

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Tue Sep 17 13:34:30 2002