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1  Einleitung

1.1 Die klinische Lebertransplantation – aktueller Stand

Die orthotope Lebertransplantation (LTx) ist mittlerweile ein etabliertes Therapieverfahren zur Behandlung von im Endstadium befindlichen oder weit fortgeschrittenen, irreversiblen Lebererkrankungen [1]. Bei den zugrunde liegenden Erkrankungen handelt es sich im Einzelnen um fortgeschrittene Leberzirrhosen bei Virushepatitiden, nutritiv-toxisch induzierter (Alkohol-induzierte) Leberzirrhose, primär biliärer Zirrhose, wie auch sekundär sklerosierender Cholangitis, Budd-Chiari-Syndrom, sowie bei primären Lebertumoren in frühem Stadium [1, 2]. Weiterhin kommen als Indikation das akute Leberversagen (Toxine, Medikamente oder viral bedingt) und angeborene Stoffwechsel- (z.B. M. Wilson) und Lebererkrankungen (z.B. Zystenleber) bzw. Agenesie von Gallengängen teilweise insbesondere im kindlichen Alter in Betracht.

Die aktuellen Ergebnisse der Lebertransplantation sind angesichts der Schwere des Ausgangszustandes hervorragend: Die 1-Jahresüberlebensrate liegt bei deutlich über 80%, die 5-Jahresüberlebensrate beträgt über 70%, wobei die Ausgangssituation ein wesentliches Kriterium hierfür darstellt. Die aktuellen Daten aus der Chirurgischen Klinik des Virchow-Klinikums Berlin zeigen noch höhere Überlebensraten auf (siehe Grafik auf der nächsten Seite) und unterstreichen diese äußerst erfolgreiche Therapie der Leberzirrhose bzw. der oben angegebenen Erkrankungen [3, 4, 5, 6].


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Abb. 1 : Die Überlebensdaten für alle Empfänger und Organe aller durchgeführten Lebertransplantationen der Chirurgischen Klinik der Charité Campus Virchow Klinikum 1/1989 – 12/2003.

Diese Überlebensraten waren nicht von Anfang an so hervorragend. Die erste klinische Lebertransplantation wurde am 1. März 1963 in Denver, CO, USA, von Thomas E. Starzl durchgeführt. Innerhalb der ersten Phase der klinischen Entwicklung der Transplantationsmedizin von etwa 15 Jahren betrug die 1-Jahres-Überlebenszeit nur 30% [7]. In den folgenden 15 Jahren konnte jedoch die Überlebensrate dramatisch gesteigert werden, was auf verschiedenen Säulen begründet ist: Zum einen ist die Entwicklung von neuen immunsuppressiven Substanzen zu nennen, insbesondere stellt die klinische Anwendung von Cyclosporin A und Tacrolimus einen Meilenstein in der Transplantationsmedizin dar. Zum anderen wurden optimierte Substanzen zur Organkonservierung entwickelt [8, 9] und das perioperative Management wurde optimiert [10]. Prinzipiell kann die Lebertransplantation heute als ein standardisiertes Routineverfahren gelten, welches schwerstkranken Patienten eine sehr hohe Chance zu einem Weiterleben mit hoher Lebensqualität bietet. Eine sinnvolle Alternative zu diesem Eingriff existiert derzeit nicht.


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Trotz aller Erfolge in der Transplantationsmedizin in den vergangenen 40 Jahren bestehen weiterhin Schwierigkeiten, welche Morbidität bzw. Mortalität für die Empfänger bedeuten können:

Die aktuelle Situation der klinischen Lebertransplantation weltweit wird von dem Dauerproblem des Organmangels [11] geprägt. Patienten versterben auf der Warteliste bevor ein geeignetes Spenderorgan zur Verfügung steht [12]. Dies hat dazu geführt, dass auch marginale („schlechte“) Organe transplantiert werden müssen, welche sich in erster Linie durch Verfettung oder auch Zirrhose auszeichnen, die wiederum überwiegend durch chronischen Alkoholkonsum hervorgerufen wird [13]. Diese verfetteten Spenderlebern stellen eine der Hauptursachen für das frühe Transplantatversagen dar [14, 15] etwa ein Drittel der möglichen Spenderorgane [16, 17] sind verfettet. Etwa ein Fünftel der möglichen, angebotenen Organe werden derzeit hauptsächlich wegen Verfettung abgelehnt [18, 19].

Der Organmangel verbunden mit dem Tod auf der Warteliste erfordert neue chirurgische Konzepte: Eine neue Entwicklung der vergangenen 15 Jahre stellt die Teilung der Organe (split liver transplantation) dar [20, 21]. Dabei wird in aller Regel ein größerer rechter Leberlappen einem erwachsenen Empfänger und ein kleiner linker Leberlappen einem Kind implantiert. Eine weitere neue Entwicklung, quasi eine Weiterentwicklung der split livers, stellt die living related donor liver transplantation (Leberlebendspende-Lebertransplantation) dar [22, 23]. Dabei wird vor allem für die pädiatrischen, aber auch zunehmend für erwachsene Empfänger dem meist verwandten Organspender (in der Regel ist es ein Elternteil) ein Teil seiner Leber entfernt. Es handelt sich in der Regel um den linken Leberlappen bzw. Segment 2/3 bei Kindern als Empfänger und um den rechten Leberlappen bei erwachsenen Empfängern [24, 25]. Diese Technik hat vor allem in den Ländern Verbreitung gefunden, in denen die Organentnahme bei hirntoten Spendern aus religiösen Gründen problematisch ist (z.B. Japan), sie wird aber auch in zunehmender Weise in Europa und den USA durchgeführt [Seite 12↓][26]. Auch diese Organempfänger und auch Spender (!) unterliegen einer signifikanten Morbidität und Mortalität, da das verbleibende Lebergewicht grenzwertig klein ist und zusätzliche Störungen wie zum Beispiel Reperfusionsschäden zum Organversagen führen können [27]. Weiterhin gelten Komplikationen beim Empfänger wie insbesondere Thrombosen der arteriellen Gefäßversorgung oder aber Leckagen der Gallengangsanastomosen wie auch Galleleckagen aus der Resektionsfläche der Leber als nicht selten und führen zu Morbidität oder sogar Organverlust. Gerade das Risiko für den gesunden Organspender führt in der medizinischen Öffentlichkeit und den Fachverbänden zu intensiven Diskussionen hinsichtlich der ethischen Aspekte dieses Verfahrens [28, 29, 30, 31, 26, 32].

1.2 Die Pathophysiologie des Ischämie/Reperfusionsschadens nach Organischämie

1.2.1 Faktoren des primären Organversagens:

Eine objektive und verläßliche Risikoabschätzung für ein Transplantatversagen ist derzeit nicht möglich [33, 34, 35, 36, 37, 15, 38, 39, 19, 18]. Die Angaben über die Häufigkeit von primären Transplantatversagen (PNF = primary nonfunction) nach LTx sind in der Literatur nicht einheitlich (2-23%), jedoch ist die Folge dessen in Form von Retransplantation oder aber Tod des Empfängers eindeutig charakterisiert [40, 41]. Dies erläutert die Notwendigkeit nicht nur besserer Evaluationsmöglichkeiten sondern insbesondere von Protektionsverfahren der Spenderorgane.

Bei dem primären Transplantatversagen nach Lebertransplantation handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, bei dem der Summation der schädigenden Einflüsse während der Spenderleberentnahme, Konservierung und Organreperfusion eine wesentliche Bedeutung zukommt. Die Ausprägung dieses Schadens ist abhängig von der kalten und warmen Ischämiezeit, der Konservierungs- und Reperfusionsart, welche hinsichtlich geeigneter [Seite 13↓]Konservierungslösungen standardisiert ist, jedoch Ausspüllösung und Reperfusionsart eine große Variationsbreite zeigen. Es besteht eine enge Korrelation des Reperfusionsschadens zu vorbestehender Schädigung, besonders bei Verfettung des Spenderorgans [34, 42, 43]. Technische Probleme, welche zum frühen Transplantatversagen führen können, sind insbesondere Gefäßverschlüsse, wie die Thrombose der Arteria hepatica.

1.2.2 Das multifaktorielle Geschehen Ischämie/Reperfusionsschaden:

Alle zu transplantierenden Organe müssen vom Zeitpunkt der Organentnahme bis zur Implantation konserviert werden. Im Rahmen der ersten Transplantationsversuche wurden die Organe gekühlt, was in den 50er Jahren praktiziert wurde. Daran schloß sich eine lange Phase der Experimente mit Konservierungslösungen an, bis schließlich Mitte der 80er Jahre die heute weit verbreitete University of Wisconsin Konservierungslösung in den klinischen Alltag mit großem Erfolg eingeführt wurde [8, 9]. Nur wenige andere Lösungen haben auch Eingang in die klinische Anwendung gefunden (HTK-Bretschneider-Lösung, Eurocollins- und Celsior-Lösung) [44, 45], die UW-Lösung dominiert bei der Anwendung für die Lebertransplantation. Der weltweite Organmangel und die daraus entstandene Notwendigkeit jedes mögliche Organ auch zu implantieren führt zu dem zentralen Interesse und Forschungsschwerpunkt höchster Priorität, Strategieen zur Minimierung der negativen Auswirkungen der Organischämie in klinischen und experimentellen Studien weiter zu entwickeln. Zunächst sollte man 3 verschiedene Formen der Organischämie, die kalte, die warme und die der Wiedererwärmung unterscheiden. Die kalte Ischämie entsteht bewußt im Rahmen der Organtransplantation, um die metabolischen Prozesse zu minimieren. Die warme Ischämie entsteht im Rahmen von Trauma, Schock, Leberchirurgie (Pringle Manöver) und Transplantation. Die Phase der Ischämie unter Wiedererwärmung von kalt nach warm entsteht im Rahmen der Manipulation am Organ (zum Beispiel ex situ split Leberpräparation) und in der Phase der Implantation vor Freigabe der Blutgefäße. In dieser Arbeit liegt der Focus auf den Bedingungen der [Seite 14↓]Lebertransplantation und somit der kalten Ischämie und der Phase der Wiedererwärmung. Die Schädigung der Hepatozyten tritt vor allem dann auf, wenn der Blutfluß mit der Sauerstoffversorgung wieder freigegeben wird. Nach kalter und warmer Ischämie und anschließender Reperfusion der Leber werden vor allem Sinusendothelzellen (SEC) irreversibel geschädigt [46, 47]. SEC spalten sich von der Gefäßwand ab, verändern ihr Zytoplasma, das Zytoskelet, die extrazelluläre Matrix und prolabieren in das sinusoidale Lumen [46],[48]. Somit wird das Endothel in seiner Integrität zerstört mit der Folge, dass Leukozyten und Blutplättchen adhärieren können und somit zu Mikrozirklationsstörungen führen [49, 50, 51]. Dabei korreliert die Länge der kalten Ischämie mit dem Ausmaß des Flurschadens bei den Endothelien [52]. Die Adhäsion der Blutplättchen an SEC induziert die Apoptose dieser im Rahmen der Reperfusion nach kalter Ischämie, wobei der Sauerstoffradikalformation eine wesentliche Bedeutung zukommt [53, 54].

Die Parenchymzellen der Leber hingegen erscheinen gegenüber Reperfusionsschäden weitgehend gut geschützt zu sein [55, 48, 56], sie werden vor allem erst sekundär durch Mangelversorgung und den Einfluß von Entzündungsmediatoren sowie infiltrierende Leukozyten geschädigt. Diese Aussage trifft für die kalte Ischämie zu. Eine wichtige Rolle zu Beginn der Pathomechanismen des Reperfusionsschadens kommt der Bildung von freien Sauerstoffradikalen zu [57, 58, 59, 60]. Freie Radikale sind in der Lage, mit den meisten biochemischen Komponenten der Zelle zu reagieren. Ein Hauptangriffspunkt liegt in der Reaktion mit Lipidkomponenten der Zellmembran, es kommt zu einer Schädigung mit erhöhter Permeabilität, bis hin zur Lyse der Zellen [61]. Aktivierte Kupfferzellen stellen initial nach Reperfusion eine Hauptquelle für toxische Sauerstoffradikale dar, deren Freisetzung wiederum weitere Entzündungsmediatoren wie zum Beispiel TNFα und IL-1 stimuliert [62]. Bereits wenige Minuten nach Reperfusion können pathologisch erhöhte Konzentrationen an Sauerstoffradikalen im zirkulierenden Blut nachgewiesen werden. Radikale entstehen im Zytochrom-P450-Metabolismus und beim Abbau von Hypoxanthin zu [Seite 15↓]Xanthin im Purinstoffwechsel [63, 64]. Erst in einer späteren Phase, mehrere Stunden nach Reperfusion, kommt es zur Freisetzung von toxischen O2-Radikalen aus Leukozyten. Aber auch aktivierte Endothelzellen setzen toxische Radikale frei [65]. Eine ganze Reihe von Mediatoren, wie z. B. Zytokine oder Eikosanoide, werden bei vermehrter Bildung von freien Radikalen aktiviert. Freie Radikale erhöhen den intrazellulären Ca2+-Spiegel und verstärken Leukozytenadhäsion nach Ischämie und Reperfusion durch die Aktivierung von Adhäsionsmolekülen. Andererseits kommt es bei Aktivierung von Mediatoren wiederum zur vermehrten Bildung von freien Radikalen, es handelt sich um einen Circulus vitiosus. Die Entstehung von freien Radikalen beim Reperfusionsschaden wurde bisher mittels Xanthin- und Hypoxanthin-Akkumulation [66] sowie durch Elektronenspinresonanz-spektroskopische Untersuchungen von Ausspüllösungen vor Reperfusion der Organe oder durch Untersuchung von reperfundierten Blutproben nachgewiesen [57, 67, 68, 69].

Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Bildungsrate freier Radikale in der Leber und der Ischämiezeit, sowie der Reperfusionsart. Außerdem bestehen Korrelationen zwischen der Bildung freier Radikale und 1.) dem Schädigungsgrad nicht parenchymatöser Zellen, vorwiegend Sinusendothelzellen und 2.) den Veränderungen der Mikrozirkulation, 3.) der primären Galleproduktion und 4.) der Häufigkeit primären Transplantatversagens [70, 71, 72, 73].

Insgesamt wird die Radikalbildung als essentielles Schlüsselereignis für den Reperfusionsschaden angesehen. Auf Grund der bestehenden Erkenntnisse über die pathophysiolgischen Abläufe bei Organreperfusion nach einer Ischämie ist es naheliegend, dass ein Organ-protektiver Effekt sowohl durch Reduktion der freien Radikalbildung, als auch durch Einsatz von Radikalfängern aufgezeigt werden konnte [74, 75]. Bei der Lebertransplantation kann der Reperfusionsschaden durch Ausspülen des Transplantates vor Reperfusion mit einer protektiven Lösung (zum Beispiel Carolina Rinse), welche auch [Seite 16↓]Radikalfänger enthält, signifikant vermindert werden [76, 77]. Auch in einer klinischen Studie wurde ein Vorteil durch den Einsatz dieser Spüllösung gesehen [78]. Diese Erkenntnisse unterstützen die zentrale Bedeutung freier Sauerstoffradikale für den Reperfusionsschaden.

1.2.3 Leukozyten-Endothelinteraktion – Mikrozirkulationsstörungen:

Direkt nach Reperfusion kommt es zur Akkumulation von Leukozyten und Thrombozyten in den Lebergefäßen [79], zu einer vermehrten Leukozyten-Endothel Interaktion in postsinusoidalen Venolen vermittelt durch eine Kaskade diverser Adhäsionsmoleküle, zu einer verstärkten intravasalen Koagulation [72] und zu einer Störung der Mikrozirkulation in den Lebersinusoiden auf Grund verschiedener mechanischer Ursachen, die zu einem Verschluß einzelner Sinusoide oder sogar ganzer Azini, sowie Akkumulation von Leukozyten führen [80, 81]. Zu diesen mechanischen Ursachen zählen neben der intravasalen Koagulation vor allem das Anschwellen bzw. Ödem der Endothelien sowie der Kupfferzellen. Auch aktivierte Myozyten sollen zur mechanischen Komponente der Mikrozirkulationsstörungen beitragen. Die Akkumulation von Leukozyten in Sinusoiden der Leber ist aber nicht auf eine Leukozyten-Endothelinteraktion zurückzuführen, da das essentielle Adhäsionsprotein P-Selektin nicht vom Sinusendothel exprimiert wird und somit eine Adhäsion von Leukozyten an das Endothel hier im Gegensatz zu Venolen nicht stattfinden kann [82, 83]. Als initialer Stimulus für diese pathophysiologischen Vorgänge werden Entzündungsmediatoren angesehen, wobei auch hier den toxischen Sauerstoffradikalen eine entscheidende Bedeutung zugemessen wird [84, 85]. Die beschriebenen pathophysiologischen Vorgänge der mikrozirkulatorischen Störungen wurden bei verfetteten Organen in deutlich ausgeprägterer Weise aufgezeigt [86].

1.2.4 Die Auswirkung der Leberverfettung auf das potentielle Spenderorgan:

Je nach dem Grad der Leberzellverfettung des Spenderorgans kommt es vermehrt zum Auftreten von PNF [87]. Das Ausmaß der Leberzellverfettung bei Spenderorganen zur [Seite 17↓]Lebertransplantation wird uneinheitlich gewertet und es besteht bis heute keine Einigkeit darüber, bis zu welchem Grad der Verfettung und unter welchen Bedingungen eine Spenderleber für eine erfolgreiche Transplantation verwendet werden kann [87]. Das Ausmaß, aber auch die Art der Verfettung, klein- oder großtropfig, das Vorliegen von hydropischer Zelldegeneration und zentrilobulären Nekrosen wirken sich unterschiedlich auf die Widerstandsfähigkeit gegenüber hypoxischer Schädigung aus.

Alkohol geschädigte Lebern zeigen nicht nur metabolische Veränderungen, sondern auch Störungen der Mikrozirkulation, welche mit Hypoxie einhergehen kann [88]. Durch chronischen Alkoholkonsum kommt es zu einer veränderten bakteriellen Darmkolonisation und einer erhöhten Permeabilität der Darmwand, welche zu einer chronischen Endotoxinämie führt [89]. Dies wiederum stellt eine weitere Ursache für die Leberschädigung dar, da durch Endotoxin aktivierte Kupfferzellen mit einer vermehrten Zytokinfreisetzung, wie auch O2-Radikalbildung reagieren [90]. Somit zeigen sich bei Alkoholkonsum ischämietypische pathologische Veränderungen der Leber, welche bei diesem Organ bereits vor einer Ischämie chronisch eingetreten sind [91, 92]. Jedoch trifft der Umkehrschluß nicht zu, dass vermehrter Alkoholkonsum zu einer gesteigerten Ischämietoleranz bei diesen Organen führen würde, diese Folgerung ist leider falsch.

In Spenderlebern mit höhergradiger Verfettung wurde bei der experimentellen Lebertransplantation eine vermehrte Bildung von freien Radikalen, vermehrte Zellschäden, Veränderungen der Mikrozirkulation und verminderte Galleproduktion gegenüber normalen Spenderorganen als Ausdruck signifikant höherer Anfälligkeit gegenüber Ischämie- und Reperfusionsschäden beobachtet [93]. Ebenfalls signifikant erhöht sind die Leukozytenadhäsion und der Phagozytoseindex als Ausdruck eines aktivierten Immunsystems [78]. Gering bis mäßig ausgeprägte Zellverfettung in Spenderorganen scheint dagegen keinen signifikanten Einfluß auf das Überleben nach Lebertransplantation zu haben [94]. Es konnte [Seite 18↓]auch nachgewiesen werden, dass mit zunehmender Ischämiedauer in Fettlebern nicht nur SEC, sondern in weit ausgeprägterem Maße die Hepatozyten direkt geschädigt werden [95].

1.3 Aktuelle Therapieansätze zur Vermeidung des I/R-Schadens:

Es wurden in den vergangenen Jahrzehnten viele Strategien zur Vermeidung des Reperfusionsschadens propagiert, welche im Folgenden dargestellt werden. Zuvor werden diese therapeutischen Möglichkeiten in 3 Gruppen unterschieden: 1. chirurgische Maßnahmen, 2. pharmakologische Substanzen, und 3. gentechnologische Therapieverfahren. Diese Therapieansätze werden im Folgenden angesprochen:

1.3.1 Chirurgische Maßnahmen:

Hierzu zählt in erster Linie das sogenannte Preconditioning, die Präkonditionierung der Leber. Dabei unterscheidet man zwischen der ischämischen Präkonditionierung und dem intermittierenden Abklemmen der Leber [96]. Die ischämische Präkonditionierung besteht aus einer kurzen Phase der warmen Ischämie gefolgt von einer Phase der Reperfusion vor Beginn der eigentlichen Ischämie-Phase [97]. Im klinischen Einsatz versteht man darunter eine komplette vaskuläre Okklusion der Leber zum Beispiel mittels Gummizügel um das hepatoduodenale Band mit einer Dauer von ca. 10-15 min und einer Reperfusionssphase von ca. 15 min [98]. Der zugrunde liegende Mechanismus der Protektion wird folgendermaßen erklärt: Die „Abwehrkräfte“ der Zellen des Organes werden durch einen harmlosen Reiz getriggert und aktiviert, Abwehrmechanismen gegen die identische oder ähnliche Art von Schädigungsmechanismus zu etablieren bzw. zu stimulieren [99]. Trotz vieler experimenteller und erster klinischen Studien bleibt der Mechanismus auf der zellulären Ebene zu großen Teilen unbekannt. Verschiedene Mediatoren wurden gefunden, welche eine entscheidende Rolle bei dieser Therapieform spielen könnten. Dazu zählen das Adenosin [97, 100], Stickstoffmonoxid [97], oxidativer Stress, die sogennanten Heat Shock Proteine (HSP), [Seite 19↓]darunter insbesondere HSP 72 und Heme Oxygenase I (HSP 32) [101], sowie TNF-α [102, 97]. TNF-α initiiert die Apoptose in Hepatozyten und Sinusendothelzellen [103]. Verschiedene proapoptotische Proteine werden während der Reperfusionsphase aktiviert, welche schließlich zum Zelltod führen. Neben der Apoptose, dem programmierten Zelltod, führt die postischämische Nekrose zum massenhaften Zelltod. Die Grenze zwischen Nekrose und Apoptose erscheint nicht eindeutig zu sein [104, 105]. Durch die Präkonditionierung wird die Apoptose in weit geringerem Maße angeregt. Die Morphologie des Parenchymes bleibt in einer Studie intakt und die Lebertransaminasen im Serum steigen nach langer Ischämie bei Weitem nicht so hoch an wie in der Kontrollgruppe. Von Peralta wurde in einem Model der warmen hepatischen Ischämie die Aktivierung der NO-Synthase durch Adenosin als wichtiger Mechanismus der Präkonditionierung beschrieben [97, 100]. NO kann die Apoptose durch direkte Blockade von Caspasen vermindern. Ein weiterer Ansatz der ischämischen Präkonditionierung mag darin bestehen, dass durch die kurzzeitige Ischämie ein geringer oxidativer Stress entsteht, welcher mit zelleigenen Möglichkeiten überlebt werden kann [54]. Dadurch werden diese natürlichen, zelleigenen Abwehmechanismen hochreguliert und können nun so effektiv dem eigentlichen ischämischen, eventuell lethalen Geschehen begegnen. Zu diesen hochregulierten Protektionsmechanismen auf zellulärer Ebene gehören Protein Kinase C, AMP-aktivierte Protein Kinase, p38 Mitogen aktivierte Proteinkinase, IK Kinase und die Aktivierungsmöglichkeit von Transkriptionsfaktor I [104, 106]. Alle diese Faktoren führen zu einer Zytoprotektion basierend auf der Hemmung des Zelltodes, Aktivierung von antioxidativen Mechanismen und dem Eintritt in den Zellzyklus [107].

Extrakorporale Perfusionssysteme, welche die Durchblutung der explantierten Leber unter physiologischen Konditionen ex vivo sicherstellen, können die Integrität und Funktion der Leber schützen und somit den Ischämie/Reperfusionsschaden weitgehend verhindern [108]. Die Organe können somit bis zu 72 Stunden transplantabel gehalten werden [109]. Aus [Seite 20↓]Gründen der Praktikabilität und Logistik haben diese Maschinen jedoch keinen Eingang in den transplantationschirurgischen Alltag gefunden.

Die hypertherme Präkonditionierung stellt eine weitere experimentelle Form der Organvorbereitung zur Ischämie und nachfolgenden Reperfusion dar [110]. Die Hyperthermie führt zur Induktion der intrazellulären Streßproteine (vor allem HSP 70) [111]. Die Hochregulation dieses Proteins in Verbindung mit Heme Oxygenase 1 führt zur gesteigerten Resistenz der Leber und anderer Organe gegenüber der Ischämie [112]. Auch diese Technik hat mangels Praktikabilität bisher keinen Eingang in den klinischen Alltag gefunden.

1.3.2 Pharmakologische Strategien

Eine große Anzahl an verschiedenen Substanzen wurde hinsichtlich der Möglichkeiten zur Verhinderung des Reperfusionsschadens untersucht. Dabei ist es das Ziel, entweder die schädigenden Reaktionen in der Zelle zu unterbrechen, oder aber eine pharmakologisch induzierte Präkonditionierung hervorzurufen. Die Substanzen lassen sich grob in mehrere Gruppen einteilen, welche nun im Detail aufgeführt werden.

Antioxidantien: Wie bereits oben erläutert stellt die Kupfferzelle initial nach Aktivierung durch Ischämie und Reperfusion die Hauptquelle für die Produktion und Freisetzung von toxischen Sauerstoffradikalen dar [59, 58, 113]. Radikale werden außerdem in Makrophagen, Leukozyten und in Hepatozyten selbst gebildet [114]. Weiterhin werden Radikale intrazellulär im Zytosol und in den Mitochondrien gebildet [115]. Hierzu zählen auch die hochtoxischen Hydroxyl-Radikale, welche insbesondere die DNA-Struktur in Mitochondrien angreifen, verändern und zerstören [116]. Weiterhin zerstören Radikale die Zellmembranen durch Lipidperoxidation [117]. In der Leber sind toxische Radikale wesentlich an der Apoptose von Hepatozyten und Endothelzellen beteiligt [118]. Der oxidative Stress führt zur Steigerung der mitochondrialen Membranpermeabilität, ein initialer und entscheidender Schritt beim programmierten Zelltod [119]. Weiterhin aktivieren niedrigen Dosen von [Seite 21↓]Sauerstoffradikalen die Caspasen, hohe Konzentrationen jedoch hemmen sie [120]. Somit kann erklärt werden, warum Radikale im Überangebot die Apoptose hemmen, die Nekrose somit jedoch verstärken. Basierend auf diesen erläuterten Mechanismen erscheint es sinnvoll zu sein, eine antioxidative Therapie mittels antioxidativen Substanzen durchzuführen.

Hierzu kann man nun zwischen Therapieansätzen unterscheiden, welche akut das intrazelluläre oder interzelluläre Angebot an antioxidativen Substanzen erhöhen, bzw. solchen Strategien, welche die natürlichen Abbaumechanismen von Radikalen in der Zelle stimulieren. Bei den extern zugeführten Substanzen handelt es sich in der Regel um Sauerstoffradikalfänger, welche quasi als eine medikamentöse Therapie gelten. Radikal-fangende Medikamente werden für viele Erkrankungen eingesetzt, sodass etablierte Medikamente auch im Rahmen des Ischämie-/Reperfusionsschadens untersucht wurden. Diese Substanzen wurden in verschiedenen Experimenten vor Spender-Organentnahme oder aber vor oder während Reperfusion im Empfänger appliziert, um einem vermehrten Anfall von Radikalen begegnen zu können. Beispielhaft werden bisher durchgeführte medikamentöse Therapieansätze aufgelistet: Acetylcystein, Adenosin, Albumin, Corticosteroide, Cyclosporin, Diclophenac, Ebselen (Selen-haltige Substanzen), FK506, γ-Glutamylcystein-Ethyl-Ester, Glycin, Grün-Tee-Extrakt, Melatonin, PGI2, Superoxiddismutase, Catalase, Trimetazidin und viele andere Substanzen. Keine dieser Substanzen hat einen definitiven Eingang in den klinischen Alltag weltweit gefunden. Die Substanzen wurden alle in verschiedenen Tiermodellen in unterschiedlichen Versuchsdesigns untersucht und konnten jeweils unter eindeutig definierten, standardisierten Versuchsbedingungen protektive Eigenschaften aufweisen. In der humanen Situation scheint dies jedoch nicht möglich zu sein. Keine der o.g. Substanzen konnte bis zum heutigen Stand nach Organtransplantation eine definitiv nachweisbare Verminderung des Reperfusionsschadens und damit verbundene verbesserte Organfunktion erzielen. Jedoch ist diese Aussage einzuschränken, da es eine Ausspüllösung der Leber gibt, genannt “Carolina [Seite 22↓]Rinse Solution”, mit welcher das Organ vor Reperfusion gespült wird, welche auch unter klinischen Bedingungen eine Verbesserung der Organfunktion aufzeigen konnte [121, 77, 71, 122, 123, 124]. Trotz eindeutig positiver klinischer Studien hat diese Lösung keine weite Verbreitung und obligatorische Anwendung gefunden [124].

Auch Pentoxyphyllin ist ein Medikament, welches experimentell gute Ergebnisse zur Vermeidung des Reperfusionsschadens aufzeigen konnte. Dabei handelt es sich um eine Methylxanthin-Verbindung, welche zu den Standardmedikamenten in der Therapie peripherer vaskulärer Erkrankungen gehört. Pentoxyphyllin führt zu einer reduzierten Synthese von TNFα und Sekretion in verschieden Organen [125]. In der Leber wird vor allem die Kupfferzell-Aktivierung reduziert, was im Endeffekt zu einem verminderten Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation in der Ratte führt [126, 127]. Zudem führt Pentoxyphyllin zu einer verbesserten Mikrozirkulation, Effekte welche den klinischen Einsatz in der Angiologie rechtfertigen [128]. Jedoch konnte auch bei diesem Präparat bisher kein positives Ergebnis in der Anwendung in der humanen Situation nach Organtransplantation erhalten werden.

Auch Prostaglandine konnten im Tierversuch einen positiven Effekt auf die Verminderung des Ischämie/Reperfusionsschadens aufzeigen, indem sie die Mikrozirkulation verbessern und außerdem zytoprotektiv wirken [126, 41, 129]. Systemische Nebenwirkungen verhindern jedoch die therapeutische Gabe nach Organtransplantation im Menschen [130].

1.3.3 Gentechnologische Therapieverfahren:

Alle bisher angeführten Therapieansätze hatten nicht zu dem definitiven, überragenden Erfolg geführt, welcher einen alltäglichen Einsatz in der klinischen Lebertransplantation rechtfertigen würde. Wie oben bereits ausgeführt ist es eindeutig nachgewiesen, dass die Bildung von toxischen Sauerstoffradikalen im Zentrum des pathophysiologischen Geschehens des Ischämie/Reperfusionsschadens steht. Wie oben angeführt, konnten peripher wirksame [Seite 23↓]Medikamente, welche überwiegend als Radikalfänger fungieren sollten, nicht als überzeugend therapeutisch wirksam identifiziert werden. Folglich erscheint es erfolgversprechend zu sein, diejenigen Proteine zu applizieren, welche im physiologischen Bereich die Sauerstoffradikale abbauen. Hierzu wurden bereits in den vergangenen 12 Jahren erste Versuche durchgeführt, welche zumindest partiell positive Ergebnisse für den Einsatz von Superoxiddismutase in experimentellen Modellen zeigten [131, 132, 133, 134, 135]. Dabei handelt es sich um Modelle der warmen und kalten Ischämie von Leber, Niere und Herz im Transplantationsmodell. Eine erste Pilotstudie in der klinischen Nierentransplantation ergab hingegen kein positives Ergebnis [136]. Bereits um 1990 wurden von W. Land und Mitarbeiter erste klinische Studien durchgeführt, welche einen protektiven Effekt hinsichtlich des postoperativen Organversagens und der Rejektion durch Gabe von rekombinanter, humaner Superoxiddismutase nach Nierentransplantation vermuten ließen [137]. Jedoch konnten diese teils ansatzweise positiven Ergebnisse nicht dazu beitragen, dass sich die Substanz im klinischen Einsatz außerhalb von Studien durchsetzen konnte. Die intravenöse Gabe von Proteinen, welche dazu auch noch körperfremd waren, wurde hinsichtlich der Effizienz sehr kritisch beurteilt. Als wesentliche Kritikpunkte sind anzumerken, dass 1.) extern in den Blutstrom zugeführte Proteine innerhalb von Minuten durch Proteasen abgebaut werden. 2.) Die antioxidativen Enzyme, hier die Superoxiddismutase, befinden sich im extrazellulären Milieu. Somit kann die extern zugeführte SOD (wie auch andere Radikalfänger) nicht den intrazellulären Raum erreichen. Folglich können die extern zugeführten Proteasen nicht am Hauptort des pathophysiologischen Geschehens angreifen bzw. hier die toxischen Radikale neutralisieren.

Es existieren in der Leber drei verschiedene Isoformen der Superoxiddismutase, welche den jeweiligen Zellkompartimenten zugeordnet werden. Es gibt die extrazelluläre Isoform (Ec-SOD), welche in Kupfferzellen gebildet wird, die mitochondriale Isoform (Mn-SOD), welche in Mitochondrien der Hepatozyten gebildet wird und schließlich die zytosolische Isoform [Seite 24↓](Cu/Zn-SOD), welche im Zytosol der Hepatozyten gebildet wird. Das abgebildete Schema verdeutlicht die Lokalisation der verschiedenen Isoformen.

Abb. 2 : Lokalisation der verschiedenen Superoxiddismutase-Isoformen

Wie oben bereits angeführt, werden die toxischen Radikale überwiegend in Kupfferzellen und somit extrazellulär der Hepatozyten, im Zytosol der Hepatozyten sowie in Leukozyten gebildet. Direkt nach der Reperfusion nach Lebertransplantation sind Hepatozyten und Kupfferzellen verantwortlich für den Großteil der Radikalproduktion. Leukozyten treten erst Stunden später in das pathophysiologische Geschehen ein [138, 114]. Dies bedeutet, dass die Radikale dieser Ursprungsstätten direkt vor Ort abgebaut werden sollten. Radikale im Blutstrom, also generiert von Kupfferzellen, werden teilweise von Enzymen dieser Kaskade abgebaut, sie verharren nicht in der Leber und können somit im gesamten Körper detoxifiziert werden [139]. Intrazellulär gebildete Radikale hingegen sind überwiegend an das intrazelluläre Milieu gebunden. Andererseits erscheint es auch nur schwer oder gar nicht möglich zu sein, externe Proteine wie die Superoxiddismutase oder die Catalase in die Zelle über einen Transporter aufzunehmen [139, 140]. Weiterhin spricht gegen den Einsatz von [Seite 25↓]körperfremden, extern zugeführten Proteinen die Tatsache, dass diese im Blutstrom innerhalb weniger Minuten durch Proteasen abgebaut werden, wie es oben bereits erwähnt wurde [139]. Folglich müßte ein extern zugeführtes Protein wie die Superoxiddismutase in den beschriebenen Versuchen von W. Land kontinuierlich intravenös zugeführt werden. Solch ein Verfahren führt zwangsläufig zu immunologischen Reaktionen. Somit ergeben sich mehrere gewichtige Argumente, welche eine externe Gabe von Radikal-abbauenden Proteinen als wenig sinnvoll erscheinen lassen. Der wichtigste Argument ist es, dass extern applizierte Proteine nicht das intrazelluläre Milieu und damit nicht den entscheidenden Ort der Radikalbildung in Verbindung mit der toxischen Wirkung erreichen können. Veränderungen der Oberflächenstruktur von extrazellulärer SOD konnten nur geringe Erfolge erbringen [141]. Daraus läßt eine wesentlich Bedingung für eine zukünftige Technik folgern, sie sollte die Zielproteine nach intrazellulär transportieren, oder aber die intrazellulären Mechanismen zur Produktion der zelleigenen Detoxifizierungsmechanismen maximal anregen. Um diese Forderungen erfüllen zu können, bedarf es einem Eingriff in die genetischen Information, welche die Proteingenerierung bzw. die Proteinaktivierung steuert. Für diese Aufgabe steht die neue Technik des Gentransfers mittels viraler Vektoren zur Verfügung. Diese wird nun kurz dargestellt:

Verfahren für den Gentransfer

Die Gentherapie als ein modernes therapeutisches Verfahren wurde vor etwas mehr als 12 Jahren eingeführt. Die Gentherapie wird durch den Einsatz des Nukleinsäuretransfers, entweder RNA oder DNA, definiert, um eine Erkrankung zu behandeln oder einer Erkrankung vorzubeugen. Bei der Gentherapie handelt es sich um den Transfer von Nukleinsäure mittels eines Vektors im engeren Sinne, oder aber durch Antisense spezifisch für ein Onkogen, oder aber auch die intradermale Immunisierung mit DNA, welche das Hepatitis S Antigen exprimiert. Bezogen auf Gentherapie mittels Vektoren wurden erste klinische Erfolge mit der auf einem Retrovirus basierenden Therapie von Kleinkindern erzielt, [Seite 26↓]welche an einer X-Chromosom-bedingten schweren Immundefizienz (SCID-X1) litten, wobei eine langfristige Heilung erreicht werden konnte [142]. Jedoch kam es auch zu schwerwiegenden Zwischenfällen, wie die Entwicklung einer Leukämie bei einem dieser Patienten [142, 143, 144] und dem Tod eines jungen Patienten nach Applikation eines adenoviralen Konstruktes zur Heilung einer Ornithin-Transcarbamylase-Defizienz [145]. Virale Vektoren dienen nicht nur zur Wiederherstellung eines Gendefektes, sie können auch in der Tumortherapie eingesetzt werden [146, 147, 148, 149, 150]. Hierbei ist es das Ziel, die transfizierte Zelle zu zerstören, die Immunantwort zu stimulieren und nach Möglichkeit ein Virus zu benutzen, welches sich im Tumor ausbreiten kann und sich dort repliziert [151]. Die dramatischen Mißerfolge führten zur strengeren Kontrolle und Durchführung von klinischen Versuchen und zur Entwicklung weiterer Vektoren, welche eine geringere pathogene Wirkung als Ziel haben sollen [152].

Im Mittelpunkt des Konzeptes der Gentherapie steht das Ziel, exogene Nukleinsäure in Zellen verschiedener Gewebe zu transportieren. Die effiziente Aufnahme und persistierende Expression von reiner DNA gelingt nur in wenigen Geweben in seltenen Fällen. Virale und nicht-virale Vektoren konnten als Transporter der DNA entwickelt werden. Nicht-virale Transporter wie Liposomen sind zwar nicht pathogen, sind aber auch deutlich weniger effektiv in der Zielsetzung des Nukleinsäuretransfers in den Zellkern des jeweiligen Gewebes [149, 153]. Hingegen sind verschiedene Viren als Transporter effektiv, jedoch sind auch diese noch nicht ausgereift [153]. Man kann 4 wesentliche Problemfelder nennen, welche die schwierige Entwicklung von viralen Vektoren beschreiben:

Insgesamt wurden in den vergangenen Jahren große Fortschritte hinsichtlich aller Aspekte der Entwicklung von Vektoren zum Gentransfer und der Zielsetzung der Genexpression erreicht. Mittlerweile kann man sagen, dass es für jeden Anwendungsbereich, bzw. jeden Anforderungskatalog ein weitgehend geeignetes Vektorsystem gibt. Jedes Vektorsystem hat seine Stärken und Schwächen, welche weitere Entwicklungsschritte bis hin zum Einsatz als allgemein einsetzbares Vektorsystem notwendig machen. Als wesentliche Vektorsysteme zum aktuellen Zeitpunkt sind die adeno-assoziierten Viren, die Adenoviren, Alphaviren, Lentiviren und Retroviren zu nennen [155]. Im Folgenden wird die Gruppe der Adenoviren mit ihren wichtigsten Charakteristika kurz beschrieben. Für diese Arbeit wurde ein adenoviraler Vektor verwendet.

Die Adenoviren sind in der Gentransfer-Forschung außerordentlich populär, da man von ihnen Basis-Vorräte mit hohem Virustiter herstellen kann und sie eine heterologe Genexpression auf hohem Niveau bieten können [154]. Adenoviren infizieren hocheffizient auch sich nicht-teilende Zellen [156]. Die erste Generation von Adenoviren zeigte eine hohe Rate an toxischen Nebenwirkungen und immunologischen Reaktionen, die folgenden Generationen zeigten diese negativen Merkmale jedoch kaum noch auf [157, 158]. Mittlerweile werden Adenoviren in verschiedenen klinischen Studien u.a. zur Tumortherapie [Seite 28↓]von Kolon-, Prostata-, Mamma- und Gliakarzinomen und Behandlung der zystischen Fibrose eingesetzt [159, 160, 149, 146, 150, 161, 148].

Unter klinischen Bedingungen ist die Effektivität der adenoviralen Gentransfers eingeschränkt, da die meisten Menschen im Laufe ihres Lebens Antikörper gegen Adenoviren gebildet haben. Die immunologische Antwort des Empfängers führt außerdem zum Verlust der therapeutische Genexpression wenige Wochen nach Infektion [154, 162]. Diese Problematik läßt sich überwinden, indem man zum Beispiel die Außenfläche der viralen Konstrukte mit einem Copolymer überzieht und somit die antigenen Strukturen versteckt [163]. Zusätzlich kann man in die Oberflächenstruktur noch endotheliale Wachstumsfaktoren integrieren, sodass die gezielte Aufnahme in die interessierenden Zellen noch schneller erfolgt. Mit dieser Oberflächenbehandlung ist auch eine wiederholte Anwendung möglich. In anderen Ansätzen wurden verschiedene Sequenzen der viralen Gene entfernt, um die Antigenizität zu vermindern [158]. Außerdem kann man die Oberfläche auch hinsichtlich der Rezeptoren verändern, sodass eine leichtere Zelladhäsion ermöglicht wird. Schließlich kann man auch sogenannte zellspezifische Promotoren in die genetische Substanz der Viren einbauen, sodass die Genexpression in der Zielzelle stimuliert wird [164]. Zusammenfassend kann man feststellen, dass Adenoviren geradezu ideal sind, wenn eine relativ kurzzeitige, einmalige Expression eines bestimmten Genes auf höchstem Niveau in einem bestimmten Gewebe erreicht werden soll. Für die wiederholte Infektion erscheinen sie auf Grund der immunologischen Antwort zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht sinnvoll zu sein [156]. Diese Ausführungen führen auf das zentrale Element zur Klärung der Fragestellung der vorliegenden Arbeit hin. Das Ziel ist es, durch die einmalige Gabe eines Vektors die Expression eines Radikal-fangenden Enzymes weit über-physiologisch hochzuregulieren, sodass möglichst viele toxische Sauerstoffradikale detoxifiziert werden können, bevor sie pathogen wirken können. Hierzu bietet sich der adenovirale Gentransfer geradezu an, denn es handelt sich um eine einmalige Gabe, bei der es das Ziel ist, von dem gewünschten Produkt [Seite 29↓]eine maximale Expression von maximal vielen Zellen im Zielorgan, also höchste Effektivität zu erreichen. Weiterhin haben sich adenovirale Vektoren in ersten Tierversuchen als komplett unproblematisch erwiesen. Diese Vektoren zeigen im Tierversuch ihre außerordentlich positiven Eigenschaften wie hohe Transfektionsraten und stabile Genprodukte bei relativ geringen Nebenwirkungen [153, 156, 158]. Diese Nebenwirkungen sind dosisabhängig und lassen sich somit steuern [156].

1.4 Fragestellung

Wie oben angeführt sind toxische Sauerstoffradikale ein entscheidendes Agens in der Pathogenese des Ischämie-/Reperfusionsschadens. Wesentliche Bestrebungen, diesen Schaden mit dem Ziel der verbesserten Organfunktion nach Lebertransplantation zu minimieren, zielen auf die Reduktion der freien Radikalen intra- und extrazellulär. Es ist zwar gelungen, extrazelluläre Radikale durch extern applizierte Therapeutika abzubauen, das intrazelluläre Überangebot von Radikalen konnte bisher jedoch nicht therapiert werden. Der Gentransfer stellt erstmals eine Technik dar, mit der man Radikale abbauende Enzyme intrazellulär permanent hochregulieren kann. Der adenovirale Gentransfer in die Leber in vivo ist effizient möglich und führt zu einer hohen Expressionsrate [165]. Erste Versuche mit adenoviralem Gentransfer von mitochondrialer Superoxiddismutase in einem Modell der warmen Ischämie der Leber in der Maus waren sehr vielversprechend, der Organschaden konnte deutlich reduziert werden [166]. Durch die Überexpression von extrazellulärer Superoxiddismutase mittels adenoviralem Vektor in der Herzmuskulatur von Hasen konnte das Ausmaß der Parenchymschadens nach Myokardinfarkt deutlich vermindert werden [167]. Diese ersten Studien zum Einsatz von adenoviralem Gentransfer konnten beweisen, dass der Gentransfer von Superoxiddismutase prinzipiell möglich ist und zu einer Verminderung des Reperfusionsschadens führen kann. Außerdem konnten andere Studien zeigen, dass der zielgerichtete Gentransfer in die Leber auch unter den Bedingungen der kalten Ischämie, also [Seite 30↓]der Konservierung eines Lebertransplantates mit University of Wisconsin Lösung, erfolgreich ist und diese Bedingungen nicht das Produkt einschränken [168].

Basierend auf diesen vielversprechenden Vorarbeiten, welche die Umsetzung des Prinzips bestätigten, ergaben sich nun folgende Fragestellungen, welche im Modell der orthotoper Lebertransplantation in der Ratte erarbeitet werden sollten:

  1. Adenoviraler Gentransfer von Superoxiddismutase in die Spenderleber – ist diese Technik unter den gegebenen Bedingungen mit einem adenoviralen Vektor erfolgreich, kommt es zu einer erhöhten Expression der Superoxiddismutase nach Organentnahme und auch identisch nach Transplantation?
  2. Welchen Einfluß hat die Überexpression von Superoxiddismutase auf die Transplantatfunktion, den postischämischen Transplantatschaden und folglich auf das Überleben nach Lebertransplantation?
  3. Können durch Überexpression von Superoxiddismutase marginale Organe als geeignete Spenderorgane verwendet werden, welche ohne protektive Vorbehandlung mit hoher Wahrscheinlichkeit zum primären Organversagen nach Lebertransplantation führen würden? Kann man also durch die Vorbehandlung mittels Gentransfer von Superoxiddismutase den Organpool vermehren und damit den Organmangel mildern?
  4. Auf welchen molekularen Mechanismen beruht die Schädigung durch die Sauerstoffradikale? Welchen Einfluß haben die Radikale auf die wesentlichen Mediatoren des zellulären Schadens wie den nukleären Transkriptionsfaktor-κB (NF-κB) und TNFα? Führt die Überexpression von Superoxiddismutase in der Tat zum Abbau von Sauerstoffradikalen, kann man folglich freie Sauerstoffradikale zum Beispiel in der Galle als Exkretionsflüssigkeit nachweisen und werden diese in Organen mit protektiver Therapie weniger stark gebildet und ausgeschieden?
  5. Es existieren in der Leber drei verschiedene Isoformen der Superoxiddismutase, welche den jeweiligen Zellkompartimenten zugeordnet werden. Es gibt die extrazelluläre Isoform (Ec-SOD), welche in der Kupfferzellen gebildet wird, die mitochondriale Isoform (Mn-SOD), welche in Mitochondrien den Hepatozyten gebildet wird und schließlich die zytosolische Isoform (Cu/Zn-SOD), welche im Zytosol der Hepatozyten gebildet wird. Welchen Einfluß hat die Überexpression jeder einzelnen Isoform jeweils auf den Reperfusionsschaden? Kann man auf Grund [Seite 31↓]dieser Ergebnisse auf die wesentliche Lokalisation der Radikalbildung schließen, bzw. läßt sich somit das Zellkompartiment mit dem größten Potential für Radikal-bedingte Schäden bestimmen?
  6. Welchen Einfluß haben die Sauerstoffradikale auf das Schadensausmaß und das Regenerationsverhalten einer transplantierten Teilleber? Kann man durch Reduktion des postischämischen Schadens die Zellteilung beschleunigen und somit die Phase der kritisch kleinen Lebermasse einer Split-Leber verkürzen? Darf man auf Grund des minimierten Zellschadens in protektiv vorbehandelten Organen eine etwas kleinere Lebermasse transplantieren, als gewöhnlich als Minimum gefordert wird?


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14.12.2004