Lage, Hermann: Atypische pleiotrope Zytostatikaresistenz (Multidrug-Resistenz) humaner Tumorzellen

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Kapitel 3. Zusammenfassung der Ergebnisse

3.1 Zellbiologische Charakterisierung verschiedener chemoresistenter Tumorzellen bezüglich bekannter Resistenzmechanismen

Ausgehend von bereits etablierten Modellsystemen wurden im Sinne der Problemstellung unterschiedliche zelluläre Resistenzmechanismen charakterisiert. Um neuartige Mechanismen von bereits in der Literatur beschriebenen Mechanismen abzugrenzen, mußte als erstes das Vorhandensein bekannter Resistenzmechanismen in den Chemoresistenz Modellzellinien nachgewiesen werden. Diesbezügliche zellbiologische Arbeiten zur Charakterisierung unterschiedlicher Resistenzmodelle sind in Dietel et al., 1990; Kellner et al., 1997; Ross et al., 1999; Lage et al., 1999; Lage et al., 2000a und Lage et al., 2000b ausführlich dargelegt.

In Dietel et al., 1990 ist die Etablierung der atypischen MDR Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV beschrieben. In dieser P-Gp-negativen Zellinie konnte erstmalig nachgewiesen werden, daß ein Zytostatikum intrazellulär kompartimentiert wird, und es die Zelle auf diese Art und Weise verhindern kann, daß das Therapeutikum seinen Wirkort erreicht.

Wie in Kellner et al., 1997 erörtert wird, ist der Resistenzphänotyp in der humanen Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV mit einer verminderten Akkumulation von Zytostatikum assoziiert. Es konnte außerdem ermittelt werden, daß die Expression von DNA-Topoisomerse IIalpha, einem häufig in atypischen MDR Zellen negativ reguliertem Enzym, in dieser Zellinie vermindert ist.

Nach Klonierung der BCRP-spezifischen cDNA (Doyle et al., 1998) wurde es ermöglicht nachzuweisen, daß dieser ABC-Transporter massiv in EPG85-257RNOV Zellen überexprimiert wird. Wie in Ross et al., 1999 ausgeführt, konnte gezeigt werden, daß BCRP nicht nur in der Linie EPG85-257RNOV verstärkt exprimiert vorliegt, sondern außerdem in weiteren atypischen MDR Zellinien. Es wurde zudem nachgewiesen, daß weitere in dieser Arbeit verwendete atypische MDR Zellinien nicht nur P-Gp- sondern auch BCRP-negativ sind.


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Eine therapeutischer Ansatz, um die Wirkung von Chemotherapeutika zu unterstützen, erfolgt über eine gleichzeitige Applikation von Hyperthermie (Übersicht in: Falk und Issels, 2001). Um zu untersuchen, wie sich die Thermosensitivität von Tumorzellen in Abhängigkeit vom Resistenztyp verhält, wurde diese in Lage et al., 2000b analysiert. Dabei zeigte sich, daß zwei klassische MDR Linien - einerseits aus einem Magenkarzinomsystem etabliert (EPG85-257RDB), andererseits aus einer Pankreaskarzinomlinie selektioniert (EPP85-181RDB) - eine erhöhte Thermotoleranz im Vergleich zur Ausgangslinie zeigten. Im Falle der atypischen MDR war das Ergebnis uneinheitlich: die BCRP-positive Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV zeigte eine verstärkte Thermotoleranz, die BCRP- und P-Gp-negative Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RNOV zeigte im Vergleich zu der parentalen Zellvariante keine Veränderung in der Thermosensitivität.

In Lage et al., 1999 wird gezeigt, daß DNA-Reparatursysteme, wie das DNA-Mismatch Repair System sowie die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) mit der Zytostatikaresistenz in unterschiedlichen Melanomzellen assoziiert ist.

Veränderungen in der DNA-Topoisomerase II-Aktivität, sowie der Expression beider DNA-Topoisomerase II Isoenzyme, DNA-Topoisomerase IIalpha und IIbeta, in chemoresistenten, malignen Melanomzellen werden in Lage et al., 2000a erörtert.

3.2 Suche nach neuen resistenz-assoziierten Faktoren auf Ebene der zellulären mRNA-Expression („Transcriptomics“)

Ein experimenteller Ansatz neue resistenz-assoziierte Faktoren darzustellen, erfolgt über den Vergleich von unterschiedlichen mRNA-Expressionsprofilen, dem jeweiligen „Transkriptom“, zwischen chemoresistenten und chemosensitiven Zellen. Überexprimierte bzw. vermindert regulierte Gene stellen dabei potentielle Kandidaten dar, die an dem entsprechenden Resistenzmechanismus beteiligt sind. Für diese Strategie bieten sich unterschiedliche Methoden an, die in Lage und Dietel, 1996; Lage und Dietel, 1997 und Grottke et al., 2000 diskutiert und angewandt wurden. In dieser Untersuchung der Chemoresistenzmodelle wurden bisher zwei unterschiedliche methodische Ansätze erfolgreich eingesetzt:

In Lage und Dietel, 1996 wird die molekulare Klonierung der humanen cDNA, spezifisch für die zytoplasmatische Methionyl-tRNA Synthetase (MetRS) beschrieben. Die subtraktive Hybrisidierungsstrategie ergab, daß die MetRS in der atypischen MDR Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV stärker exprimiert, als in der Ausgangslinie vorlag. Diese Überexpression ist allerdings als Ausdruck einer vermehrten, streßinduzierten zellulären Proteinbiosynthese und nicht als ursächlich verbunden mit dem Resistenzgeschehen zu interpretieren.

Ebenfalls über eine subtraktive Hybridisierung konnte, wie in Lage und Dietel, 1997 dargelegt, die MXR7 spezifische cDNA kloniert werden. MXR7, mittlerweile als Glypican-3 (GPC3) identifiziert, zeigte sich dabei als stark in den atypischen MDR Magenkarzinomzellen EPG85-257RNOV überexprimiert. Wie später noch in Wichert et al., 1999 und Wichert et al., eingereicht ausgeführt, ist es unterdessen möglich gewesen die GPC3-Expression spezifisch zu inhibieren und dadurch den funktionellen Nachweis zu führen, daß GPC3 tatsächlich an dem atypischen MDR Phänotyp beteiligt ist.

Der Einsatz der DDRT-PCR wird in Grottke et al., 2000 erörtert. Durch den Einsatz dieser Technik war es möglich insgesamt 11 cDNA-Fragmente zu klonieren, deren homologe mRNA Moleküle differentiell in chemoresistenten malignen Melanomzellen exprimiert werden. Diese Fragmente entsprachen 3 bekannten Genen mit charakterisierter biologischer Funktion, 4 bekannten Genen mit unbekannter Funktion und 4 völlig unbekannten Genen. In Lage et al., 2001a wird dargestellt werden, daß bisher für eines dieser Fragmente, homolog zu DFNA5, eines Gens mit unbekannter physiologischer Funktion, der funktionelle Nachweis geführt wurde, am Chemoresistenzverhalten beteiligt zu sein.


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3.3 Suche nach neuen resistenz-assoziierten Faktoren auf Ebene der zellulären Protein-Expression („Proteomics“)

Eine weitere experimentelle Strategie zur Identifizierung potentiell an der Chemoresistenz beteiligter Faktoren, ist durch den Vergleich der Protein-Expressionsmuster, dem entsprechenden „Proteom“, chemoresistenter und -sensibler Tumorzellen gegeben. In Sinha et al., 1998; Sinha et al., 1999a; Sinha et al., 1999b und Sinha et al., 2000 ist dieser Ansatz, der durch den Einsatz der 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) gekennzeichnet ist, dargelegt.

Eine vergleichende Proteom-Analyse zwischen parentalen Magenkarzinomzellen (EPG85-257P), klassischen MDR-Varianten (EPG85-257RDB) sowie atypischen MDR-Varianten (EPG85-257RNOV) ist in Sinha et al., 1998 beschrieben. Über diesen Ansatz konnte gezeigt werden, daß in beiden chemoresistenten Zellinien, Thioredoxin in einer höhereren Konzentration, als in den sensitiven Zellen vorliegt. Zudem konnten in der atypischen MDR-Variante vermehrt Annexin I-spezifische Signale detektiert werden.

Der gleiche experimentelle Ansatz, dargestellt in Sinha et al., 1999a, ergab beim Proteom-Vergleich von sensiblen Pankreaskarzinomzellen (EPP85-181P), klassischen MDR-Varianten (EPP85-181RDB) und der atypischen MDR-Sublinie (EPP85-181RNOV) eine verstärkte Überexpression von Cofilin in beiden unterschiedlichen MDR-Linien. In der atypischen MDR-Variante konnte zudem ein erhöhter zellulärer Gehalt an zytosolischem E-FABP („epidermal-fatty acids binding protein“) und 14-3-3-sigma nachgewiesen werden.

In Sinha et al., 1999b sind die Proteom-Analysen eines Resistenzmodells, das sich vom Kolonkarzinom herleitet (HT-29P: parental; HT-29RDB: klassische MDR; HT-29RNOV: atypische MDR) und eines Fibrosarkommodells (EPF86-079P: parental; EPF86-079RNOV: atypische MDR) dargelegt. In der Linie HT-29RDB konnte BCSG-1 („breast cancer-specific gene-1“), in HT-29RNOV-Zellen APRT (Adenin-Phosphoribosyl Transferase) und in der Zellinie EPF86-079RNOV konnten Rho-Guanindinukleotidphosphat (Rho-GDP) Dissoziationsinhibitor und ein unbekanntes Protein mit Homologie zum Saccharomyces cerevisiae Polypeptid yer-7, als verstärkt exprimiert, identifiziert werden.


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Sinha et al., 2000 beschäftigt sich mit der vergleichenden Proteom-Analyse von unterschiedlichen, chemoresistenten Melanomzellinien. In diesem System wurden erhöhte zelluläre Konzentrationen von insgesamt 4 unterschiedlichen bekannten Proteinen nachgewiesen: Elongationsfaktor 1-delta, TCTP („translationally controlled tumor protein“), 14-3-3-gamma und einem Tetratricopeptid Protein.

3.4 Gentherapeutische Inhibition resistenz-assoziierter Faktoren mittels Ribozymtechnologie

Die spezifische Inhibition von Resistenzfaktoren stellt sowohl einen experimentellen, als auch einen therapeutischen Ansatz dar, um Zytostatikaresistenzen zu modulieren. Zudem können potentielle Resistenzfaktoren, bei denen eine Beteiligung am Resistenzgeschehen nicht experimentell belegt ist, über eine spezifische Inhibition funktionell bezüglich ihrer Beteiligung am Zytostatikaresistenz-Phänotyp charakterisiert werden. In Wichert et al., 1999; Kowalski et al., 2001; Materna et al., 2001 ist eine gentherapeutische Strategie zur Modulation von Chemoresistenzen dargelegt. Bei diesem Ansatz werden Ribozyme, spezifische riboendonukleolytische RNA-Moleküle, gegen die Transkripte von resistenz-assoziierten Genen konstruiert, die auf diese Weise inaktiviert werden können.

In Wichert et al., 1999 ist das Design und die kinetische Charakterisierung eines Ribozyms gegen den bereits in Lage und Dietel, 1997 erwähnten, potentiellen Resistenzfaktor GPC3, der in atypischen MDR Magenkarzinomzellen verstärkt exprimiert vorliegt, beschrieben.

Kowalski et al., 2001 beschäftigt sich mit der Konstruktion und kinetischen Analyse eines Ribozyms gegen den mit atypischer MDR assoziierten und in der Zellinie EPG85-257RNOV überexprimierten ABC-Transporters BCRP.

Design und Charakterisierung zweier gegen den cisplatinresistenz-assoziierten ABC-Transporter cMOAT („canalicular multispecific anion transporter“) gerichteter Ribozyme sind in Materna et al., 2001 dargelegt.


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3.5 Fuktionelle Charakterisierung neuer resistenz-assoziierter Faktoren

In Wichert et al., eingereicht; Lage et al., 2001a und Lage et al., 2001b sind funktionelle Studien mit mutmaßlich neuen, zytostatikaresistenz-assoziierten Faktoren bezüglich ihrer physiologischen Bedeutung und bezüglich ihrer möglichen Beteiligung an Chemoresistenzerscheinungen dargestellt.

Der funktionelle Nachweis, daß GPC3 an dem in der atypischen MDR Zellinie EPG85-257RNOV vorliegenden Resistenzphänotyp beteiligt ist, ist in Wichert et al., eingereicht erörtert. Durch die Applikation des in Wichert et al., 1999 beschriebenen Ribozyms gegen GPC3, konnte das GPC3 kodierende Transkript spezifisch inhibiert werden. Das Ausmaß der Resistenz gegenüber Mitoxantron konnte dabei um fast 80% reduziert werden. Die Studie zeigt gleichzeitig, daß das eingesetzte anti-GPC3 Ribozym potentiell für eine gentherapeutischen Strategie zur Resistenzmodulation einer atypischen MDR geeignet ist.

Transfektionsexperimente, mittels eines DFNA5-Expressionskonstruktes sind in Lage et al., 2001a dargelegt. Wie in Grottke et al., 2000 erwähnt, ist DFNA5 in etoposid-resistenten Melanomzellen vermindert exprimiert. Durch Überexpression von DFNA5 in etoposid-resistenten Melanomzellen konnte die Sensitivität gegenüber einer Etoposidbehandlung partiell wieder hergestellt werden. Dieser Effekt beruht auf einer DFNA5-spezifischen Wirkung, die zelluläre Bereitschaft einen caspase-3-abhängigen Signaltransduktionsweg, der in einem apoptotischen Ereignis mündet, auszulösen.

In Lage et al., 2001b wird gezeigt, daß der ABC-Transporter TAP („transporter associated with antigen presentation“), physiologisch beteiligt an der MHC Klasse-I assoziierten Antigenpräsentation, in der atypischen MDR Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV überexprimiert vorliegt. Über Transfektionsexperimente mit beiden TAP-Untereinheiten des heterodimeren Transportmoleküls konnte Resistenz gegenüber Mitoxantron auf sensible Tumorzellen übertragen werden.


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Mon Sep 9 13:36:15 2002