Krabatsch , Thomas : Untersuchungen zu klinischem Stellenwert und zugrundeliegenden Mechanismen der transmyokardialen Laserrevaskularisation

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Kapitel 4. Untersuchungen zu zugrundeliegenden Mechanismen der transmyokardialen Laserrevaskularisation - Histologische Analyse

4.1 Aufgabenstellung

Bis heute ist die Frage, ob die Laserkanäle im Langzeitverlauf wirklich offen bleiben oder nicht, noch nicht vollständig geklärt. Sowohl aus tierexperimentellen als auch aus klinisch-autoptischen Befunden wurden Arbeiten publiziert, die zum Teil ein Offenbleiben der Kanäle klar verneinen, anderenteils aber auch offene Kanäle fanden. Das vorliegende Kapitel soll die histologischen Befunde nach transmyokardialer Laserrevaskularisation systematisch analysieren und versuchen, die Frage, ob die Laserkanäle tatsächlich offen bleiben oder nicht zu beantworten und darüber hinaus Rückschlüsse auf einen möglichen Wirkmechanismus des Verfahrens zu ziehen.

Die hier präsentierten Ergebnisse wurden teilweise bereits 1996 im Journal of Cardiac Surgery publiziert [205]. In der Folgezeit konnten sie durch die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen bestätigt werden [100, 102, 149, 187, 188, 253, 373, 374, 385, 403, 452]. Dennoch gibt es auch heute noch einzelne Zentren, die die Ansicht vertreten, die transmyokardiale Laserrevaskularisation basiere auf dem Blutfluß durch endothelialisierte, offene Laserkanäle.

4.2 Methodik

Zwölf der 168 durch eine alleinige TMLR behandelten Patienten verstarben perioperativ. Die Angehörigen von 7 der 12 verstorbenen Patienten willigten in eine Sektion ein. Zwei weitere Herzen konnten nach einem längeren Zeitraum untersucht werden (s.u.). In Tabelle 27 ist ein Überblick über anamnestische und klinische Daten zu den 7 perioperativ verstorbenen Patienten und ein Vergleich mit dem Gesamtpatientengut dargestellt.

In Zusammenarbeit mit dem Pathologischen Institut des Rudolf-Virchow-Klinikums der Charité Berlin erfolgte eine detaillierte histologische Untersuchung der 9 Herzen, bei denen ursprünglich insgesamt mehr als 250 Laserkanäle angelegt worden waren.

Nach der Explantation wurden die Herzen zunächst gespült und für mindestens 3 Wochen in toto in 10%iger neutral gepufferter Formalinlösung fixiert. Insbesondere bei den perioperativ verstorbenen Patienten waren häufig die Kanalöffnungen auf der Endocard- oder Epicardseite sichtbar (Abb. 20). Die Vorder-, Seiten- und Hinterwand des linken Ventrikels wurde zunächst in Blöcke von maximal 20 mm Kantenlänge geschnitten. Das Schneiden der Präparate erfolgte bei Blöcken mit sichtbaren Kanalöffnungen längs zum vermuteten Kanal. Blöcke ohne makroskopisch sichtbare Kanalöffnungen wurden in Würfel von 5 mm Kantenlänge zerschnitten. Alle so gewonnenen Primärblöcke wurden sodann in Paraffin eingebettet und zu Präparaten mit einer Schichtdicke von 6-8 µm weiterverarbeitet.

Auf diese Art wurden ca. 500 Präparate gewonnen. Neben der üblichen Haematoxylin-Eosin- und Elastica-van-Gieson-Färbung kamen verschiedene immunhistologische Färbemethoden auf Basis der Avidin-Biotin-Methode zur Anwendung. Als primäre Antikörper verwendeten wir CD 68 (DAKO Clone KP1, 1:4000) zur Darstellung von Makrophagen. Dieser Antikörper färbt zudem periphere Blutmonozyten, Myeloid-Precursor-Zellen, periphere Blut-Granulozyten, T-Zellen und Mastzellen. Für die Endothelzelldarstellung verwendeten wir neben


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Factor VIII (DAKO, Clone JC/70A, 1:50) und UEA-1 (Ulex europaeus Antigen, E-Y-Laboratories, Lot 060916CA, 1:1600) insbesondere CD 31 (DAKO Clone JC/70A, 1:100). Diese Substanz reagiert neben


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Tab. 27: Klinische Daten zu den 9 Patienten, deren Herzen nach TMLR histologisch untersucht wurden

Patient Nr.

Alter [a]

Intervall zwischen TMLR und Todeszeitpunkt [d]

Todesursache

LVEF [%]

LVEDP [mmHg]

Kanalanzahl

Anzahl früherer Bypass-Operationen

Anzahl früherer Infarkte

1

64

3

akuter Myokardinfarkt

51

8

15

3

1

2

66

5

unbekannt, wahrscheinlich Asystolie

45

18

34

1

1

3

65

14

sept. Multiorganversagen

37

38 (?)

39

1

2

4

59

7

Sepsis

26

27

15

1

2

5

70

20

Sepsis

35

4

36

0

1

6

54

2

akuter Myokardinfarkt

30

?

14

0

1

7

75

6

akuter Myokardinfarkt

42

?

32

1

2

Gesamte Patientengruppe

63.5

 

 

44.0

18.0

32

1.2

1.3

8

64

445

akuter Myokardinfarkt

?

?

„several“<24>

1

2

9

49

241

-<25>

18

 

 

2

 


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Endothelzellen auch mit Thrombozyten und Megakaryozyten. Als Proliferationsmarker verwendeten wir Ki-67 (Dianova, Clone MIB 1, 1:100), welches mit dem Ki-67-Antigen, einem spezifischen proliferationsassoziierten Kernantigen, reagiert. Letztlich fand ein Farbstoff für die Darstellung von Kollagen-Typ-4 Verwendung (MEDAC GmbH, Lot 013.05, 1:400), der speziell mit Kollagen-Fasern reagiert. Für die morphometrische Analyse benutzten wir das LEICA Quantimed Q600 Morphometer, für die Färbungen ein DAKO ChemMate Detection Kit (Code No. K 5005).

Zwei weitere Herzen wurden nach einem erheblich längeren Intervall nach TMLR untersucht. Im ersten Fall überlebte der Patient den Lasereingriff 16 Monate. Er war bei koronarer Dreigefäßerkrankung 15 Jahre zuvor mit einer Bypassoperation versorgt worden. Nach komplettem Bypassverschluß erhielt er im Januar 1994 eine kombinierte Bypassoperation mit TMLR in Houston/USA, da zu diesem Zeitpunkt eine TMLR in Deutschland noch nicht durchgeführt wurde. Obwohl der postoperative Verlauf durch ein low-cardiac-output-Syndrom mit Notwendigkeit der intraaortalen Gegenpulsation kompliziert war, erholte sich der Patient nach diesem Eingriff schließlich gut und war anschließend 14 Monate beschwerdefrei. Unter dem Bild einer akuten Linksherzdekompensation erfolgte danach die stationäre Wiederaufnahme. Eine Woche später erlitt er einen akuten Vorderwandinfarkt, der schließlich zum Tod des Patienten führte.

Das zweite dieser beiden Herzen stammt von einem Patienten, der acht Monate nach TMLR herztransplantiert wurde. Bei seit Jahrzehnten bestehender koronarer Dreigefäßerkrankung hatte er sich bereits zweimal einer Bypassoperation unterzogen. Zum Zeitpunkt der Laserrevaskularisation, die in unserer Einrichtung erfolgte, bestand trotz dreier offener Bypass-Grafts bei hochgradig diffusen Stenosierungen aller Koronararterien Angina pectoris vom CCS-Grad 4 und zudem hochgradige Dyspnoe. Dieser Patient hatte postoperativ zu keinem Zeitpunkt von der Laseroperation profitiert. Die linksventrikuläre Funktion nahm im weiteren Verlauf kontinuierlich ab, so daß der Patient schließlich für eine Herztansplantation akzeptiert und gelistet wurde. Nach einer Wartezeit von 2 Monaten konnten wir diese schließlich erfolgreich durchführen.

4.3 Ergebnisse

4.3.1 Perioperativ verstorbene Patienten

Bereits in der lichtmikroskopischen Untersuchung der HE-Präparate wurde sichtbar, daß es durch das Anlegen der Kanäle vereinzelt zu Verbindungen zwischen Arteriolen und den Kanälen gekommen war (Abb. 21). Die Kanäle zeigten zum Teil eine direkte Kommunikation zu kleineren Arteriolen in ihrer Umgebung.

Zum Zeitpunkt der histologischen Untersuchung waren bis auf 2 Kanäle alle untersuchten Laserkanäle verschlossen. Prinzipiell unterschieden sich die Befunde von Patienten, die innerhalb der ersten 3 Tage nach der TMLR verstorben waren, deutlich von denen später verstorbener Patienten.

Bei den Frühbefunden imponierte ein zylindrischer Myozytenverlust, der durch ein lockeres Netzwerk von Fibrin, Erythrozyten und Granulozyten aufgefüllt war (Abb. 22). Dabei wurde deutlich, daß der geschaffene Laserkanal analog zum Laserstrahl einen Durchmesser von ca. 1 mm aufweist.

Jeder Kanal war von einer schmalen Karbonisationszone umgeben, der sich eine Nekrosezone anschloß. Diese war in Präparaten aus den ersten postoperativen Tagen 200 - 400 µm, um den 5. postoperativen Tag bis 500 µm stark (Radius, Abb. 23). In der postoperativen Frühphase beobachteten wir in den Venolen in der Kanalumgebung vermehrt kleinste Partikel, die dem nekrotischen Material innerhalb der Kanäle ähnelten (Abb. 24).


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Kanäle von Patienten, die 2 bis 3 Wochen nach der transmyokardialen Laserrevaskularisation verstarben, zeigten ein etwas anderes histologisches Bild. Das frische intrakanalikuläre Gerinnsel wurde ersetzt durch ein Granulationsgewebe von wechselnder Dichte. In diesem Gewebe bestand eine hohe Konzentration von Makrophagen und Monozyten. In der CD-68-Inkubation, der spezifischen Färbung für diese Zellpopulationen, erschien der Kanal als ein intensiv gefärbter Streifen (Abb. 25). Dies scheint Ausdruck einer intensiven Phagozytose des perikanalikulären nekrotischen Materials zu sein. Das Ausmaß dieser zellulären Aktivität konnte auch durch Verwendung eines spezifischen Proliferationsmarkers wie MiB-1 demonstriert werden. Hier wurden vor allem Makrophagen sichtbar, daneben aber auch zahlreiche Fibroblasten, was auf eine Transformation in Narbengewebe hinweist.

Die Färbung auf Kollagen-Typ-IV, welches vor allem in Basalmembranen von Gefäßen zu finden ist, ergab eine hohe Anzahl gefärbter Strukturen in den verschlossenen Kanälen (Abb. 26). Unter höherer Vergrößerung sah man unzählige girlandenartige Strukturen, die den Kanal durchzogen. Auch die Färbung auf Endothelzellen (CD 31-Inkubation, Abb. 27) ergab ein ähnliches Bild: Intrakanalikulär wurden zahlreiche gefärbte Strukturen sichtbar. Unter ausreichender Vergrößerung erkennt man ein dichtes Netz von Kapillaren, die eine typische Endothelauskleidung aufweisen und außen von Kollagen-Typ-IV-haltigen Basalmembranen umgeben zu sein schienen (Abb. 28). Dieses Kapillarnetz wies an einigen Stellen durchaus eine deutlich höhere Dichte auf, als es für das Myokard typisch ist. Die Kapillaren wiesen innerhalb der Kanäle zumeist eine Längsorientierung auf.

4.3.2 Spätbefunde

Das Herz des 16 Monate nach TMLR verstorbenen Patienten zeigte neben einer mittelgradigen zellulären Hypertrophie mit Kerngrößenvarianzen und Kernhyperchromasie eine fleckförmig ausgebildete interstitielle Fibrose mit Übergang in eine herdförmige Schwielenbildung. In sämtlichen angefertigten Schnittpräparaten ließen sich weder offene noch fibrosierte Laserkanäle erkennen.

Das während der Transplantation 8 Monate nach Laserrevaskularisation explantierte Herz zeigte neben einer schweren diffusen KHK, einer exzentrischen Hypertrophie und offenen Bypass-Grafts eine ausgeprägte Endokardfibrose. Histologisch sahen wir Kardiomyozyten mit erheblichen Faserdurchmesserschwankungen, vergrößerten, teilweise hyperchromatischen oder bizarr verformten Kernen. Linksventrikulär fand sich eine erhebliche, perivaskulär konzentrierte und fleckförmig ausgebildete kollagenfaserreiche Fibrose. Laserkanäle ließen sich trotz Anfertigung mehrerer hundert Präparate nicht identifizieren.


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Abb. 20: Makroskopische Sicht auf den linken Ventrikel nach TMLR von epikardial (oben) bzw. endokardial (unten). Deutlich sichtbar sind die verschlossenen Kanalöffnungen.


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Abb. 21: Die in der Bildmitte sichtbare Arteriole weist oben rechts eine direkte Verbindung zu einem Laserkanal auf (HE-Färbung, 110-fache Vergrößerung).


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Abb. 22: Frisch verschlossener TMLR-Kanal (5 Tage nach TMLR, HE-Färbung, 10-fache Vergrößerung). Der Kanal liegt direkt neben einer trabekulären Einziehung (oben, rechts).


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Abb. 23: Frisch verschlossener TMLR-Kanal, der in unmittelbarer Nähe einer Arterie verläuft (5 Tage nach TMLR, HE-Färbung, 20-fache Vergrößerung).


92

Abb. 24: Kleinste Partikel aus nekrotischem Material ähnlich dem im Kanallumen fanden sich vereinzelt in den Venen der Kanalumgebung (3 Tage nach TMLR, Azan-Färbung, 440-fache Vergrößerung).


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Abb. 25: CD-68-Inkubation (21 Tage nach TMLR, Monozyten-, Makrophagenfärbung, 28-fache Vergrößerung). Der Kanal erscheint als intensiv gefärbter Streifen.


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Abb. 26: Färbung auf Typ-IV-Kollagen. Im verschlossenen Kanal findet sich eine deutliche Farbstoffablagerung (21 Tage nach TMLR, 28-fache Vergrößerung).


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Abb. 27: CD-31-Inkubation (21 Tage nach TMLR, Endothelzellfärbung, 20-fache Vergrößerung). Die Dichte CD-31-positiver Zellen ist im ehemaligen Kanallumen größer als im umgebenden Myokard.


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Abb. 28: CD-31-Inkubation (21 Tage nach TMLR, Endothelzellfärbung, 440-fache Vergrößerung). Endothelausgekleidete Neokapillaren durchziehen die verschlossenen Laserkanäle.

4.4 Diskussion

Inzwischen gibt es eine Vielzahl publizierter histologischer Untersuchungen zu TMLR-Kanälen [5, 30, 37, 69, 86, 88, 100, 102, 149, 153, 187, 188, 246, 251, 253, 298, 299, 372-374, 385, 403, 452, 463, 464]. Insbesondere die Arbeit von Gassler et al. scheint unsere Ergebnisse in nahezu idealer Weise zu bestätigen [102].

Okklusion der Laserkanäle

Die absolute Mehrheit der von uns untersuchten Laserkanäle war im histologischen Bild verschlossen. Wir halten es daher für wahrscheinlich, daß sich TMLR-Kanäle grundsätzlich innerhalb der ersten 3 postoperativen Tage wieder verschließen. Offensichtlich stellt die Thermokoagulation von Myozyten, die mit einer erheblichen Exposition von interstitiellem Kollagen verbunden sein dürfte, einen starken thrombogenen Stimulus dar.

Dies korreliert mit der aus der klinischen Anwendung bekannten Tatsache, daß sich Blutungen aus frisch angelegten Laserkanälen, die zunächst besonders in der Phase der Systole durchaus heftig spritzen können, allein


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durch Aufdrücken einer Kompresse über wenige Minuten stillen lassen. Bei intakter Gerinnung wird zumindest die äußere Kanalöffnung also rasch wieder thrombotisch*<26> verschlossen. Daß dies nicht auch für den Rest des Kanals zutrifft, wurde zwar immer wieder behauptet [60, 273], ist jedoch bisher nicht zweifelsfrei und reproduzierbar bewiesen worden. Zwar argumentieren die Verfechter der „patent-channel“-Theorie, daß diese Blutstillung nur durch die Bildung eines kleinen, ausschließlich an der epikardialen Öffnung des Kanals gelegenen Thrombus erzielt wird, während die endokardial gelegenen Kanalanteile durchgängig bleiben, uns erscheint diese Argumentation aber doch sehr konstruiert.

Bei der Beurteilung von Befunden verschlossener Laserkanäle in Autopsiepräparaten sollte jedoch berücksichtigt werden, daß verschlossene Kanäle bei Verstorbenen nicht zwangsläufig auch auf verschlossene Kanäle bei den vielen überlebenden TMLR-Patienten schließen lassen, die ja zumeist maßgeblich von der Operation profitierten [373, 374, 385].

Wir halten es jedoch für höchst unwahrscheinlich, daß sich die von uns beobachteten verschlossenen Kanäle erst in Zusammenhang mit dem Tod des Patienten verschlossen haben. Die Veränderungen, die wir in den Kanälen der Patienten sehen konnten, die 2 - 3 Wochen nach der Operation verstarben, benötigen Zeit. Sie können nicht erst in Zusammenhang mit dem Tod des Patienten entstanden sein. Wir halten es daher für nicht unwahrscheinlich, daß diese Prozesse auch bei den Patienten stattfinden, die die Operation überleben und später subjektiv davon profitieren. Insbesondere die Analyse der verschiedenen Todesursachen läßt es bei den meisten Patienten eher unwahrscheinlich erscheinen, daß es einen direkten Zusammenhang zwischen dem Tod des Patienten und dem Kanalverschluß gibt.

Aber auch histologische Analysen an anderen Spezies bestätigen weitgehend unsere Vermutung, daß sich transmyokardiale Kanäle ebenso wie Nadelpunktionskanäle frühzeitig wieder thrombotisch verschließen, auch wenn ursprünglich spekuliert wurde, daß die spezifischen Eigenschaften des Lasers dieses verhindern könnten [273]. So wurden an Ratten [456], Hunden [86, 187, 190], Schafen [145] und Schweinen [105, 149, 153, 298, 299, 464] grundsätzlich ähnliche histologische Befunde erhoben, wie an humanen Autopsiepräparaten [37, 101, 102, 205, 372-374, 385], so daß unseres Erachtens heute kein Zweifel mehr daran bestehen kann, daß es früh postoperativ zu einem thrombotischen Verschluß der Kanäle kommt. Auch Verbindungen zwischen Kanal und freiem Ventrikelkavum konnte die Mehrheit der Studiengruppen nicht nachweisen [37, 102, 188, 205, 374, 385, 463].

Nur von wenigen Arbeitsgruppen sind bisher langfristig offene Laserkanäle publiziert worden. Tierexperimentell fand zunächst Mirhoseini 3.5 Monate nach TMLR am Hund noch offene, endothelialisierte Laserkanäle [277]. Offene Laserkanäle wurden zudem von Mack ebenfalls am Hund [251], bei Schafen [145] und an der Ratte [457] gefunden. Aber auch in humanen Autopsiepräparaten wurden sehr vereinzelt längerfristig offene Kanäle nachgewiesen. So fanden Cooley et al. 3 Monate nach TMLR immerhin 9 von 30 intraoperativ angelegten Kanälen offen mit einem Kanallumen von 20 bis 75 µm und einem Fibrosesaum von 150-500 µm Breite. Diese Kanäle enthielten Erythrozyten, zeigten Verbindungen zu den umliegenden Gefäßen sowie dem Ventrikelkavum, und die Autoren schlußfolgerten daraus, daß die Kanäle auch eine funktionelle Bedeutung besitzen [60]. Diese Arbeitsgruppe gehört noch heute zu den wenigen überzeugten Verfechtern der „open-channel“-Theorie. Noch


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1998 bezeichneten sie einen fast vollständig verschlossenen Kanal in einem Autopsiepräparat 55 Tage nach TMLR als „partiell offen“ [94], was Smith in einem „invited commentary“ relativierte.

Schweitzer hat in einer Untersuchung an 10 innerhalb der ersten 18 Tage nach TMLR Verstorbenen, bei denen während der Operation im Mittel 41 Kanäle angelegt worden waren, histologisch nur jeden zehnten Kanal nachweisen können. Während bei früh postoperativ Verstorbenen noch die Mehrheit dieser Kanäle offene Lumina zeigte, nahm deren Anzahl mit der postoperativen Überlebenszeit kontinuierlich ab. Auch waren alle untersuchten endokardialen Kanalöffnungen durch Fibrinpfröpfe verschlossen, die kammerseitig in den ersten Tagen durchaus von kleineren Parietalthrombosen begleitet waren, sich später jedoch von einer Endothelschicht überzogen zeigten [374].

Dennoch wurde zunächst die Hoffnung nicht aufgegeben, offene und endothelialisierte Laserkanäle zu erzeugen. Diese Hoffnung basierte neben den Befunden von Mirhoseini und Cooley auch auf den Ergebnissen von Hardy et al., der in einem Vergleich zwischen Laser- und Nadelpunktionskanälen zeigen konnte, daß erstere bis zu 14 Tage offen bleiben, wärend alle Nadelpunktionskanäle nach 48 Stunden okkludiert waren [115].

Durch die Wahl optimaler technischer Laserparameter oder durch Auswahl geeigneter myokardialer Targetareale sollte es nach Ansicht einiger Arbeitgruppen dennoch möglich sein, einen thrombotischer Verschluß der Kanäle zu verhindern.

So untersuchte Mueller et al. das histologische Schicksal von Ho:YAG-Laserkanälen am Schweinemyokard [299]. Bei der Hälfte seiner Versuchstiere erzeugte er unmittelbar im Anschluß an den Laserprozeß einen ausgedehnten Myokardinfarkt im Laserareal, um die Hypothese zu testen, daß Laserkanäle eventuell nur in ischämischem Myokard offen bleiben. In beiden Studienarmen konnte er zwischen 1 und 6 Wochen postoperativ ausschließlich verschlossene Laserkanäle finden. Möglicherweise war das verwendete Infarktmodell jedoch für diese Fragestellung weniger geeignet; uns erscheint z.B. eine Ischämieinduktion mit Ameroidkonstriktoren in diesem Falle adäquater zu sein. Aber auch am Modell der chronischen Ischämie wurde der Verschluß der Kanäle beobachtet. So erzeugten Zlotnick et al. am Schwein mit Ameroidkonstriktoren eine chronische Ischämie; sechs Wochen später wurden die Tiere einer TMLR mit dem Heart-Laser® unterzogen. In der histologischen Analyse, die 4 Wochen postoperativ erfolgte, konnten sie 69% der Kanäle identifizieren, die jedoch alle fibrotisch verschlossen waren [464].

Fleischer et al. versuchten, durch zusätzliche intramyokardiale Applikation von Profilin, einem Peptid, das neben der Erhöhung der Endothelzelladhäsivität und -motilität auch in die Regulation dynamischer Prozesse des Zytoskelettes eingreift, oder durch VEGF-Gentransfer in die Myozyten über Transfektion mit einem Adenovirus offene Laserkanäle zu erzielen [88]. Aber auch dieser Versuch schlug fehl.

Neben den beiden Thesen, die Laserkanäle seien langfristig offen bzw. früh wieder verschlossen, gibt es jedoch noch eine dritte Theorie, die der Kanalrekanalisation. Mack et al. fanden in einem Experiment mit dem Excimer-Laser am Schaf nach 72 Stunden durchgehend thrombotisch verschlossene Kanäle. Nach 4 Wochen hingegen fanden sich fast ausschließlich offene, endothelialisierte Laserkanäle mit einem Lumen zwischen 10 und 100 µm. Sie stellten die These auf, daß sich im ursprünglich verschlossenen Kanal endothelialisierte Hohlräume bilden, die später konfluieren und sich zu einem offenen Kanal entwickeln können. Die karbonisierte Kanalwand könne dabei für die Endothelzellen ein geeignetes Skelett bilden [250]. Unsere histologischen Befunde von den beiden Patienten, die mehrere Monate nach TMLR verstarben, geben jedoch keine Hinweise auf eine Rekanalisation der Laserkanäle.


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Auswirkungen des Untersuchungszeitpunktes

Wenngleich bei der Beurteilung histologischer Befunde zur TMLR der untersuchten Spezies offensichtlich keine entscheidende Rolle zukommt, so ist es hingegen von wesentlicher Bedeutung, welcher Zeitraum zwischen der Anlage der Kanäle und der Analyse liegt. Zu den ausgesprochen früh-postoperativen histologischen Studien gehört eine Arbeit von Lutter et al. [246]. Er fand zwei Stunden postoperativ bei einem im low-cardiac-output-Syndrom verstorbenen TMLR-Patienten offene Kanäle mit einem Lumen von nahezu 1mm, welches konzentrisch von einer 1-2mm breiten Nekrosezone umgeben war, der sich eine 1-3mm breite Zone der myofibrillären Degeneration und Ödembildung anschloß. Insgesamt fand sich also um jeden TMLR-Kanal eine Schädigungszone, deren Radius ca. 5mm groß war. Das Ausmaß der myokardialen Schädigung war somit weit größer als vermutet, auch wenn Lutter et al. spekulierten, daß die Veränderungen in der äußeren Degenerationszone reversibel sein sollten. Immerhin schlußfolgerten sie aus ihren Beobachtungen, daß die TMLR bei Patienten mit bereits präoperativ beeinträchtigter Kontraktilität nur mit besonderer Vorsicht einzusetzen sei. In histologischen Untersuchungen im späteren Verlauf nach TMLR kann das Ausmaß der TMLR-Wirkung auf das Myokard offensichtlich leicht unterschätzt werden.

Angioneogenese

Eine Angioneogenese steht häufig in engem Zusammenhang mit einer Entzündungsreaktion. Seit langer Zeit ist bekannt, daß Makrophagen und Monozyten verschiedene angiogene Wachstumsfaktoren freisetzen. Wir halten es daher für wahrscheinlich, daß es aufgrund der Monozyten- und Makrophageninvasion, die durch den thermischen Lasereffekt hervorgerufen wird, am Ort des Kanals zu einer anhaltend hohen Konzentration dieser angiogenen Wachstumsfaktoren kommt. Bortone et al. konnten nachweisen, daß die Leukozyten- und insbesondere Neutrophilenzahl im peripheren Blut nach PMR signifikant ansteigen. Daneben fanden sie einen deutlich erhöhten Blut-Procalcitoninspiegel, einem Marker für eine systemische inflammatorische Reaktion [30]. Auch dürften hohe Zytokinkonzentrationen, die typisch für thermische Schädigungen sind, für die Angiogenese mit verantwortlich sein. In der Folge bilden sich kapillarähnliche Strukturen aus, die wachsen. Nach Burkhoff führt diese regionale Angioneogenese zur Verbesserung der Kollateralisierung zwischen den einzelnen Myokardarealen, was klinisch Ausdruck in einer erhöhten Angina-pectoris-Schwelle findet, jedoch mit „herkömmlichen“ klinischen Methoden der Perfusionsanalyse wie Thallium-SPECT oder auch PET nicht nachgewiesen werden kann [40].

Nicht eindeutig kann dabei differenziert werden, ob der Hauptstimulus für die Angioneogenese aus dem durch die thermische Laserwirkung alterierten Myokard oder aus dem intrakanalikulär gebildeten Thrombus herrührt. Möglicherweise spielen auch beide Faktoren eine Rolle.

Gassler untersuchte die Auswirkungen der TMLR auf das Herzskelett. Er fand eine deutlich erhöhte Tenascin-Expression in den lasergeschädigten Bindegewebssepten, jedoch eine normale Vimentin-Expression. Er ist der Ansicht, daß weniger die kleinen Gefäße in den Bindegewebssepten des Herzskelettes, als die myokardialen Kapillaren Ausgangspunkt der Angioneogenese nach TMLR sind [100].

Fuchs et al. konnten für TMR-Gebiete neben 3-fach erhöhten Gewebskonzentrationen von VEGF und bFGF auch vermehrt MCP-1 nachweisen [96]. Daß dieser Effekt längerfristig anzuhalten scheint, belegt eines der


100

wenigen publizierten langfristigen Tierexperimente. Hughes et al. fanden noch 6 Monate nach TMLR am Schwein in den laserbehandelten Ischämiearealen eine fast 5fach erhöhte Gefäßdichte im Vergleich zu unbehandelten ischämischen Myokardgebieten [153].

Die Größe der gefundenen neugebildeten Arteriolen lag in einer Analyse von Kohmoto zwischen 50 und 100µm. Arteriolen mit mehreren Schichten glatter Muskelzellen fanden die Autoren noch in 3mm Entfernung zum angelegten Laserkanal. Daß sich diese Gefäße neu gebildet hatten, konnte er durch den hohen Anteil PCNA-positiver Kerne in den Zellen ihrer Gefäßwand nachweisen [187]. Auch Mueller et al. beobachteten 4 Wochen nach TMLR mit einem Ho:YAG-Laser am Schwein eine Verdoppelung der Gefäßdichte im verschlossenen Laserkanal, nicht jedoch in der unmittelbaren Kanalumgebung. Sie untersuchten darüber hinaus die Gefäßdichte im Längsverlauf eines Laserkanals. Vor dem Hintergrund der Ergebnisse der PET-Stude von Frazier et al. [91], die zu dem Schluß kamen, daß insbesondere die subendokardiale Durchblutung nach TMLR steigt, vermutete Mueller, einen Gefäßdichtegradienten von subendokardial nach subepikardial zu finden. Dies ließ sich anhand seiner Studie jedoch nicht nachweisen [298].

Auch Yamamoto konnte überzeugend darlegen, daß nach der TMLR eine erhebliche Angioneogenese einsetzt. Er fand in einem chronischen Ischämiemodell (Ameroidkonstriktoren) nach TMLR mit dem Ho:YAG-Laser an 14 Hunden ausschließlich verschlossene Laserkanäle. Zusätzlich injizierte er 1, 2, und 3 Wochen nach TMLR seinen Versuchstieren Bromdesoxyuridin (BRDU), welches nur von proliferierenden Zellen inkorporiert wird. Dieses konnte er 2 Monate postoperativ in Endothel- und glatten Muskelzellen der Wand zahlloser kleiner Gefäße in einem Radius von bis zu 3mm um die Laserkanäle nachweisen. Da sich zum gleichen Zeitpunkt nur noch wenige PCNA-positive Zellen fanden, halten Yamamoto et al. die Angioneogenese nach 2 Monaten für abgeschlossen. Daß ausschließlich die TMLR-Gruppe 2 Monate postoperativ unter Adenosin-induziertem Stress einen erhöhten myokardialen Blutfluß zeigte, was mit farbcodierten Mikrosphären nachgewiesen wurde, interpretierten die Autoren als Hinweis auf die funktionelle Bedeutung der neu gebildeten Gefäße [463].

In einer technisch aufwendigen dreidimensionalen Rekonstruktion aller intramyokardialen Arteriolen mit einem Durchmesser zwischen 20 und 110µm konnten Schweitzer et al. nachweisen, daß sich nach TMLR im behandelten Myokard zylinderförmige Netzwerke dieser Arteriolen finden, die dem Verlauf der früheren Laserkanäle entsprechen könnten. Auch beschrieben sie einige wenige Verbindungen dieses Gefäßnetzes zum freien Ventrikelkavum [372].

Im chronischen Tierversuch an einem porcinen Ischämiemodell sah Hughes 6 Monate nach TMLR in den laserbehandelten ischämischen Myokardarealen nicht nur eine signifikant erhöhte myokardiale Durchblutung, die er mittels PET untersuchte, sondern auch eine vergleichsweise bessere myokardiale Kontraktilität in der Dobutamin-Stressechokardiographie [149]. Damit gelang ihm tierexperimentell der Nachweis, daß die erzielte Angioneogenese auch für die lokale Perfusion und Funktion von Bedeutung ist.

Moosdorf et al. konnten tierexperimentell nachweisen, daß eine zusätzlich zur TMLR erfolgte Applikation von VEGF-Protein oder -Gentransfer den erzielten Angioneogeneseeffekt deutlich erhöht. Auch fand sich bei den Tieren mit Kombinationstherapie ein höherer Anteil an neu formierten Arteriolen, wohingegen nach isolierter TMLR insbesondere die Zahl der Kapillaren anstieg [290].


101

Narbenbildung und Schrumpfung

Wie aus Studien zur allgemeinen Wundheilung hinlänglich bekannt ist, kommt es im Rahmen einer Narbenbildung häufig zu ausgeprägten Schrumpfungsprozessen, an denen Fibroblasten und Myofibroblasten beteiligt sind. Dies gilt auch für die Umwandlung eines thrombotisch verschlossenen Laserkanals in eine Narbe. So bezifferte Fisher das Ausmaß der Schrumpfung der perikanalikulären thermischen Nekrosezone mit 50% innerhalb der ersten 3 Wochen und 85% nach insgesamt 6 Wochen [86]. In einer ähnlichen Untersuchung fanden Mueller et al. innerhalb von 5 Wochen nach TMLR mit einem Ho:YAG-Laser eine Schrumpfung um 75% [299]. Sie halten diesen Prozeß für so wesentlich, daß sie in ihrer Arbeit spekulieren, ob etwa die Schrumpfung der zahlreichen während der TMLR angelegten Kanäle im Rahmen ihrer Umbildung zu Narben insgesamt zu einer Verkleinerung des linken Ventrikels führen könnte. Nach dem Gesetz von Laplace sollte sich dann die Wandspannung des Ventrikels vermindern, was in einem geringeren Energie- bzw. Sauerstoffbedarf resultieren würde. Somit wäre die narbige Schrumpfung der thrombotisch verschlossenen Laserkanäle letztlich für den klinisch beobachteten Rückgang des Angina-pectoris-Syndroms bei den TMLR-Patienten verantwortlich.

Nach Whittaker führt die intramyokardiale Narbenbildung hingegen allenfalls zu einer Zunahme der Steifigkeit des linken Ventrikels im Sinne einer restriktiven Funktionsstörung [452]. Auch hält er es für möglich, daß es sich bei der beobachteten Zunahme der Gefäßdichte nicht um eine absolute, sondern nur um eine relative Erhöhung der Gefäßanzahl handelt. Bei der ausgeprägten narbigen Schrumpfung wären nach einigen Wochen auch ohne Angioneogenese bezogen auf die untersuchte Fläche mehr Gefäße zu beobachten. Diese These wird aber meines Erachtens z.B. durch die Arbeit von Yamamoto [463] klar widerlegt.

Histologische Befunde von Patienten, die den Lasereingriff viele Monate bis Jahre überlebt haben, sind in der Literatur nur wenige publiziert. Summers et al. berichten über die histologischen Befunde vom Myokard eines Patienten, der knapp 9 Monate nach TMLR an einem Verkehrsunfall verstarb. Bis dahin war der Patient nach der Operation komplett beschwerdefrei gewesen. Es fanden sich zahlreiche fokale Narben, die senkrecht zur Herzoberfläche verliefen und wenige kleine Gefäße enthielten. Offene Laserkanäle wurden nicht gefunden. Die Beobachtungen decken sich also im wesentlichen mit unseren Spätbefunden.

Domkowski et al. konnten hingegen histologisch in den laserbehandelten Arealen auch 9 Monate nach TMLR noch eine doppelt so hohe Gefäßdichte wie in den unbehandelten Gebieten sehen. Sie untersuchten das Herz eines Patienten, der während der ersten 6 Monate nach TMLR einen signifikanten Rückgang der Angina-pectoris-Symptomatik verspürte, dann aber wieder symptomatisch wurde. Neun Monate nach TMLR wurde er schließlich herztransplantiert. Wenngleich sämtliche Kanäle zum Untersuchungszeitpunkt verschlossen waren, so konnten die Untersucher mit verschiedenen immunhistologischen Färbemethoden (CD 31, Faktor VIII) zahlreiche blutgefüllte Gefäße in den Kanälen und ihrer Umgebung nachweisen [69].

Eine Sonderstellung nimmt die Publikation von Stock et al. ein, die einen Patienten mit einer LVEF von 17% ohne Vorliegen von signifikanten Koronarstenosen einer TMLR unterzogen. Neun Monate postoperativ mußte der Patient nach nur kurzzeitiger subjektiver Verbesserung seines Status dann doch transplantiert werden, und die Autoren unterzogen das explantierte Herz einer histologischen Analyse. Außer zahlreicher Narbenstränge von 1.5 bis 2mm Durchmesser konnten sie jedoch keine offenen Kanäle finden [398].


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Ist die Angiogenese ein laserspezifischer Effekt?

Mirhosheini stellte bereits sehr früh die These auf, daß sich Kanäle, die durch einen Laser angelegt wurden, im Vergleich zu Nadelpunktionskanälen durch spezifische Eigenschaften auszeichnen [273, 277]. Die Vermutung wurde durch die Ergebnisse von Fisher et al. gestützt, der eine grundsätzlich verzögerte Wundheilung nach Laserapplikation im Vergleich zur Wundheilung nach chirurgischen Inzisionen feststellte [87]. Wenngleich diese Spezifik aber offensichtlich nicht so weit führt, daß die Kanäle langfristig offenbleiben, so bleibt doch dringend die Frage zu klären, ob die mit dem Laserprozeß initiierte Angiogenese qualitativ oder zumindest quantitativ von der üblicherweise mit Wundheilung einhergehenden Angiogenese zu unterscheiden ist. Obwohl es nunmehr eine Vielzahl publizierter Ergebnisse zu dieser Fragestellung gibt, kann meines Erachtens die oben gestellte Frage dennoch nicht eindeutig beantwortet werden.

Die Diskussion dieses Aspektes wurde insbesondere durch eine Arbeit von Pelletier et al. eröffnet, der nachweisen konnte, daß auch durch einfache Nadelpunktion ein erhebliches Maß an Angioneogenese ausgelöst werden kann [330]. In einer Untersuchung an Ratten konnte er demonstrieren, daß es durch Anlage von nur 6 transmyokardialen Nadelpunktionskanälen zu einer signifikanten Zunahme der intramyokardialen Gefäßdichte kommt. Diese erreichte eine Woche postoperativ ihr Maximum. Dieser Prozeß ging mit einem signifikanten Anstieg der TGF-beta- und bFGF-Expression einher, wohingegen kein signifikanter Anstieg von VEGF gemessen werden konnte. Von der ersten bis zur 8. postoperativen Woche nahm die Gefäßdichte in der Kanalumgebung jedoch wieder kontinuierlich ab.

Fisher et al. fanden in ihrer histologischen Analyse zur TMLR am Hund in den laserbehandelten Arealen nach 6 Wochen zahlreiche Arteriolen mit muskulärem Wandaufbau, die er als untypisch für eine einfache Wundheilung ansah und daher auf eine spezifische Laserwirkung zurückführte [86]. Andere Untersucher konnten jedoch keine Unterschiede zu einer normalen Wundheilung feststellen [88].

Verschiedene Arbeitsgruppen haben tierexperimentell Laserkanäle mit Kanälen verglichen, die auf andere Weise, zumeist durch einfache Nadelpunktion, erzeugt wurden (siehe auch Abschn. 1.3). Chu et al. vertreten dabei die Auffassung, Nadelpunktionskanäle wiesen so geringe Unterschiede zu Laserkanälen auf, daß der hohe apparative und finanzielle Aufwand, der mit dem Einsatz eines Lasers verbunden ist, nicht gerechtfertigt sei [52]. Sie untersuchten an einem chronisch-ischämischen Schweinemodell die VEGF-Expression in der Umgebung von TMLR- und Nadelpunktionskanälen und fanden 6 Wochen postoperativ keine wesentlichen Unterschiede zwischen beiden Behandlungsformen. Methodologische Schwachpunkte der Untersuchung relativieren jedoch diese Befunde; so wurde ein niedrig-energetischer CO2-Laser (100W) verwendet, und die Kanalanzahl war mit 10 deutlich geringer als in der klinischen Routine. Auch gibt diese Studie keine Antwort auf die Frage, ob durch Nadelpunktion auch langfristig ähnliche Ergebnisse erzielbar wären wie mit der Laserrevaskularisation.

Auch Mack et al. begaben sich auf die Suche nach spezifischen Effekten der Laserapplikation. Sie verwendeten für ihre Untersuchung am Schaf ein spezielles nadelförmiges Handstück mit abschaltbarer Laseremission. Damit legten sie neben typischen TMLR-Kanälen auch mechanisch erzeugte Kanäle an, indem die Abgabe von Laserstrahlung einfach unterbrochen wurde. Nach 30 Tagen sahen sie ausschließlich in der Umgebung der Laserkanäle eine signifikante Angioneogenese, woraus sie schlußfolgerten, daß die Laserenergie eine wesentliche Komponente des TMLR-Konzeptes darstellt [250].


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Dem stehen Ergebnisse von Malekan et al. entgegen, der an einem nichtischämischen Schafmodell CO2-Laser-Kanäle mit mechanisch erzeugten Kanälen verglich. Letztere legte er mit einem speziellen Bohrer an. Die 4 Wochen später erhobenen histologischen Befunde waren jedoch in jeder Hinsicht identisch: Alle Kanäle waren verschlossen, und in dem intrakanalikulären Granulationsgewebe fanden sich Arteriolen mit mehrschichtigem glattmuskulären Wandaufbau sowohl in den Laserkanälen und ihrer Umgebung als auch in den mechanisch gebohrten Kanälen [253].

Der Einfluß des verwendeten Lasertyps

Das histologische Bild scheint jedoch nicht unwesentlich von der Art des verwendeten Lasers abhängig zu sein. So sind Kanäle, die mit einem Ho:YAG-Laser angelegt wurden, zwar auch nach einigen Tagen wieder verschlossen, und die Umgebung des Kanals zeigt eine inflammatorische Reaktion, was z.B. Bortone et al. bereits 4 bis 5 Stunden nach PMR im Leukozytenscan zeigen konnten [30], jedoch scheint die thermische Nekrosezone, die einen mit dem Ho:YAG-Laser angelegten Kanal umgibt, im Vergleich zu CO2-Laserkanälen deutlich größer zu sein. Die daraus resultierende Narbenbildung mit Verlust an kontraktilem Myokard hält Bortone für so wesentlich, daß er fordert, so wenig wie möglich Kanäle anzulegen. Dies steht allerdings im Gegensatz zu der Tatsache, daß auch er in seiner Studie keinen signifikanten Creatinkinase- oder Troponin-I-Anstieg nach dem Lasereingriff verzeichnen konnte.

In unserer Analyse fanden wir die Laserkanäle in den ersten Tagen von einer ca. 0.5 mm breiten Zone der thermischen Schädigung umgeben. Schweitzer ermittelte bei unmittelbar nach TMLR verstorbenen Patienten 0.5 bis 0.75 mm [374]. Okada teilte die geschädigte Randzone um einen Kanal noch einmal in eine innere Karbonisationszone, für die er eine Breite von 100 µm ermittelte, und eine Zone der Koagulationsnekrose, die 200 µm breit war. Allerdings verwendete er einen 90 Watt - CO2-Laser [319].

Fisher fand in einer CO2- und Holmium:YAG-Laser vergleichenden Untersuchung alle Kanäle nach 24 Stunden verschlossen. Die akute thermoakustische Schädigungszone, deren Charakteristika in einer faszikulären Separation der Myozyten sowie einer Aufweitung des perivaskulären Interstitiums bestanden, war wiederum bei Verwendung des Ho:YAG-Lasers 3fach größer. Innerhalb dieser Schädigungszone fand er zunächst ein gefäßreiches Proliferationsgewebe, welches unter erheblicher Schrumpfung schließlich in eine Narbe umgewandelt wurde. Sechs Wochen post operationem war aufgrund der ausgeprägteren Schrumpfung der Ho:YAG-Laserkanäle das histologische Bild in beiden Lasergruppen nicht mehr unterscheidbar [86].

Drei verschiedene Laser (CO2, Ho:YAG, Xenonchlorid-Excimer) verglich Hughes mit einer Sham-Thorakotomie in einem chronischen Tierversuch an einem porcinen Ischämiemodell [149]. Die höchste perikanalikuläre Gefäßdichte ließ sich dabei nach Einsatz des Ho:YAG-Lasers beobachten, wobei mit dem CO2-Laser und dem Ho:YAG-Laser signifikant höhere Gefäßdichten, eine signifikant erhöhte myokardiale Durchblutung sowie eine vergleichsweise bessere myokardiale Kontraktilität in der Dobutamin-Stressechokardiographie als mit dem Excimer-Laser oder der Sham-Operation erzielt wurden. Bedenklich stimmt, daß Hughes keine signifikanten Unterschiede zwischen der Placebotherapie und dem Einsatz des Excimerlasers fand, obwohl dieser in der perkutanen Laserrevaskularisation breite Verwendung gefunden hat.

Whittaker et al. hält es durchaus für möglich, daß sich zwar mit CO2- und Ho:YAG-Lasern, die im Infrarot-Bereich arbeiten, keine langfristig offenen Kanäle erzeugen lassen, Ultraviolett-Laser wie der Excimer- oder Nd:YAG-Laser aufgrund ihrer spezifischen physikalischen Eigenschaften dafür hingegen ideal geeignet sind. Zu dieser Schlußfolgerung gelangt er nach der Analyse eines Tierversuches mit einem Excimer-Laser (lambda = 355nm,


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20 Hz, 10mJ/Puls, 600µm-Faser) an Ratten, bei dem er noch 2 bis 5 Monate nach TMLR Offenheitsraten der Laserkanäle von 89% verzeichnen konnte. Das Kanallumen war hierbei bis zu 140 µm groß. Er begründete dies mit der grundsätzlich verschiedenen Ablationswirkung der beiden Laserarten. Während die Energie der Infrarotlaser insbesondere von Wasser absorbiert wird, woraus eine thermische Gewebeschädigung resultiert, erzielen Ultraviolettlaser eine Gewebsablation über eine direkte Photonenabsorption der intermolekulären Bindungen, was zu einer weit geringeren thermischen Wirkung auf das umliegende Gewebe führt (sog. „kalte“ Laser). Auch konnte Whittaker Verbindungen der so erzeugten Laserkanäle an das Ventrikelkavum und umliegende Gefäße demonstrieren. Schließlich war nach Anlage der Laserkanäle und zusätzlichem Erzeugen eines Myokardinfarktes das resultierende Nekroseareal signifikant kleiner, was auf die funktionelle Bedeutung der Laserkanäle hinweisen soll [457]. Da die räumlichen Verhältnisse zwischen Laserkanal und Ventrikelwand zwischen Ratten- und Menschenherzen jedoch höchst unterschiedlich sind, scheint es dringend geboten, diese Ergebnisse an größeren Säugetieren zu reproduzieren.

4.5 Zusammenfassung

Unsere histologische Analyse ergab, daß zum Zeitpunkt der Untersuchung praktisch alle Laserkanäle durch ein Granulationsgewebe verschlossen waren. Gleichzeitig war eine zelluläre Abräumreaktion zu beobachten. In den Präparaten von Patienten, die erst einige Wochen nach der TMLR verstarben, waren im verschlossenen Kanallumen zahlreiche vakuolenähnliche Hohlräume sichtbar. Durch verschiedenen Färbemethoden (CD 68, CD 31 und einen polyklonalen Kollagen-Typ-IV-Farbstoff) konnte eindeutig gezeigt werden, daß diese Hohlräume mit Endothelzellen ausgekleidet und von Basalmembranen umgeben, also wie Kapillaren aufgebaut sind. Drei Wochen nach der TMLR wiesen die verschlossenen Laserkanäle ein kapillarähnliches Netz auf, dessen Dichte z.T. über der üblicherweise in Narbengewebe beobachteten Kapillardichte liegt. Acht bis 16 Monate nach TMLR ließen sich die angelegten Laserkanäle histologisch nicht mehr nachweisen.

Im Einklang mit zahlreichen anderen Arbeitsgruppen gehen wir daher davon aus, daß sich transmyokardiale Laserkanäle unmittelbar nach ihrer Anlage wieder verschließen. In der Umgebung der Laserkanäle setzt gleichzeitig eine ausgeprägt Angioneogenese ein, die wahrscheinlich durch den spezifischen Effekt der Laserstrahlung mitunter ein erhebliches Ausmaß erlangen und auch funktionell zu einer besseren regionalen Durchblutung mit konsekutivem Rückgang des klinischen Angina-pectoris-Syndromes führen kann. Diese Angioneogenese könnte durchaus den Hauptwirkmechanismus der TMLR darstellen.

Für die Beantwortung der Frage nach dem geeignetsten Lasertyp für die TMLR erscheint die Datenlage derzeit noch nicht ausreichend.


Fußnoten:

<24>

im Op-Bericht des Texas-Heart-Institute fand sich nur die Angabe, daß anterolateral einige TMLR-Kanäle angelegt wurden

<25>

der Patient ist nicht verstorben, er wurde herztransplantiert

<26>

* der Terminus „thrombisch“ ist eigentlich nicht exakt, da es sich bei dem Kanal nicht um ein präformiertes Gefäß handelt. Der Anschaulichkeit halber wird er jedoch weiter verwendet.


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Mon Sep 16 16:01:06 2002