Lage, Hermann: Atypische pleiotrope Zytostatikaresistenz (Multidrug-Resistenz) humaner Tumorzellen

15

Kapitel 4. Diskussion

Resistenzen von Tumorzellen gegenüber antineoplastisch wirksamen Substanzen stellt eines der zentralen Probleme in der klinischen Onkologie dar. Die Überwindung dieser Resistenzen gehört daher zu den vordringlichsten Anliegen der molekularen onkologischen Forschung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche experimentelle Strategien verfolgt, neue molekulare Mechanismen zu identifizieren, die bei dem Zustandekommen von Zytostatikaresistenzen von Bedeutung sind. Insbesondere wurden verschiedene Formen der atypischen Multidrug-Resistenz näher charakterisiert. Dafür wurden unterschiedliche Zellkulturmodelle bezüglich der vorliegenden Resistenzmechanismen zellbiologisch analysiert. Zugleich wurden Techniken eingesetzt, die es ermöglichten auf den Ebenen der mRNA- und Proteinexpression neue, mutmaßlich resistenz-assoziierte Faktoren zu identifizieren. Es konnte so für GPC3, DNFA5 und TAP erstmalig funktionell nachgewiesen werden, für zelluläre Chemoresistenzerscheinungen humaner Malignomzellen mitverantwortlich zu sein. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit eine gentherapeutische Strategie verfolgt, die es gewährleistet, spezifisch Zytostatikaresistenzen zu modulieren.

Wesentliche Grundlage der Charakterisierung von atypischen MDR Phänotypen in Tumorzellen stellte die zellbiologische Analyse von bekannten, in der Literatur beschriebenen Mechanismen dar. Auf diese Weise konnte überprüft werden, ob sich die Chemoresistenz eines zu untersuchenden Zellkulturmodells nicht schon allein über bereits bekannte Mechanismen erklären läßt. So können z.B. die klassischen MDR Phänotypen der humanen Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB und der humanen Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RDB über das Vorhandensein des ABC-Transporters P-gp (Lage et al., 2000) erklärt werden. Im Gegensatz dazu konnten in atypischen MDR Zellinien, wie z.B. der humanen Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV mehrere Mechanismen identifiziert werden, die zum Resistenzphänotyp beisteuern.

Als ein wesentliches Ergebnis haben die verschiedenen Analysen unterschiedlicher chemoresistenter Zellinien ergeben, daß ein Resistenzphänotyp i.d.R. aufgrund eines komplexen multifaktoriellen Geschehens zustande kommt. So konnten z.B. in der atypischen MDR Zellinie EPG85-257RNOV bisher insgesamt fünf unterschiedliche Mechanismen ausgemacht werden, die einen Effekt auf den Resistenzphänotyp ausüben:


16

Es konnten in dieser Zellinie zudem weitere Veränderungen gefunden werden, bei denen eine ursächliche Beteiligung an der Resistenz nicht geklärt ist (Lage und Dietel, 1996; Sinha et al., 1998). Da sich ein Tumor aus heterogenen Anteilen zusammensetzt, kann darauf geschlossen werden, daß auch in der klinischen Situation mit verschiedenen, gleichzeitig agierenden Resistenzmechanismen gerechnet werden muß. Therapeutische Konsequenz aus dieser Überlegung stellt neben dem gleichzeitigen Einsatz unterschiedlicher Zytostatika, deren antineoplastische Wirkung über unterschiedliche Resistenzmechanismen inhibiert wird, die gleichzeitige Applikation von unterschiedlichen Chemoresistenzmodulatoren dar. Im Falle der in dieser Arbeit eingesetzten gentherapeutischen Strategie mittels Ribozymtechnologie, bedeutet dieses, daß gleichzeitig Ribozyme appliziert werden müssen, die spezifisch gegen die mRNA-Moleküle unterschiedlicher Resistenzfaktoren gerichtet sind.

Die eingesetzten Methoden zur vergleichenden mRNA- und Proteinexpressionsanalyse von chemoresistenten Tumorzellen zeichnen sich durch unterschiedliche Vor- und Nachteile aus. Die zu Beginn eingesetzte Methode der subtraktiven Hybridisierung (Hedrick et al., 1984) ist durch eine relativ schnelle Durchführbarkeit charakterisiert, hat jedoch die Nachteile, daß sich jeweils nur zwei Zellinien miteinander vergleichen lassen und nur relativ stark exprimierte Transkripte über diese Methode zu identifizieren sind. Die anschließend angewandte Methode der DDRT-PCR (Liang und Pardee, 1992) bietet darüber hinaus entscheidende Vorteile. Es lassen sich erstens gleichzeitig mehrere Zellinien miteinander vergleichen, zum anderen können auch schwach exprimierte Transkripte identifiziert werden. Es stehen außer der DDRT-PCR mittlerweile noch weitere Methoden zur Verfügung, mit deren Hilfe sich mRNA-Expressionsprofile analysieren lassen. Dazu gehören die Techniken SAGE („serial analysis of gene expression“) (Velculescu et al., 1995), SSH („subtractive suppression hybridization“) (Diatchenko et al., 1996) sowie der Einsatz von DNA Chips bzw. Microarrays (Marshall and Hodgson, 1998). Der entscheidende Vorteil der DDRT-PCR gegenüber anderen


17

experimentellen Ansätzen zur Analyse differentieller mRNA-Expression liegt darin, daß beim gleichzeitigen Vergleich der Expressionsmuster vieler verschiedenen chemoresistenter Zellinien, Transkripte, die in mehreren resistenten Zellen gleichzeitig in ihrer Expressionsstärke verändert sind, als besonders geeignete Kandidaten für eine mögliche Beteiligung an der Chemoresistenz in Frage kommen. Ein Beleg dafür, daß diese Methode besonders für diese Anwendung geeignet ist, ist dadurch gegeben, daß die Überexpression eines bekanntermaßen an der Resistenz beteiligten Faktors gefunden wurde. So konnte mittels DDRT-PCR die verstärkte Expression des ABC-Transporters BCRP in der atypischen MDR Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV detektiert werden (Lage und Dietel, 2000). Damit konnte der „proof of principle“ für die DDRT-PCR zur Identifikation von Resistenzfaktoren erbracht werden.

Die eingesetzte Technik der 2D-PAGE zur Proteomanalyse hat gegenüber der mRNA-Expressionsprofilanalyse zwei grundlegende Vorteile. Zum einen können potentielle Resistenzfaktoren direkt als Polypeptid detektiert werden, zudem können mittels 2D-PAGE Proteinmodifikationen, wie z.B. unterschiedliche Phosphorylierungs- oder Glykolisierungsmuster nachgewiesen werden. Der Nachteil der Methode liegt darin, daß die Empfindlichkeit des Nachweises schwach exprimierter Faktoren wesentlich geringer ist als bei Techniken, die Nukleinsäuren nachweisen. Dadurch bedingt ergibt sich, daß mittels dieser Technologie - im Gegensatz zu den auf PCR basierenden Techniken - nicht alle in Frage kommenden mutmaßlichen Resistenzfaktoren gefunden werden können. Ein weiterer Nachteil der Proteomanalyse besteht darin, daß besonders große, ausgeprägt hydrophobe, extrem saure oder stark basische Proteine mittels 2D-PAGE nur unzureichend aufgetrennt werden können. Für den Nachweis von spezifischen mRNA-Molekülen sind diese Einflußgrößen bedeutungslos.

Der gentherapeutische Einsatz von Ribozymen zur Modulation von Resistenzmechanismen hat sich in zweifacher Hinsicht als innovativ erwiesen. Zum einen können mittels Ribozymen resistenzfaktor-kodierende RNA-Moleküle spezifisch eliminiert werden (Wichert et al., 1999; Kowalski et al., 2001, Materna et al., 2001) und auf diese Weise den Resistenzphänotyp im zellulären System modulieren (Wichert et al., eingereicht). Zum anderen stellen Ribozyme ein ausgezeichnetes Laborwerkzeug dar, um den experimentellen Nachweis zu erbringen, daß ein mutmaßlicher Resistenzfaktor tatsächlich an einem Resistenzmechanismus beteiligt ist.


18

Dieses konnte für GPC3 gezeigt werden. Durch eine über Transfektion erreichte Überexpression von GPC3 in chemosensiblen Tumorzellen konnte keine Übertragung des Resistenzphänotyps bewerkstelligt werden (Lage und Dietel, 1997). Erst die spezifische Inhibition von GPC3 mittels der Ribozymtechnologie, war in der Lage den experimentellen Nachweis zu erbringen, daß GPC3 an der atypischen MDR beteiligt ist. Wie oben ausgeführt, stellt GPC3 somit einen für die Resistenz bedeutsamen Faktor dar, der auf das gleichzeitige Vorhandensein bisher unbekannter Kofaktoren angewiesen ist. Eine Überexpression kann daher keine Resistenz übertragen, die Inhibition eines essentiellen Faktors kann jedoch den Resistenzmechanismus negativ beeinflussen. Ein ähnlichen Effekt wurde vom humanen „major vault protein“ (MVP) - ursprünglich als „lung resistance protein“ (LRP) bezeichnet - berichtet. In Transfektionsexperimenten, in denen die LRP kodierende cDNA in sensible Tumorzellen eingeführt wurde, konnte keine Übertragung von Zytostatikaresistenz erreicht werden (Scheffer et al., 1995). Die Inhibition von LRP mittels Ribozymen konnte jedoch auch in diesem System erstmals direkt experimentell belegen, daß LRP an der Ausbildung eines Resistenzphänotyps ursächlich beteiligt ist (Kitazono et al., 1999).

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Sep 9 13:36:15 2002