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4  Methodik

4.1 Versuchstiere

4.1.1 Tiermaterial

Insgesamt wurden in beiden Teilstudien 220 männliche Wistar-Ratten (Gewicht: 190 ± 40g ) im Alter von 6 - 7 Wochen verwendet. Die Versuchsreihen orientierten sich an den Richtlinien für die Durchführung von Tierversuchen nach § 2 sowie § 8 Absatz 1 des Tierschutzgesetzes [293] und wurden von der zuständigen Berliner Senatsverwaltung für Gesundheit genehmigt (Aktenzeichen: G 0102/91, G 0395/94, G 0496/95, G 0157/98). Die Versuche wurden von Oktober 1994 bis Januar 1999 durchgeführt. Die Tierhaltung erfolgte bei 12-stündigem Hell/Dunkel-Rhythmus (Temperatur: 25°C, Luftfeuchtigkeit: 55-60%). Den Tieren war freier Zugang zu Wasser und Standardnahrung (Altromin®, Altromin, Lage, Deutschland) möglich. Eine Woche nach Anlieferung wurden die Tiere den Versuchen zugeführt. Einen Tag vor Versuchsbeginn wurde den Tieren die feste Nahrung entzogen. Wasser ad libitum wurde bis zum Beginn der Versuche gewährt.

4.1.2 Gruppeneinteilung

4.1.2.1 Teil 1 – antioxidative Substanzen

In der Kontrollgruppe (n = 20) wurden die Tiere instrumentiert, laparotomiert und die Untersuchungen ohne sonstige Behandlung durchgeführt (sham operation).

Zwei weitere Kontrollgruppen (je n = 20) wurden gleichfalls instrumentiert und laparotomiert. Sie erhielten außerdem 5 bzw. 20 mg/kg KG Endotoxin (LPS von E. coli, Serotyp O55:B5; Sigma, Deisenhofen, Deutschland; gelöst in NaCl 0,9%) als i.v.-Kurzinfusion über 15 min ohne weitere Therapie.

In den vier Therapiegruppen (je n = 20) wurden die Tiere präpariert, erhielten 5 bzw. 20 mg/kg KG Endotoxin und zusätzlich eine Therapie mit U-74389G (Upjohn, Kalamazoo, MI, USA; gelöst in CS-4, Upjohn, Kalamazoo, MI, USA; 3 mg/kg KG i.v. 30 min vor LPS-Gabe, 1,5 mg/kg KG i.v. 60 min nach LPS-Gabe) bzw. Oxypurinol (Sigma, Deisenhofen, Deutschland; gelöst in 0,1 n NaOH nach McKechnie et al. [201]; 50 mg/kg KG i.p. 24 h präoperativ, 20 mg/kg KG i.p. vor LPS-Gabe).


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4.1.2.2  Teil 2 – vasoaktive Substanzen

Die Tiere in den vier Therapiegruppen (je n = 20) wurden präpariert und erhielten nach Applikation von 5 bzw. 20 mg/kg KG Endotoxin entweder Iloprost (Ilomedin®, Schering, Berlin, Deutschland; 50 µg/50 ml NaCl 0,9%; 2 ng/kg/min i.v.) oder Dopexamin (Dopacard®, Ipsen Pharma, Ettlingen, Deutschland; 50 mg/50 ml NaCl 0,9%; 0,5 µg/kg/min i.v.). Als Kontrollgruppen dienten die ersten drei Gruppen aus Teil 1.

In jeder Gruppe wurden 10 Tiere intravital mikroskopiert und 10 Tiere mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) untersucht. Bei den Tieren mit LDF wurde eine Powerspektralanalyse von Blutdruck- und Lasersignal durchgeführt. Die Blutentnahmen erfolgten bei allen Tieren (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Gruppeneinteilung und Untersuchungen (IVM = Intravitalmikroskopie, LDF = Laser-Doppler-Flowmetrie, LAZ = Lazaroid U-74389G, OXY = Oxypurinol, ILO = Iloprost, DPX = Dopexamin; MDA = Malondialdehyd, PSA = Powerspektralanalyse; je n = 20)

Gruppen

Monitoring

Spezielle Untersuchungen

Kontrollgruppe

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA, LDF, PSA

 

  

LPS 5

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA, LDF, PSA

LPS 20

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA, LDF, PSA

 

  

LPS 5 + LAZ

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA

LPS 5 + OXY

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA

LPS 20 + LAZ

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA

LPS 20 + OXY

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, MDA

 

  

LPS 5 + ILO

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, LDF, PSA

LPS 5 + DPX

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, LDF, PSA

LPS 20 + ILO

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, LDF, PSA

LPS 20 + DPX

Hf, MAP, BGA, Laktat, Leuko

IVM, TNF-α, LDF, PSA


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4.2  Versuchsmodell

4.2.1 Versuchsablauf

Der allgemeine Versuchsablauf war für alle Gruppen identisch. Die gesamte Präparationsdauer betrug ca. 30 Minuten. Sie beinhaltete das Einlegen der intravasalen Katheter, die Tracheotomie und die mediane Laparotomie. Danach wurde den Tieren eine Erholungsphase von 15 min gewährt. Es folgte die Induktion der Endotoxinämie. Zwei Stunden nach LPS-Applikation wurden die intravitalmikroskopischen Messungen durchgeführt. Die Zeitpunkte der Blutentnahmen (BE) sind aus Abbildung 13 ersichtlich. Zu den gleichen Zeitpunkten erfolgte die Laser-Doppler-Flowmetrie und die Malondialdehyd-Bestimmung.

Abb. 13 : Versuchsablauf

4.2.2 Anästhesie und Monitoring

Die Narkose wurde mittels Etherrausch (Ether pro narcosi, Hoechst, Frankfurt/M., Deutschland) und nachfolgender intraperitonealer Applikation von 60 mg/kg KG Pentobarbital (Nembutal®, Sanofi, Düsseldorf, Deutschland) eingeleitet. Die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte mit einer Erhaltungsdosis von 1 mg/kg KG/h Pentobarbital i.v. und bei Bedarf mit intravenösen Bolusgaben bis 30 mg/kg KG Pentobarbital. Die Narkosetiefe wurde kontinuierlich anhand des Zwischenzehenreflexes und [Seite 45↓]des Ohrreflexes kontrolliert. Zehn Minuten nach Narkoseeinleitung konnte mit der Operation begonnen werden. Die Fixierung der Tiere erfolgte in Rückenlage. Polyethylenkatheter (PE 50, Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,96 mm, Portex®, Hythe, Kent, GB) wurden in die linke Vena jugularis interna und linke Arteria carotis communis eingebracht. Es erfolgte ein kontinuierliches Monitoring des systolischen, diastolischen und mittleren arteriellen Blutdrucks (MAP) und der Herzfrequenz (Hf; BMT Biomonitor 5231, Druckmesswandler W112, RFT, Stassfurt, Deutschland). Mittels eines Infrarotsensors wurde ein kontinuierliches Monitoring der Atemfrequenz vorgenommen. Alle Tiere wurden tracheotomiert, um eine Verlegung der oberen Atemwege auszuschließen. Die Tiere atmeten spontan Raumluft. Eine Wärmematte diente zur Aufrechterhaltung einer Körperkerntemperatur von 37 ± 0,5°C (rektale Thermistorsonde, W 233, RFT, Stassfurt, Deutschland).

Über den zentralvenösen Zugang erfolgte die Volumensubstitution mit Vollelektrolytlösung (Thomaejonin®, Thomae, Biberach, Deutschland). Es erfolgte eine Differenzvolumensubstitution zu der Gruppe, die am meisten Volumen erhalten hatte (Oxypurinolgruppe), wie in Tabelle 2 dargestellt. Der Differenzbetrag wurde zusätzlich über vier Stunden infundiert. Die Gesamtvolumenzufuhr betrug 7,5 ml/kg KG/h.

Tabelle 2 : Berechnung der Volumensubstitution (LPS = Lipopolysaccharid, LAZ = Lazaroid U74389G, OXY = Oxypurinol, ILO = Iloprost, DPX = Dopexamin)

 

Kontrolle

LPS

LAZ

OXY

ILO

DPX

Basisinfusion

1 ml/h

1 ml/h

1 ml/h

1 ml/h

1 ml/h

1 ml/h

LPS

-

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

U-74389G

-

-

1 ml

-

-

-

Oxypurinol

-

-

-

1,5 ml

-

-

Iloprost

-

-

-

-

0,08 ml

-

Dopexamin

-

-

-

-

-

0,025 ml

Summe (4 h)

4 ml

4,5 ml

5,5 ml

6 ml

4,58 ml

4,525 ml

Diff. (4 h)

2 ml

1,5 ml

0,5 ml

-

1,42 ml

1,475 ml


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4.2.3  Operative Technik

Nach Rasur und Desinfektion der linken Halsseite wurde die Haut über 2 cm von kranial nach kaudal inzidiert und die Vena jugularis interna sin. dargestellt. Nach distaler Ligatur und proximaler Abklemmung der Vene mittels Microclip (Aesculap®, Tuttlingen, Deutschland) erfolgte die Kathetereinlage in Venae sectio-Technik, die Fixierung des Katheters mit Haltefäden und die Entfernung des Microclips. Analog wurde mit der Arteria carotis communis sin. verfahren. Danach erfolgte die Darstellung der proximalen Trachea. Die Trachea wurde mit einer Mikroschere (Aesculap®, Tuttlingen, Deutschland) quer eröffnet und mit Hilfe einer Venenverweilkanüle (Braunüle® G14, Braun, Melsungen, Deutschland) intubiert. Abschließend wurde die Halswunde mit einer fortlaufenden Naht (Ethibond®, 3,5 metric, Ethicon, Norderstedt, Deutschland) verschlossen.

Im Anschluss an die zentralvenöse und arterielle Katheterisierung und die Tracheotomie erfolgte nach Rasur und Desinfektion eine mediane Laparotomie vom Xiphoid bis zur Symphyse. Für die Laser-Doppler-Flowmetrie wurde zur Sonden-Einlage die rechte laterale Bauchwand zusätzlich über 0,5 cm inzidiert. Die Laser-Doppler-Sonde wurde mittels Gewebekleber Enbucrilat (Histoacryl®, Braun, Melsungen, Deutschland) am terminalen Ileum fixiert. Danach wurde den Tieren eine Erholungsphase von 15 min bis zur Induktion der Endotoxinämie gewährt.

Zwei Stunden nach LPS-Applikation wurden die intravitalmikroskopischen Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurde ein 5 cm langes Segment des terminalen Ileums proximal der Ileocoecalklappe aufgesucht und auf eine spezielle Haltevorrichtung verbracht. Ein Deckgläschen (21x26 mm, Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) diente als transparente und plane Abdeckung der Mikroskopierkammer (siehe Abbildung 15 - Versuchsaufbau). Auf diese Weise wurde ein Darmabschnitt von ca. 1 cm2 von serosal mikroskopisch zugänglich. Für die Untersuchung der Mukosa wurde der Darm antimesenterial mittels eines Elektrokauters (BCH 50, TUR, Dresden, Deutschland) eröffnet. Eventuell vorhandener Darminhalt wurde durch Spülung mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung entfernt. Nicht zu untersuchende Darmregionen wurden mit Plastikfolie und Gaze abgedeckt und kontinuierlich mit auf 37°C angewärmter Elektrolytlösung (Thomaejonin®, Thomae, Biberach, Deutschland) superfundiert, um eine Exposition gegenüber Raumluft sowie eine Austrocknung zu vermeiden. Die Tötung der Tiere erfolgte am Versuchsende mit einer Überdosis Pentobarbital.


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4.3  Labor

4.3.1 Leukozyten

Für die Bestimmung der Leukozytenzahl wurden aus dem arteriellen Katheter 150 µl Blut entnommen (Citratblut; Zell-Counter: Technicon H1, Bayer, Leverkusen, Deutschland; Eichung auf Rattenblut).

4.3.2 Laktat

Für die Bestimmung der Laktatkonzentration wurden 50µl Heparinblut benötigt. Die Abnahme erfolgte ebenfalls aus dem arteriellen Katheter (Analysegerät: YSI 2300 STAT-PLUS-S, Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH, USA).

4.3.3 Blutgasanalyse

Für die Untersuchung des pH-Wertes, des Kohlendioxidpartialdrucks (pCO2) und Sauerstoffpartialdrucks (pO2) wurden 100µl Heparinblut arteriell gewonnen. Die Bestimmung dieser Parameter erfolgte an einem automatischen Blutgasanalysator (ABL 505, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark).

4.3.4 Tumornekrosefaktor-α

In jeweils 200 µl arteriellem Heparinblut wurde der Tumornekrosefaktor-α bestimmt. Zur Analyse wurde ein monoklonaler, Ratten-spezifischer TNF-α-ELISA-Kit (Factor-Test-X®, Genzyme, Cambridge, MA, USA; Testsensitivität 10pg/ml) eingesetzt.


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4.3.5  Malondialdehyd

Malondialdehyd (OHC-CH2-CHO; MDA) ist ein Zerfallsprodukt mehrfach ungesättigter peroxidierter Fettsäuren. Es wirkt als Quervernetzungsagens und wird zur Quantifizierung der radikalischen Belastung laborchemisch im Test auf Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS = thiobarbituric acid reactive substances) mittels HPLC bestimmt.

Abb. 14 : Verbindung von Malondialdehyd mit dem Nachweisreagenz Thiobarbitursäure

Die MDA-Bestimmung erfolgte aus Dünndarmgewebeproben (gewonnen zum Zeitpunkt 0 h, 2 h, 4 h). Die Aufarbeitung der tiefgefrorenen Gewebeproben erfolgte im Kühlraum bei 4°C. Dort wurden die Gewebeproben mit einem Pistill zerkleinert und in je 5 ml physiologische Kochsalzlösung gegeben. Die Homogenisierung der Proben wurde im Eisbad in einem Homogenisator nach POTTER-ELVEJEM durchgeführt. Das Homogenisat wurde erneut in flüssigen Stickstoff überführt.

Die Bestimmung der MDA- Konzentration der Proben erfolgte in Anlehnung an die Methode nach Wong et al. [317] in einem Mikromessansatz fluorimetrisch. Zu 50 µl des Homogenisats wurden jeweils 0,75 ml 70%ige Phosphorsäure, 0,45 ml Aqua dest. und 0,25 ml Thiobarbitursäure (TBA)- Lösung gegeben. Für eine Stunde wurden die Proben in geschlossenen Gefäßen bei 95°C im Wasserbad inkubiert und anschließend in Eiswasser abgekühlt. Danach wurden die so vorbereiteten Proben mit Methanol-NaOH im Verhältnis von 1:1 neutralisiert. Die Ansätze wurden dann 20 min bei 4°C im Kühlraum geschüttelt und zum Schluss in einer Ultrazentrifuge bei einer Beschleunigung von 1200 g zentrifugiert.

Darauf erfolgte die Separation der organischen Phase, die am Fluoreszenzspektrometer [Seite 49↓]RF - 551 (Shimadzu, Tokio, Japan; HPLC-Säulen: LC - 18 15cm/4,6mm/5µm, Supelco, Bellefonte, PA, USA; HPLC - Pumpe: Waters 510, Waters, Milford, MA, USA) bei einer Exzitationswellenlänge von 525 nm und einer Emissionswellenlänge von 550 nm gemessen wurde. Die Berechnung wurde auf Grundlage einer Eichkurve durchgeführt, die für Malondialdehydbisethylacetat (97%) im Bereich von 0 bis 25 nmol/ml (in Essigsäure gelöst) für jedes Experiment bestimmt worden war.

4.4 Intravitalmikroskopie

4.4.1 Technik

Die intravitale Fluoreszenz-Video-Mikroskopie (Intravitalmikroskopie, IVM; Abbildung 15) erfolgte mit folgender technischer Ausrüstung:

Epifluoreszenzmikroskop Axiotech Vario, Carl Zeiss, Jena, Deutschland

Lichtquelle HBO 50, Carl Zeiss, Jena, Deutschland

Okulare 10 x, Carl Zeiss, Jena, Deutschland

Objektiv - 10 x / 0,5; Fluar, Carl Zeiss, Jena, Deutschland (Übersichtsaufnahmen)

Objektiv - 20 x / 0,5; Achroplan, Carl Zeiss, Jena, Deutschland (Detailaufnahmen)

Filtersatz Nr. 20, Carl Zeiss, Jena, Deutschland (Anregung: BP 546/12; Frequenzteiler: 560; Emission: BP 575 - 640) für Beobachtungen mit Rhodamin 6G

Filtersatz Nr. 10, Carl Zeiss, Jena, Deutschland (Anregung: BP 450 - 490; Frequenzteiler: 510; Emission: BP 515 - 565) für Beobachtungen mit FITC-Dextran

Video Kamera: Panasonic WV 1850, Matsushita,Tokio, Japan

Videorecorder: Panasonic AG 6200, Matsushita,Tokio, Japan

Monitor: Philips LDH 2106/00, Philips, Eindhoven, Niederlande

Video Timer: VTG-22, For-A, Tokio, Japan

In der beschriebenen Konfiguration werden 250- bzw. 500fache Vergrößerungen erreicht.


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Abb. 15 : Versuchsaufbau Intravitalmikroskopie

Zuerst erfolgte die Markierung der Leukozyten mit Hilfe der intravenösen Gabe von 0,017 %igen Rhodamin-6G (Sigma, Deisenhofen, Deutschland; Lösungsmittel: NaCl 0,9 %). Im Beobachtungszeitraum wurden 2 Boli zu je 200 µl verabreicht. Dadurch wurde eine optimale Darstellung der Leukozyten erreicht.

Mittels Fokussierung wurde am Mikroskop die Submukosa des ausgelagerten Darmabschnittes eingestellt. Es wurden sieben Gesichtsfelder mit unverzweigten, über mindestens 300 µm gestreckt verlaufenden Venolen 1. Grades und sieben Gesichtsfelder mit ebensolchen Venolen 3. Grades (siehe Abb. 16) aufgesucht und für 30 - 60 s aufgezeichnet. Die Dauer der Mikroskopie für diesen Abschnitt betrug etwa 20 Minuten.

Danach erfolgte die Gabe von 200 µl einer 5 %igen FITC-Dextran-Lösung (Sigma, Deisenhofen, Deutschland; gelöst in NaCl 0,9 %). Durch die resultierende Kontrastanhebung des Plasmas ist eine Evaluierung des Kapillarstrombettes möglich. Aufgezeichnet wurden nach Fokussierung wiederum zehn Videosequenzen (30 s) mit Kapillaren der longitudinalen [Seite 51↓]Muskulatur und zehn Videosequenzen mit Kapillaren der zirkulären Muskulatur (Abbildung 16). Die Dauer der Mikroskopie für diesen Abschnitt betrug zusätzlich 8-10 Minuten.

Anschließend wurde das Darmlumen in einer Länge von 2 cm in Anlehnung an Bohlen et al. antimesenterial mit einem Mikrokauter eröffnet [28]. Hierbei wurden gefüllte Abschnitte bevorzugt, um eine Hitzealteration der gegenüberliegenden, mesenterialen Darmwand zu vermeiden [103]. Nach Spülung mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung wurde der Darm erneut auf eine Haltevorrichtung verbracht. Es wurden diejenigen Abschnitte der Mukosa untersucht, die direkt den mesenterialen Gefäßarkaden anliegen. Somit ist die größtmögliche Entfernung zu den Schnitträndern gewählt und eine Alteration dieser Mukosaabschnitte durch die Mikrokauterisierung am geringsten. Es wurden zehn Videosequenzen der Mukosakapillaren von 30 s Länge aufgezeichnet. Die Mikroskopiedauer betrug 8-10 Minuten. Die Gesamtmikroskopiezeit belief sich somit auf ca. 30 - 45 min. Die Auswertung aller Videosequenzen erfolgte off-line am Videomonitor. Folgende Parameter wurden analysiert:

4.4.2 Leukozytenadhärenz

Zur Auswertung gelangten jeweils sieben submuköse Venolen 3. Grades (V3) mit einem Durchmesser von 37,2 ± 5,5 µm und sieben Venolen 1. Grades (V1) mit einem Durchmesser von 70,8 ± 7,1 µm (MW ± SD; Abb. 16).

Flow temporär mit dem Endothel interagierender Leukozyten (Roller - Flow)

Definition: Anzahl von Leukozyten, die in einem Beobachtungszeitraum von 30 s einen selektierten Gefäßdurchmesser rollend passieren. Die Geschwindigkeit rollender Leukozyten liegt typischerweise bei ca. 50 µm/s [184].

Die Anzahl der temporär mit dem Endothel interagierenden Leukozyten wird an zwei unterschiedlichen Gefäßdiametern des jeweiligen Gefäßes ermittelt und der Mittelwert bestimmt.

[Roller - Flow] = Zellen/min


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Abb. 16 : Schema des Darmwandaufbaus; wesentliche Aufzweigungen der Arteriolen (A1 - A5) und Venolen (V1 - V4), Kapillaren der zirkulären (CC) und longitudinalen (LC) Muskulatur, MA: zentrale Villusarteriole mit Aufzweigung in zwei Verteilungsarteriolen (DA), PC: präkapilläre Sphinkteren, MC: Mukosakapillaren, 2VM: mukosale Venolen 2. Ordnung, CV: Villussammelvenole [103]

Adhärente Leukozyten (Sticker)

Definition:Anzahl der Leukozyten, die im Beobachtungszeitraum für mindestens 30 Sekunden an einer umschriebenen Endotheloberfläche haften. Für die Berechnung der Endotheloberfläche wird eine Zylinderstruktur des Gefäßes angenommen.

Zylinderfläche F = l x U

U = Zylinderumfang = π x d

d = Gefäßdurchmesser

l = Länge des Gefäßes

[Sticker] = Zellen / mm2

Unter Zuhilfenahme eines Objektmikrometers konnte am Monitor eine maßstabsgerechte Größen- und Längenbestimmung derjenigen Gefäße vorgenommen werden, in denen Leukozyten-Endothel-Interaktionen ausgewertet wurden.


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Abb. 17 : Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrolltier, Submukosa, obenliegend A1-Arteriole, darunter V1-Venole mit adhärierenden Leukozyten [L] markiert mit Rhodamin-6G)

Abb. 18 : Intravitalmikroskopie der Darmwand (Tier mit 5 mg/kgKG LPS, Submukosa, adhärierende Leukozyten [L] in V3‑Venolen, Markierung mit Rhodamin-6G)


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4.4.3  Funktionelle Kapillardichte

Definition: Die funktionelle Kapillardichte (FCD) errechnet sich aus der Länge der Kapillaren mit sichtbarer Erythrozytenperfusion (erkennbar als Hell- [FITC-Dextran-markiertes Plasma]/ Dunkel- [Erythrozyten] Kontrast) im Verhältnis zu einer umschriebenen Fläche.

Funktionslose Kapillaren: Kapillaren ohne sichtbare Erythrozytenperfusion / Kapillaren mit sichtbar stehenden Erythrozyten über eine Beobachtungszeit von mindestes 30 s

Die Auswertung erfolgte in den Schichten Lamina muscularis longitudinalis, Lamina muscularis circularis und Lamina mucosae.

Anwendung fand hierbei die im folgenden dargestellte manuelle Methode nach Schmid-Schoenbein et al. [253] unter Nutzung einer quadratischen Gitterschablone am Bildschirm. Sie ermöglicht die Ermittlung der FCD über die Ermittlung von Schnittpunkten perfundierter Kapillaren mit der Gitterschablone in einer "region of interest". Die FCD wird als Kapillarlänge je Gitterkästchen LK ausgedrückt.

FCD (LK)= k x N/L

L = 2 PMd = Länge des Gittersystems

d = Kantenlänge der Kästchen (in µm = Originallänge)

PM = Anzahl der Kästchen

N = Anzahl der Kreuzungen von perfundierten Kapillaren mit den Gitterlinien

k = Konstante , die durch π/2 beschrieben wird

[FCD] = cm/cm2 = cm-1

Jeweils zehn Regionen der Muskularisschichten mit einer Ausdehnung von 400 x 500 µm sowie zehn mukosale Kapillargebiete in einer Ausdehnung von ca. 100 x 150 µm (zentraler Villusbereich) wurden ausgewertet. Für die Kapillaren der Muskularis wurde ein Gitter der Kantenlänge von 50 µm und für die Kapillaren der Mukosa von 12,5 µm gewählt.


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Abb. 19 : Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrolltier, Muscularis circ., Kontrastierung der Kapillaren mit FITC-Dextran)

Abb. 20 : Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrolltier, Muscularis long., Kontrastierung der Kapillaren mit FITC-Dextran)


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Abb. 21 : Intravitalmikroskopie der Darmwand (Kontrolltier, Mukosa, Kontrastierung der Kapillaren mit FITC-Dextran)


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4.5 Laser-Doppler-Flowmetrie

Die Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF) wurde mit dem Gerät MBF 3D (Moore Instruments, Axminster, GB) durchgeführt. Das Gerät nutzte eine Laserdiode im nahen infraroten Frequenzbereich (810 nm; Leistung: 3 mW). Die Eichung erfolgte vor allen Messungen mit einer standardisierten Eichlösung (Lawrenz, Sulzbach, Deutschland) bei 20 °C. Über einen optischen Koppler wurde das monochromatische Laserlicht durch eine ummantelte Glasfaser (Faserdurchmesser: 0,42 mm, Manteldurchmesser: 0,7 mm; Länge: 80 cm) zum Gewebe geleitet. Der Lichtkegel hatte an der Sondenspitze einen Durchmesser von 0,42 mm. Die Restleistung des Lasers beträgt dort 1 mW. Die Sondenkonfiguration gewährleistete eine hohe Penetration des Gewebes, so dass die gesamte Darmwand erfasst wurde. Das reflektierte Licht wurde über die gleiche Glasfaser und einen Entkoppler dem Photodetektor im Gerät zugeführt. Die Messwerte wurden mit einer Abtastrate von 40 Hz über einen Zeitraum von 240 s bei einer Zeitkonstante von 0,1 s aufgezeichnet. Es wurde die Konzentration (Conc) und die mittlere Geschwindigkeit (Speed) der bewegten Teilchen (hauptsächlich Erythrozyten) im untersuchten Gebiet ermittelt [311]. Der berechnete Flux (intestinaler mikrovaskulärer Blutfluss, IMBF) zeigt eine lineare Korrelation zum totalen intestinalen Blutfluss [143]. Die Daten wurden über eine RS 232-Schnittstelle online auf einen IBM-kompatiblen PC (ESCOM, Heppenheim, Deutschland) übertragen und der weiteren Auswertung (Powerspektralanalyse) zugeführt.

4.6 Powerspektralanalyse

Die Software für die Powerspektralanalyse (PSA) von Blutdruck und Laser-Doppler-Flowmetrie wurde von Stauss et al. [280] entwickelt und freundlicherweise für die vorliegende Studie zur Verfügung gestellt.

Die Daten der IMBF-Messungen wurden für die Analyse in das ASCII-Format überführt. Bei einer Abtastrate von 40 Hz und 240 Sekunden Aufzeichnungslänge resultierten 9600 Messwerte. Zur Überprüfung auf Kontinuität und zur Identifizierung von Artefakten wurden die Primärdaten visuell kontrolliert. Die Artefakte wurden aus den [Seite 58↓]Sequenzen eliminiert. Bei einer Unterschreitung der kritischen Aufzeichnungslänge von 210 Sekunden wurden die Datensätze verworfen.

Nach der visuellen Inspektion der Daten erfolgte zunächst die Entfernung von linearen Trends (Hochpassfilter; 50 mHz) und eine Bandbegrenzung der Zeitreihen (Tiefpassfilter; 3 Hz). Diese bandbegrenzten Daten wurden dann mit 6 Hz erneut abgetastet.

Die Spektren wurden mit der Methode der Autoregressionsanalyse berechnet [222; 224; 281]. Die quantitative Auswertung der Powerspektren erfolgte im Frequenzbereich von 0 bis 3 Hz. Dazu wurden in Anlehnung an Julien et al. [148] die Flächen unter der Kurve des Powerspektrums in den Frequenzbereichen 0,27 – 0,74 Hz (low frequency; LF) und 0,76 – 3 Hz (high frequency; HF) ermittelt (siehe Abbildung 22).

Die Flächen unter der Kurve zum Zeitpunkt 0 h wurden als 100 % angesetzt. Die Flächen unter der Kurve zu den folgenden Zeitpunkten wurden auf den Zeitpunkt 0 h bezogen, so dass z.B. ein Anstieg der spektralen Leistungsdichte auf das Doppelte als 200 % angegeben wird.

Abb. 22 : Ausgewertete Frequenzbänder im IMBF-Powerspektrum der Ratte (FU = flux units)


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Abb. 23 : IMBF - Originalaufzeichnung und Powerspektrum, Normalbefund (FU = flux units)


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Abb. 24 : IMBF - Originalaufzeichnung und Powerspektrum, Endotoxinämie (FU = flux units)


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4.7  Statistik

Für die statistische Analyse und Darstellung der Ergebnisse wurden die Statistikpakete SigmaStat/SigmaPlot und SPSS (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA) benutzt. Zunächst wurde eine deskriptive Statistik erstellt (Mittelwert, Varianz, Standardabweichung, Standardfehler). Die Testung auf Normalverteilung erfolgte nach Kolmogorov-Smirnov.

Lag eine Normalverteilung vor, erfolgte der einfaktorielle Mittelwertvergleich unabhängiger Stichproben (1 Variable, mehrere Gruppen) mittels Ein-Weg-Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA). Bei Auftreten von Signifikanz erfolgte die post hoc–Testung mit einem nach Bonferroni korrigierten t-Test.

Waren die Daten nicht normalverteilt, wurde eine nichtparametrische Varianzanalyse (Kruskal-Wallis) mit nachfolgendem nach Bonferroni korrigiertem Wilcoxon-Test vorgenommen.

Bei mehrfaktoriellem Design (wiederholte Messungen, mehrere Gruppen) führten wir eine Zwei-Weg-Varianzanalyse mit Messwertwiederholung (two-way repeated measures-ANOVA) mit anschließendem Scheffé-Test durch.

Das Signifikanzniveau wurde bei p<0.05 angesetzt. In den Diagrammen sind die Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt.


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18.01.2005