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8  Diskussion der experimentellen Ergebnisse

8.1 Tiermodell, Operationstechnik und Komplikationen

Für die experimentellen Untersuchungen wurde das Kaninchenkniegelenk als Modell gewählt. In zahlreiche wissenschaftlichen Arbeiten konnte dieses Modell in Bezug auf die Anwendbarkeit bestätigt werden (AMIEL et al. 1986, BALLOCK et al. 1989, BLINKENSTAFF et al. 1997, GRANA et al. 1994, GUZZANTI et al. 1994, KENNEDY et al. 1980, PAPACHRISTOU et al. 1998, SCHIAVONE PANNI et al. 1993). Der prinzipielle morphologische Aufbau entspricht dem des humanen Kniegelenkes. Das Gelenk ist jedoch sehr klein und die Präparation sowie das Anlegen der Bohrkanäle, insbesondere femoral, schwierig. In den durchgeführten Untersuchungen wurden Bohr­kanäle von 2,7 mm gewählt, diese Größe ist ausreichend um ein Trans-plantat der gewählten Dimension sicher zu platzieren. In der Literatur wurden teilweise größere Bohrkanäle bis zu 4,5 mm gewählt (FROMM 1994). Dieser Bohrkanaldurchmesser erscheint aufgrund der kleinen Größe des Kniegelenkes zu vulnerabel und strukturkompromittierend.

Als ein Nachteil des Tiermodells ist der quadropode Stand des Tieres mit einer Kniegelenkflexion von mehr als 120° anzusehen. Dieser gravierende Unterschied ist bei der Beurteilung und Übertragung der ermittelten Daten zu berücksichtigen.

Die Grundidee der Transplantatmodifikation in der Gruppe C geht auf die Tatsache zurück, dass Transplantate nach intraartikulärer Platzierung unter der Exposition einer warmen Ischämie und ohne Gefäßanbindung schnell nekrotisch werden. Die ungünstige Situation sollte durch das Spalten der kollagenen Fasern hinsichtlich der Ernährungssituation verbessert werden. Aus experimentellen Arbeiten ist bekannt, dass lediglich Zellen in der Peripherie eines Transplantates durch die Nähe zur Synovia und der Synovialis vital bleiben können (KLEINER et al. 1986). Aus diesem Grund wurde das Transplantat gespalten, um so die Oberfläche artifiziell zu vergrößern und dem Gesamttransplantat eine bessere Ernährungs-möglichkeit zu geben. GINGSBURG et al. (1980) vertreten sogar die An­sicht, dass die Ernährung einer Patellarsehnen-Kreuzbandplastik durch die Synovialflüssigkeit wichtiger sei als die direkte Blutversorgung.

Die Ernährung eines vorderen Kreuzbandes wird nicht nur durch eine Mikrovaskularisierung getragen, sondern zu einem erheblichen Anteil durch die synoviale Umspülung. RENZONI et al. (1984) berichteten in einem Experiment mit Tritium markierten Prolin, dass die synoviale Ernährung des vorderen Kreuzbandes bis zu 70 % beträgt. Auch in einer aktuelleren Studie von MURAKAMI et al. (1996), welche Tritium-Methyl-Glukose in einem


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pharmakokinetischen Kompartmentmodell benutzten, wurde gezeigt, dass mehr als 50 % der Ernährung des vorderen Kreuzbandes durch Permeation von der Synovialflüssigkeit getragen wird.

In einem anderen Versuchsaufbau durch HASHIMOTO et al. (1991) wurde nach selektiver Embolisation der zuführenden Gefäße zum vorderen Kreuzband keine wesentlichen nekrotischen Veränderungen am vorderen Kreuzband von Hunden beobachetet.

Neben der verbesserten synovialen Ernährung der Transplantate sollte durch die Spaltung der Transplantate eine Gewebsverletzung und damit ein repa-ratorischer Prozess eingeleitet werden, der deutlich früher aktiviert wird als beim herkömmlichen Transplantatumbau. Eine erhöhte Proliferation und Vaskularisierung konnte eindeutig belegt werden. Die Induktion des Reparationsprozesses und eine Verbesserung der Ernährungssituation durch die synoviale Umspülung der Faseranteile durch die Splitting-Technik ist bisher in der Literatur noch nicht beschrieben worden.

Die gewählte Vorspannung des Transplantates von 17,5 N geht auf eine frühere Untersuchung zurück (LABS et al. 2002). In dieser Studie wurden Transplantate mit 1 N, 7,5 N und 17,5 N vorgespannt und 2, 8 und 32 Wochen postoperativ histomorphometrisch und biomechanisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Qualität und Quantität der histopatho-logischen Veränderungen durch die eingesetzte Vorspannung determiniert wird. Die Kreuzbandtransplantate der Gruppe mit 17,5 N Vorspannung hatten sowohl morphologisch die größte Ähnlichkeit mit dem normalen vorderen Kreuzband als auch die höchsten Ausrisswerte. Demgegenüber war die mechanische Stabilität in der 1 N Gruppe signifikant geringer.

Auf eine postoperative Immobilisation der operierten Extremität wurde verzichtet. In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Immobilisation eines Kniegelenkes negative Veränderungen in den mechanischen Eigenschaften des Bandapparates bewirkt und degenerative Schäden des Gelenkknorpels nach sich zieht (MUNETA et al. 1993, NEWTON et al. 1995). Auch ultrastrukturelle Veränderungen der Fibroblasten, eine verringerte Permeabilität des vorderen Kreuzbandes (KANDA et al. 1998) und eine erhöhte Expression der Adhäsionsproteine Integrin beta 1, alpha 5 und alpha v (AbiEzzi et al. 1995) wurden beschrieben.

Die gewählten Nachuntersuchungsintervalle sollten eine Beurteilung der kurz-, mittel- und langfristigen Veränderungen ermöglichen. Anlehnend an die von BALLOCK et al. (1989) geforderten langfristigen Standzeiten von mindestens einem Jahr wurden die Tiere auch nach 56 Wochen evaluiert. Für Aussagen zu Sekundärlockerungen der Transplantate und osteoarthrotischen Veränderungen sind insbesondere die Langzeitbeobachtungen sinnvoll. Obwohl die wesent-lichen zellulär transformativen Veränderungen bereits im Kleintiermodell


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zu einem viel früheren Zeitpunkt abgeschlossen sind, konnte gezeigt werden, dass auch nach der 32. postoperativen Woche strukturelle Veränderungen stattfinden.

Bei keinem operierten Tier trat ein oberflächlicher oder tiefer Infekt auf. Ein Kaninchen der Gruppe B erlitt ein Narkosetod und wurde von der Untersuchung ausgeschlossen. Jeweils ein Tier der Gruppe A und C zeigten radiologisch und klinisch eine laterale Subluxation der Patella. Bei freier Gelenkbeweglichkeit wurden diese Tiere in die Untersuchung mit eingeschlossen. Drei Tiere hatten ein Streckdefizit von 10°, eine Ursache konnte nach der Arthrotomie nicht erkannt werden. Diese Tiere wurden in die Auswertung mit aufgenommen.

Klinisch und radiologisch wurden keine Schraubenlockerungen beobachtet.

8.2 Wirkung der Faktor XIII-Applikation

In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass nach einer vorderen Kreuzbandplastik die Faktor XIII-Plasmakonzentration postoperativ gegen-über präoperativ signifikant abfiel. Ohne Faktor XIII-Applikation konnten die Ausgangwerte erst nach dem 14. p.o. Tag wieder erreicht werden, während sich nach Substitution von Faktor XIII bereits ab den 3. p.o. Tag der Plasma-spiegel normalisierte und auf ein höheres Niveau bis zum 14. p.o. Tag ein-stellte.

Es ist zu schlussfolgern, dass der eingriffsbedingte Verbrauch des Faktors XIII nur nach längerer Zeit durch die körpereigene Synthese ersetzt werden kann, wodurch die Effizienz von Heilungsvorgängen möglicherweise herab-gesetzt wird.

Ein postoperativer Faktor XIII-Abfall ist durch mehrere klinische Unter-suchungen (BARTHELS et al. 1993, BROCKMEIER und ARNOLD 1999, CHAOUI et al. 1999, DAVIDS und HODEL 1999, ENGELHARDT et al. 1983, MUTO 1977, SILBERZAHN 1993) belegt worden, wobei die Intensität des Abfalls von verschiedenen Variablen, wie Größe des Eingriffes, Konstitution der Patienten und Dauer der chirurgischen Intervention abhängen (KIRSCHNER et al. 1977, MARKTL et al. 1977 und TAUBER et al. 1974).

Die niedrigsten Faktor XIII-Werte werden zwischen dem ersten und sechsten postoperativen Tag beobachtet, also zu einem Zeitpunkt, wo die intensive Migration und Proliferation sowie eine gesteigerte Kollagensynthese für die initiale Gewebsreparatur erforderlich ist. Für den physiologischen Ablauf dieser Reparationsvorgänge ist nach SCHRAMM et al. (1977) eine normale Faktor XIII­Konzentration Voraussetzung.

Um optimale Grundlagen für den multifaktoriellen Vorgang der Binde-gewebsheilung zu schaffen, ist eine komplett vernetzte Fibrin-Matrix zur Einsprossung von Fibroblasten bzw. Osteoblasten erforderlich.


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Fibroblasten sind die vorherrschende Zellpopulation und die Hauptsynthese-zellen in Regionen der Bindegewebsheilung. Der Prozess der Bindegewebs-heilung hängt von der Zellzahl und der Syntheseleistung dieser Zellen ab. Die Vernetzung des Fibrins stimuliert die Migration von Fibroblasten in ein Fibringerüst (KNOX et al. 1986). Die Vernetzung der alpha-Ketten wird durch die Faktor XIII-Konzentration bestimmt (BROWN et al. 1993).

Der Faktor XIII bindet Fibronektin an Fibrin- und Kollagenfibrillen, die für einsprossende Fibroblasten als Leitschiene dienen (MIYACHI et al. 1993). Die Interaktionen von Faktor XIII mit Fibrin, Fibronektin und Kollagen liefern bei entsprechenden Faktor XIII­Konzentrationen die grundlegende Matrix für eine stabile und schnelle Bindegewebsreparation.

In vitro-Studien zeigten neben der zellproliferativen Wirkung des Faktor XIII auch positive Effekte auf Zelladhäsion (PAYÉ und LAPÉRE 1986, UEKI et al. 1996), Kollagensynthese (PAYÉ und LAPÉRE 1986) und Mitoserate (BECK et al. 1961, CLAES et al. 1987) von Fibroblasten und Osteoblasten. Aufgrund der stimulierenden Wirkung des Faktor XIII auf die Fibroblastenproliferation empfahl BRUHN (1983) diesen Faktor als fibroblastenstimulierenden Faktor und nicht als Faktor XIII zu bezeichnen.

Die vorliegenden Ergebnisse der eigenen Untersuchungen belegen, dass durch die zusätzliche Applikation des Faktors XIII qualitative und quantitative morphologische Veränderungen des Kreuzbandtransplantates resultieren und 2 Wochen postoperativ die Medianwerte der Zellularität und der Gefäß-anschnittsflächen in den Gruppen B und C nach Applikation von Faktor XIII signifikant höher waren als in Gruppe A, was für eine Beschleunigung der initialen Umbauvorgänge spricht.

Neben einem akzelerierten intraartikulären Umbauprozess der Transplantate konnte auch eine verbesserte extraartikuläre ossäre Integration der Knochen-blöcke beobachtet werden. Die Ausrissmechanismen konnten belegen, dass in der Gruppe A ohne Faktor XIII Applikation 2 Wochen postoperativ alle Knochenblöcke herausgerissen wurden. Dies traf für die Gruppen B und C nicht zu. Der positive Einfluss auf die Osteoblastenstimulation und Knochenheilung wurde bereits in früheren experimentellen (CLAES et al. 1999, KIENAPFEL et al. 1995, SCHLENZKA et al. 1993, SCHWAB et


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al. 1999) und klinischen Anwendungen (GERNGROß et al. 1987) belegt. Experimentell ließ sich dies durch eine vermehrte Freisetzung der alkalischen Phosphatase und durch eine Zunahme der Mineralisierung untermauern (KUGELMEIER 1985).

Die in der Studie verwendete Dosierung von 50 IE/kg Körpergewicht geht auf Dosisfindungsstudien von CLAES et al. (1999) zurück. Auch in eigenen Voruntersuchungen ließen sich keine wesentlichen pharmakokinetischen Unterschiede bei Anwendung von 50 bzw. 100 IE/kg Körpergewicht finden. So kann die eingesetzte Dosierung über einen Zeitraum von 7 Tagen als adäquat bezeichnet werden.

Als Nachteil der durchgeführten Untersuchung ist zu diskutieren, dass aufgrund der kleinen Kniegelenksdimension des Kaninchens nur eine systemische Applikation von Faktor XIII möglich war. Andererseits ist bekannt, dass in der Synovia des Kniegelenkes kein Thrombin vorhanden ist, welche für die Wirkung des Faktor XIII erforderlich ist. Es ist anzuzweifeln ob die lokale intraartikuläre Applikation die Wirkung auf den Transplantatumbau verbessern würde.

8.3 Makroskopische Befunde und Osteoarthrose

Die makroskopischen Befunde zeigten keine wesentlichen Befund-unterschiede in den Untersuchungsgruppen. Dies gilt auch für die Prüfung der Transplantatspannung und Kniegelenkstabilität. Auffällig war, dass die Transplantate, insbesondere zu den Untersuchungszeitpunkten 2 und 32 Wochen postoperativ, durch eine vergrößerte synoviale Umhüllung, die teilweise mit dem Hoffa´schen Fettkörper kommunizierte, charakterisiert waren. Ähnliche Beobachtungen wurden auch von anderen Arbeitsgruppen (AMIEL et al. 1986, FROMM et al. 1996, KLEINER et al. 1986, PANNI et al. 1997) beschrieben. Diese reaktive Proliferation der Synovialis scheint die Quelle für den vaskulären Anschluss und die Zellmigration in das Transplantat zu sein (KLEINER et al. 1989). Nach Abschluss des Revaskularisationsprozesses bildet sich die proliferierte synoviale Deckschicht zu einer physiologischen ein- bis zweischichtigen typischen Synovialis zurück.

Zur Evaluierung der Knorpelschädigungen wurde der MANKIN-Score genutzt. Die Untersuchungen nach 32 und 56 Wochen deckten eine deut-liche Knorpelschädigung auf. Aber auch die nichtoperierten Kontrolltiere zeigten eine erhebliche Progredienz der Knorpelschädigung. Die operative Stabi-lisierung bei einem derartigen kleinen Gelenk kann eine operationsbedingte Knorpelschädigung induzieren, jedoch sind hierbei auch zusätzlich Überlagerungen mit physiologischen Alterungsprozessen zu berücksichtigen. Nach 56 Wochen zeigten die Gelenke sowohl femoral als auch tibial nachweisbare Knorpelschäden, diese besaßen im Vergleich zur Kontrollgruppe keinen signifikanten Unterschied.


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PAPACHRISTOU et al. (1998) berichteten ebenfalls über Knorpelschäden bei operierten Kaninchenkniegelenken 12 und 22 Wochen nach dem chirur-gischen Eingriff. Auch BALLOCK et al. (1989) sahen frühzeitig, bereits 6 Wochen nach dem Kreuzbandersatz, an Kaninchengelenken initiale Knorpelläsionen. Es ist unklar, ob allein die Arthrotomie und die Anlage von Bohrkanälen als Ursache für diese degenerativen Knorpelveränderungen angesehen werden kann oder, ob die Kreuzbandersatzoperation die physio-logische Kinematik verändert, so dass sekundäre Knorpelläsionen resultieren (HEFTI et al. 1991).

8.4 Morphologische und ultrastrukturelle Ergebnisse

Der histologische Umbau der Transplantate zeigte die typischen phasenhaften Veränderungen, wie sie bereits mehrfach in der Literatur beschrieben wurden (AMIEL et al. 1986, BOSCH et al.1990, PANNI et al. 1997, SOMER 1990).

Vorangegangene Studien betrachteten in der Regel nur isoliert den intra-artikulären Transplantatumbau oder die ossäre Integration der Knochen-blockeinheilung.

Die Insertion von Sehnen und Bändern kann prinzipiell in zwei unter-schiedliche Formen unterschieden werden.

Die direkte oder chondrale Insertion zeigt einen typischen Vierzonenaufbau (SCHIAVONE PANNI et al. 1993). Die Zone 1 entspricht der Sehne oder dem Band aus straffem organisierten Bindegewebe, die Zone 2 ist gekennzeichnet durch fibrokartilaginäres Gewebe. Der Hauptunterschied zwischen Zone 1 und 2 ist der Wechsel der Zellen von dünnen länglichen Fibrozyten zu ovalen bis rundlichen Chondroblasten. Die Zone 2 ist in der Regel recht schmal. Es folgt die Zone 3 des mineralisierten fibrokartilaginären Gewebes. Am Anfang sind nur wenige Mineralisierungen vorhanden die sich dann säulenartig vermehren. Zwischen der unmineralisierten und der mineralisierten Zone befindet sich eine Transitionszone, die als „tide mark“ bezeichnet wird. Zwischen Zone 2 und 3 konnte immunhistochemisch Kollagen-Typ 2 nachgewiesen werden (PETERSON und LAPRELL 2000). Die Zone 4 besteht aus dem Knochen.

Anders dagegen zeigt sich die indirekte oder fibröse Insertion , welche einen typischen Dreizonenaufbau besitzt. Die Zone 1 besteht aus dem straffen kollagenen Sehnen­ oder Bandgewebe. Während die Zone 2 aus Geflecht-knochen gebildet wird. Lichtmikroskopisch ist zu erkennen, dass die Kolla-genfasern der Sehnen schräg in den Geflechtknochen penetrieren. Die Zone 3 wird aus Lamellenknochen gebildet. Kollagen-Typ II wird in keinem Abschnitt der indirekten bzw. fibrösen Insertion beobachtet (PETERSON und LAPRELL 2000).


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In der vorliegenden Studie wurde femoral eine typische direkte Trans-plantatinsertion beobachtet, während tibial sowohl eine direkte als auch indirekte Transplantatinsertion gezeigt werden konnte. Dies hängt mit der Länge des Transplantates und des tibialen Bohrkanals zusammen. Die tibiale Insertion ist demzufolge initial immer eine Komposition aus direkter und indirekter Insertion.

In verschiedenen Studien wurde beschrieben, dass die knöcherne Inkor-poration nach 32 Wochen abgeschlossen ist (AMIEL et al. 1984, BALLOCK et al. 1989, FROMM 1994, SCHIAVONE PANNI et al. 1993). Unklar und nicht einheitlich ist jedoch die histomorphologische Beschreibung der Transplantatinsertion.

CLANCY et al. (1981) führten eine histologische Analyse an Patellarsehnen­transplantaten am Affenmodell durch und fanden, dass das Transplantat-Knochen­Interface dem des normalen vorderen Kreuzbandes nach 9 Monaten ähnelte. CHIROFF et al. (1975) untersuchten ebenfalls das Patellarsehnentransplantat am Hundemodell und beschrieben einen typischen zonalen Aufbau der Insertionen innerhalb von 4 Wochen. SCHIAVONE PANNI et al. (1993) berichteten, dass die anatomische direkte Sehneninsertion des Patellarsehnen-Knochen-Transplantates am Kaninchenmodell einem Degradationsprozess unterliegt und dass sich im Verlauf des Transplantatumbaus wieder eine physiologische direkte Sehneninsertion ausbildet.

All diese Studien geben keine klare Differenzierung zwischen femoraler und tibialer Insertion an. Für die genaue Beurteilung der Insertion ist eine parallele Schnittführung zum Transplant bzw. Bohrkanal notwendig und eine regionale Differenzierung der Untersuchungsregion erforderlich.

YOSHIYA et al. (2000) betrachteten erstmalig fünf verschiedene Regionen innerhalb des Knochenkanals während des Transplantateinbaus. Sie unterschieden folgende Zonen:

In dieser Studie wurden für das Patellarsehnentransplanat sowohl eine direkte als auch eine indirekte Insertion am Hundemodell 12 Wochen postoperativ nachgewiesen. Die Autoren führten aus, dass anders als bei der Semitendinosus-/Gracilissehnen­Inkorporation (BLICKENSTAFF et al. 1997, GRANA et al. 1994, RODEO et al. 1993, [Seite 135↓]SHOEMAKER et al. 1989, SCRANTON et al. 1993), die Sehneninsertion des Patellarsehnen-transplantates morphologisch der vorderen Kreuzbandanheftung

entspricht. Sie konnten im Weiteren zeigen, dass sich die Ratio aus mineralisierter und unmineralisierter fibrokartilaginären Zone im Zeitverlauf nicht signifikant ändert (YOSHIYA et al. 2000).

Bei der Interpretation der Transplantatinsertionen ist auch die Wahl der Transplantatverankerung zu berücksichtigen. In der vorliegenden Unter-suchung konnten morphologische Unterschiede in Abhängigkeit von der Fixationswahl beobachtet werden. Während femoral eine isolierte knöcherne Integration des Knochenblockes stattfand, war tibial eine temporäre Kombination aus direkter und indirekter Insertion nachweisbar.

Die Übersichtslichtmikroskopie ermöglicht zwar eine qualitative Beschreibung der morphologischen Veränderungen, zeigt jedoch Grenzen für quantitative Vergleichsuntersuchungen. Die Anwendung eines histomorphometrischen Verfahrens ist vor allem dort nützlich, wo in Übersichtsvergrößerungen keine markanten Unterschiede zu erkennen sind (WEIBEL und ELLIAS 1967). Hiermit konnten geringfügige Differenzen des intraartikulären Transplantatumbaus demaskiert und quantifiziert werden.

In der so genannten Phase der Degeneration und Nekrose, 2 Wochen nach der Transplantation, zeigten die Operationsgruppen signifikante Unterschiede in den Zellzahlen, der Gefäßanschnittsflächen und der Zellvolumina. Die Transplantate der Gruppe C, die mit der Transplantat-Splitting Technik und einer Faktor XIII-Applikation versorgt wurden, wiesen die höchste Zellularität und die größten Zellvolumina auf. Die histomorphometrischen Veränderungen scheinen hierbei sowohl durch die eingesetzte

mechanische Schädigung des Transplantates als auch durch die frühzeitige Faktor XIII Administration einer vorzeitigen zelluläre Reparationsantwort zu unterliegen. Aber auch die alleinige Faktor XIII Gabe (Gruppe B) hatte im Vergleich zur Gruppe A (Standardversorgung) eine erhöhte Zellularität, Vaskularität und ein größeres Zellvolumen. Die Veränderungen im Zytoskelett der Gruppe B und C präsentierten bereits invadierte Fibroblasten als initiale Reparaturzellen.

Aus den ermittelten Daten kann geschlussfolgert werden, dass ein be-schleunigter histomorphometrischer Umbau sowohl durch die alleinige Gabe von Faktor XIII, als auch durch die Kombination der Transplantat-Splitting Technik mit der Faktor XIII Gabe eingeleitet werden kann.

Die prinzipiellen histomorphometrische Veränderungen 2 Wochen postoperativ entsprechen den Ergebnissen von BOSCH et al. (1990) für das Umbauverhalten eines hinteren Kreuzbandtransplantates in der Standardversorgung.


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Der Phase der Nekrose folgt die Phase der Revitalisierung. Während 32 Wochen postoperativ die Gruppe C noch die höchste Zellularität und Gefäßdichte besaß, waren die Zellvolumina in dieser Gruppe nicht mehr am höchsten. Die stoffwechselaktiven

Fibroblasten veränderten ihre Zellform zu einer energetisch günstigeren Kugelform. Dagegen wurden in den Gruppen A und B noch weiterhin die syntheseaktiven großen Fibroblasten beobachtet. Dieser Befund spricht für die weiterhin bestehende reparative Aktivität der Zellen in den Gruppen A und B, während diese in der Gruppe C reduziert war.

Im weiteren Verlauf kommt es zur Phase der Rekollagenisierung und Phase des Remodeling. Kennzeichnend für diesen Abschnitt des Transplantatumbaus ist die Abnahme der Zellularität und der Zuwachs an neu gebildeten Kollagen-faserbündeln mit Ausrichtung in axialer Hauptbelastungsrichtung.

56 Wochen nach der Transplantation erreichten die Transplantate einen dem vorderen Kreuzband ähnlichen histomorphologischen Befund, jedoch waren die Zellzahl, die Gefäßanschnittsflächen und das Zellvolumen weiterhin signifikant erhöht. Zwischen den Operationsgruppen bestanden auch nach diesem Zeit-raum weiterhin morphometrische Unterschiede, wobei vom histologischen Aufbau der Gruppen B und C eine größere Übereinstimmung mit dem vorderen Kreuzband auftrat als bei Gruppe A.

Der von AMIEL et al. (1986) inaugurierte und häufig zitierte Prozess der Ligamentisation eines Patellarsehnentransplantates muss auf der Grundlage der histomorphometrischen Ergebnisse abgelehnt werden. Die ermittelten signifikanten morphologischen Unterschiede gestatten nicht, von einem vollständigen

Transplantatumbau zu sprechen. Auch die supportiven Einflüsse, wie der Einsatz von Faktor XIII oder der Transplantat-Splitting-Technik konnten nicht die markanten histogenetischen Unterschiede eines Patellar-sehnentransplantates von einem vorderen Kreuzband aufheben.

Verschiedene Studien zeigten eine Korrelation der mechanischen Eigenschaften des Bindegewebes zum Kollagenfibrillendurchmesser (CRAIG et al. 1987, FLINT et al. 1984, HART et al. 1999), wobei höhere Stress-expositionen mit einem größeren Kollagenfibrillendurchmesser einhergehen (CRAIG et al. 1987, FLINT et al. 1984). Viele andere Faktoren, wie das Alter (OAKES 1993, PARRY et al. 1978), das Geschlecht (TZAPHLIDOU 2001), der Trainingszustand (OAKES et al. 1982, OAKES 1993) und die Immobilisation eines Gelenkes (BINKLEY und PEAT 1986, CHRISTEL und GIBBONS 1993) sowie der Heilungszustand (CHRISTEL und GIBBONS 1993) des Bandgewebes wurden ebenfalls als bestimmende Kriterien für Fibrillendurchmesser nachgewiesen.


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In Anlehnung an eine Klassifikation von AMENTA et al. (1988) können Kollagenfasern in fibrilläre Typen (z.B. Typ I und III) mit einem Durchmesser

> 15 nm und in filamentäre Typen (z.B. Typ VI) mit einem Durchmesser < 15 nm unterschieden werden. Die Darstellung von filamentären Kollagenfibrillen ist schwierig,

da ihre Lage keine strenge parallele Anordnung zeigt und in Querschnitten diese dünnen Fibrillen oft nur schräg angeschnitten werden.

Die Bestimmung der Kollagenfibrillendurchmesser und deren Sekundär-parameter in der durchgeführten Untersuchung zeigte, dass die Fibrillen eine langsame Abnahme der Durchmesser, gefolgt von einer Zunahme der Durchmesser, durchlaufen. Innerhalb der Transplantatgruppen wurde 32 und 56 Wochen nach der Operation eine signifikante Erhöhung der Durchmesser für die Gruppe C im Vergleich zu den anderen Operationsgruppen festgestellt. Das heißt, das Breitenwachstum der Kollagenfibrillen in dieser Gruppe konnte durch die eingesetzte Manipulation beeinflusst werden. Die verbesserten Ernährungsmöglichkeiten der gesplitteten Transplantate scheinen allein die Ursache für die erhöhten Kollagenfibirillendurchmesser zu sein, da in Gruppe B mit alleiniger Faktor XIII-Applikation eine derartige Veränderung nicht beobachtet werden konnte. Der Prozess des Breitenwachstums ist auch noch nach der 32. postoperativen Woche hinaus zu beobachten gewesen. Die erreichten Werte nach 56 Wochen lagen aber für alle Gruppen signifikant unter denen des vorderen Kreuzbandes.

Die häufig in der Literatur angegebenen Mittelwerte für die Kollagen­fibrillenmorphometrie erscheinen als unzweckmäßig, da sie nicht die Streuung der Fibrillendurchmesserverteilungen respektieren. Für diese Aus-sagen sollte der Medianwert verwendet werden.

Die graphische Darstellung der Kollagenfibrillenverteilungen ist als äußerst hilfreich anzusehen. Es konnten hierbei typische Verteilungen, wie zum Beispiel das unimodale Muster für die Patellarsehne und das bimodale Muster für das vordere Kreuzband beobachtet werden. Aus den Ver-änderungen der Transplantate war eine typische Linksverschiebung zu kleineren Durchmessern dokumentiert worden.

Für die Veränderungen der Kollagenfibrillenverteilung in Richtung der Zunahme und des Überwiegens von zahlreichen dünnen Kollagenfibrillen im Transplantat werden verschiedene Ursachen diskutiert.

Die Exposition des Transplantates mit der intraartikulären Synovialflüssigkeit ist gekennzeichnet durch die Wirkung von zahlreichen aggressiver Proteine. Insbesondere in der Frühphase ist die schützende Wirkung der Synovialis nicht gegeben.


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Es konnte gezeigt werden, dass synoviale Kollagenasen in der Lage sind, dicke Kollagenfibrillen in dünne Kollagenfibrillen zu transformieren (Cunningham et al. 1999).

DECKER et al. (1991) beobachteten in elektronenmikroskopischen Untersuchungen ein Kollagenfibrillendesintegration mit der Bildung von zahlreichen dünnen Fibrillen und

vermuteten darin einen Grund für die verringerte mechanische Belastbarkeit von Kreuzbandtransplantaten.

Neben der enzymatischen Degradation könnte es sich aber auch um zahlreiche neugebildete dünne Kollagenfibrillen des Kollagen-Typs III handeln. Dicke Kollagenfibrillen repräsentieren den Kollagen-Typ I und werden als Indiz für einen geringen Kollagenumsatz betrachtet (SVOBODA et al.1983).

Proteglykane besitzen eine wichtige regulatorische Funktion während des Gewebewachstums und der Reparation. Nach einer Untersuchung von SCOTT et al. (1981) sind die Proteoglykane nahezu zirkulär um die Kollagen-fibrillen gelagert. In dieser Lage verhindern sie ein Breitenwachstum der Fibrillen.

Die Rate der Kollagenfibrillenformation und –organisation wird im Weiteren von den leucinreichen Proteoglykanen Decorin, Lumican (VOGEL et al. 1984), Biglycan (PLAAS et al. 2000) und Fibromodulin (IOZZO 1998), welche an verschieden Stellen der extrazellulären Martix der Kollagenfibrillen wirken, bestimmt. Diese Core-Proteine sind in der Lage, das Kollagenfibrillen-wachstum zu hemmen, besitzen aber gleichzeitig einen positiven Einfluss auf den Ordungsgrad und die Stabilität (NEAME et al. 2000).

NAKAMURA et al. (2000) führte eine Technik ein, wobei selektiv die Expres-sion von Decorin geblockt werden konnte. In einem Reparationsmodell des medialen Seitenbandes wurden elektronenmikroskopisch größere Kollagen-fibrillen nachgewiesen als in den Kontrollgruppen. Es bestand eine signifi-kante negative Korrelation zwischen dem mittleren Kollagenfibrillen-durchmesser und der Expression von Decorin mRNA. Auch erreichten die behandelten Bänder eine höhere Ausrissfestigeit und eine geringere Dehnung. In dieser Studie gelang es erstmalig durch eine Genmanipulation die Kollagenfibrillenbildung in-vivo zu manipulieren.

Decorin konnte in-vivo in Assoziation mit Kollagen-Typ VI entdeckt werden (TAKAHASHI et al. 1993); dieser Kollagen-Typ wird zusammen mit dem Proteoglykan Chondroitinsulfat in relativ großen Beträgen in den inter-fibrillären Septen gefunden (BRAY et al. 1993). Decorin steht auch in Wechselwirkung mit Fibronektin (SCHMIDT et al. 1987), einem nichtkollagenen Matrixprotein der Bindegewebsheilung. DAHNERS [Seite 139↓]et al. (2000) zeigten, dass die Decorin-Fibronektin-Verbindung die interfibrillären Kollagenbindungen reguliert.

Experimentell konnte auch gezeigt werden, dass die Akkumulation von großen Mengen Biglycans die Ausbildung eines kräftigen Kollagen-fibrillennetzwerkes limitieren kann und zu persistierenden Entzündungs-prozessen führt, welche wiederum die Wiederherstellung eines funktionellen Bandgewebes behindert (PLAAS et al. 2000).

Ein Anstieg der Proteoglykane Chondroitinsulfat und Dermatansulfat wurde in Kreuzbandtransplantaten nachgewiesen. Während die Erhöhung von Dermatansulfat nur temporär war, persistierte die Chondroitinsulfaterhöhung noch 2 Jahre nach der Kreuzbandoperation (BOSCH et al. 1998).

Ein gesteigerter Hyaluronsäuregehalt soll nach YAMAKAGE et al.(1985) ebenfalls die Fibrillogenese hemmen.

Die ultramorphologische Dickenverteilung der Kollagenfibrillen kann durch zahlreiche weitere Einflussfaktoren wie in-situ Schockfrierung (JACKSON et al. 1991), biologische Reifungsprozesse (HART et al. 1999), Entzündungen (NEURATH und STOFFT 1991), Reparationsprozesse (BOSCH et al.1995, FRANK et al. 1997) und Traumen (DECKER et al. 1991) erheblichen Veränderungen unterliegen.

Auch Alterationen der Quervernetzungen zwischen den Kollagenfibrillen können dafür verantwortlich sein, dass Kollagenfibrillen sich in dünne Fibrillen entwickeln (PARRY und CRAIG 1984).

Eine konstante mechanische Überlastung des Transplantates wurde ebenfalls als Ursache für eine veränderte Kollagenfibrillendistribution diskutiert (BOSCH et al. 1995).

Innerhalb eines anatomischen Substrates konnte eine Heterogenität der Kollagenfibrillenverteilung nachgewiesen werden. BAEK et al. (1998) zeigten, dass für die zu untersuchende Struktur der Entnahmeort ein wichtiger Parameter für die Befundbewertung ist. An humanen Kreuzbändern wurde ein völlig inverses Kollagenfibrillendurchmessermuster gefunden. Das vordere Kreuzband besitzt Fibrillen mit einem Durchmesser von 20 - 170 nm. Der mittlere Querschnitt nahm von proximal nach distal zu (66,1 nm – 74,8 nm – 78,2 nm). Der mittlere Fibrillendurchmesser und die Querschnittsfläche für das vordere Kreuzband sind distal am größten. Der Anteil an Gesamtkollagen pro Querschnitt bleibt jedoch gleich, somit liegt eine Veränderung der Fibrillendistribution vor.

Wenn Sehnen und Bänder strukturell geschädigt werden, unterliegen sie einem biologischen Heilungsprozess und unterschiedlichsten Einfluss-faktoren. Am Ende eines Umbauprozesses entsteht ein hochorganisiertes Bindegewebsregenerat mit verringerten mechanischen Eigenschaften. Es wurde gezeigt, dass geschädigtes [Seite 140↓]Sehnen- und Bandgewebe nach einem Reparaturprozess nicht mehr die typische Kollagenfibrillenordnung des nativen ungeschädigten Gewebes herstellen kann (MATTHEW und MOORE 1991, POSTACCHINI et al. 1978, WILLIAMS et al. 1985).

Einem ähnlichen Umbau- und Reparationsprozess unterliegt das Patellarsehnentransplantat als vorderer Kreuzbandersatz. Die Patellarsehne ist nicht in der Lage, die Kollagenfibrillenarchitektur und –verteilung des vorderen Kreuzbandes wiederherzustellen. Es treten zwar signifikante Veränderungen auf, doch sind diese nur

eine Annäherung an die strukturellen Eigenschaften des vorderen Kreuzbandes. Die Veränderungen sind durch eine signifikante Zunahme von dünnen Kollagenfibrillen gekennzeichnet. Diese Beobachtungen wurden auch in Großtierversuchen von JACKSON et al. (1993) und BOSCH et al. (1995) am Patellarsehnen-transplantat beschrieben.

Der Regulationsprozess der Fibrillenreifung und Fibrillengrößenausbildung ist ein komplexer Vorgang, welcher bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht vollständig aufgeklärt ist. Die Fibrillengröße hängt von verschiedenen Faktoren, wie der Expression von Kollagen-Typ III (LAPIERE et al. 1977), der Interaktion von Kollagen­Typ I und Typ III (FLEISCHMAJER et al. 1990, LAPIERE et al. 1977) oder Kollagen­Typ V (ADACHI und HAYASHI 1986, Niyibizi et al. 2000) und der Interaktion zwischen Kollagen und Proteoglykanen (BOSCH et al. 1995, RUGGERI und BENAZZO 1984) ab.

8.5 Biochemische Ergebnisse

Neben den histomorphologischen Eigenschaften von Transplantaten sind für das Verständnis der Umbauvorgänge und der Beschreibung von Veränderungen biochemische Parameter besonders nützlich.

Untersuchungen zum Zusammenhang von mechanischer Belastbarkeit und biochemischen sowie histologischen Parametern zeigen deutlich, dass der Gesamtkollagengehalt eines Gewebes allein nicht zur Beschreibung der Eigenschaften und des Verhaltens einer Struktur ausreichen. Es sollten vor allem das Verteilungsmuster einzelner Kollagentypen und die Konzentration nichtreduzierbarer, stabiler Quervernetzungen betrachtet werden (WOO et al. 1997).

Hydroxyprolin gilt als ein Indikator für die Präsenz und den Metabolismus von Kollagen, da diese Aminosäure fast ausschließlich im Kollagen von Bindegewebsstrukturen und an der Y-Position des sich wiederholenden Tripeptids Gly-X-Y existiert.

Die Patellarsehne hat mit 73,6 % einen sehr hohen Kollagengehalt. Der Unterschied zum vorderen Kreuzband war jedoch nicht signifikant.


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Im Rahmen des Beobachtungszeitraumes zeigten die Transplantate bezüglich ihres Gesamtkollagengehaltes einen unterschiedlichen Verlauf. So wurden in der Gruppe A nur geringfügige Verringerungen beobachtet, die erreichten Werte lagen jedoch zu jedem Untersuchungszeitpunkt unter denen der Patellarsehne und des vorderen Kreuzbandes. Hieraus lässt sich schließen, dass der Kollagenumsatz in dieser Gruppe am geringsten war. Anders dagegen verhielten sich die Kollagenkonzentrationen in den Gruppen B und C. Die Gruppe B zeigte zunächst einen Abbau bis zur 32. Woche, lag nach einem Konzentrationsanstieg nach 56 Wochen über den Werten des vorderen

Kreuzbandes. Es kann hieraus geschlussfolgert werden, dass die Prozesse des Kollagenmetabolismus auch nach einem Jahr nicht abgeschlossen sind. Dagegen hatte die Gruppe C einen nur geringfügigen Abfall bis zur 32. Woche, verringerte danach die Gesamtkollagen-konzentration weiter und lag am Ende der Untersuchungszeit nur geringfügig unter den Werten des vorderen Kreuzbandes.

Insgesamt waren die ermittelten Unterschiede für die Kollagen-konzentrationen sehr gering, es bestand weder ein korrelativer Zusammen-hang zu den ermittelten Faktor XIII-Konzentrationen noch zu den biomechanischen Belastungsparametern.

Der Gesamtkollagengehalt zeigt eine alterspezifische und gewebsspezifische Abhängigkeit und Veränderung (AMIEL et al. 1984, IPOLITO et al. 1980). Die Kollagenzusammensetzung der Gewebe ist vor allem funktionsdeterminiert.

In der Literatur wird auf die heterogene Verteilung des Kollagen- bzw. Hydroxyprolingehaltes in Sehnen und Bändern hingewiesen (FRANK et al. 1988, FAN et al. 1997, Mommersteeg et al. 1994).

Die Untersuchungen von FRANK et al. (1988) zeigten für das mediale Seitenband die geringsten Werte am Femuransatz und die höchsten Kollagenkonzentrationen im mittleren Teil des Bandes. Ursächlich wurden veränderte Glykosaminoglykankonzentrationen in den Insertionsbereichen als verantwortlich angesehen.

Dagegen fanden FAN et al. (1997) an der Supraspinatussehne, dass der Ansatzbereich einen signifikant höheren Hydroxyprolingehalt besitzt als im eigentlichen Sehnenverlauf.

LEMLEY und WELCH (1991) zeigten in ihrer Arbeit am Beispiel der humanen Patellarsehne, dass die Hydroxyprolinkonzentration der einzelnen Proben von 1,88 – 3,34 μg/mg TG (n = 5) stark variierte.

Es kann in diesem Zusammenhang postuliert werden, dass der Gesamtkollagengehalt bzw. die Hydroxyprolinkonzentration, wie bereits oben erwähnt (WOO et al. 1997), ein für die Gesamteigenschaften der Transplantate unspezifisch messbarer Parameter ist und großen regionalen Schwankungen unterliegt.


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Der Nachweis der Kollagentypen kann qualitativ mit immunhistochemischen Methoden (NEURATH und STOFFT 1992a, PETERSEN und TILLMANN 1999) oder quantitativ­biochemisch mit chromatographischen, RIST- (Radioimmunsorbent), ELISA- oder elektrophoretischen Verfahren (AMIEL et al. 1986, CAMPA et al. 1990, Hanson und Bentley 1983, RIECHERT 2001, WIGGINS et al. 1994) oder mittels RNA-Analyse (Hsieh et al. 2000, YU et al. 1999, LIU et al. 1996, LIU et al. 1997) erfolgen.

In Sehnen und Bändern dominieren die Kollagene Typ I und Typ III, aber auch andere Kollagentypen wurden nachgewiesen (ADACHI und HAYASHI 1986, Niyibizi et al. 2000, Petersen und Tillmann 1999).

Kollagen-Typ I ist für die mechanische Festigkeit von Bindegewebe verantwortlich. Der Anteil in Sehnen und Bändern liegt bei über 90 %.

Kollagen-Typ II wird regelmäßig in den zentralen Anteilen des vorderen Kreuzbandes gefunden. Es handelt sich hierbei um fibrokartilaginäre Gewebsformationen mit typischen Chondrozyten und dem Nachweis von Kollagen-Typ II in der perizellulären Matrix der Chondrozyten. Die Ursache für das Vorhandensein dieser Zellformation wird in auftretende Druck- und Zugbelastungen des vorderen und hinteren Kreuzbandes gesehen (PETERSEN und LAPRELL 2000).

Im Weiteren findet man Kollagen-Typ II in der Ansatzregion der Kreuzbänder innerhalb des unverkalkten Faserknorpels und des verkalkten Faserknorpels (PETERSEN und LAPRELL 2000).

Kollagen-Typ III ist in deutlich geringerer Konzentration als Kollagen-Typ I vorhanden und hat eine elastische Funktion. Charakteristisch für diesen Kollagentyp ist die Existenz von intramolekularen Disulfidbrücken zwischen Cystinresten nahe dem C­terminalen Bereich der Triplehelix, die der Stabilisierung des Kollagenmoleküls dienen (AMIEL et al. 1993, Chung et al. 1974,van der REST und Garrone 1991). Kollagen-Typ III bildet dünne oder mit Kollagen-Typ I gemeinsame heterotype Fibrillen aus, so dass einige Kollagenfibrillen als molekulare Legierungen angesehen werden müssen (AMIEL et al. 1993,Lapiere et al 1977,van der REST und Garrone 1991).

Durch Brückenbildungen mit der Basalmembran von Gefäßen hat es eine Funktion bei der Anheftung der Gefäße in der extrazellulären Matrix. Insbesondere im Granulations­ und Reparationsgewebe wird dieser Typ vermehrt gefunden. Der Kollagen-Typ III ist ubiqutär im Bandverlauf vorhanden, die höchsten

Konzentrationen befinden sich in der Nähe der Insertionszonen der Kreuzbänder (NEURATH und STOFFT 1992b).


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Kollagen-Typ IV wird in allen Basalmembranen von Gefäßen gefunden. Die Färbung mit monoklonalen Antikörpern kann als Nachweis für die Gefäßdichte genutzt werden.

Kollagen-Typ V ist bisher wenig untersucht, hat aber möglicherweise eine regulatorische Funktion auf die Kollagenfibrillendurchmesser. Kollagen-Typ V besitzt zusätzliche amino-terminale Peptide, die eine Schlüsselsstellung in der Regulation der Fibrillenausbildung besitzen sollen. Ein Modell, in dem Kollagen-Typ V den Kollagen Typ I kontrolliert und reguliert, wurde beschrieben (Linsenmayer et al. 1993).

Studien am Knochen zeigten, dass kovalente cross links zwischen Kollagen-Typ I und V bestehen (Niyibizi und Eyre 1993).

Kollagen-Typ VI wird in filamentären Strukturen gefunden, welche zwischen den großen Kollagenfibrillen liegen. Es wird auch als interfibrilläres Gleitfilament bezeichnet. Es ist in der Regel parallel zu Kollagen-Typ III ausgerichtet und unterteilt Kollagenstrukturen in Untergruppen. Die Konzentration des Kollagen-Typ VI ist im distalen Drittel des vorderen Kreuzbandes am höchsten (NEURATH und STOFFT 1992a). Möglicherweise stellen die Filamente des Kollagen-Typs VI eine wichtige Verbindung zu den Proteoklykanen dar (BRAY et al. 1990).

In der eigenen Studie wurde für die Kollagen-Typen I und III Analyse ein elektrophoretisches Verfahren weiterentwickelt, welches sich in Anlehnung an die beschriebenen Methoden von LAURENT et al. (1981) und RIESLE et al. (1998) orientierte.

Jeder Kollagentyp spaltet sich in Abhängigkeit von der Position der Azetyl­Methioningruppen unter Einwirkung von Bromzyan mit 70%iger Ameisen-säure als Lösungsmittel in Peptide unterschiedlicher Molekulargewichte auf. Diese Eigenschaft wurde zur Identifizierung der Kollagentypen benutzt. Im Elektropherogramm wurde die Position der CNBr-Peptide in den zu untersuchenden Gewebsproben anhand der Position dieser Peptide gegenüber reinen Kollagenstandards, die nach der gleichen Vorschrift wie das Analysematerial aufgearbeitet wurden, bestimmt. Dabei ist die Färbeintensität der Banden im gefärbten Gel proportional der Konzentration dieser Peptide in den Proben (CHAN und COLE 1984, COLE und BEAN 1979).

Für den Kollagen-Typ I wurden die Markerpetide α1(I) CB7 und α1(I) CB8 mit den Molekulargewichten von 24 kDa und 25 kDa verwendet. α1(III) CB3 mit einem Molekulargewicht von 7 kDa wurde als Markerpeptid für den Kollagen-Typ III benutzt (AMIEL et al. 1984, 1986, COLE und BEAN 1979, FAN et al. 1997, SCOTT und VEIS 1976, SCOTT et al. 1976).

Um eine möglichst vollständige Bromzyanspaltung der Kollagenmoleküle zu erreichen, wurde in Anlehnung an FAN et al. (1997) eine zweimalige Spaltung über je 20 Stunden [Seite 144↓]bei Zimmertemperatur durchgeführt. In der elektrophoretischen Auftrennung ließen sich danach keine hochmolekularen Peptide nachweisen.

Im Gegensatz zu Pepsin, das auch zur Spaltung der Kollagenmoleküle verwendet werden kann, jedoch nur weniger als 25 % spaltet, wird bei Verwendung von Bromzyan 70 – 90 % (Harwood und AMIEL 1992) bzw. über 95 % (Sykes et al. 1976) des Kollagens verdaut und gespalten. Pepsin wirkt nur in terminalen, nichthelikalen Segmenten der Kollagenmoleküle, dagegen sind tripelhelikale Bereiche wahrscheinlich aufgrund der Quervernetzungen dem Angriff von Pepsin gegenüber resistent

(EPSTEIN 1974). Bromzyan gespaltenes Kollagenmaterial ergibt damit einen reelleren Eindruck von der Quantität der einzelnen Kollagentypen in dem zu untersuchenden Gewebe und ist effektiver. Die Bromzyanspaltung sollte deshalb auch insbesondere dann angewendet werden, wenn der Nachweis eines Kollagentyps mit nur einem geringen Anteil am Gesamtkollagengehalt erfolgen soll.

Eine vor der Bromzyanspaltung durchgeführte Denaturierung des Kollagen-moleküls führt zu einer weiteren Vervollständigung der Spaltung der Methioningruppen (Riesle et al.1998).

Mit der Silberfärbemethode, die 100-fach sensitiver als die Färbung mit Coomassie Blau ist, ließen sich niedermolekulare Peptide <14 kDa gut nachweisen und densitometrisch quantifizieren (Bjellqvist et al. 1993). Die Vorteile der Silberfärbung bestehen in dem besseren Nachweis niedermolekularer Peptide und in der Möglichkeit, auch Peptide geringerer Konzentrationen zu identifizieren. Die Reduktion des Probenmaterials mit DTT vor der Elektrophorese erhöht die Sensitivität der Silberfärbung (Hodny und Syrovy 1993). Der Nachteil der Coomassie Blau­Färbung liegt hauptsächlich darin, dass pro Auftrennungsspur eine Mindest­konzentration von 20 - 40 µg aufgetragen werden muss und dass bei aufgetragenen Mengen von ca. 10 µg Protein weniger zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden (O'Driscoll et al. 1995). Deshalb wurde in früheren Veröffentlichungen auch häufig beschrieben, dass in Sehnen keine Kollagen-Typ III Konzentration messbar war. Die Ergebnisse der vorliegenden

Studie zeigen jedoch, dass auch in der Patellarsehne mit einer relativen Menge von ca. 5 % der Kollagen-Typ III nachweisbar war.

Die Resultate ergaben gut reproduzierbare, zuverlässige Ergebnisse auch im Bereich der Peptide mit einem geringen Molekulargewicht. Die Hauptgründe dieser Beobachtung liegen neben der vor der zweifachen Bromzyanspaltung durchgeführten Denaturierung in der Verwendung der Silbernitratfärbung, einer ausreichend langen Fixierung der aufgetrennten Peptidfragmente in 40%igem Ethanol und 10%iger [Seite 145↓]Essigsäure sowie im Anschluss daran einer Fixierung über mindestens 12 Stunden in je 5%iger Ethanol-Essig-säurelösung.

Der Vorteil der dargestellten und modifizierten Methode besteht in einer schnellen, technisch einfachen Durchführbarkeit gegenüber den Methoden, die eine chromatographische Auftrennung vor der SDS-PAGE enthalten.

Die dargestellten Ergebnisse sind reproduzierbar, was die Effizienz und Zuverlässigkeit dieser Methode zeigt.

Der Verzicht auf eine Vorreinigung mittels Chromatographie senkt die Gefahr des Materialverlustes sowie den Zeit- und Kostenaufwand bei gleichen Analyseergebnissen.

Für Sehnen und Bänder wurden in der Vergangenheit typische Verteilungs-muster der Kollagen-Typen I und III beschrieben (AMIEL et al. 1986, RIECHERT).

Hierbei zeigte sich, dass das vordere Kreuzband einen fast doppelt so hohen Anteil an Kollagen-Typ III im Vergleich zur Patellarsehne enthält.

Innerhalb der durchgeführten Untersuchung zeigten die Transplantate im Zeitverlauf eine signifikante Erhöhung der Kollagen-Typ III- und eine entsprechend signifikante Reduktion der Kollagen-Typ I Konzentrationen. Am Ende der Beobachtungszeit erreichten die Transplante eine Kollagen-Typ III Konzentration, die etwa 3-fach so hoch war wie die der Patellarsehne und etwa 1,5-fach so hoch wie die des vorderen Kreuzbandes.

Die Kollagen-Typ III Konzentrationserhöhung zeigte eine signifikant negative Korrelation mit der maximalen Ausrissfestigkeit für die Gruppen B (p = 0,015) und C (p = 0,003). In Langzeituntersuchungen an Rindern konnten NG et al. (1996) eine nichtsignifikante negative Korrelation zwischen der Kollagen-Typ III Konzentration und der Ausrissfestigkeit zeigen. Die erheblichen Veränderungen der Kollagen-Typen Verteilung in den Untersuchungs-gruppen ist als eine wesentliche Ursache

für die biomechanischen Defizite der Transplantate gegenüber dem nativen vorderen Kreuzband anzusehen.

Der Kollagen-Typ III ist in embryonalem Gewebe und Granulationsgewebe vermehrt nachweisbar und wird deshalb als eher unreife Kollagensubstanz beschrieben. Der höhere Anteil an Kollagen-Typ-III sagt jedoch nicht aus, dass es sich um unreifere Gewebe handelt, sondern dass die Kreuzbandtransplantate metabolisch aktivere Strukturen darstellen. Die Anwesenheit von Kollagen-Typ III spricht auch für eine Neubildung von Kollagen, es existiert eine stete Kollagensynthese. Untersuchungen zeigten, dass Kollagen-Typ III in verletzten Bindegewebsstrukturen vermehrt vorhanden ist (WILLIAMS et al. 1984) und somit eine wesentliche Rolle in [Seite 146↓]Heilungsprozessen spielt. Kollagen-Typ III kann sich im Zeitverlauf in die reifere Form, des Kollagen-Typ I umwandeln(NG et al. 1996). NG et al. (1996)beschrieben als Hinweis auf Umbauvorgänge nach vorderer Kreuzbandplastik mittels eines Patellarsehnentransplantates am Rinder-modell eine höhere Typ III-Konzentration im Transplantat nach 24 Wochen postoperativ als nach 3 Jahren.

FAN et al. (1997) zeigte in seiner Untersuchung am Beispiel der Supraspinatussehne, dass die Ratio von Kollagen-Typ I und III in Geweben nicht konstant ist, sondern

sowohl während der Entwicklung als auch bei pathologischen Prozessen sich verändert.

Eine hohe Konzentration von Kollagen-Typ III ist ein Hinweis für ein Überwiegen von dünnen Kollagenfibrillen (Niyibizi et al. 2000). In Kreuzbandtransplantaten konnte gezeigt werden, dass Fibrillen mit einem Durchmesser zwischen 40-50 nm immer mit Kollagen-Typ III vergesell-schaftet waren (DECKER et al. 1990). Kollagen-Typ III scheint die Fibrillendurchmessergröße mit zu regulieren. Es konnte gezeigt werden, dass Kollagen-Typ III sowohl mit dicken als auch mit dünnen Fibrillen assoziiert sein kann (KEEN et al. 1987).

Immunhistochemisch wurde Kollagen-Typ III im lockeren Bindegewebe gefunden, welches Kollagen-Typ I positive Fibrillen umgibt und in dünne Kollagenfibrillen separiert (PETERSEN und TILLMANN 1999).

Unterschiede bezüglich der mechanischen und physikalischen Eigenschaften der einzelnen Bindegewebe liegen in der Art und Zahl der gebildeten Quervernetzungen. Sie sind ein verlässlicher Parameter für die Beschreibung von Materialeigenschaften, wie z. B. die Zugfestigkeit (FRANK et al. 1995) der chemischen und enzymatischen Resistenz (FRASER 1998, Fujii et al. 1994). Sie reflektieren den Kollagenmetabolismus und den Reifegrad des Kollagens eines Gewebes (FRASER 1998, HARWOOD und AMIEL 1992). Reife, nichtreduzierbare

Quervernetzungen sind essentiell für die Struktur und Funktion der Sehnen und Bänder (FRASER 1998, TANZER 1973).

Die komplexen Mechanismen der Bildung und Regulierung der einzelnen Schritte der Kollagenbiosynthese, insbesondere der Bildung der nichtreduzierbaren Quervernetzungen, sind bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur zum Teil aufgeklärt. Prinzipiell lassen sich unreife reduzierbare und reife nichtreduzierbare Quervernetzungen unterscheiden.

Fujimoto et al. (1978) zeigte in einer seiner Untersuchung, dass die Stabilität der Kollagenfasern mit zunehmendem Alter steigt und mit einer Abnahme der [Seite 147↓]Konzentration der reduzierbaren und Zunahme der nicht-reduzierbaren Quervernetzungen korreliert.

Auch Takahashi et al. (1995) fand in seiner Studie, dass sich die Quer­vernetzungskonzentrationen in den Sehnen und Bändern des Menschen mit dem Alter verändern.

Entsprechend ihrer Funktion und Lokalisation im Organismus enthalten die einzelnen Gewebe unterschiedliche Konzentrationen und Verteilungsmuster an nichtreduzierbaren Quervernetzungen. Deoxypyridinolin z. B. ist haupt-sächlich im

Knochen existent, während es in anderen Geweben nur in sehr geringen Konzentrationen nachweisbar ist.

Zur Bestimmung der Konzentration nichtreduzierbarer Quervernetzungen Pyridinolin (PYR) und Deoxypyridinolin (DPD) wurden zwei kommerzielle ELISA-Kits verwendet. Diese ELISA-Verfahren stellen ein gegenüber der Chromatographie methodisch vereinfachtes Verfahren auf der Grundlage einer Reaktion des Pyridinolinringes mit gegen ihn gerichtete spezifische Antikörper dar (SEIBEL et al. 1994).

Die Untersuchungen von WOO et al. (1997) und FRASER (1998) bezüglich des Zusammenhanges zwischen biochemischen und biomechanischen Eigenschaften zeigten, dass die Dichte bzw. Konzentration reifer Quervernetzungen der beste Prädiktor für Materialeigenschaften ist, d.h. es existiert eine direkte Beziehung zwischen der Konzentration der reifen Quervernetzungen, die in engem Zusammenhang mit dem Kollagengehalt steht und der mechanischen Festigkeit, Resistenz und Widerstandsfähigkeit eines Gewebes.

Für die Patellarsehne existierten sehr geringe Pyridinolin- und De­oxypyridinolinkonzentrationen. Die Unterschiede gegenüber dem vorderen Kreuzband waren hochsignifikant.

In den Operationsgruppen kam es im zeitlichen Verlauf zu Konzentrations­verschiebungen, wobei die erreichten Werte aller Operationsgruppen am Ende der Beobachtungszeit für Pyridinolin etwa sechsmal höher waren als in der Patellarsehne und nur geringfügig unter den Werten des vorderen Kreuzbandes. Ein signifikanter Unterschied bestand lediglich in der Gruppe A, welche auch die geringsten biomechanischen Ausrissfestigkeiten besaß. Es bestand ein signifikanter korrelativer Zusammenhang zwischen der Pyridinolinkonzentration und der mechanischen Ausrissfestigkeit der Transplantatgruppen.

Zu den gleichen Ergebnissen kamen auch die Arbeitsgruppen CHAN et al. (1998), FRANK et al. (1995) und NG et al. (1996). In allen Studien konnte ebenfalls ein signifikanter korrelativer Zusammenhang zwischen der mechanischen Ausrissfestigkeit [Seite 148↓]von Bindegewebsregeneraten und der Pyridinolinkonzentration festgestellt werden. NG et al. (1996) sehen die Pyri-dinolinkonzentration als den besseren biochemischen Marker als die Gesamtkollagenkonzentration an. Den Reifungsprozess von Kollagenfibrillen unter der Synthese von Pyridinolin halten sie für wichtiger als die isolierte Betrachtung der Gesamtkollagenproduktion.

Die in der Literatur beschriebenen Konzentrationen der Quervernetzungen, die alle mittels einer chromatographischen Methode ermittelt wurden, zeigen selbst innerhalb eines Modells deutlich die starke Varianz der Werte. Die Ursache dafür ist bisher weder bekannt noch diskutiert worden. Der Ver-gleich der Pyridinolinkonzentration in

der Untersuchung von HARWOOD und AMIEL (1992) mit denen der eigenen Studie zeigte für die Patellarsehne annährend identische Werte, jedoch für das vordere Kreuzband etwa doppelt so hohe Konzentrationen.

Die Deoxypyridinolinkonzentrationen der Transplantate waren 56 Wochen postoperativ ca. 3-5-fach höher als die der Patellarsehne und lagen alle geringfügig über den Konzentrationen des vorderen Kreuzbandes.

Ein direkter Vergleich der Deoxypyridinolinkonzentrationen mit den in dieser Arbeit ermittelten Werten und denen der Literatur ist nicht möglich, da entweder diese nicht analysiert wurden oder die Angabe „non detected“ erfolgte. Die Ergebnisse der eigenen Studie bezüglich der Deoxy-pyridinolinkonzentration in Gewebsproben zeigte im Gegensatz zu den Resultaten von EYRE (1984), dass auch in der Patellarsehne Deoxypyridinolin in messbaren Konzentrationen nachweisbar ist.

Als eine für die Vergleichbarkeit von Daten recht nützliche Berechnungsgrundlage sieht FRASER (1998) die relative Verteilung der Querver-netzungen an. Sie wird ermittelt aus der Ratio der Pyridinolinkonzentration bezogen auf eine Einheit Deoxypyridinolin.

Für die Patellarsehne war diese Ratio mit 15:1 am geringsten. Die Transplantate zeigten 56 Wochen nach der Operation eine höhere Ratio als die Patellarsehne, lagen aber deutlich unter dem vorderen Kreuzband. Unter den Transplantaten hatte die Gruppe C sowohl hinsichtlich der Einzel-konzentrationen der nichtreduzierbaren Querbrücken als auch der Ratio die größte Annährung an das vordere Kreuzband.

Somit gilt als bewiesen, dass in-vivo Manipulationen wie die Faktor XIII-Applikation oder die Kollagen-Splitting-Technik einen Einfluss auf die Synthese der nichtreduzierbaren Quervernetzungen hat. In Übereinstimmung mit anderen Arbeitsgruppen ist die Pyridinolinkonzentration ein valider Marker zur Einschätzung der biomechanischen Leistungsfähigkeit eines Bindegeweberegenerates.


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8.6  Biomechanische Ergebnisse

In der Literatur gibt es keine übereinstimmenden Empfehlungen hinsichtlich der optimalen Ausrissgeschwindigkeit. Es existieren starke Variationen im Versuchs-aufbau, der Winkelstellung des Kniegelenkes und der Ausrissgeschwindigkeit. Aus diesem Grund sind die Daten in der Literatur nur mit Einschränkung vergleichbar.

In der eigenen Untersuchung wurden entsprechende Empfehlungen von WOO et al. (1987) eingehalten. Als besonders wichtig erschien hierbei, dass die Zugkräfte parallel zum Transplantat gerichtet sind und jede Form der Rotation vermieden wird.

Es konnte gezeigt werden, dass die Gruppen signifikante Unterschiede in ihren biomechanischen Parametern und in den Ausrissmechanismen hatten.

2 Wochen postoperativ hatten die Transplantate erwartungsgemäß die geringsten maximalen Ausrisskräfte und Steiffigkeiten. Nach biomechanischen Gesichtspunkten unterscheiden KASPERCZYK et al. (1991) diese Phase des morphologischen Umbauprozesses in 2 Abschnitte: A. Initium und B. Manifestation . Initial, das heißt unmittelbar postoperativ wird die Festigkeit des Systems durch die Fixation des Transplantates bestimmt. Mit der Manifestation wird die Ausprägung der Nekrosenvorgänge erreicht, und das Transplantat gelangt in ein Belastungsminimum. Zwischen den Untersuchungsgruppen gab es zu diesem Zeitpunkt bereits für die Gruppe A und Gruppe B einen signifikanten Unterschied. Während die Gruppe A mit der Standardversorgung ohne Faktor XIII Gabe die geringsten Ausrisswerte und Steiffigkeiten erreichte, waren die Werte für die Gruppe B und C deutlich höher. Es lässt sich hieraus schlussfolgern, dass die Applikation des Faktor XIII in der Frühphase die bio-mechanische Belastbarkeit des Knochen-Transplantat-Knochen-Komplexes eindeutig erhöht. Der Übergang zwischen Initium und Manifestation ist fließend, die Schwächung des Knochen-Transplantat-Knochen-Komplexes wird von beiden Anteilen getragen.

Die veränderte Transplantataufbereitung bei der Transplantat -Splitting-Technik (Gruppe C) zeigte keine wesentliche Schwächung des Transplantates 2 Wochen postoperativ. Zwischen den Gruppen B und C bestand kein signifikanter Unter-schied, die Werte für die maximale Ausrissfestigkeit lagen jedoch für beide Gruppen höher als für Gruppe A.

Die Gruppe A war die einzige Versuchsgruppe, in der 2 Wochen postoperativ alle Transplantate an der femoralen knöchernen Verankerung versagten. Die gewählte Operationstechnik in femoraler press-fit Verankerung stellt nicht den Schwachpunkt dar, denn intraoperativ konnte in jedem Fall bei maximalem manuellen Zug eine sichere Verankerung belegt werden. Gegen eine biomechanische Limitierung der press-fit-Technik spricht auch, dass in den Vergleichsgruppen keine Knochenblockdislokation bzw. ein Knochenblock-ausriss beobachtet wurde. Es ist vielmehr ein weiterer Beweis, dass die [Seite 150↓]Gruppen B und C unter Faktor XIII Gabe eine schnellere und sicherere ossäre Integration aufwiesen. Entsprechend konnte biomechanisch belegt werden, dass die Faktor XIII Gruppen initial eine erhöhte Ausrissfestigkeit der Transplantate (p < 0,05) hatten.

Die Ausrissmechanismen können durch die gewählte Prüfgeschwindigkeit beeinflusst werden. Während NOYES et al. (1974) für langsame Ausrissraten vor allem tibiale Avulsionen beobachtete, sahen AZANGWE et al. (2000) häufiger tibiale Avulsionsfrakturen bei Prüfgeschwindigkeiten von 500 mm/min. Dagegen berichteten sie auch über das gehäufte Auftreten von tibialen Avulsionsfrakturen bei extrem langsamen Ausrissgeschwindigkeiten von 0,5 mm/min. Sicher ist, dass die Geschwindigkeit auch die Strukturzerstörung kollagener Fasern beeinflusst. In vergleichenden

rasterelektronenmikros-kopischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass bei langsamen Geschwindigkeiten sukzessiv Faseranteile über eine längere Distanz zerstört werden. Dagegen führen hohe Testgeschwindigkeiten zu einem gleichmäßigen Riss der Fasern auf einer Ebene mit geringerer oberfächlicher Desorganisation der Kollagenfibrillen (AZANGWE et al. 2000).

32 Wochen postoperativ kam es in allen Versuchsgruppen zu einem sprung-haften Anstieg der biomechanischen Kapazitäten des Knochen-Transplantat-Knochen-Komplexes. Den größten Anstieg hatte hierbei die Gruppe C.

Die erreichte Ausrissfestigkeit der Gruppe C von 70,1 % des vorderen Kreuz-bandes liegt weit über denen, die bisher für Kreuzbandtransplantate in Tiermodellen berichtet wurden (Ballock et al. 1989, FROMM 1996, Katsuragiet al. 2000, YOSHIHA 1987).

Es ist zu vermuten, dass durch die Transplantatbearbeitung im Sinne des „splittings“ der Kollagenfasern eine verbesserte Ernährungsgrundlage für den Umbau der Transplantate geschaffen wurde. Im Weiteren könnte durch die Manipulation der Transplantate eine erhöhte reparative Aktivität induziert worden sein, die im Endprodukt ein belastungsstabileres Transplantat erzielt haben. Anders als in Läsionsmodellen am Bandapparat erfolgte durch das Splitten keine Strukturstörung quer zu den Kollagenfibrillen, sondern lediglich eine strukturelle Auflockerung der dicht gepackten Fasern. Die Veränderungen sind somit nicht mit Ruptursituationen zu vergleichen, die nachweislich in der Reparation dünnere Kollagenfibrillen mit geringerer mechanischer Belastbarkeit entwickeln (FRANK et al. 1997).

Weitere Veränderungen nach der 32. postoperativen Woche hinsichtlich der biomechanischen Parameter waren nur von geringfügigen Erhöhungen geprägt.

Die wesentlichen Transplantatumbauprozesse für die biomechanische Be-lastbarkeit der Transplantate sind bereits nach 32 Wochen abgeschlossen. Die biomechanischen Charakteristika der Transplantate nach 56 Wochen waren den mechanischen [Seite 151↓]Eigenschaften des physiologischen vorderen Kreuzbandes weit unterlegen. Die erreichten Werte der Operationsgruppen für die maximale Ausrissfestigkeit von 54,9 – 77,7 % und der Steiffigkeit von 71,4 – 81,8 % des vorderen Kreuzbandes sind Ausdruck eines unvollständigen Transplantat-umbaus.

Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation des Faktor XIII, insbesondere in der Frühphase, die mechanische Festigkeit des Knochen-Transplantat-Knochen-Komplexes verbessert, jedoch langfristig es zu keiner Verbesserung der mechanischen Qualität kommt. Dagegen scheint die gewählte Operationstechnik im Sinne der Patellarsehnen-Splitting­Technik in Kombination mit der Faktor XIII-Applikation einen weit größeren Einfluss auf die langfristigen biomechanischen Eigenschaften der Transplantate zu besitzen.

8.7 Zusammenfassende Diskussion

Unter Berücksichtigung aller Einzelergebnisse konnte in der durchgeführten Studie gezeigt werden, dass eine Faktor XIII Gabe oder die Kombination mit einer veränderten Transplantataufbereitung wesentlich den Transplantatein- und umbau beeinflussen kann. Die dynamischen Veränderungen des Einwachsverhaltens konnten stimuliert und die biomechanischen Parameter im Vergleich zu einer sogenannten Standardversorgung verbessert werden. Die markanten Veränderungen, denen ein Patellarsehnentransplantat unterliegt, um die morphologischen und biomechanischen Eigenschaften eines vorderen Kreuzbandes zu erreichen, konnten mit den eingesetzten Methoden nur näherungsweise beeinflusst werden. Ursachen hierfür sind die heterotope Transplantation eines primär extraartikulär gelegenen Transplan-tates in das intraartikuläre System. Die signifikanten histomorphometrischen und biochemischen Unterschiede des Patellarsehnentransplantates im Vergleich zum vorderen Kreuzbandes können auch nach mehr als einem Jahr nicht vollständig angeglichen werden. Obwohl das Patellarsehnen-transplantat strukturell hinsichtlich seiner Kollagenfibrillenarchitektur und seiner bekannten biomechanischen Daten dem vorderen Kreuzband über-legen ist, erreicht dieses Transplantat nach abgelaufenem Umbauprozess nur maximal 3/4 der biomechanischen Leistungsfähigkeit des vorderen Kreuzbandes. Die auffälligsten Veränderungen weisen die Kollagen­zusammensetzung, die Kollagenfibrillenstärke und –verteilung sowie die veränderte Ratio der nichtreduzierbaren Querbrücken auf.

Valide Parameter zur Einschätzung der biomechanischen Eigenschaften sind die Zellularität, die Vaskularität, die Pyridinolinkonzentration, die Kollagen-Typ III Konzentration und die Kollagenfibrillenmorphometrie.

Zwar verändern sich die morphologischen und biochemischen Charakteris-tika der Transplantate in Richtung der Eigenschaften des vorderen Kreuzbandes, sie zeigen [Seite 152↓]aber zum Teil noch nach über einem Jahr signifikante Unterschiede. Der Prozess der Ligamentisation ist demzufolge unvollständig und der Begriff fehlorientierend.

Zahlreiche unbekannte Faktoren konnten nicht oder können noch nicht berücksichtigt werden. Die Wirkung und Interaktion von Proteoglykanen, Wachstumsfaktoren, die intrinsiche Aktivität der Fibroblasten und die zellulären Eigenschaften von genetisch determiniertem Bindegewebe, welches als Kreuzbandersatz genutzt wird, bedürfen weiterer Studien.


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