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6  Material und Methoden

6.1 Geräte und Chemikalien

Für den Tierversuch wurden folgende Medikamente von nachstehenden Firmen bezogen: Diazepam (Ratiopharm, Ulm, BRD), Hypnorm® (Jansen, Leyden, Niederlande), Baralgin® (Hoechst, Franfurt/M, BRD), Pentstrep-400® (Interchemie, Werben, Niederlande), Betaisodona® (Mundipharma, Limburg, BRD), Rompun® (Bayer, Leverkusen, BRD), Ketamin (Parke-Davis, Berlin, BRD) Trapanal (BYK Gulden, Konstanz, BRD), Human-Albumin®5% und Fibrogammin® HS (Aventis Behring, Liederbach, BRD).

Die Faktor XIII-Analyse wurde mit dem Berichrom®-Kit der (DADE Behring Marburg, BRD) durchgeführt.

Die Ausrissversuche wurden an der Prüfmaschine (Zwick 1455, Zwick GmbH, Ulm, BRD) durchgeführt, die Einbettung der Röhrenknochen erfolgte inPolyacryl (Beracryl®, Fulenbach, Schweiz).

Für die licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden folgende Chemikalien verwendet: vergällter Alkohol, Cacodylatpuffer pH 7,3 (Dr. Holborn & Söhne, Leipzig, BRD), Chloroform, Xylol, absoluter Alkohol (Baker, Deventer, Niederlande), Eiweißglycerin (Chroma, Hagen, BRD), Tissue Tec (Miles Inc., Ohio, USA), Fuchsin (Sojuschemie, Moskau, GUS), Poncean, Bleicitrat, DDSA-Eponhärter, Epon 812, Propylenoxid, DePex-Eindickmittel, Bleicitrat (Serva, Heidelberg, BRD), 25 % Glutaraldehyd, Uranylacetat, Saccharose, 1 N Natron-lauge, Lichtgrün, Orange G, Essigsäure 100 %, Eisen-III-chlorid, Hämatoxylin, Eosin, Paraffin, Neofix®-Fixierlösung (Merk, Darmstadt, BRD), Osmiumsäure / Osmiumteroxyd, Gelantinekapseln (Planet GmbH, Wetzlar, BRD), MNA (Balzers, Lichtenstein), 2, 4,6-Tris-(dimethylaminomethyl)-phenol (Fluka Chemie, Steinheim, Schweiz), Aqua bidestilata steril (Aqua Braun, Melsungen, BRD), Aqua destilata (Charité Hausapotheke, Berlin, BRD).

Die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden an einem Standardlichtmikroskop, die elektronenmikroskopischen Untersuchungen am Zeiss II-Mikroskop (Carl Zeiss, Jena, BRD) durchgeführt.

Für die Analyse des Gesamtkollagengehaltes und der Konzentration der nichtreduzierbaren Quervernetzungen dienten zur Vorbehandlung der Proben ein Trockenschrank (WTC binder, Tuttlingen, BRD), ein pH-Messgerät MV 88


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(Präzisions-Labor-pH-Messgerät, VEB PRÄCITRONIC, Dresden, ehemalige DDR) und eine elektronische Präzisionswaage MC 1 (Sartorius AG, Göttingen, BRD).

Des Weiteren wurde für die Hydroxyprolinanalyse ein Rotationsmischer 3 300 und Thermostat 3 401 (Eppendorf Gerätebau GmbH, Hamburg, BRD) sowie ein Photometer (SUMAL PE 2, Carl Zeiss, Jena, BRD) verwendet.

Folgende Chemikalien wurden eingesetzt: Phosphor(V)-Oxid (Merck, Darm-stadt, BRD), L-Hydroxyprolin (Serva, Heidelberg, BRD), Chloramin T (Natrium N-Chloro-p­Toluolsulfonamid), 2-Propanol, Pufferstammlösung (25 g Zitronensäure-Monohydrat, 96 %ige Essigsäure, Natriumacetat-Trihydrat, Natriumhydroxid, Aqua bidestillata, Toluol, 2-Propanol, DAB–Perchlorsäure-Lösung, 4-Dimethylaminobenzaldehyd, 70 %ige Perchlorsäure, Kalium-hydroxid, Kalziumchlorid (Merck, Darmstadt, BRD).

Für die Konzentrationsbestimmung der nichtreduzierbaren Querbrücken wurden kommerzielle ELISA-Kits verwendet. Die notwendigen Lösungen, Kontrollen, Standards und Materialien sind in den ELISA-Kits enthalten (PYRILINKS® Metra Biosystems, Inc., Mountain View, USA, IMMULITE® Pyrilinks-D, DPC, Los Angeles, USA).

Die für die Kollagentypisierung erforderlichen Geräte und Materialien werden im Folgenden genannt. Die Zentrifuge 5 402 und der Thermomixer 5 436 stammten von der Firma Eppendorf (Hamburg, BRD). Es wurden

3ml all-glas Potter-Homogenisatoren der Firma Novodirect (Kehl, BRD), konische Reaktionsgefäße (15 ml) der Firma NALGE Company (New York, USA) verwendet sowie ein Rüttler (Heidolph Polymax 2 040, Füssen, BRD) während der Bromzyanspaltung genutzt. Die Lyophilisation erfolgte mittels des Gerätes ALPHA 2-4 der Firma Martin Christ, Gefriertrocknungsanlagen GmbH (Osterode, BRD). Weitere Chemikalien, wie PBS (Seromed, Berlin, BRD), Bromzyan ( Fluka Chemie AG, Steinheim, BRD) wurden eingesetzt.

Für die Elektrophorese dienten folgende Chemikalien und Geräte: Power Supply, XCELL IITM -Mini-Cell und 4-20 % Tris-Glycin-Gele (1,5 mm) der Firma NOVEXTM (San Diego, USA). Die SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese stammte von (Fa. Bio-Rad Laboratories, Los Angeles, USA).

Die Kollagenstandards Typ I (bovine fetal skin) und III (bovine skin) wurden von der Firma Chemicon (Hofheim/Ts, BRD) bezogen.


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6.2  Tierexperimenteller Versuchsaufbau

Als Versuchstiere wurden ausgewachsene Kaninchen der Rasse „New Zealand White“ SPF verwendet. Hierbei bedeudet SPF - specific pathogen free und das die Tiere regelmäßig auf für Kaninchen spezifische pathogene Erreger virologisch, bakteriologisch, parasitologisch und mykologisch im Zeitraum vom 01.09.1996 – 20.10.1997 untersucht wurden. Die Untersuchungen wurden in der veterinärmedizinischen Abteilung des Pharmakologischen Institutes der Firma GRINDEX (Riga, Lettland) durchgeführt.

Die Tiere hatten zum Operationszeitpunkt ein mittleres Körpergewicht von 3720 g (3450 - 4305 g) sowie ein durchschnittliches Alter von 7,2 Monaten (7,0 - 8,7 Mo.). Die Epiphysenfugen waren bereits verschlossen.

Vor der operativen Intervention wurden die Tiere 14 Tage zur Akklimati-sierung an die konventionelle Tierhaltung in Quarantäne gehalten, zur Anpassung an die Stallgewohnheiten.

Alle verwendeten Tiere wurden in Standardkäfigen gehalten (400 mm hoch, 400 mm breit, 600 mm tief), sie erhielten spezielles Kaninchentrockenfutter (HEMO GmbH, Scheden, BRD) sowie Trinkwasser ad libitum. Der Licht-Dunkel-Wechsel betrug 12/12 Stunden, die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit wurden automatisch kontrolliert. Die Luftumwälzung erfolgte 10-15 mal pro Stunde bei einer Luftfeuchtigkeit von 45 % +/- 5 %.

Die Operationen wurden in einem Tieroperationsaal des 1. Traumatologisch­Orthopädischen Institutes der Stadt Riga durchgeführt. Die Pflege und fortlaufende veterinärmedizinische Betreuung wurde entsprechend den Konventionen von Leyden in der veterinärmedizinischen Abteilung des Pharmakologischen Institutes der Firma GRINDEX (Riga, Lettland) abgesichert.

Eine Genehmigung für die Durchführung der Tierexperimente lag von der Ethikkommission des Pharmakologischen Institutes der Firma GRINDEX (Riga, Lettland) in schriftlicher Form vor.

6.2.1 Versuchsgruppen

Für die wissenschaftlichen Fragestellungen erfolgte in der präoperativen Planung eine entsprechende Gruppenaufteilung. Es wurden insgesamt drei Operationsgruppen und eine Kontrollgruppe gebildet. Die Zuteilung der Tiere zu den Gruppen erfolgte randomisiert, wie unter 6.2.2 beschrieben.

  1. Gruppe A (n = 24):
    vordere Kreuzbandplastik mit Patellarsehnentransplantat in Standard-versorgungstechnik
  2. Gruppe B (n = 24):
    vordere Kreuzbandplastik mit Patellarsehnentransplantat und Faktor XIII-Applikation
  3. Gruppe C (n = 24):
    vordere Kreuzbandplastik mit Patellarsehnentransplantat in Transplantat-Splitting-Technik und mit Faktor XIII-Applikation
  4. Gruppe D (n = 8):
    Kontrollgruppe, ohne Operation zur Verlaufskontrolle des Faktor XIII- Plasmaspiegels und der Osteoarthrosedokumentation

6.2.2 Randomisierung der Versuchstiere

Es erfolgte die Randomisierung von 80 Kaninchen nach geplanter Beobachtungszeit und der Zuteilung zur entsprechenden Operationsgruppe mittels Zufallszahlenverteilung (Wissenschaftliche Tabellen, Geigy 1982). Die Gruppen A-C bestanden aus jeweils 24 Tieren, die sich entsprechend ihrer Untersuchungszeitpunkte in Untergruppen von je 8 Tieren aufteilten. Es wurden jeweils beide Kniegelenke operiert, wobei die linken Kniegelenke für die morphologischen sowie biochemischen Untersuchungen genutzt wurden und die rechten Kniegelenke ausschließlich der biomechanischen Testung dienten.

Bei den 8 Tieren der Kontrollgruppe wurde während des gesamten Untersuchungsverlaufes der Faktor XIII-Plasmaspiegel bestimmt. Weiterhin dienten diese Gelenke als Referenzgruppe zum Vergleich der radiologischen osteoarthrotischen Veränderungen, der histologischen, morphometrischen und biochemischen Untersuchungen für die Patellarsehne und dem vorderen Kreuzband sowie für die biomechanische Untersuchung.


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6.3  Operationsmethoden

Die Betäubung erfolgte durch eine intramuskuläre Applikation eines Ge-misches aus 2 mg/kg Diazepam und 0,3 ml/kg Rompun® in den rechten Hinterlauf. Postoperativ wurde einmalig zur Schmerztherapie Baralgin® sowie zur antibiotischen Abschirmung Pentstrep-400® jeweils intramuskulär ver-abreicht. Unter Narkosebedingungen wurden die Hinterläufe rasiert.

Nach dreimaliger chirurgischer Hautdesinfektion mit Betaisodona® und steriler Abdeckung erfolgte ein gerader Hautschnitt frontal zwischen der Kniescheibe und dem Unterrand der Tuberositas tibae. Die Patellarsehne spannte sich in leichter Beugung gut an und wurde vom Paratenon befreit. Aus dem zentralen Drittel der Patellarsehne wurde ein 3 mm breiter Streifen mit endständigen Knochenblöcken von der Patella und der Tuberositas tibae entnommen.

Abb. 19: a, b: Entnahme des zentralen Patellarsehnenstreifens mit einem quaderförmigen Knochenblock aus dem kaudalen Patellapol und der Tuberositas tibia.

Anschließend erfolgte eine paramediane mediale Arthrotomie und die Lateralisation der Patella. Nach Exzision des vorderen Kreuzbandes wurde femoral 0,5 cm tief und tibial durch den gesamten Schienbeinkopf ein 2,7 mm starker Bohrkanal angelegt.


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Abb. 20: Anlage des transtibialen Bohrkanals von 2,7 mm. Die Lage des Bohrkanals liegt ca. 60° in der Sagittalebene und 15-20° in der Frontalebene.

Die weitere Transplantatbearbeitung unterschied sich für die einzelnen Untersuchungsgruppen. Für die Gruppen A und B erfolgte keine weitere Bearbeitung des Knochen-Patellarsehnen-Knochen-Transplantates. Für die Gruppe C wurde das Transplantat mit einem Skalpell standardisiert im Faserverlauf gespalten (Splitting­Technik). Hierbei entstand ein Transplantat mit drei gleichstarken kollagenen Faserbündeln. Diese Technik wird in den weiteren Beschreibungen als „Splitting­Technik“ bezeichnet.

Abb. 21: Patellarsehnentransplantate mit endständigen Knochenblöcken.: Links: Standardtransplantat. Rechts: Transsplantat in drei Hauptbündel gesplittet.


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Vor dem Einzug der Transplantate wurden diese auf einem suture board 10 Minuten mit 5 N gespannt. Der trapezförmige Knochenblock aus der Tuberositas tibia wurde in press-fit Technik femoral eingebolzt. Die tibiale Verankerung erfolgte mit einer Kleinfragment-Spongiosaschraube (2,2 x 10 mm), die nach dem Interferenzschraubenprinzip parallel zum quaderförmigen Knochenblock in 10° Flexion unter 17,5 N Vorspannung eingebracht wurde.

Abb. 22: a, b: Links: Einbolzen des Knochenblockes femoral in press-fit Technik. Rechts: Tibiale Fixierung des Knochenblockes mit einer Kleinfragmentspongiosaschraube.

Abb. 23: Abschlussbild des Operationssitus nach Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes mit einem Patellarsehnentransplantat

Postoperativ erfolgte keine Protektion der operierten Extremität.


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6.3.1  Nachuntersuchungsintervalle

Die Nachuntersuchungsintervalle wurden auf 2, 32 und 56 Wochen festge-legt. Somit konnte sowohl eine Aussage zum Einheilungsverhalten in der postoperativen Frühphase als auch zur Langzeitprognose der vorderen Kreuzbandtransplantate gegeben werden. Die ausgewählten Zeitintervalle entsprechen Literaturangaben zum Testen von kollagenem Bindegewebe bei Kaninchen (BALLOCK et al. 1989, BLICKENSTAFF et al. 1997, FROMM 1994, SCHIAVONE PANNI et al. 1993).

6.3.2 Explantation

Nach Ablauf der Beobachtungszeit wurden die Tiere mit 5mg/kg Ketamin-HCL und 0,1 ml/kg Rompun® jeweils intramuskulär anästhesiert. Die Tötung der Tiere erfolgte aus tiefer Narkose mit einer Überdosis Trapanal® intrakardial. Die Hinterläufe wurden beidseits abgtrennt und bei –20 °C eingefroren.

6.4 Faktor XIII – Kontrolle

Allen Tieren wurde nach einem festgelegten Protokoll (präoperativ, 1., 3., 5., 7., 14. Tag post operationem, für die Langzeitbeobachtungsgruppen nach 32 und 56 Wochen) Blut aus der Ohrvene abgenommen und eine Faktor XIII-Aktivitätsbestimmung durchgeführt. Es erfolgte die Aspiration von 2,7 ml Blut in 0,3 ml Zitratlösung, welches unmittelbar nach der Abnahme 2 x 10 Minuten mit 5000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurde. Der Plasmaüberstand wurde bei –20 °C eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt mit dem Berichrom® Test auf die Faktor XIII-Konzentration untersucht.

Die Tiere der Operationsgruppen B und C erhielten jeweils nach vorangegangener Blutabnahme am 1., 3., 5, und 7. Tag post operationem eine intravenöse Faktor XIII Therapie. Die Gruppe A erhielt eine Äquvivalenzdosis von 0,5 ml Human-Albumin 5 % ohne Faktor XIII, um einen Wirkanteil des Albumins in den Gruppen B und C auszuschließen.Den Gruppen B und C wurden jeweils 50 IE /kg Körpergewicht Fibrogammin® HS appliziert.

Da die nötigen Daten der Faktor XIII-Spiegel in Plasma und Synovia für Kaninchen aus der Literatur nicht ermittelt werden konnten, war es erforderlich, eigene pharmakokinetische Untersuchungen in Vorversuchen durchzuführen. Hierfür wurden jeweils 5 Tiere mit 50 IE/kg KM und 100 IE/kg KM Faktor XIII intravenös


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behandelt und die Plasmaspiegel des Faktor XIII 10 Minuten vor Gabe, sowie 30 Minuten, 2, 4, 8 und 24 Stunden nach der Applikation gemessen. Dabei ergaben sich lediglich bis 4 Stunden nach der Applikation signifikant höhere Werte für die höhere Faktor XIII-Gabe. Von weitaus größerem Interesse war die Konzentration in der Gelenksynovia. Diese wurde 24 Stunden nach intravenöser Applikation gemessen. Aufgrund des geringen Volumens des Kaninchenkniegelenkes konnte keine direkte Aspiration von Synovialflüssigkeit erfolgen. Hierfür wurde die Verdünnungs-methode mit dem Hydroxylstärketest nach HEILMANN et al. (1996) ange-wandt. Aus den gewonnenen Aspiraten konnte dann näherungsweise unter Berücksichtigung des Synoviavolumens und des Verdünnungseffektes die Faktor XIII­Konzentrationsbestimmung mit dem Berichrome®-Test ermittelt werden. Die Ergebnisse zeigten sehr geringe Konzentrationen zwischen 50 – 60 % für Faktor XIII, ohne signifikanten Unterschied für die Synovia-konzentration, in Abhängigkeit von der applizierten Dosierung. Im vor-liegenden Experiment wurde aus diesem Grund die Applikation von 50 IE/kg KM in den entsprechenden Versuchsgruppen gewählt.

6.5 Makroskopische Befunddokumentation

Nach der Arthrotomie wurde eine makroskopische Befundung folgender Parameter durchgeführt: Farbe der Synovia, Ausbildung des Hoffa-Fett-körpers, Verwachsungen, Verklebungen, Synovialisierung des Trans-plantates und Straffheit des Transplantates. Die Evaluierung des Knorpel-status ist unter Abschnitt 6.6 beschrieben.

6.6 Knorpelstatus und Osteoarthrosedokumentation

Die Einschätzung und Beurteilung des Knorpelstatus bei Kleintieren ist sehr schwierig und subjektiven Einflussfaktoren unterlegen. Zur Beurteilung wurden die makroskopische Befundung des Untersuchers, die Beurteilung der Röntgenuntersuchung des Kniegelenkes in zwei Ebenen und die lichtmikroskopische Betrachtung des Knorpels herangezogen. Die Beur-teilung der histologischen Veränderungen der Kniegelenke auf das Ausmaß der Arthrose erfolgte mit Hilfe des MANKIN-Score, der mehrfach bei Untersuchungen an Kleintieren in der Literatur Anwendung fand (MACHNER et al. 1999, MANKIN et al. 1971, NEIDEL et al. 1998, PAP et al. 1998). Die Präparate wurden zum Ausschluss einer Beobachterbeeinflussung kodiert. Entsprechend den Angaben in der Literatur wurden vier Schweregrade der Arthrose unterschieden.

Grundlage hierfür waren die erreichten Punktwerte im MANKIN-Score. Hierbei wurde differenziert in: Grad 0 - keine Arthrose (0 Punkte), Grad I – leichte Arthrose (1-5 Punkte), Grad II – mäßige Arthrose (6-11 Punkte) und Grad III – schwere Arhrose (11-[Seite 72↓]14 Punkte). Die Einstufung des Schädigungs-grades des Kniegelenkes erfolgte dabei anhand der stärksten Schädigung, wobei Tibia und Femur jeweils getrennt wurden.

6.7 Ausrissfestigkeitsuntersuchungen

Die Ausrissversuche wurden zu einem späteren Zeitpunkt nach dem Auftauen der Präparate unter standardisiertem Vorgehen durchgeführt. Die Kniegelenke wurden vollständig von den umgebenen Weichteilen befreit und die Knochen deperiostiert. Lediglich das vordere Kreuzband blieb erhalten. Die Femura und die Tibiae wurden in Beracryl® gegossen und mit Spezialklemmbacken in der Prüfmaschine fixiert. Der Flexionswinkel des Kniegelenkes betrug 60° um eine streng axiale Zugwirkung auf das Transplantat zu gewährleisten. Ein Rotieren von Femur und Tibia gegeneinander mit dem Resultat einer scheinbaren Bandverlängerung kann mit dieser Versuchsanordnung ausgeschlossen werden. Vor dem Ausrisstest wurden die Transplantate mit 0,2 N vorgespannt. Der Ausrisstest erfolgte mit einer Prüfgeschwindigkeit von 10 mm/min.

Bei der Bestimmung der Reißfestigkeit des transplantierten Kreuzbandes wird das Band inklusive seiner femoralen und tibialen Insertionen gemessen. Dieses Vorgehen erlaubt die sichere Verankerung des Kreuzbandes und ist bei der geringen Länge des Transplantates die technisch einzig mögliche Lösung. Die isolierte Untersuchung des Patellarsehnentransplantates war aufgrund der kleinen Dimension in der verwendeten Messapparatur nicht möglich.


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Abb. 24: Messapparatur für die biomechanische Testung der Transplante. Streng axiale Ausrichtung der Zugrichtung für das VKB-Transplantat.

Der Ausrissmechanismus wurde in einer Kraft-Dehnungs-Kurve dokumentiert. Kraft­Dehnungs-Kurven von Sehnen und Bändern zeigen einen typischen mehrphasigen Verlauf, was in der Mikrostruktur des elastischen Gewebes begründet ist. Folgende Parameter wurden aus den Ausrissversuchen zur Bewertung herangezogen: maximale Reißfestigkeit, die Steiffigkeit im linearelastischen Bereich und der Ausrissmechanismus (Transplantatruptur, Avulsion, Knochenblockausriss). Während der Untersuchung erfolgte die ständige Befeuchtung der Transplantate mit physiologischer Kochsalzlösung.

Für die Referenzdaten des vorderen Kreuzbandes wurden 8 Kniegelenke der Kontrollgruppe untersucht.


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6.8  Histologische und histomorphometrische Untersuchungen

6.8.1 Übersichtslichtmikroskopie

Nach dem Ausrissversuch wurden die Bandanteile in Neofix® fixiert und in Paraffin eingebettet. Die angefertigten 6 µm starken Längs- und Querschnitte erhielten alternierend Hämatoxilin-Eosin, Masson-Goldner und van Gieson Färbungen im standardisierten Vorgehen und wurden histologisch und histomorphometrisch ausgewertet.

In der Übersichtslichtmikroskopie wurden Granulations- und Nekroseareale bestimmt sowie die Transplantate auf Kollagenausrichtung beurteilt. Die Erfassung dieser Kriterien erfolgte in den zentralen Transplantatanteilen. Im Weiteren wurden die Insertionszonen sowie die knöcherne Integration der Knochenblöcke femoral und tibial beurteilt.

Die Beurteilung der Knorpelschädigung erfolgte in femoralen Sagittal- und tibialen Frontalschnitten in Hämatoxilin-Eosin und Safranin-O Färbungen mit Hilfe des MANKIN­Scores durchgeführt (MANKIN et al. 1971).

6.8.2 Histomorphometrie

Zur Ermittlung der stereologischen Messwertparameter wurde ein quadratisches Raster mit 121 Messpunkten (Pt) und konstanter Periodenlänge (a) zwischen den Punkten nach HAUG (1955) benutzt. Die Ermittlung der Messwerte erfolgte in der Immersionsauflichtmikroskopie bei 1000-facher Vergrößerung. Es wurden die so genannten Primärparameter erfasst und unter Nutzung sterologischer Gleichungen die Sekundärparameter, wie Volumen- und Flächenwerte berechnet (LABS 1993, WASSILIEW 1977, WEIBEL und ELIAS 1967).

Bestimmung der Primärparameter


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Abb. 25: Schematische Darstellung eines Rasterbildes. Es befinden sich vier Fibroblasten (NZ = 4, PZ = 12, CZ = 10) und zwei Gefäßanschnitte (NZ = 2, PZ = 2, CZ = 6) im Einheitsfeld

Bestimmung der Sekundärparameter

Die Volumendichte (VVZ) der Fibrozyten und Fibroblasten entspricht dem Quotienten aus der Anzahl der Trefferpunkte über den Zellen und der Gesamtpunktezahl des Rasters.

VVZ [µm²/µm³] = PZ / Pt

Die Berechnung der nummerischen Dichte (NVZ) beruht auf der Relation von Zellzahl pro Einheitsfläche und Volumendichte, entsprechend dem Volumen der Zellen pro Einheitsvolumen. Des Weiteren gehen ein Form- und ein Größenfaktor ein.


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NVZ [µm³] = (k / ß) x (NAZ x 1,5 / VVZ x 0,5)
k = Größenverteilungsfaktor
ß = Formfaktor

Im vorliegenden Versuch ist eine Stichprobenanzahl von 120 Gesichtsfelder pro Versuchsgruppe gewählt worden. Alle Primärparameter wurden nach manueller Auszählung in ein Datenerfassungsprogramm eingegeben. Diese Daten wurden mit einem speziell angefertigten Morphometrieprogramm gekoppelt und alle gewünschten Sekundärparameter berechnet (LABS 1993, WASSILIEW 1977).

6.9 Kollagenfibrillenmorphometrie

Aus den Transplantaten unmittelbar oberhalb der tibialen Insertion wurden je 2 Proben der Größe 1 x 1 mm gewonnen und in 0,075 M 1 %- iger Osmium-tetraoxid-Na-cacodylatpuffer (pH 7,35) bei 4 °C eine Stunde fixiert. Dann folgte die Dehydratation in einer aufsteigenden Alkoholreihe und die Ein-bettung in Epoxidharz. Die Kontrastierung wurde mit Uranylacetat und Bleicitrat durchgeführt. Von jedem Querschnitt wurden 5 Schwarz-Weiß-Fotografien bei 18000-facher Vergrößerung mit einem Transmissions-elektronenmikroskop angefertigt, anschließend digitalisiert und bei 54.000-facher Vergrößerung morphometriert. Im Kalkulationsprogramm (Excel 97, Microsoft, USA) wurden die Parameter Gesamtfläche der Fibrillenfaseranschnitte, prozentuale Flächendichte der Fasern, nummerische Dichte der Fasern, Medianwert der Fibrillendurchmesser und der Minimum–Maximum-Durchmesser der Fibrillen bestimmt.

Während des Messvorganges erfolgte eine kontinuierliche Ermittlung der Standardabweichung und des Standardfehlers einer Stichprobe. Die Anzahl der Messungen wurde beendet, wenn das Verhältnis aus Standardfehler zu mittlerem Fibrillendurchmesser der Stichprobe unter 0,1 lag, da dann die Stichprobengenauigkeit > 95 % betrug. Zusätzlich erfolgte eine fortlaufende graphische Darstellung der Verteilung der Kollagenfibrillendurchmesser im Intervall mit folgenden Kategorien: 0-25 nm, 25-50 nm, 50-75 nm, 75-100 nm, 100-125 nm, 125-150 nm, 150-175 nm, 175-200 nm, 200-225 nm, 225-250 nm und > 250 nm.


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6.10  Biochemische Analyse

Die Bandanteile wurden von Fett- und Synovialisresten freipräpariert. An-schließend erfolgte die Aufteilung der Proben für die Analyse des Hydroxyprolingehaltes und der Konzentrationen der Quervernetzungen sowie für die Kollagentypisierung. Nach der Bestimmung des Feuchtgewichtes wurden die Proben im Vakuum-Exsikkator getrocknet und das Trockengewicht der einzelnen Proben mittels der elektronischen Präzisionswaage MC 1 ermittelt.

6.10.1 Quantitative Hydroxyprolinbestimmung

Die Methode nach Stegemann und Stalder (1967) fand eine modifi-zierte Anwendung.

Zu den im Vakuum-Exsikkator getrockneten Proben wurde zur Säurehydro-lyse je 1 ml 6 N HCl/10 mg Trockengewicht zugegeben. Die Hydrolyse erfolgte in einem Trockenschrank bei 100 °C über 24 Stunden (ROBINS 1982).

Anschließend trockneten die Analyseproben erneut im Vakuum-Exsikkator für 5 Tage.

Nach dieser Vorbereitung des Untersuchungsmaterials wurden die Analyse- und Standardproben mit Aqua bidestillata verdünnt. Die Standardproben enthielten definierte Mengen an L-Hydroxyprolin und dienten der Bestimmung der Bezugskurve.


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Abb. 26: Ablauf der biochemischen Analyse (Riechert 2001)

Danach wurden zu 200 μl der Probelösungen je 200 μl Chloramin T (Natrium N-Chloro-p-Toluolsulfonamid) und verdünnter Puffer gegeben und auf einem Rotationsmischer gemischt.

Die Dauer dieser Oxidationsreaktion betrug 20 Minuten. Zur Herstellung der Chloramin T-Lösung wurden 0,141 g Chloramin T eingewogen und mit 1,0 ml Aqua bidestillata, 1,0 ml 2-Propanol und 8,0 ml verdünnter Pufferlösung gemischt. Die verdünnte Pufferlösung, die im Vergleich zur Methode von Stegemann und Stalder (1967) doppelt so stark war, bestand aus 25 ml Pufferstammlösung (25 g Zitronensäure-Monohydrat, 6 ml 96 %ige Essigsäure, 60 g Natriumacetat-Trihydrat, 17 g Natriumhydroxid, 250 ml Aqua bidestillata und 3 Tropfen Toluol, pH 6,6), 17,5 ml Aqua bidestillata und 7,5 ml 2-Propanol.


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Die Oxidationsreaktion wurde durch Zugabe von 200 μl DAB–Perchlorsäure-Lösung gestoppt. Diese Lösung bestand aus 1,5 g 4-Dimethyl-aminobenzaldehyd, 4 ml 2­Propanol und 3,8 ml 70 %ige Perchlorsäure, die mit 2-Propanol auf 10 ml aufgefüllt wurde. Die Eppendorfröhrchen wurden dann für 20 Minuten in einem 56 °C warmen Wasserbad inkubiert und anschließend über 5 Minuten in kaltem Wasser gekühlt.

Die Exstinktionsmessung erfolgte am Photometer bei einer Wellenlänge von 550 nm.

Abschließend wurde auf der Grundlage der Hydroxyprolinkonzentration der prozentuale Kollagengehalt (F = 7,7) in den Proben berechnet (EYRE et al. 1984).

6.10.2 Analyse der nichtreduzierbaren Quervernetzungen

Für die Analyse der nichtreduzierbaren Quervernetzungen mittels kommerziellem ELISA ist ein pH-Wert von 7,4 erforderlich. Zur genauen Einstellung des pH-Wertes wurde dem gelösten Probenmaterial bis zum Erreichen des Ziel-pH-Wertes Natriumhydroxid zugegeben.

Pyridinolinanalyse (PYR)

Probenmaterial, Standards und Kontrollen wurden in einem Verhältnis von 1:10 mit dem Analysepuffer verdünnt. Zur Inkubation, die bei 2 bis 8 °C über 3 Stunden ablief, wurden 50 µl dieser Lösungen und 100 µl Enzymkonjugat (monoklonale Pyridinolin­Antikörper) an alkalische Phosphatase gebunden und in vorbereitete, mit Pyridinolin beschichtete Mikrowellplatten pipettiert. Das Antigen (PYR) aus der Beschichtung und den Proben konkurriert um die Bindungsstellen des Enzymkonjugates. Nach dreimaligem Waschen mit einem speziellen Puffer erfolgte durch Zugabe von 150 µl Substratlösung (p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin- und Magnesiumchloridpufferlösung gelöst) eine zweite Inkubation über 60 Minuten bei Raumtemperatur. Die Enzymreaktion wurde durch 100 µl 1 N Natriumhydroxid gestoppt.

Anschließend wurde die optische Dichte bei 405 nm bestimmt. Die Pyridinolinkonzentration im Probenmaterial und in den Kontrollen wurde an-hand einer Standardkurve ermittelt. Es besteht eine indirekte Proportionalität zwischen der optischen Dichte und der Pyridinolinkonzentration.

Die Resultate wurden in nmol/l angegeben und auf der Grundlage des Trockengewichtes und des ermittelten Kollagengehaltes in den einzelnen Proben in mol Pyridinolin/mol Kollagen umgerechnet.

[Seite 80↓]Deoxypyridinolinanalyse (DPD)

Analog der Pyridinolinuntersuchung erfolgte die automatisierte Analyse. Es wurden für Deoxypyridinolin (DPD) spezifische, monoklonale Antikörper, die ebenfalls an alkalische Phosphatase gebunden sind, verwendet. Die Inkubation erfolgte hier bei 37 °C. Nichtgebundene Reaktionspartner wurden mittels eines Waschvorganges entfernt. Nach Zugabe des Substrates (Adamantyldioxetanphosphatester) startete die Enzymreaktion, eine zweite Inkubation wurde über 10 Minuten durchgeführt.

Die optische Dichte wurde mittels eines Luminometers gemessen.

Die Berechnung der vom Automaten ausgegebenen Werte für DPD erfolgte analog der Berechnung für die Pyridinolinkonzentration.

6.10.3 Quantitative Kollagen-Typ I und III Bestimmung

Nach Präparation der einzelnen Strukturen wurden diese im Vakuum-Exsikkator getrocknet und anschließend zur Vorbereitung der Homogeni-sation mit Flüssigstickstoff zerkleinert.

Die Kollagenanalyse erfolgte modifiziert nach der Methode von LAURENT et al. (1981) und RIESLE et al. (1998).

Nach der Zerkleinerung der Transplantate wurde das Gewebe mit PBS in einem 3 ml all-glas Potter-Homogenisator homogenisiert und anschließend bei 10 000 U/min für 6 Minuten zentrifugiert. Zur weiteren Aufarbeitung wurde jeweils der Überstand nach der Zentrifugation verworfen und nur der Rückstand verwendet. Das nach der Zentrifugation erhaltene Material wurde in 2 %igem SDS gelöst, ebenfalls homogenisiert und bei 10 000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, wobei dieser Vorgang viermal wiederholt wurde.

PBS wurde zur dreimalig wiederholten Extraktion verwendet. Zum Abschluss der Vorbereitung des Materials erfolgte zweimal eine Homogenisation in Anwesenheit von Azeton mit nachfolgender Zentrifugation.

Das Analysematerial wurde im Anschluss daran in einem Vakuum-Exsikkator mit Phosphor(V)-Oxid getrocknet (LAURENT et al. 1981).

Die azetongetrockneten Proben wurden in einem 3 ml all-glas Potter-Homogenisator mit 70 %iger Ameisensäure zweimal homogenisiert und in ein konisches 15 ml Zentrifugenröhrchen transferiert. Das Waschen des Homogenisates geschah mit 70 %iger


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Ameisensäure. Das Gesamtvolumen an Ameisensäure in dem Zentrifugenröhrchen betrug 1 ml/10 mg Trocken-gewicht.

Das in Ameisensäure gelöste und homogenisierte Analysematerial wurde für 40 Minuten bei 60 °C unter ständiger Durchmischung inkubiert (RIESLE et al. 1998). Anschließend wurde Bromzyan in fester Form mit einer Konzentration von 50 mg/ml zu der aus Analysematerial und 70 %iger Ameisensäure bestehenden Lösung zugegeben. Zur Deoxigenierung setzte man dem Reaktionsgemisch Stickstoffgas zu. Die Bromzyanspaltung dauerte 20 Stunden. Während dieser Zeit wurden die Zentrifugenröhrchen zur gleich-mäßigen Durchmischung auf einem Rüttler gelagert. Gestoppt wurde die Bromzyanreaktion durch Zentrifugation bei 10 000 U/min für 20 Minuten. Die Zentrifugenröhrchen wurden unter einem Abzugschrank geöffnet und 0,25 ml des Überstandes in Eppendorfröhrchen abpipettiert und bei –20 °C gelagert. Anschließend erfolgte eine zweite Bromzyanspaltung entsprechend dem oben beschriebenen Vorgehen mit dem nach der Zentrifugation erhaltenen Material (FAN 1997).

Nachdem die Proben bei –80 °C gefroren waren, erfolgte eine Trocknung mittels Lyophilisation.

Das lyophilisierte Material wurde mittels der SDS-Polyacrylamid-Elektro-phorese nach LAEMMLI (1970) in einzelne Peptide aufgetrennt. Dazu wurden die Proben in SDS­Probenpuffer (63 mM TrisHCl, 10 % Glycerol, 2 % SDS in 250 ml Aqua bidestillata, pH 6,8) mit 4 mg Probenmaterial/60 µl Probenpuffer gelöst.

Im Anschluss an eine Neutralisation mit 1 µl 10 N NaOH wurden die Proben mittels 10 % des Probenvolumens 50 mM DTT reduziert und zur Denaturierung der Proteine bei 95 °C für 8 Minuten inkubiert.


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Abb. 27: Schematische Darstellung des Procedere für die Kollagentypisierung mittels Bromzyanspaltung und Elektrophorese (RIECHERT 2001)


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Nach der Zentrifugation der Proben bei 10 000 U/min für 5 Minuten verwendete man nur die Überstände zur weiteren Analyse. Vor der Elektrophorese erfolgte eine zweite Verdünnung des Probenmaterials in einem Verdünnungsverhältnis von 1:160.

Die Elektrophorese erfolgte mit Vertikal-Gradientengelen und einer Stromstärke von 30 mA je Gel. Für die Elektrophorese wurde der Molekulargewichtsmarker (MultiMarkTM) benutzt. Das aufgetragene Probenvolumen betrug 5 µl. Die Elektrophorese wurde beendet, wenn die Bromphenol Blau-Front die untere Kante des Gels erreichte.

Die Gele wurden einer Silbernitratfärbung nach Bjellqvist et al. (1993) unterzogen, da diese 100-fach sensitiver ist als die Färbung mit Coomassie Brilliant Blau. Nach Entnahme der Gele wurden diese für 5 Minuten in deionisiertem Wasser gewaschen und anschließend für zweimal 60 Minuten in einer Ethanol-Essigsäure-Wasserlösung (40:10:50) sowie über Nacht im Verhältnis 5:5:90 fixiert.

Nach dem Waschen der Gele für 5 Minuten in deionisiertem Wasser brachte man die Gele für 30 Minuten in eine Lösung aus Natriumazetat (0,5 M) und Glutaraldehyd (1 %).

Danach erfolgten Waschschritte mit dreimal 10 Minuten in deionisiertem Wasser, anschließend mit zweimal 30 Minuten in Naphthalin-1,5-disulfonsäure zur Erzielung einer gleichmäßigen Färbung des Gelhintergrundes. Zum Schluss dieses Teilschrittes wurden die Gele nochmals viermal 15 Minuten in deionisiertem Wasser gespült und danach in einer frisch hergestellten Ammoniak-Silbernitratlösung über 30 Minuten gefärbt. Vor der Entwicklung der Banden erfolgte ein wiederholtes Waschen der Gele über viermal 4 Minuten in deionisiertem Wasser. Die Entwicklung der Banden erfolgte mit einer Lösung aus Zitronensäure (0,01 % w/v) und Formaldehyd (0,1 % v/v) innerhalb von 4 Minuten und wurde mit Hilfe einer Tris (5 % w/v)-Essigsäure (2 % v/v)­Lösung gestoppt.

Die quantitative Auswertung erfolgte mit dem Quantity One. Dazu wurde der prozentuale Anteil der Banden der Markerpeptide für Kollagentyp I (α1(I) CB 7 + CB 8) und III (α1(III) CB3) ermittelt (AMIEL et al. 1984, AMIEL et al. 1986, FAN et al. 1997, LISTRAT et al. 1998).


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6.11  Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden, wenn nicht anders vermerkt, als Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) angegeben. Bei der graphischen Darstellung wurden zusätzlich der Median in Boxplots angegeben.

Die Daten wurden vor Festlegung des Testverfahrens auf eine Abweichung von der Normalverteilung mit dem Kolmogoroff-Smirnow-Test geprüft. Bei kleinen Stichproben wurden zusätzlich die Abweichungen des Mittelwertes und des Medians herangezogen oder die Interpretation des Boxplots genutzt. Im Weiteren erfolgte die Prüfung auf Varianzgleichheit mit dem Levene-Test.

Bei parametrischen unabhängigen Daten erfolgte die Prüfung der Gruppen­unterschiede mit einer einfaktoriellen ANOVA-Analyse. Zur Identifikation der Gruppenunterschiede in Bezug auf den Beobachtungszeitpunkt und der Operationsmethode wurden a posteriori-Tests durchgeführt. Hierzu wurde der Bonferroni-Test (multipler t-Test mit Alpha-Korrektur) und der Dunnett-Test (multiple Vergleiche gegen eine Kontrollgruppe) eingesetzt.

Für nichtparametrische abhängige Daten erfolgte die Prüfung auf Gruppen­unterschiede mit dem Friedman-Test und anschließend die Einzelvergleiche mit dem Wilcoxon-Test.

Bei nichtparametrischen unabhängigen Daten wurden die Gruppen-unterschiede mit dem Rangsummentest nach Kruskal-Wallis durchgeführt und die Paarvergleiche mit dem t-Test nach Student durchgeführt. Sowohl für den Wilcoxon-Test als auch für den t-Test erfolgte eine zusätzliche alpha-Adjustierung nach Bonferroni (p-Wert geteilt durch Anzahl der Paar-vergleiche).

Werte die unter der festgelegten Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0,05 bzw. dem alpha-adjustierten Wert nach Bonferroni lagen wurden als signifikant definiert, wobei immer zweiseitig getestet wurde.

Eine Korrelationsanalyse nach Spearman wurde für die Ausrissfestigkeit und Faktor XIII-Konzentration 2, 32 und 56 Wochen postoperativ gegen ver-schiedene Variablen auf ihre Abhängigkeit geprüft. Die Berechnungen erfolgten nach der Primärdatenerfassung im Kalkulationsprogramm Excel 97 (Microsoft, Seattle, USA) und nach Übertragung die statistische Auswertung im Programm SPSS Version 10 (SPSS Inc. Chicago, USA) auf einem handelsüblichen Personalcomputer.


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03.08.2005