2 Materialien und Methoden

2.1 Adenovirale Vektoren

Rekombinante, Replikations-defiziente adenovirale Vektoren, welche das Transgen für β-Galaktosidase als Markerenzym (Ad.lacZ), oder Ec-SOD, oder Mn-SOD oder aber Cu/Zn-SOD wurden nach etablierten Standardprotokollen angefertigt [169, 166]. Bei Ad.lacZ zum Beispiel wurde der Plasmid Shuttle Vektor pAd5-CMV-lacZ entsprechend der bekannten Standard Protokolle wie von Sambrook beschrieben angefertigt [170]. Das adenovirale Shuttle Plasmid wurde in eine HEK 293-Zelllinie transfiziert um ein rekombinantes Ad.lacZ Adenovirus herzustellen. Die Herstellung von Ad.IκB gestaltete sich wie folgt entsprechend der Literaturangaben [169]: Das Plasmid pRc/CMV-IκBαS32A/S36A, welches den Hämagglutinin-markierten humanen Superrepressor von NF-κB enthält, wurde in die XbaI-Seite von dem pACCMV.PLPASR Plasmid geklont, um das Plasid pACCMV/IκB zu klonen, in welchen IκB durch den CMV Promotor verstärkt wird. Das rekombinante Adenovirus AdIκB wurde dann durch Cotransfektion einer 293 humanen Nierenzelllinie mit dem pACCMV/IκB Plasmid zusätzlich mit dem gereinigten Fragment der ClaI-behandelten DNA von E1-reduzierten Adenoviren des Typs 5 hergestellt. Die Existenz der IκB Sequenz in dem rekombinanten Ad5 Virus (AdIκB) wurde mittels PCR und Western Blots nachgewiesen. Ad.IκB Vektoren wurden dann in 293 HEK-Zellen hochgezogen und anschließend gereinigt. Die Titer wurden mittels optischer Dichte und sogenannter Plaque Assays bestimmt. Die Vektoren wurden dann in 10% Glyzerol bei –80°C aufbewahrt. Der Titer der „Vorrats-Lösung“ betrug nach verschiedenen Konzentrierungsschritten über 1x1011 PFU (platelet forming units). Die Vektoren mit den drei Isoformen der Superoxiddismutase wurden identisch hergestellt. Ad.SOD1 (Cu/Zn-SOD) und Ad.SOD2 (Mn-SOD) wurden dem Gene Therapy Center der University of North Carolina in Form eines Grundstockes, aus dem [Seite 33↓]heraus dann weitere Vorräte jeweils gezüchtet wurden, freundlicherweise von Dr. John Engelhard und Dr. Beverly Davidson, University of Iowa, zur Verfügung gestellt.

An der University of North Carolina at Chapel Hill (UNC) ist ein hochspezialisiertes Gene Therapy Center ansässig. In einem der gesamten Medizinischen Einrichtungen der UNC zugänglichen Vector Core dieses Gene Therapy Centers werden die gewünschten Vektorsysteme zum Gentransfer hergestellt und gelagert.

2.2 Tiere und Tierhaltung

2.2.1 Tierhaltung

Alle Tierversuche waren von der zuständigen Behörde ordnungsgemäß genehmigt und die vom Gesetz geforderten Vorraussetzungen zur Haltung und Überwachung der Versuchstiere während des Versuches, sowie ihre ordnungsgemäße Entsorgung nach Beendigung des Versuches waren durch den zuständigen Veterinärmediziner und ausgebildete Tierpfleger der Central Animal Facility, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA gegeben. Richtlinie für alle Tierversuche war die Publikation „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ in NIH Publication 86-23, revised 1985 sowie der Bestimmungen des State of North Carolinaund des Animal Use Committee of the University of North Carolina. Von allen Tierexperimentatoren wurde an der University of North Carolina die Teilnahme an einem Tierversuchskurs mit Schwerpunkt Tierhaltung und -pflege, Tieranästhesie und postoperative Schmerztherapie vor Aufnahme der Versuche gefordert.

Für alle Untersuchungen wurden kommerziell erhältliche, rückgezüchtete Ratten der Rasse Sprague-Dawley verwendet. Dabei handelte es sich ausschließlich um weibliche Ratten mit eiinem Gewicht von 190 bis 230 Gramm. Die Tiere wurden frei von spezifischen Pathogenen von der Firma Charles-River Wiga in Raleigh, NC, USA geliefert und in den tierexperimentellen Einrichtungen der University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA, in Gruppen von 2 bis 4 Tieren pro Käfig gehalten. Nach einer Akklimatisierungsphase von 5 [Seite 34↓]Tagen mit einer Tag-Nachtzeitschaltung von jeweils 12 Stunden, wurden die Tiere für die Versuche verwendet. Nach erfolgreicher Transplantation wurden die Tiere wieder in die Versuchstieranlage zurückgebracht. Vor und während der Versuche hatten die Tiere mit Ausnahme der Fettlebergruppe (siehe unten) freien Zugang zu Wasser und Standard-Laboratoriumsdiät für Nager (Agway PROLAB RMH 3000, Syracuse, NY, USA).

2.2.2 Gentransfer mit adenoviralen Vektoren

Die Organspendertiere wurden durch Inhalation von Methoxyfluran narkotisiert. Sodann wurde in der linken Leiste die Vena femoralis freipräpariert. Organspendern, welche zur jeweiligen Kontrollgruppe gehörten, wurde 1 ml Ringer‘sche Lösung injeziert und der Zugang zu den Gefäßen der Extremität wieder verschlossen. Allen Tieren, welche ein adenovirales Konstrukt erhielten, wurde Ad.lacZ oder Ad.SOD1 oder Ad.SOD2 oder Ad.SOD3 in einer Konzentration von 3 x 109 PFU aufgelöst in 1 ml Ringer’sche Lösung in identsicher Weise injeziert. Diese Dosierung des Virus wurde in Pilotstudien (siehe Vorarbeiten im Ergebnisteil) als optimal herausgearbeitet. Um eine maximale Proteinexpression zu erreichen, wurden die Spendertiere 72 Stunden vor der Organentnahme mit den viralen Konstrukten transfiziert (siehe Vorarbeiten).

2.2.3 Fettleberinduktion – chronisches Ethanol-Modell

Die Spender-Ratten wurden immer zu zweit in einem Käfig untergebracht und erhielten eine minimal modifizierte Ethanoldiät nach Lieber und DeCarli für 4 bis 5 Wochen [171, 172, 173]. Dabei erhalten die Ratten eine vollwertige Ernährung mit äquivalenten Mengen von Getreide-Öl (35% der Kalorien) und 36% der Kalorien stammen von Ethanol in den Ethanol-Fettleber-Gruppen. Die hochkalorisch ernährte Kontrollgruppe ohne Alkohol erhielt ein isokalorisches Maltose-Dextrin Gemisch [171]. Ethanol-behandelte Ratten hatten freien Zugang zu der Diät und die tägliche Nahrungsaufnahme wurde gemessen. Die hochkalorische, Ethanol-freie Kontrollgruppe erhielt entsprechend die identische Menge an [Seite 35↓]Kalorien und Nahrung für die jeweilig identische Nahrungsaufnahme-Periode. Die Tiere erhieleten täglich um 16.00h ihre Diät und wurden täglich gewogen und hinsichtlich des Allgemeinzustandes beurteilt. Mit Hilfe dieses Ernährungsschemas erhöhen sich die Triglyceride in der Ethanol-Gruppe um den Faktor 2,4 innerhalb eines Fütterungszeitraumes von 4 Wochen [171, 174]. Die unbehandelten Kontrolltiere hatten freien Zugang zur Standardlabornahrung für Nager und Wasser.

2.2.4 Fettleberinduktion - Akutes Ethanol-Modell

Die Spenderratten erhielten Ethanol in einer Dosierung von 7 g/kg Körpergewicht direkt oral in den Magen appliziert. Dazu wird reines, unvergälltes Ethanol mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung im Verhältnis 1 zu 4 gemischt. Das Volumen wird in einer Spritze aufgezogen und nun dem Tier über eine starre Magensondierung mittels Knopfkanüle direkt in den Magen verabreicht [175, 176]. Durch diese akute, massive Alkoholaufnahme sind die Tiere nicht nur Alkohol-intoxikiert, sie erleiden eine massive feintropfige Leberverfettung, welche reversibel ist. Das Alkoholgemisch wird 20 Stunden vor der Organentnahme appliziert, da nach diesem Zeitraum die Verfettung maximal ausgeprägt ist und die Alkoholintoxikationszeichen insbesondere hinsichtlich Depression der Atmung nicht mehr vorhanden sind, sodass die Inhalationsnarkose komplikationslos durchgeführt werden kann.

2.3 Die Technik der orthotopen Lebertransplantation in der Ratte

2.3.1 Die Spenderoperation

Die Lebertransplantation in der Ratte wurde bereits 1979 von Kamada und Calne ausführlich beschrieben und diese Technik gilt auch heute noch als das Standardverfahren [177, 178], auch wenn viele kleine Modifikationen stattgefunden haben, welche unter anderem der Autor selbst auch eingeführt hat. In Allgemeinnarkose durch Inhalation von Methoxyfluran wurde nach gründlicher Rasur des Abdomens und Hautdesinfektion das Abdomen in der [Seite 36↓]Medianlinie eröffnet. Anschließend wurde die Leber von fast allen Aufhängebändern befreit. Sodann wurde das Ligamentum hepatoduodenale freigelegt, dargestellt und der Gallengang distal der Leber isoliert, mit einer Ligatur angeschlungen, ein Polyethylenstent (22G) von 5 mm Länge in das Lumen eingbracht und mit der Ligatur fixiert. Intravenös wurden 50 iE Heparin injeziert. Sodann wurde die Pfortader angeschlungen, auf Höhe der V. mesenterica inf. mit einem Mikrogefäß-Clip unterbunden, Leber-wärts davon inzidiert und dann eine Kanüle (18G) eingebracht. Die suprahepatische Vena cava wurde eröffnet und nun die Leber über die Kanüle mit 10 ml eiskalter, isotonischer Kochsalzlösung perfundiert. Sodann wurde die Leber mit 5ml eiskalter University of Wisconsin (UW) Konservierungslösung (ViaSpan®, DuPont Pharma, Wilmington, DE, USA) über die Pfortaderkanüle perfundiert und konserviert. Die Leber wurde nun aus dem Abdomen entnommen, wobei die letzten Aufhängebänder und die A. hepatica communis noch durchtrennt werden mußten. Die gesamte Organentnahmeoperation dauerte bis zu diesem Punkt 7 bis 9 min, wobei minutiös darauf geachtet wurde, dass die Leber annähernd nicht angefaßt oder bewegt wurde, um einen Manipulationsschaden zu verhindern [179]. Das Spendertier verstarb in tiefer Narkose durch Ausbluten. Sodann wurde die Leber in eine Petrischale gelegt, welche mit eiskalter UW-Lösung gefüllt war und auf Eis in einer größeren Schale stand. In dieser kalten Konservierungslösung wurde das Organ präpariert, die Cuff-Manschetten an V. cava inferior und V. portae (jeweils 14G) fixiert und in die A. hepatica communis nach Unterbindung der A. gastrica und A. gastroduodenalis ein Splint (24G) für die Anastomosierung eingebracht. Die so komplett für die Implantation vorbereiteten Organe wurden nun in einem verschlossenen mit UW-Lösung gefülltem Gefäß, welches auf Eis stand, für 24h in einer Kühlkammer bei 4°C aufbewahrt.

Für die Versuchsreihe mit größenreduzierten Lebern wurden die Organe nach Entnahme zunächst in eine mit eislkalter UW-Lösung gefüllten Schale gelegt. Sodann wurden die einzelnen linken und inferioren rechten Leberlappen entfernt, bis schließlich nur noch der [Seite 37↓]rechts laterale und rechts kaudale Leberlappen übrig blieben. Das Gewicht der Restleber betrug nun nur noch ca. 45% des ursprünglichen Gesamtgewichtes. Die Ligaturen an den einzelnen Gefäßstielen wurden mit 5/0 Seide angelegt. Es wurde bei diesen Schritten exakt darauf geachtet, dass keinerlei Obstruktion von übrigen Strukturen verursacht wurde und insbesondere die verbliebenen Gefäße nicht eingeengt wurden. Auch wurde besonders auf die Vermeidung jeglicher Manipulation geachtet. Das Gewicht der Restleber wurde auf einer hochsensiblen Waage nach Abtropfen der UW-Flüssigkeit ermittelt und in Relation zum Gesamtgewicht der intakten Leber gesetzt.

2.3.2 Die Empfängeroperation - Implantation

In Allgemeinnarkose durch Inhalation von Methoxyfluran wurde nach gründlicher Rasur des Abdomens und Hautdesinfektion das Abdomen in der Medianlinie eröffnet. Anschließend wurde die Leber von allen Aufhängebändern befreit. Die suprahepatische Vena cava wurde auf ihrer gesamten Länge dargestelltt. Sodann wurde das Ligamentum hepatoduodenale freigelegt, dargestellt und der Gallengang an der Leber isoliert, koaguliert und abgesetzt. Die Arterie wurde identisch präpariert und abgesetzt. Die Vena portae wurde nun dargestellt und von umgebenden Bindegewebe befreit, die Vena pylorica als letzte einmündende Vene vor der Leber koaguliert und abgesetzt. Die rechte Nebennierenvene wurde ebenso koaguliert und abgesetzt. Anschließend wurden Klemmen an V. cava inferior und superior sowie die Vena portae gesetzt. Das Organ wurde entfernt und die Spenderleber eingesetzt, nachdem sie zuvor mit 10ml isotoner, eiskalter Kochsalzlösung gespült worden war um die UW Lösung zu entfernen. Die suprahepatische Anastomose wurde durch eine fortlaufende Naht mit 7/0 Prolene® (Ethicon, Norderstedt) hergestellt. Die infrahepatische Vena cava und die Vena portae wurden in ihrer Kontinuität durch die Cuff-Anastomosierung und die Arteria hepatica durch Insertion des Splintes in die A. hepatica communis wiederhergestellt. Es erfolgte dann die simultane Reperfusion von Vena portae und Arterie. Auch der Gallengang wurde durch [Seite 38↓]Insertion des Splintes in den korrespondierenden Gallengang wiederhergestellt. Sodann wurde das Abdomen mittels fortlaufender Naht wieder verschlossen. Die anhepatische Phase dauerte 11 bis 13 Minuten, für die gesamte Implantation wurden 32 bis 36 Minuten benötigt. Nach Abschluß der Operation wurden die Tiere wieder in den Käfig zurückgelegt und unter einer Wärmelampe erwärmt. Die Tiere wachten dann wieder auf und nahmen bald Nahrung zu sich, welche sie frei zu sich nehmen können. Die postoperative Schmerztherapie erfolgte mit Tramal Tropfen.

2.4 Das Überleben - Definition

Um jegliche Komplikationen oder Interferenzen durch eine Rejektion zu vermeiden, welche in der Regel etwa 10 Tage nach der Transplantation einsetzt, wurde das Überleben der Empfänger als ein Überleben von mindestens 7 Tagen nach Transplantation definiert.

2.5 Lebergewicht bei Regenerationsversuchen

Die Empfänger der größenreduzierten Lebern wurden 7 Tage nach Transplantation getötet. Die Lebern wurden entnommen, Cuffs, Kanülen und Nahtmaterial entfernt und anschließend nach Abtropfen gewogen. Um jeglichen Einfluß des Gesamtkörpergewichtes auszuschließen, welches bei den Tieren unmittelbar nach Lebrtransplantation in der Regel zunächst abnimmt, wurde die Zunahme des Gewichtes innerhalb der 7 Tage nach Reperfusion mit folgender Gleichung berechnet:

(W0 = Gewicht der größenreduzierten Leber vor Transplantation; BW0 = Gewicht des Empfängers unmittelbar nach Transplantation; W7 = Gewicht der transplantierten Leber 7 Tage nach Reperfusion, BW7 = Gewicht des Empfängers 7 Tage nach Transplantation direkt vor Organentnahme).


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2.6  Bestimmung der Aktivität von β-Galaktosidase und Superoxiddismutase

Das Lebergewebe wurde in einem speziellen Puffer A (40 mM Tris, 140 mM NaCl und ein Proteaseinhibitor Cocktail mit Aprotinin, Leupeptin, PMSF, und Dithiothreitol) homogenisiert. Nachdem das Homogenat mittels Zentrifugation bei 10,000 x g für 10 min bei 4°C gereinigt worden war, wurde das Extract gesammelt und in Puffer A zu einem Endvolumen von 150 μL verdünnt. Eine kleine Menge von 150 μL des Puffers B (120 mM Na2HPO4, 80 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 100 mM 2-mercaptoethanol) und 1.33 mg/mL von O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG) wurden zu dem Extrakt hinzugegeben und für 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 500 μL einer 2.8%igen Natrium-Karbonat Lösung gestoppt. Die Aktivität der β-Galaktosidase wurde durch die Reaktion mit ONPG quantifiziert, welches dann gelbes Nitrophenol ergab, das wiederum bei 420 nm spektrophotometrisch gemessen wurde. Die erhaltenen Werte wurden dann auf den Protein-Gehalt bezogen, welcher mittels des Bio-Rad Protein Assays (Bio-Rad, Hercules, CA) bestimmt wurde.

Die Superoxiddismutase (SOD) Aktivität wurde mit Hilfe der Reduktion von Ferricytochrom C gemessen [180, 181]. Das Extrakt von Lebergewebe (10 μL) wurde einer Lösung hinzugegeben, welche 50 mM K2HPO4, 0.1 mM Na2EDTA, 0.5 mg/mL Cytochrom C, und 0.25 mg/mL Xanthin enthielt. Superoxid wurde durch die Zugabe von 0.004 Einheiten der Xanthinoxidase gebildet. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Kühlung auf Eis gestoppt und die Absorption von Cytochrom C spektophotometrisch bei 550 nm gemessen. Die Superoxid-Konzentration wurde ermittelt, indem die Hintergrund-Absorption subtrahiert wurde und dieser Wert durch den mmolaren Extinktionskoeffizienten von 18,5 dividiert wurde. Die SOD-Aktivität wurde ermittelt, indem eine Standardkurve als Basis zugrunde gelegt wurde, welche durch die Reaktion mit [Seite 40↓]gereinigter, boviner Erythrozyten-Superoxiddismutase (Boeringer Mannheim, Mannheim) ermittelt wurde.

2.7 Western Blot von Superoxiddismutase

Lebergewebe wurde in Puffer A (40 mM Tris, 140 mM NaCl, und der Proteaseinhibitor-Cocktail s.o.) homogenisiert. Nach der Zentrifugation bei 900 g wurde der Überstand separiert und darin der Proteingehalt mittels des Bio-Rad Protein Assays (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ermittelt. Der Überstand wurde in Puffer A bis zu einer Konzentration von einem Endvolumen von 15 µL verdünnt. Zu diesem Substrat von 15 µL wurden weitere 15 µL eines 2X Laemlli Puffers hinzugegeben und diese Probe dann bei 95°C für 5 min erhitzt bevor sie auf in Geltasche eingebracht wurde. Die Proteinprobe wurde dann durch Gelelektrophorese in einem 10% SDS-PAGE Gel aufgetrennt und anschließend mittels der semi-dry transfer Methode auf Nitrocellulose übertragen. Die Membran wurde dann in 5% fettfreiem Trockenmilchpulver in TBS/ 0.05% Tween-20 für 1 h inkubiert und anschließend mit einem 1:1000 verdünnten polyklonalen Hase anti-SOD Antikörper (ACCU-SPECS, Westbury, NY, USA) für 2 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Membran mit einem Ziege anti-Hase IgG- Meerrettich-Peroxidase conjugated antibody mit einer Verdünnung von 1:5000 für 1 h inkubiert. Zwischen jedem einzelnen Inkubationsschritt wurde die Membran dreimal für 10 min jeweils mit TBS/ 0.05% Tween-20 gewaschen. Schließlich wurde die Membran mit dem ECL Western Detection Reagent (Amersham, Piscataway, NJ, USA) inkubiert und die Banden für SOD so visualisiert.

2.8 Immunopräzipitation bzw Western Blot Analyse von p21 & CyclinD1

Lebergewebe wurde in einem NP-40 Puffer (50mM Tris-HCl (pH7,5), 150mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40, 50mM NaF), welcher auch Protease- und Phosphataseinhibitoren (1mM Na3VO4, 1mM DTT, 1 mM Phenylsmethylsulfonylfluorid und 1x Proteaseinhibitor Mini [Seite 41↓]Tablets (Roche, Mannheim)enthielt, homogenisiert. Das Homogenat wurde dann bei 15 000 rpm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde portioniert und bei –80°C aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wurde mittels des BioRad DC Protein Reagenz (BioRad, Hercules, CA) entsprechend der Herstellervorgaben ermittelt.

Für die Western Blot Analyse wurden 100µg Proteinextrakt und das identische Volumen eines 2x Lammeli Puffers pro Streifen aufgetragen. Die Proteine wurden in einem 10% SDS-Polyacrylamid Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher and Schuell, Einbeck-Wenzen) in einer Pufferlösung (1% SDS, 20% Methanol, 400mM Glycin, 50mM Tris-HCl (pH 8,3)) bei 4°C über 2h bei 200mA übertragen [182]. Zur Primärantikörper-Inkubation wurden die Membranen mit anti-p21, anti-PCNA und anti-Cyclin D1 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Ca, USA) inkubiert. Als Sekundärantikörper wurden Peroxidase-konjugierter Donkey anti-Hase IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) oder anti-Maus IgG (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA) benutzt. Diese Antigen-Antikörper-Komplexe wurden mit dem ECL Chemiluminexcence Kit (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) dargestellt. Um sicherzustellen, dass in jedem Experiment die identische Proteinmenge verwendet wurde, wurden die Membranen ausgeschnitten und mit anti-α-Tubulin Antikörper (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) inkubiert. Die gesamte Prozedur des Western Blots wurde für jedes Protein mindestens fünf Mal durchgeführt um verläßliche Angaben zu erhalten.

2.9 Histologische Untersuchungen

2.9.1 Nekrose-Rate

Acht Stunden nach Reperfusion wurden die Organe entnommen und das Lebergewebe in 10% gepufferter Formalin-Lösung durch Immersion fixiert. Anschließend wurde das Gewebe in Paraffin eingebettet und in 5 µm dicken Gewebeschichten auf Objektträger aufgebracht. Der zelluläre Schaden in Form von nekrotischen Arealen wurde an mit Hematoxylin & Eosin-[Seite 42↓]gefärbten Gewebeschnitten ermittelt. Dabei wurden 5 Gesichtsfelder bei einer Vergrößerung von 100x zufällig je an mindestens 4 verschiedenen Abschnitten pro Gewebeschnitt ausgewählt und die durchschnittlichen Werte ermittelt. Die histologischen Untersuchungen wurden mit verdeckter Identifikation der Gewebeschnitte durchführt.

2.9.2 Immunohistochemie von β-Galaktosidase

Die Beta-Galaktosidase wurde immunohistochemisch an 5 μm dicken Paraffinschnitten auf Glasobjektträgern durchgeführt. Hierzu wurden die Schnitte in Xylen deparaffiniert, in einer Reihe verschiedener Alkoholkonzentrationen rehydriert und mit PBS-T (Natriumphosphat Pufferedlösung mit 1% Tween 20 versetzt). Für die Immunhistochemische Darstellung wurde ein monoklonaler primärer Maus Antikörper Anti-β-Galaktosidase (Boehringer-Mannheim, Mannheim) benutzt und die Immunreaktion mit dem EnVision Kit (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA) visualisiert. Hierzu wurde der Primärantikörper 1: 500 mit 1% bovinem Albumin (Sigma, St. Louis, MO, USA) in PBS gelöst verdünnt. Die weiteren Inkubationsschritte wurden entsprechend den Anleitung des EnVision Kits durchgeführt.

2.9.3 Steatose

Die Bestimmung der Steatose wurde entsprechend der Standardarbeit von Enomoto 1999 durchgeführt [183]. Es wurde ein Axioskop 50 Mikroskop (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY, USA) für die Untersuchung der histologischen Gewebeschnitte benutzt, welches mit einem Bild Aquisitations- und Analysesystem verbunden war (Image-1/AT; Universal Image Corp, Chester, PA, USA). Das Ausmaß der Fettansammlung und Verteilung in den perizentralen Regionen der Leberazini wurde definiert als Anteil der Fetttropfen in der eingesehen Region bzw. Azinus. Um einen repräsentativen Durchschnittswert zu erhalten, wurden durchschnittlich 5 eingesehene Felder pro Gewebeabschnitt auf dem H&E-Schnitt analysiert.


[Seite 43↓]

2.9.4  Apoptose

Apoptotische Zellen wurden in H&E gefärbten Gewebeschnitten gezählt, indem fragmentierte oder zerfallende Nuklei gezählt wurden. Hierzu wurden etwa 1000 Nuklei von 5 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern bei einer Vergrößerung von 400x pro Schnitt ausgewählt und ausgezählt. Apoptotische Zellkerne wurden in Prozent von allen Zellkernen pro Schnitt angeben.

2.9.5 BrdU (Bromodeoxyuridin) Darstellung

Um die Hepatozytenproliferation zu ermitteln, wurde die DNA-Synthese in Hepatozyten 24h nach Transplantation mittels BrdU-Inkorporation ermittelt. Dreiundzwanzig Stunden nach Transplantation wurde den Empfängern BrdU (Bromodeoxyuridin) (100 mg/kg; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO, USA) intraperitoneal injeziert und 1h später getötet (n=6 pro Gruppe). Die Lebern wurden mittels Immersion von 10%igem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, und immunohistochemisch weiterbearbeitet. Die Gewebeschnitte wurden deparaffiniert durch jeweiliges Bad von 5-min in Xylen, einer Alkoholreihe (100, 95, 70, und 30%) und in dH2O rehydriert. Für die immunhistochemische Färbung von BrdU wurde das DAKO Envision system® (DAKO Corp., Carpinteria, CA, USA) benutzt. Hierzu wurden die Schnitte in 4 N HCl für 20 min bei 37°C inkubiert und dann mehrfach mit dH2O und 1× PBS-Tween 20 (PBST; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) gewaschen. Nach Blockierung der endogenen Peroxidase wurden die Schnitte mit monoklonalem Mausanti-BrdU Antikörper ((1:200 in PBS enthaltend 5% BSA; Sigma Chemical Co.) über 10 min bei 25°C inkubiert. Nach 2 Waschschritten mit PBST wurden die Gewebeschnitte mit einem markierten Polymer (Peroxidase-markiertes Polymerkonjugiert mit Schaf anti-Hase and Schaf anti-Maus Immunoglobulinen)über 10 min bei 25°C inkubiert. Die Gewebeschnitte wurden dann erneut 2 fach mit PBST gewaschen, mit 3,3-Diaminobenzidine (DAB) über 8 min inkubiert, mit dH2O gewaschen, mit DAB Verstärker (InnovexBiosciences, Richmond, [Seite 44↓]CA, USA) über 5 min inkubiert, erneut mit dH2O gewaschen und schließlich mit Hematoxylin angefärbt. BrdU-positive Hepatozyten wurden unter dem Lichtmikroskop bei einer Auflösung von 400 begutachtet und die prozentuale Anzahl der BrdU-positiven Zells in Relation zu allen Hepatozyten ermittelt, wobei die Gesamtzahl der Hepatozyten im Gesichtsfeld ermittelt wurde [184].

2.10 Klinische Chemie

Die Blutproben wurden 8 h nach Transplantation von der Vena cava inferior entnommen. Das Serum wurde mittels Zentrifugation gewonnen und zunächst bei -80°C gelagert. Die Transaminasen AST and ALT wurden mit Hilfe von Standard Enzymatischen Test Kits (Sigma, St. Louis, MO, USA) spektrophotometrisch bestimmt, Gesamt-Bilirubin hingegen wurde direkt spektrophotometrisch bei 454 nm bestimmt [185, 186]. In den Tieren, welche eine reduzierte Leber erhalten hatten, wurde das Gesamtbilirubin erst 24h nach Reperfusion bei 454 gemessen.

2.11 Electrophoretic Mobility Shift Assay für NF-κB

NF-κB Aktivität, JNK Kinase Aktivität und TNFα Freisetzung wurden in Lebergewebe untersucht, welches 70 min nach Reperfusion entnommen worden war. Die Technik des Electrophoretic Mobility Shift Assays wurde eingesetzt, um die Menge des aktiv an der Protein-DNA-Interaktionen beteiligten Proteines zu bestimmen. Es handelt sich hierbei um eine Standardmethode, welche in der Literatur ausführlich beschrieben worden war und in diesen Versuchen entsprechend der Standard-Protokolle durchgeführt wurde [187, 188]. Zunächst wurden die Zellen in Nonidet P-40 (0.25%) gelöst in 10mM HEPES und mit verschiedenen Protease Inhibitoren lysiert. Das Homogenat wurde bei 13000 x g und 4°C 10 min lang zentrifugiert und das nukleäre Pellet wurde erneut in 50µl von 50 mM HEPES, Protease Inhibitoren und 10% Glycerol gelöst. Dieses aufbereitete Pellet wurde dann 15 min [Seite 45↓]lang bei 4°C gemischt, zentrifugiert und der Überstand wurde abgetrennt und nun weiterverwendet. Electromobility Shift Assays wurden mit Strahlen-markierten Oligonucleotiden, welche spezifisch für NF-κB waren, durchgeführt. Identsiche Mengen (10μg) des nukleären Extrakt wurden zuerst mit 1μg poly(dI-dC), 20μg BSA (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) und 2μl einer 32P-markierten DNA (10,000 c.p.m./μl, Cerenkov), welche 1ng einer Doppel-Strang Oligonucleotid-Verbindung enthielt, inkubiert, wobei das Endvolumen 20μl betrug. Diese Verbindung wurde dann in einem 5% Polyacrylamid und 0.4 XTBE Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Spezificität der NF-κB Anheftung wurde durch Vergleich mit nicht-markierter DNA nachgewiesen. Außerdem wurde die Bindung von spezifischen Antikörpern gegen die Untergruppen p50 und p65 an die Protein/DNA Verbindungen nachgewiesen. Nach Abschluß der Elektrophorese wurde die Gele auf X-OMAT LS Kodak Film abgelichtet. Die Intensität der NF-κB Bindungsaktivität wurde mit Hilfe des GelScan XL (Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden) quantifiziert.

2.12 Kinase Assays

Die Aktivität von JNK und IKK wurde mit Hilfe eines Kinase Assyas ermittelt, welches kürzlich vorgestellt wurde [189]. Die Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt: Lebergewebe wurde in Triton Lyse-Puffer (20 mM Tris, pH 7.4, 1% Triton X, 10% glycerol, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, Protease Inhibitoren (40 µg/ml Bestatin, 0.5 µM Pefabloc, 70 µg/ml Pepstatin A, 2 µg/ml Aprotinin, 0.5 µg/ml Leupeptin, Boehringer Mannheim, Mannheim) und Phosphatase Inhibitoren (10 µM 4-Nitrophenylphosphat, Boehringer Mannheim; 20 µM β-Glycerophosphat, Sigma; 50 µM Na3Vo4, Sigma) bei 4 °C über einen Zeitraum von 30 min aufgelöst. Nach der Zentrifugation bei 10,000 x g über 5 Minutes wurde der Überstand mit der Bradford Methode hinsichtlich des Proteingehaltes untersucht. Bezüglich des IκB Kinase (IKK)-Assays wurden 300 µg Protein mit 2 µl anti-IKKγ (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) gelöst in 500 µl Puffer (20 mM Tris, pH 8.0, 3 mM EDTA, 3mM EGTA, 250 mM [Seite 46↓]NaCl, 0.05% NP40 plus Protease and Phosphatase Inhibitoren s.o.) über 2h bei 4 °C immunopräzipitiert. Protein A/G Agarose Beads (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) wurden für 1h hinzugegeben und dann drei Mal in dem o.g. Puffer gewaschen um dann nochmals im Kinase Puffer (20 mM HEPES pH 7.7, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 1 mM DTT plus Phosphatase Inhibitoren) gewaschen zu werden. Für die eigentliche Kinasereaktion wurden dann 25 µl Kinase Puffer, 1 µl GST-IκB Substrat (Aminosäuren 1-54) (0.5 mg/ml), 0.5 µCi 32P ATP und 0.125 µl ATP (10 mM) zu jeder Probe hinzugegeben und incubated bei 30 °C über 30 min inkubiert. Anschließemd erfolgte das spezifische Jun-N-terminal Kinase (JNK)-Assay indem 25 µg Protein zusammen mit 1 µl GST-c-jun gebunden an GSH-Agarose Beads in 500 µl Puffer (40 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 % Triton X) über 3 h bei 4 °C inkubiert wurde. Nach zweifacher Waschung in HBB Puffer wurden 25 µl Kinase Puffer (10 mM MgCl2 an Stelle von 2 mM MgCl2), 0.5 µCi 32P ATP und 0.125 µl ATP (10mM) zu jeder Probe hinzugegeben und die Kinasereaktion lief über 30 min bei 30 °C ab und die Proben wurden dann in einem 10% SDS-Acrylamid Gel aufgetrennt. Die Gele wurden mit Coomassie Blau angefärbt, um die identische Substratmenge zu zeigen, danach getrocknet und schließlich auf Kodak Biomax Film abgebildet.. Die IKK Aktivität wurde durch die Immunopräzipitation von Leberzellextrakten mit anti-IKKγ Antikörpern (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) ermiitelt. Nach dem Waschvorgang wurden die Immunopräzipitate der Kinase Reaktion unterzogen, indem GST-IκBα (1-54) als Substrat verwendet wurde. Alle weiteren Schritte entsprachen der JNK Kinase Aufstellung.

Das p38 Kinase Assay: 25 µg Protein wurden mit 5 µl Agarose-gebundenem anti-p38 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) gelöst in 300 µl Triton Lyse-Puffer, welcher Protease and Phosphatase Inhibitoren enthielt, über 2h immunopräzipitiert. Nach 3 Waschvorgängen wurde die Kinase Reaktion wie oben bereits beim JNK Assay beschrieben durchgeführt, wobei 5 µg Myelinisches Protein als Substrat eingesetzt wurde. Diese Kinase Reaktion wurde [Seite 47↓]mittels eines 10% SDS-Acrylamid Geles untersucht und auf einem Phosphorimager quantifiziert. Identische Substratmengen wurden mittels Coomassie Blue Färbung nachgewiesen.

2.13 Ribonuklease Protection Assay für TNFα

Die Ribonukleinsäure wurde mittels des RNA STAT 60 (Tel-Test) Testkits aus der Leber gewonnen. Die Rnase Protection Assays wurden mit Hilfe des RiboQuant® Multiprobe Assay Systemes (Pharmingen, Carpenteria, CA, USA) durchgeführt. 32P-markierte RNA Proben wurden mit T7 Polymerase transkribiert, indem das Multiprobe Template Set rCK-1 verwendet wurde. Die RNA (10μg) wurde mit 4 x 105 cpm der Probe für 18 Stunden bei 56°C hybridisiert. Anschließend erfolgte die Behandlung mit Rnase und danach mit Protein Kinase K. Anschließend erfolgte eine Extraktion mit Phenol/Chloroform und eine Präzipitation mit Ethanol. Die Proben wurden dann in einem 5% Acrylamide-Bisacrylamid (19:1) Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die geschützten Fragmente mittels Autoradiographie dargestellt. Die Quantifizierung erfolgte mit dem GelScan XL.

2.14 Reverse Transkriptions-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)

Die Gewinnung der Ribonukleinsäure aus Lebergewebe ist ein Standardverfahren und wurde hier entsprechend der einschlägigen Empfehlungen durchgeführt, siehe 2.12 und [190]. RNA (1µg) wurde umgekehrt transkribiert, indem Oligo(dT) as ein Primer und Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transkriptase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) gelöst in 25µl Tris-EDTA Puffer (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) verwendet wurden. Die weiteren Schritte der Amplifikation von TNFα und β-Actin mRNA wurden entsprechend der allgemein gültigen und verwendeten Anleitungen durchgeführt [188]. Die amplifizierten PCR [Seite 48↓]Produkte wurden elektrophoretisch in 1.8% Agarose Gelen aufgetrennt und die Bande der cDNA mittels UV-Illumination nach Färbung mit Ethidium Bromid dargestellt.

2.15 Identifikation und Quantifizierung der freien Radikale mittels Elektronenresonanzspektroskopie

2.15.1 Das Prinzip der Technik

Die Elektronenresonanzspektroskopie (ESR, oder synonym EPR) ist ein Vefahren, bei dem Moleküle mit ungepaarten Elektronen durch Magnetfelder einer monochromatischen Strahlung ausgesetzt werden und dann die resonante Absorption der eingestrahlten monochromatischen Strahlung gemessen wird. Da in der Regel Moleküle mit unpaaren Elektronen eine resonante Absorption bei Magnetfeldern einer Feldstärke von ca. 0,3 Tesla und bei einer Frequenz des elektromagnetischen Feldes von etwa 10 GHz erfolgt, wird die ESR als Mikrowellenverfahren beschrieben. Die ESR eignet sich zum Nachweis eines Radikals in einer Probe, da das magnetische Moment für die Moleküle mit unpaaren Elektronen in der Regel auch bei eingestrahlter monochromatischer Strahlung stabil bleibt. Ein Elektronenspinresonanzspektrometer besteht aus einer Mikrowellenquelle, einer Probenkammer, in die eine Probe in einem Quarzbehälter eingebracht wird, einem Elektromagneten und einem Mikrowellendetektor. Ein ESR-Spektrum wird beobachtet, wenn die Absorption einer Mikrowellenstrahlung gemessen wird, während das Magnetfeld variiert [191]. Die Hyperfeinstruktur eines ESR-Spektrums bezeichnet die Aufspaltung einzelner Resonanzlinien in mehrere Komponenten. Dabei ist eine definierte Hyperfeinstruktur eines definierten Spektrums typisch für ein in einer Probe enthaltenes Radikal [192, 191]. Die Hyperfeinstruktur eines ESR-Spektrums wird durch die Wechselwirkung zwischen den magnetischen Polen der Kerne und des ungepaarten Elektrons definiert [191]. Ein p-Elektron wird wegen seiner Distanz zum Kern einem magnetischen Feld ausgesetzt und die entstehende Wechselwirkung wird als eine wesentliche Komponente der Hyperfeinstruktur [Seite 49↓]gemessen. Ein s-Elektron hingegen zeigt eine symmetrische Ladungsverteilung um den Kern und weist daher keine messbare Wechselwirkung auf. Das s-Elektron hat jedoch eine endliche Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der Nähe des Kernes und ist somit einer Fermi-Kontaktwechselwirkung ausgesetzt, die jedoch keinem Punktdipolfeld entspricht. Insgesamt ergeben die Kombinationen aus Dipol-Dipol- und Fermi-Kontaktwechselwirkungen die in den ESR-Spektra darstellbaren Hyperfeinstrukturen [191, 193]. Bei der hier angewendeten Technik wird das Prinzip des Elektronen Spin Trappings eingesetzt, wobei ein organisches Nitron mit einem freien Radikal reagiert und ein Nitroxid bildet, welches mittels ESR dargestellt werden kann [194, 195]. Sauerstoffradikale können durch die Reaktion mit einer Spin Trapping Substanz somit erfaßt werden [196, 197, 57].

2.15.2 Die Analysen dieser Arbeit wurden wie folgt durchgeführt

Die Radikale wurden 3 Stunden nach Reperfusion in der Gallenflüssigkeit dargestellt. Hierzu wurde den Tieren in Narkose zuerst ein zentralvenöser Katheter in die rechte Vena jugularis implantiert. Sodann wurde das Spin Trapping Reagenz α-(4,4’-dipyridyl 1-oxid)-N-tert-butylnitrone (4-POBN: 1g/kg) gelöst in 2 ml NaCl 0,9% langsam über den zentralen Venenkatheter injeziert. Das Abdomen wurde wieder geöffnet, der Gallengangsspilnt entfernt und eine 8 cm lange Kanüle im Gallengang plaziert. Nun wurde die Galle über 90 min in einem Gefäß gesammelt, welches auf Eis lag und 30 μl von 30 mM 4,4’-Dipyridil enthielt, welches die ex vivo Radikalbildung verhindert. Sodann wurden die Proben bei -80°C gelagert. Zur Analyse wurden die Gallenproben dann in ein Quartz Gefäß gegeben und mit Sauerstoff und Ascorbat-Oxidase (Boehringer Mannheim) für 10 Minuten versetzt, um interferierendes Ascorbatzu entfernen, sowie für weitere 5 Minutes mit Stickstoff versetzt, um Sauerstoff zu entfernen. Die freien Radikale wurden dann mittels eines Bruker ESP 300 EPR Spektrometers dargestellt, wobei folgende Einstellungen vorgenommen wurden: 20-mW Mikrowellenleistung, 1.00-G Modulationsamplitude, 80-G Scanweite, 670-sec Scan und 1.3-[Seite 50↓]sec Zeitkonstante. Die so ermittelten Spektra wurden nun in Bezug auf ihre Hyperfeinstrukturen mit Hilfe einer Computersimulation untersucht [198]. Die Stärke des ESR-Signales wurde in relativen Einheiten angegeben.

2.16 Statistik

Die Mittelwerte ± Standardabweichung vom Mittelwert der verschiedenen Gruppen und Tiere wurden mit Hilfe des Fisher’s Exakt Tests oder aber der zwei-Wege Varianzanalyse in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls post-hoc Test ermittelt. Als Kriterium für die Signifikanz wurde ein P<0.05 Wert festgelegt.[Seite 51↓]


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14.12.2004