3 Ergebnisse

3.1 Vorarbeiten zur Bestätigung des Konzeptes des adenoviralen Gentransfers und der Dosisfindung beim Spender

3.1.1 Adenoviren in vivo:

Vor Beginn der Versuche mußte die Anwendbarkeit des adenoviralen Gentransfers demonstriert werden. Dabei ergaben sich drei wesentliche Punkte, welche in Form von Pilotstudien zu klären waren, bevor die eigentlichen Tierexperimente zur Therapie beginnen konnten:

  1. Immunantwort auf die Infektion mit Viren
  2. optimale Dosis-Wirkungs-Nebenwirkungskonzentration
  3. Inkubationszeit bzw. optimales Zeitintervall nach Infektion in Bezug auf maximalen Effekt
  4. Anzahl der in vivo infizierten Hepatozyten in der Leber

Alle Pilotstudien, also jedes einzelne Vor-Experiment, wurde unter den Bedingungen der eigentlichen Zielsetzung der Arbeit der Lebertransplantation in der Ratte durchgeführt, daher wurde die Praktikabilität beim Spender evaluiert. Das Spendertier wurde über eine Injektion direkt intravenös infiziert, wie es unter Materialien und Methoden oben beschrieben ist. Hierzu wurde Ratten das Viruskonstrukt mit dem bakteriellen Markerenzym beta-Galaktosidase intravenös appliziert. Aus Erfahrungswerten in der Literatur und eigenen Versuchen des Gene Therapy Centers an der UNC war bekannt, dass die maximale Proteinexpression mit adenoviralem Transfer nach 3 bis 5 Tagen erreicht wird. Ebenso war es aus der Literatur bekannt, dass die viralen Vektoren systemisch appliziert werden konnten, eine organspezifische Applikationsart (z.B. intraarterielle Injektion) war nicht notwendig. Die [Seite 52↓]Vektoren verteilen sich weitgehend in allen Organen, die Genprodukte können somit fast im gesamten Körper nachgewiesen werden.

Zu a.): Auch Ratten reagieren nach intravenöser Applikation von Adenoviren mit einer immunologischen Reaktion. Diese wurde zum Beispiel an einem deutlichen Anstieg der Lebertransaminasen erkennbar. In einer Versuchsreihe mit einer aus der Literatur und Vorexperimenten des Herstellers bekannten Dosierung von 1 x 109 PFU Ad.lacZ mit Blutabnahmen alle 6 Stunden über 5 Tage hinweg nach intravenöser Applikation konnte gezeigt werden, dass der Maximalwert von GOT und GPT etwa 24 h nach Injektion erreicht wurde, nach 72 h waren die Transaminasen wieder im Normbereich.

Da die Adenoviren in einem konservierenden Medium aufbewahrt wurden, war die Frage zu klären, ob in der Tat das Virus das auslösende Agens für die Leberschädigung war, oder aber nicht doch sogar das Konservierungsmedium zur Schädigung der Ratte führte. Die vom UNC Vector Core hergestellten Adenoviren wurden in der Konservierungslösung Glyzerol aufbewahrt, welches konzentrationsabhängig zytotoxisch ist. Auffällig bei den Dosisfindungsstudien war, dass die meisten Tiere nach Applikation von 1x1011 PFU Ad.lacZ verstarben. Daraufhin wurde ausschließlich Glyzerol in der Ad 1x1011 PFU entsprechenden Konzentrationen appliziert und die Tiere verstarben prompt. Nach Injektion von niedrigeren Dosierungen von Glyzerol entsprechend der Menge von Ad.lacZ bei 1x109 PFU oder 5x109 PFU ließen sich keinerlei Anstiege der Transaminasen GOT und GPT im Vergleich zu Kontrollen nachweisen, sodass man davon ausgehen konnte, dass ein Transaminasenanstieg bei einer Dosierung von 1x109 oder aber 3x109 PFU auf das applizierte Virus zurückzuführen wäre. Injektionen von Glyzerol entsprechend einer Dosierung von 1x1010 PFU führten zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Transaminasen um ca. 30% zu den Zeitpunkten 6 h und 12 h nach Injektion, 24 h nach Injektion zeigte sich immer noch eine deutliche Transaminasenerhöhung.


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Zu b.) Wie bereits oben angesprochen wurden bezüglich der optimalen Dosierung von Adenoviren gemessen in platelet forming units (PFU) ausgedehnte Untersuchungen angestellt, da es hierzu in der Literatur für die eingesetzten viralen Konstrukte keine verläßlichen Angaben im Modell der Ratte gab. Hierbei galt es, die Wirkung und Intensität der Proteinexpression in Bezug auf Dosierung der Adenoviren zu überprüfen, sowie potentielle zytotoxische Nebenwirkungen in Relation zu setzen. Für diese Versuche wurde das Markerenzym β-Galaktosidase mit dem Vektor Ad.lacZ transfiziert. In der Literatur war bisher keine Methode beschrieben worden, mit welcher man man die enzymatische Aktivität von β-Galaktosidase im Lebergewebe bestimmen konnte, sodass zuerst diese Methode etabliert wurde. Ebenso wurde ein immunhistochemisches Nachweisverfahren von β-Galaktosidase an Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Lebergewebeproben entwickelt.

Es konnte aufgezeigt werden, dass eine kontinuierliche Steigerung der Proteinexpression von β-Galaktosidase in den Konzentrationen von 1x108 auf 1x109 und weiter auf 1x1010 PFU möglich war und zu einer entsprechend vermehrten Expression 7 Tage nach Transfektion führt. Eine weitere Steigerung auf 1x1011 PFU erbrachte keine weiter erhöhte Expression, jedoch 24 h nach Injektion tote Tiere zunächst unklarer Ursache, eventuell auf Grund der hohen Glycerol-Menge, wie oben beschrieben. Je höher die verabreichte Menge an Adenovirus war, um so höher waren die Transaminasen 24 h nach Virusinjektion. Bereits 72 h nach Injektion waren die Transaminasen je nach PFU-Menge wieder im Normbereich, wie es oben bereits beschrieben wurde. Dieses Ergebnis bedeutete, dass man die optimale Konzentration auch nach Nebenwirkungen und potentieller Regeneration bzw. inflammatorischer Antwort beurteilen muß. Dabei war es das Ziel, die bestmögliche Proteinexpression in Abwägung mit geringstmöglichen immunologischen Nebenwirkungen zu erzielen. Bei der als optimal eruierten Dosierung von 3x109 PFU waren die Transaminasen nach 72 h wieder im Normbereich. Bei einer Dosierung von 1x1010 PFU waren die [Seite 54↓]Transaminasen nach 72 h immer noch diskret erhöht bei einer nur minimal erhöhten Proteinaktivität im Vergleich zu 3x109 PFU.

Zu c.) Die optimale Inkubationszeit ermittelten wir, nachdem die ausgewogenste Konzentration von 3x109 PFU von Ad.lacZ feststand: 24 h nach Injektion zeigte sich nur ein minimaler Anstieg der Aktivität des Markerenzymes β-Galaktosidase im Serum. Dagegen konnten wir 1 Woche nach Injektion einen gegenüber dem Basiswert mehrfach erhöhte Konzentration nachweisen. Sodann bestimmten wir die Proteinaktivitäten zu diversen Zeitpunkten, alle 24 h, innerhalb einer Woche nach Reperfusion. Der Höchstwert ließ sich 72h nach Reperfusion nachweisen und bleibt dann auf einem konstant hohen Niveau für mindestens 1 Woche. Im nächsten Schritt konnte dann geklärt werden, dass im Zeitraum 3 Tage bis etwa 3 Wochen nach Inkubation die maximale Proteinexpression nach Injektion mit Adenoviren (Ad.lacZ) im Sine eines Plateaus erhalten werden konnte, dann kam es zu einem langsamen Absinken von Expression und Proteinaktivität. Etwa 6 Wochen nach Injektion war etwa noch 50% der maximalen Proteinaktivtät vorhanden, nach 3 Monaten war nur noch eine minimale Restaktivität von β-Galaktosidase in der Rattenleber nachweisbar. Dieses Ergebnis bedeutete, dass der Zeitraum der erwünschten Proteinüberexpression durch adenoviralen Gentransfer genau den Anforderungen für ein Transplantat entspricht, nämlich exakt innerhalb der ersten Stunden und Tage nach Reperfusion eine maximale Überexpression zu bieten.

Zu d.) Wie oben angesprochen wurde ein immunhistochemisches Nachweisverfahren für β-Galaktosidase entwickelt. Wie es aus der Literatur und eigenen Erfahrungen des Gene Therapy Centers bekannt war, infizieren Adenoviren je nach Konzentration der applizierten Menge einen Großteil der Hepatozyten in vivo. In dem hier vorgestellten Modell der Transfektion der Leber in Ratten konnte mit der als optimal erachteten Dosierung eine sehr hohe Infektionsrate von mindestens 80% aller Hepatozyten nachgewiesen werden. Bei [Seite 55↓]manchen Tieren waren sogar über 90% aller Hepatozyten infiziert. Interessanterweise waren die Infektionsraten nicht bei jedem Tier identisch und es trat eine Schwankungsbreite zwischen 80 und 95% (n=20) auf. Ebenso überraschend war es, dass die Infektionsraten von Tieren infiziert mit 1x109 PFU nicht signifikant niedriger waren, als die von Tieren infiziert mit 1x1010 PFU (n=10 pro Gruppe). Somit war auch in dieser Hinsicht nachgewiesen, dass eine Dosierung von 3x109 PFU vollkommen ausreichend war, um eine optimale Infektionsrate zu erreichen. Diese hohen Transfektionsraten spiegelten sich auch in den Bestimmungen der Proteinaktivität im Leberhomogenat 72 h nach Injektion wieder, wie bereits unter c.) aufgeführt. Auch hier konnte noch eine Aktivitätszunahme von 1x109 PFU nach 3x109 PFU festgestellt werden, jedoch weitere keine Zunahme mehr nach 5x109 PFU und nur noch eine nicht signifikate Steigerung der Aktivität von 3x109 PFU nach 1x1010 PFU.

Die nun mit Ad.lacZ erhaltenen Resultate wurden nun auf die Infektion mit Ad.SOD1 übertragen und bildeten sich in identischer Weise ab. Somit wurde nachgewiesen, dass die Infektion mit Ad.SOD1 beim Organspender zu einer Überexpression des Zielproteins führt.

3.2 Bestätigung des Konzeptes bei der Lebertransplantation in der Ratte

Nachdem nun die Grundvorraussetzungen für die Durchführung der Versuche entsprechend der Fragegestellung gegeben waren, konnte nun die Technik auf die Lebertransplantation in der Ratte übertragen werden. Es folgen nun die Daten zu den ersten Versuchen. Dabei handelt es sich um Tiere, welche nicht mit einer hochkalorischen Diät oder einer Leberteilresektion vorbehandelt wurden. Den Spendern wurde ausschließlich das entsprechende Adenovirus intravenös appliziert, 72 h später die Leber entnommen, 24 h kalt konserviert und dann transplantiert.


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Weiterhin sollte nun nach Überprüfung der Praktikabilität der Technik erstmals der Einfluß der Überexpression von zytosolischer Superoxiddismutase auf den Ischämie/Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation dargestellt werden.

Der Versuchsaufbau im Schema:

 

Kontrolle

Ad.lacZ

Ad.SOD1

Proteinexpression immunhistochemische Analyse β-Galaktosidase

ja

ja

ja

Proteinexpression β-Galaktosidase

ja

ja

ja

Proteinexpression der Superoxiddismutase

ja

ja

ja

Proteinaktivität der Superoxiddismutase

ja

ja

ja

Einfluß von der Überexpression von SOD auf das Überleben

ja

ja

ja

Einfluß von der Überexpression von SOD auf die Transaminasen und die Nekroserate histologisch

ja

ja

ja

3.2.1 Proteinexpression nach adenoviralem Gentransfer

Um die Effektivität des adenoviralen Gentransfers und der Proteinexpression im Zielorgan zu zeigen, sowie auch den Einfluß der kalten Ischämie, der warmen Ischämie und der Reperfusion auf dieses Produkt zu untersuchen, wurden die transplantierten Lebern den [Seite 57↓]Empfängern 8 h nach erfolgter Transplantation entnommen. Die Lebern wurden aufbereitet und nun hinsichtlich der Proteinexpression und Aktivität untersucht.

β -Galaktosidase:

Zunächst wurde die Proteinexpression von β-Galaktosidase immunhistochemisch untersucht. Dabei konnte eine intensive Anfärbung von Hepatozyten, welche nun nach Transfektion mit Ad.lacZ das Enzym β-Galaktosidase exprimierten, erzielt werden (siehe Abb.3B). Die morphometrischen Analysen an 6 Tieren zeigten eine Infektionsrate von 83,4% ± 4,9% aller Hepatozyten (siehe Abb.3B). Hingegen zeigte sich keinerlei Anfärbung bei den Kontrollen oder aber den Ad.SOD1 infizierten Tieren (jeweils n=6, siehe Bild A der Abbildung 3).

Abb. 3 : Histologische Schnitte von unbehandelter Leber nach Transplantation (A), sowie transplantierter, mit Ad.lacZ infizierter Leber (B).

Diese repräsentativen Abbildungen zeigen histologische Schnitte von unbehandelter Leber nach Transplantation (A), sowie von transplantierter, mit Ad.lacZ infizierter Leber (B). Die spezifische immunhistochemische Färbung der β-Galaktosidase erkennt man durch die Braunfärbung des Diaminobenzidines von β-Galaktosidase produzierenden Hepatozyten. Ursprüngliche Vergrößerung: X20 (A und B).


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Sodann wurde die Aktivität der β-Galaktosidase im Homogenat der Leber untersucht. Bei der β-Galaktosidase handelt es sich um ein pflanzliches Enzym, welches nicht natürlich im Organismus eines Säugetieres vorkommt. Daher eignet sich dieses Protein ähnlich wie das sonst auch gebräuchliche Grün-fluoreszeierende Protein (GFP) ideal als Markerenzym für den Gentransfer. Im Homogenat der nicht-infizierten Kontrolltiere zeigte sich eine Hintergrundexpression von 0,3 Absorptionseinheiten/ mg Protein, was angesichts des zuvor Beschriebenen auf die Methode zurückzuführen ist (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu konnte in den Tieren, welche mit Ad.lacZ infiziert worden waren, ein Anstieg der Aktivität auf 2.5 Absorptionseinheiten / mg Protein nachgewiesen werden (Abbildung 4). In Ad.SOD1-infizierten Tieren wurde nur das „Hintergrundrauschen“ von 0,3 Absorptionseinheiten/ mg Protein gemessen. Dieses Ergebnis bestätigt die Daten der Vorexperimente jetzt auch nach erfolgter Lebertransplantation. Man kann daraus folgern, dass die Ischämiephase und Reperfusion das Genprodukt nach Transfer nicht schädigen. Außerdem zeigen die Daten, dass die gewählte Dosierung von Adenovirus suffizient ist und das Genprodukt in fast allen Zellen exprimiert wird.

Abb. 4 : Einfluß der Spenderleber-Transfektion mit Ad.lacZ auf die β -Galaktosidase-Aktivität.


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Superoxiddismutase:

Um nachzuweisen dass die Infektion mit Ad.SOD1 in der Tat zu einer Überexpression von Cu/Zn-SOD in transplantierten Organen führt, wurde die SOD Expression 8 h nach Reperfusion evaluiert. Dabei wurde Leber Homogenat hinsichtlich der Expression von Cu/Zn-SOD mittels Western-Blot untersucht und dabei ein monoklonaler Antikörper spezifisch für die ~16 kDa Isoform von SOD1 eingesetzt. In den mit Ad.SOD1 infizierten Lebern konnte 8 h nach Reperfusion eine annähernd 3-fache Steigerung der Expression von Cu/Zn-SOD gegenüber der natürlichen endogenen Expression in Ad.lacZ-infizierten Tieren und den unbehandelten Kontrollen (Abb. 5A). Diese Ergebnisse beweisen, dass Cu/Zn-SOD erfolgreich unter den gegebenen Bedingungen in der Leber überexprimiert werden kann. Weiterhin wurde auch die SOD-Aktivität in transplantierten Organen 8 h nach Reperfusion gemessen. In den Organen, welchen 72 h zuvor Ad.SOD1 injeziert wurde, konnte im Vergleich zu Kontrollen und den Ad.lacZ infizierten Tieren eine etwa 10-fach höhere Aktivität gemessen werden (Abb. 5B).

Die Aktivität der β-Galaktosidase wurde in homogenisiertem Lebergewebe gemessen, indem die Menge von gebildetem O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside spektrophotometrisch bei 420 nm gemessen wurde. Die Spender Tiere wurden 72 h vor Organentnahme mit Ad.lacZ infiziert. Das Gewebe wurde 8 h nach Lebertransplantation gewonnen. Die Werte sind auf das Gesamtprotein bezogen. Alle Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben (a: p<0.001 im Vergleich zu unbehandelt und Ad.SOD1; b: nicht signifikant im Vergleich zu unbehandelt; mittels zwei-Wege ANOVA und mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt, n = 6 pro Gruppe).


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Abb. 5 : A: Ergebnis der Transfektion mit Ad.SOD1 auf die Proteinexpression. B: Ergebnis der Transfektion mit Ad.SOD1 auf die Aktivität von Superoxiddismutase.

Die Expression von Superoxiddismutase wurde mit Hilfe eines Western Blots evaluiert (Abb.5A). Dabei wurde homogenisiertes Gewebe mittels Gelelektrophorese auf einem 10% SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine auf Nitrocellulose mittels der semi-dry Transfermethode übertragen. Die Membranen wurde dann mit einem polyklonalen Hase-gegen-SOD Antikörper inkubiert und die Banden durch das ECL Western Detection Reagent sichtbar gemacht. Bei dem abgebildeten Blot handelt es sich um repräsentative Banden. Relative densotometrische Einheiten wurden somit ermittelt und die Ergebnisse als MW ± SEM angegeben (*p<0.001 durch zwei-Wege ANOVA verbunden mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6-8 pro Gruppe). Die Superoxiddismutase Aktivität wurde in homogenisiertem Lebergewebe bestimmt (Abb.5B), indem die Reduktion von Ferricytochrom C durch Superoxid, welches durch die Xanthin/Xanthinoxidase-Reaktion gebildet wurde, quantifiziert wurde. Die Absorption von Cytochrom C wurde spektrophotometrisch bei 550 nm bestimmt. Daraus ergab sich dann die SOD Aktivität, welche basierend auf einer Standardkurve, die zuvor mittels reiner, boviner Erythrozyten-Superoxiddismutase erstellt worden war, ermittelt wurde. Auch hier sind die Werte als MW ± SEM angegeben (*p<0.001 durch zwei-Wege ANOVA verbunden mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6-8 pro Gruppe).


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3.2.2  Protektiver Effekt des Gentransfers von SOD1 bei der Lebertransplantation

Lebertransaminasen

Nachdem bewiesen worden war, dass die Technik des adenoviralen Gentransfers im Spenderorgan auch unter Bedingungen der Lebertransplantation erfolgreich durchführbar ist, stand jetzt die Beantwortungen der entscheidenden Fragen hinsichtlich dem protektiven Einfluß der Überexpression von SOD auf den zellulären Schaden nach Lebertransplantation an. Hierzu wurden zunächst nach erfolgreicher Transplantation die Lebertransaminasen GOT (AST) und GPT (ALT) 8 Stunden nach Reperfusion bestimmt. Die Transaminasen im Serum sind ein gut geeigneter Indikator für den hepatozellulären Schaden und erreichen ihr Maximum im Serum etwa 8 h nach Reperfusion. Unter den hier genannten Bedingungen konnten für AST hohe Werte von 1600 bis zu 2000 U/l 8 h nach Reperfusion ermittelt werden. Identisch ließen sich für ALT Werte von 1100 bis zu 1550 U/l in den Gruppen unbehandelte Kontrolle und Ad.lacZ errmitteln. Hingegen zeigte sich bei den Empfängern von SOD-überexprimierenden Organen nur ein verminderter postoperativer Anstieg der Transaminasen von etwa 40% der Werte bei den Kontrollen oder den Ad.lacZ infizierten Tieren (Abbildung 6 A&B). Folglich kann zusammengefaßt werden, dass die hier eingesetzte Dosierung von Ad.SOD1 (3x109 PFU) geradezu optimal ist, den laborchemisch meßbaren zellulären Schaden dramatisch zu reuzieren. Zur Analyse des Traumas ausschließlich hervorgerufen durch Narkose, Manipulation und Eröffnung des Abdomens wurden auch sogenannte Scheinoperationen durchgeführt, bei denen nur das Abdomen eröffnet wurde und Blut zur Analyse gewonnen wurde. Bei diesen Tieren wurden die Werte AST: 52 ± 11 U/l und ALT: 32 ± 10 U/l ermittelt. Diese Ergebnisse zeigen sich in Form einer Grafik und sind auf der folgenden Seite zu betrachten:


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Abb. 6 : Einfluß des Gentransfers auf den postoperativen Transaminasenverlauf.

Bereits 8 h nach Transplantation wurde Blut der unteren Hohlvene entnommen und die Transaminasen AST (A) und ALT (B) mit Standardmethoden bestimmt. Bei den Tieren mit Scheinoperationen (Schein) wurde nur eine Laparotomie durchgeführt und Blut zur Analyse gewonnen. Die Werte sind als MW ± SEM agegeben (*p<0.001 durch zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6-8 pro Gruppe); a: p<0.001 verglichen mit Schein-operierten Tieren; b: p<0.001 verglichen mit unbehandelten oder Ad.lacZ-infizierten Lebern nach Transplantation.

Histologie

Angesichts des drastischen Effektes der protektiven Therapie des adenoviralen Gentransfers von SOD auf den hepatozellulären Schaden stellte sich nun die Frage, ob man diese Ergebnisse der Transaminasen auch in Form eines morphologischen Korrelates histologisch nachvollziehen könnte. Hierzu wurden Paraffinschnitte von Lebern 8 h nach Reperfusion in Formalin fixiert lichtmikroskopisch ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass etwa 20% aller [Seite 63↓]Hepatozyten von unbehandelten und Ad.lacZ-infizierten Lebern nekrotisch waren. Außerdem zeigten die Lebern dilatierte Sinusoide, intrazellulär anoxische Vakuolen und apoptotische Nuklei (Abb. 7 & 8A). Im Gegensatz dazu waren jedoch nur etwa 2% aller Hepatozyten in SOD-überexprimierenden Lebern nekrotisch und die zuvor beschriebenen Pathologien waren nur vereinzelt an wenigen Stellen erkennbar (Abb. 7 & 8A).

Abb. 7 : *p<0.001 im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen; zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6 pro Gruppe)


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Abb. 8 : Histopathologische Analyse der Lebertransplantate 8 h nach Reperfusion. Anfärbung des Gewebes mit Hematoxylin & Eosin.

Überleben

Nachdem der protektive Effekt des Gentransfers von SOD in die Spenderlebern zum frühen Zeitpunkt nach Reperfusion gezeigt werden konnte, stellte sich nun die Frage, ob diese Protektion wirklich in vivo einen Einfluß auf die Organfunktion hat und somit das Konzept der Überexpression eines Radikalfängers einen therapeutischen Nutzen erbringen kann. Hierzu bietet sich als quasi ultimativer Test das Überleben nach Lebertransplantation an. Als Überleben nach erfolgter Lebertransplantation wurde eine Überlebenszeit von 7 Tagen definiert. Die Ratten der verschiedenen Gruppen wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in dieser Reihenfolge transplantiert, um jeglichen potentiellen Einfluß der chirurgischen Übung auf das Ergebnis im Verlauf des Versuches zu vermeiden. Sowohl die unbehandelten [Seite 65↓]Kontrollen, wie auch die Empfänger der Ad.lacZ-infizierten Spenderlebern zeigten Überlebensraten von ca. 25%. Der Unterschied zwischen den Empfängern der unbehandelten und der Ad.lacZ-infizierten Spenderorgane war nicht signifikant. Im Gegensatz zu diesen niedrigen Überlebensraten überlebten alle Empfänger von Ad.SOD1-behandelten Spenderorganen.

Abb. 9 : Die Überlebenden sind angegeben als 3 von 12 Ratten in der unbehandelten Gruppe, 2 von 10 in der Ad.lacZ-Gruppe und 7 von 7 in der Ad.SOD1-Gruppe (*p<0.001, Fisher’s Exact Test gegen beide anderen Gruppen).

3.3 Mechanismen der protektiven Wirkung der SOD-Überexpression – Erweiterung des Spenderpools?

Nachdem nun die prinzipielle Anwendbarkeit des Konzeptes Überexpression von SOD zur Minimierung des Reperfusionsschadens geklärt worden war und insbesondere die tatsächlich protektive Wirkung in Form der weitgehenden Verhinderung des Reperfusionsschadens bewiesen worden war, stellte sich nun die Frage nach der tatsächlichen Wirkungsweise des Radikalfängers SOD und außerdem die Frage nach dem Einfluß auf molekulare Mechanismen der Entzündungsmediation. Unter Fragestellung wurden zuvor diese Untersuchungsthemen aufgeführt: Auf welchen molekularen Mechanismen beruht die Schädigung durch die [Seite 66↓]Sauerstoffradikale? Welchen Einfluß haben die Radikale auf die wesentlichen Mediatoren des zellulären Schadens wie der nukleäre Transkriptionsfaktor-κB (NF-κB) und TNFα? Führt die Überexpression von Superoxiddismutase in der Tat zum Abbau von Sauerstoffradikalen?

Können durch Überexpression von Superoxiddismutase marginale Organe als geeignete Spenderorgane verwendet werden, welche ohne protektive Vorbehandlung zum primären Organversagen nach Lebertransplantation führen würden? Kann man durch Gentransfer von SOD den Organmangel mildern?

Um diese gestellten Fragen beantworten zu können, wurde zunächst die Durchführbarkeit des adenoviralen Gentransfers in hochgradig verfettete Lebern untersucht. Hierzu mußten marginale Spenderlebern geschaffen werden, was man durch die Verabreichung der Ethanol-haltigen, hochkalorischen Lieber-DiCarli-Diät erzeugen kann, wie es in Materialien & Methoden beschrieben ist.

3.3.1 Proteinexpression in marginalen Lebern nach adenoviralem Gentransfer

Um die Effektivität des adenoviralen Gentransfers und der Proteinexpression im Zielorgan marginale, verfette Leber zu demonstrieren, sowie auch den Einfluß der kalten Ischämie, der warmen Ischämie und der Reperfusion zu untersuchen, wurden die transplantierten Fettlebern den Empfängern 8 h nach erfolgter Transplantation entnommen.

β -Galaktosidase

Zunächst wurde die Proteinexpression von β-Galaktosidase immunhistochemisch untersucht. Dabei konnte eine intensive Anfärbung von Hepatozyten, welche nach Transfektion mit Ad.lacZ das Enzym β-Galaktosidase exprimierten, erzielt werden (siehe Abbildung 10, Bild B). Die morphometrischen Analysen an 6 Tieren zeigten eine Infektionsrate von 81,1% ± 5,8% aller Hepatozyten. Hingegen zeigte sich keinerlei Anfärbung bei den Kontrollen oder aber den Ad.SOD1 infizierten Tieren (jeweils n=6, siehe Bild A der Abbildung 10).


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Abb. 10 : Repräsentative Bildausschnitte einer unbehandelten Fettleber (A) und einer mit Ad.lacZ (B) transfizierten Fettleber.

Nach erfolgter Transplantation wurden die Lebern 8 h später entnommen und dann die β-Galaktosidase nach der üblichen histologischen Vorbereitung mittels eines monoklonalen Antikörpers dargestellt, wobei diese durch Diaminobenzidine erfolgte, was an der braunen Farbe zu erkennen ist. (Ursprüngliche Vergrößerung 200X).

Nachdem der histochemische Nachweis der erfolgreichen Transfektion auch in Fettlebern geführt war, bedurfte es einer Analyse der Funktion dieses Proteins, eine wesentliche Beeinflußung durch die hochgradige Verfettung mußte ausgeschlossen werden. Hierzu wurde die Aktivität der β-Galaktosidase im Homogenat der Leber untersucht. Im Homogenat der nicht-infizierten Kontrolltiere zeigte sich eine geringfügige Hintergrundexpression, die Ad.lacZ-infizierten Tiere zeigen eine ausgeprägte Bande im Blot (Abbildung 11 und 12). In den Untersuchungen zur Aktivität von β-Galaktosidase spiegelten sich die Ergebnisse der Proteindetektion nun in vivo wieder, die Enzymaktivität war in allen nicht Ad.lacZ-infizierten Organ ganz gering entsprechend einem „Hintergrund“-Rauschen. Im Gegensatz dazu war die [Seite 68↓]Proteinaktivität der Ad.lacZ-infizierten Tiere jedoch ausgeprägt und entsprach etwa einem 10-fachen Anstieg gegenüber den Kontrollen (Abbildung 11 und 12).

Die SOD-Expression wurde ebenso in Lebertransplantaten 8 h nach Reperfusion evaluiert. Zunächst wurde Leberhomogenat in Bezug auf die Expression von Cu/Zn-SOD mittels Western Blot untersucht, wobei ein monoklonaler Antikörper gegen die ~19 kDa Isoform von humaner Cu/Zn-SOD eingesetzt wurde. Die Fettlebern der Tiere, welche mit Ad.SOD1 72 h vor Explantation infiziert worden ware, zeigten eine eindeutige Bande, welche die humane Cu/Zn-SOD Expression darstellte (Abb. 11 und 12). Im Gegensatz dazu konnte in keiner anderen Gruppe eine spezifische Bande entsprechend der humanen Cu/Zn-SOD dargestellt werden. Die Banden, welche die endogene SOD bei ~17 kDa darstellten, konnten in identischer Weise in allen Gruppen dargestellt werden (Abb. 11 und 12). Auch die SOD-Aktivität in den transplantierten Organen 8 h nach Reperfusion wurde untersucht. In den mit Ad.SOD1 infizierten, verfetteten Transplantaten erhöhte sich die Aktivität um etwa den Faktor 3 im Vergleich zu allen anderen Untersuchungsgruppen (Abb. 11 und 12). Diese Ergebnisse beweisen, dass der adenovirale Gentransfer von Cu/Zn-SOD äußerst erfolgreich ist und die Expression des Zielproteins in verfetteten Lebern hervorragend gesteigert werden kann.


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Abb. 11 : Die Infektion mit Ad.lacZ und Ad.SOD1 erhöht die Expression von β -Galaktosidase und Cu/Zn-SOD. Die Superoxiddismutase- und β-Galaktosidase Proteinexpression wurden mittels Western Blotting bestimmt, ein repräsentatives Experiment ist hier abgebildet.


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Abb. 12 : Einfluß der Spenderorgan Transfektion mit Ad.lacZ und Ad.SOD1 auf die β-Galaktosidase (A) und die Superoxiddismutaseaktivität (B).

Die β-Galaktosidase-Aktivität im Lebergewebe wurde durch die Quantifizierung der Bildung von O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid spektrophotometrisch bei 420 nm bestimmt (Abb.12A). Die Werte sind auf das Gesamtprotein bezogen. Alle Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben (*: p<0.001 Ad.lacZ im Vergleich zu allen anderen Gruppen, mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt, n = 6 pro Gruppe). Superoxiddismutase-Aktivität wurde in homogenisiertem Lebergewebe bestimmt, indem die Reduktion von Ferricytochrom C durch Superoxid, welches durch die Xanthin/Xanthinoxidase-Reaktion gebildet wurde, quantifiziert wurde (Abb.12B). Die Absorption von Cytochrom C wurde spektrophotometrisch bei 550 nm bestimmt. Daraus ergab sich dann die SOD Aktivität, welche basierend auf einer Standardkurve, die zuvor mittels reiner, boviner Erythrozyten-Superoxiddismutase erstellt worden war, ermittelt wurde. Auch hier sind die Werte als MW ± SEM angegeben (*p<0.001 Ad.SOD1 im Vergleich zu jeder anderen Gruppe, durch zwei-Wege ANOVA verbunden mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6 pro Gruppe).


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3.3.2 Kann die SOD Überexpression das primäre Organversagen von Fettlebern verhindern – was sind die Mechanismen?

Überleben

Nachdem der protektive Effekt des Gentransfers von SOD in die gesunde Spenderlebern in vivo bewiesen werden konnte und somit das Konzept der Überexpression eines Radikalfängers einen therapeutischen Nutzen erbringen kann, stellt sich nun die Frage, ob mit dieser Methode auch ein massiv verfettetes Organ vor dem hochwahrscheinlichen Transplantatversagen bewahrt werden kann. Hierzu bietet sich als entscheidender Test wieder das Überleben nach Lebertransplantation an. Als primäres Überleben nach erfolgter Lebertransplantation wurde eine Überlebenszeit von 7 Tagen definiert, um jeglichen Einfluß von möglichen Rejektionsvorgängen auszuschließen. Außerdem stellt sich das primäre Organversagen innerhalb von einer Woche nach Reperfusion ein. Die Ratten der verschiedenen Gruppen wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in dieser Reihenfolge transplantiert, um einen potentiellen Einfluß der chirurgischen Übung auf das Ergebnis im Verlauf des Versuches zu vermeiden. Da sich im Vergleich zu der vorangegangenen Studie die Übung in der Lebertransplantation deutlich intensiviert hatte, konnte bei allen Empfängern gesunder Trannsplantate ein Überleben von 100% erreicht werden. In der Gruppe der Empfänger von mittelgradig verfetteten Lebern, was durch eine hochkalorische Diät erreicht wurde und im Folgenden als hochkalorische Gruppe bezeichnet wird, zeigte sich eine Überlebensquote von 50%. Fast alle Empfänger von hochgradig verfetteten Organen, was durch die Ernährung mit der Ethanol-haltigen Diät erreicht wurde und im Folgenden als Ethanol-Gruppe bezeichnet wird, überlebten nicht mit Ausnahme der Gruppe der Überexpression von Cu/Zn-SOD. Im Gegensatz dazu überlebten alle Empfänger [Seite 72↓]von Ad.SOD1-infizierten, hochgradig verfetteten Organen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Folglich kann der deletäre Ausgang der Implantation von marginalen, hochgradig verfetteten Lebern durch die Überexpression von Cu/Zn-SOD komplett verhindert werden.

Nachdem diese herausragenden Ergebnisse erzielt wurden, mußte nun die Frage der dem Erfolg zugrunde liegenden Mechanismen eruiert werden. Hierzu wurden zunächst die zelllulären Schäden quantifiziert.

Lebertransaminasen

Die Lebertransaminasen GOT (AST) und GPT (ALT) im Serum sind ein gut geeigneter Indikator für den hepatozellulären Schaden und erreichen ihr Maximum etwa 8 h nach Reperfusion. Unter den hier genannten Bedingungen konnten in den Empfängern von hochgradigen Fettlebern ohne Cu/Zn-SOD Überexpression für AST hohe Werte von 2350 bis zu 3000 U/l 8 h nach Reperfusion ermittelt werden. Identisch ließen sich für ALT Werte von 1600 bis zu 2100 U/l in den Gruppen Ethanol-Diät ohne und mit Ad.lacZ errmitteln. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei den Empfängern von SOD-überexprimierenden Organen nur ein verminderter postoperativer Anstieg der Transaminasen von etwa 30% der Werte bei den Kontrollen & Ethanol-Diät oder den Ad.lacZ-infizierten Tieren & Ethanol-Diät und diese Werte entsprachen etwa den gesunden, transplantierten Lebern. Die Werte sind im Detail in der Tabelle 1 aufgeführt. Folglich kann zusammengefaßt werden, dass der in den Fettlebern eingesetzte adenovirale Gentransfer von Cu/Zn-SOD den von der massiven Verfettung verursachten, im Vergleich zu den gesunden Transplantaten zusätzlichen parenchymatösen Schaden rückgängig macht bzw. verhindert.

Histologie

Die ausgezeichnete Protektion von Cu/Zn-SOD Überexpression läßt sich sicherlich auch histologisch dokumentieren, was nun im Folgenden durchgeführt wurde. An H&E gefärbten Gewebeschnitten wurden Nekroseraten und die apoptotischen Zellen morphometrisch [Seite 73↓]ausgewertet. Dabei zeigt sich, dass die protektive SOD Therapie die Nekroserate von etwa 35% auf unter 10% reduziert und auch die Anzahl der apoptotischen Zellen halbiert. Auf die Verfettung der Leber hat der adenovirale Gentransfer erwartungsgemäß keinen Einfluß, die Ethanol-Gabe erstreckte sich über mehr als 4 Wochen. Die Apoptose wurde durch die morphologische Identifikation von geschrumpften oder fragmentierten Zellkernen ermittelt. Die SOD-Überexpression reduzierte die Apoptoserate um etwa 55%. Die genauen Zahlen sind aus der Tabelle 1 unten zu ersehen.

Tabelle 1: Parameter des Parenchymschadens von Fettlebern nach Transplantation:

 

Unbehandelt

Hochkalor-ische Nahrung

Ethanol

Ethanol + Ad.lacZ

Ethanol + Ad.SOD1

AST (U/l)

705 ± 28.6

941 ± 146

2457 ± 198

2757 ± 243

833 ± 113 *

ALT (U/l)

418 ± 21.5

737 ± 126

1813 ± 189

1882 ± 205

636 ± 86 *

Überleben (%)

100 (10/10)

50 (7/14)

0 (0/10)

9 (1/11)

100 (10/10) *

Nekrose (%)

16.3 ± 1.4

21.5 ± 1.1

36.1 ± 1.4

34.4 ± 1.6

9.4 ± 1.1 *

Fettinfiltration (%)

3 ± 0.3

18 ± 4.1

38 ± 3.5

41 ± 5.1

39 ± 4.8

Apoptose (%)

7.2 ± 0.9

7.8 ± 1.0

10.6 ± 1.2 #

11.3 ± 0.8 #

5.5 ± 2.0

* p<0.05 im Vergleich mit der Ethanol und der Ethanol+Ad.lacZ Gruppe; # p< 0.05 im Vergleich mit hochkalorischer Ernährung; p<0.05 im Vergleich mit der Ethanol+Ad.lacZ Gruppe

Hier wird der Einfluß der Infektion mit Ad.SOD1 auf Serum Transaminasen, Überleben, Nekrose, Fettinfiltration und Apoptose auf Transplantatleber entnommen 8 h nach Transplantation beschrieben. Das Überleben wird aufgeführt in prozentuales Überleben und [Seite 74↓]in Klammern als überlebende Tiere / alle Tiere dieser Gruppe. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben, berechnet durch zwei-Wege ANOVA verbunden mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6 pro Gruppe.

Abb. 13 : Repräsentative histologische Untersuchungen an H & E Schnitten der explantierten Lebern 8 h nach Transplantation.

Die Abbildung 13 zeigt repräsentative histologische Untersuchungen an H & E Schnitten der explantierten Lebern 8 h nach Transplantation. Besonderes Augenmerk ist auf die Nekroseareale zu richten, welche durch die Pfeile angezeigt werden. Erneut zeigen die Ad.SOD1 infizierten Organe trotz massivster Verfettung weitgehend keine zelluläre Nekrose. Die ursprüngliche Vergrößerung betrug 200x.

Freie Radikale – ESR

In einem weiteren Schritt sollten toxische, freie Radikale nachgewiesen werden und dabei die Schlüsselfrage beantwortet werden, ob denn durch die SOD-Überexpression in der Tat vermehrt freie Radikale intrazellulär abgebaut werden können bzw. sich entsprechend [Seite 75↓]vermindert nachweisen lassen. Diese Antwort kann erstmals eindeutig die Frage klären, ob tatsächlich die freien Radikale eine Schlüsselposition bei der Pathogenese des Ischämie/Reperfusionsschadens innehaben. Zur Analyse wurde die ElektronenSpinResonanzspektrometrie (ESR) verwendet, wie sie oben unter Materialien und Methoden ausführlich beschrieben wurde.

In der Galle der hochgradig verfetteten Lebern konnte 3 bis 5 Stunden nach Reperfusion ein typisches 6-Linien ESR Spektrum, welches von 4-POBN Radikaladdukten reultiert, aufgezeichnet werden. Die Computersimulation der Spektren ergab dann 2 verschiedene Radikalgruppen. Die eine Gruppe, welche etwa 60% des Spektrums ausmachte, entsprach nach Auswertung der Hyperfeinstruktur der Kohlenstoff-zentrierten Radikalen. Die andere Gruppe hingegen war den Sauerstoff-zentrierten Radikalen zuzuordnen. Die Ergebnisse zeigten, dass die hochgradige Verfettung der Leber zu einem massiven Anstieg der Radikalproduktion führt. Die Überexpression von SOD kann diese extensive Radikalfreisetzung verhindern, ja die nachgewiesenen Radikale waren in der Fettleber + Ad.SOD1 Gruppe sogar noch niedriger als bei den unbehandelten, gesunden transplantierten Spenderorganen. Somit ist die Hypothese bewiesen, dass der protektive Effekt der SOD-Überexpression auf einem gesteigerten Abbau der toxischen Sauerstoffradikale beruht. Weiterhin ergibt sich die Schlußfolgerung, dass toxische Sauerstoffradikale eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese des Reperfusionsschadens einnehmen. Die Spektra sind auf der folgenden Seite in der Abbildung 14 zu erkennen.


[Seite 76↓]

Abb. 14 : Einfluß des Cu/Zn-SOD Gentransfers auf die Bildung freier Radikale.

Das Spin Trapping Reagenz α-(2,2’-Dipyridyl 1-Oxid)-N-tert-butylnitrone (4-POBN; 1g/kg in isotoner NaCl-Lsg.) wurde 3 h nach Transplantation langsam über einen zentralvenösen Katheter injeziert. Galle wurde über 90 min in einem Gefäß gesammelt. Freie Radikaladdukte wurden im ESR Spektrometer identifiziert. Typische Signale sind hier abgebildet. Unbehandelt: gesunde Leber; Ad.lacZ & Ad.SOD1: Fettleber.

Abb. 15 : Die Intensität des ESR Signals wurde unter jeweils identischen Voraussetzungen gemessen und als relative Einheiten dargestellt.

Die Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben, berechnet durch zwei-Wege ANOVA verbunden mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n=6 pro Gruppe. a p<0.05 im Vergleich mit der unbehandelten und der Ethanol+Ad.SOD1 Gruppe; b p< 0.05 im Vergleich mit der unbehandelten Gruppe. Unbehandelt: gesunde Leber; Ad.lacZ & Ad.SOD1: Fettleber.


[Seite 77↓]

NF- κ B electrophoretic mobility shift assay

Die Aktivität von NF-κB wurde in nukleären Extrakten von Leberhomogenat, welches 60 min nach Reperfusion gewonnen wurde, bestimmt. In fast allen untersuchten Gruppen zeigten sich intensive Banden, welche NF-κB darstellten. Ausschließlich im Homogenat von Ad.SOD1-infiziertem Gewebe konnte man nur eine schwache Bande entsprechend geringer Aktivität nachweisen. Die Spezifität der Proteinbindung der nukleären Extrakte an die Oligonukleotide wurde mit Hilfe der Darstellung der aktiven p50/p65 Formen von NF-κB im Gel Shift Assay dargestellt. Im Gegensatz dazu war die DNA Bindungsaktivität deutlich geringer in Gewebe, welches zuvor mit Ad.SOD1 infiziert worden war (Abbildung 16, siehe unten). Dies ist als eindeutiger Nachweis dafür zu werten, dass Ad.SOD1-Transfektion zu einer deutlich erniedrigten Aktivierung von NF-κB in diesem Modell führt.

Jun-N-terminale Kinase, I κ B Kinase und p38 Aktivität

Jun-N-terminale Kinase (JNK) und p38 gehören der Familie der MAPK Kinase Gruppe der signalgebenden Kinasen an und sind entscheidend an der Vermittlung von Entzündungsreaktionen beteiligt. Hepatische p38 Kinase war in keiner transplantierten Leber aktiviert (Daten sind nicht aufgeführt). Im Gegensatz dazu war JNK in allen transplantierten Lebern hochreguliert, jedoch nicht in den Schein-operierten Tieren, welche keiner Lebertransplantation unterzogen wurden. Eine entscheidende Ausnahme zeigte sich wieder in Bezug auf die JNK-Aktivität, diese war in Ad.SOD1-infizierten Fettlebertransplantaten fast nicht detektierbar (Abbildung 16, siehe unten). Die Ethanolgabe selbst veränderte die Kinase-Aktivitäten im Vergleich zu unbehandelten Lebern nicht (Abbildung 16, siehe unten). Überraschenderweise wurde die IKK Kinase (IκB Kinase) durch die Ad.SOD1-Injektion nicht beeinflußt und überhaupt waren die Aktivitäten der IKK in transplantierten Tieren nur geringfügig über denen von Schein-operierten Tieren (Abbildung 16, siehe unten).


[Seite 78↓]

Abb. 16 : Der Einfluß der Ad.SOD1-Infektion auf die Aktivitäten von NF- κ B und der Kinasen.

Die Lebern wurden 1 h nach Transplantation entnommen. Nukleäre Extrakte der Leber wurden mit 32P-markiertern Doppelstrang-Oligonukleotiden inkubiert, welche spezifisch für κB Muster waren, um die NF-κB DNA Bindungsaktivität darzustellen. Die Supershift Experimente mit Antiseren gegen die p50 und p65 Proteine wurden an Lebergewebe der Ethanol & Ad.lacZ-Gruppe durchgeführt, um die Spezifität der aktiven Form von NF-κB darzustellen. Die Positionen der nativen und Supershift NF-κB/DNA-Komplexe sind markiert. Rekombinantes GST-c-jun wurde ebenso mit Zellextrakten von Lebern, welche 1 h nach Transplantation entnommen wurden, inkubiert. Die JNK-vermittelte Phosphorylierung von GST-c-jun wurde durch die Inkorporation von 32P-ATP und daran anschließender Elektrophorese und Autoradiographie dargestellt, wie es in Materialien und Methoden beschrieben ist. Die einfachen Banden repräsentieren GST-c-jun. Für die IKK Kinasereaktion wurde GST-IκB Substrat mit jeder Probe inkubiert. DIe Abbildungen sind repräsentative Autoradiogramme.


[Seite 79↓]

3.4  Welche der drei verschiedenen Isoformen der Superoxiddismutase ist am effektivsten in der Protektion des Ischämie/Reperfusionsschadens?

Wie in der Einleitung bereits beschrieben existieren 3 verschiedene Isoformen der SOD, welche jeweils einem spezifischen Kompartiment der Zelle zugeordnet werden: Die Cu/Zn-SOD ist die zytosolische ISoform, die Mn-SOD ist die mitochondriale Isoform und die Ec-SOD ist die extrazelluläre Isoform, welche von Kupfferzellen gebildet und in den extrazellulären Raum abgegeben wird. Es ist bis zu dieser nun aufgeführten vergleichenden Untersuchung vollkommen unklar, welche Isoform am effektivsten den I/R-Schaden verhindern kann. Um diese Fragestellung zu klären, wurde folgende Versuchsplanung umgesetzt, wobei wieder Fettlebern induziert und als Transplantate benutzt wurden, um einen ausgeprägten Schaden zu erhalten:


[Seite 80↓]

Versuchs-Gruppen →

unbehandelt

Ethanol (EtOH)

EtOH & Ad.lacZ

EtOH & Ad.SOD1

EtOH & Ad.SOD2

EtOH & Ad.SOD3

Untersuchungsthema ↓

SOD Aktivität in der Leber

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

SOD Aktivität im Serum

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

AST

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

ALT

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Nekrose

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Apoptose

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Überleben

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Histologie

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

NF-κB

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

IκB Kinase

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

TNF-α

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

In dieser Versuchsreihe wurde nun statt dem chronischen Ethanol-Modell nach Lieber-DiCarli, welche zu einer grobtrofigen Leberverfettung führt, ein sogenanntes akutes Verfettungsmodell eingesetzt:

Akute Leberverfettung - „Binge“-Modell:

Exzessiver Alkoholgenuß in kurzer Zeit führt zu einer akuten Leberverfettung. Dies gilt auch für gesunde Lebern. Insbesondere in den USA aber auch in europäischen Ländern „rekrutiert“ sich ein nicht geringer Anteil an Organspendern aus Unfallopfern, welche im alkoholisierten Zustand verunglücken. Die Lebern dieser hirntoten Organspender weisen eine feintropfige Leberverfettung auf. Diese Form der Verfettung ist reversibel. Im akuten Zustand gelten auch diese Lebern als marginal, sie zeigen einen ausgeprägten Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation auf. Im Tiermodell bei der Ratte kann man den kurzzeitigen, exzessiven Alkoholgenuß durch eine intragastrale Verabreichung von einer Alkohollösung simulieren. Dabei wird mit einer Knopfkanüle der Ösophagus intubiert und die Kanüle in den Magen vorgeschoben. Sodann wird die definierte Menge an Alkohollösung injeziert. Verschiedene Rattenstämme weisen ein unterschiedliches Verhalten bzw. Abbau von Alkohol auf. In den in [Seite 81↓]dieser Arbeit beschriebenen Experimenten mit Sprague-Dawley Ratten war die subletale Dosis von 7 g/kg Körpergewicht notwendig, um eine ausgeprägte und in allen Tieren konstante Verfettung zu erreichen. Man kann maximal eine 20%ige Lösung in 0.9% NaCl verabreichen. Mit dieser Technik erhält man einen Verfettungsgrad von etwa 25-30% des Parenchymvolumens. Die maximale Verfettung läßt sich etwa 20-24 h nach Alkoholaufnahme nachweisen, in den hier aufgeführten Experimenten wurden die Organe 20 h nach Alkoholinjektion explantiert. 72 h vor Aloholverabreichung wurde den Tieren das jeweilige Adenoviruskonstrukt bzw. Ringerlösung injeziert. In allen Tieren war der Grad der Verfettung weitgehend identisch, insbesondere bei SOD-überexprimierenden Tieren ergab sich keine signifikante Veränderung. Die Empfängertiere erhielten keinen Alkohol.

Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe im Einzelnen:

3.4.1 Die SOD Aktivität in verschiedenen Kompartimenten:

β-Galaktosidase

Vor der Untersuchung der SOD-Aktivitäten wurde zunächst wieder die Spezifität und Effektivität des adenoviralen Gentransfers in die Lebern, welche 72 h nach adenoviraler Injektion der akuten Alkoholintoxikation unterzogen wurden, nach erfolgter Lebertransplantation mit Hilfe des Markerenzymes β-Galaktosidase untersucht. Wie es bereits aus den Voruntersuchungen bekannt war, gab es auch in diesem Versuch keine Überraschungen, ausschließlich diejenigen Lebern zeigten eine deutliche Aktivität des Markerenzymes, welche zuvor mit Ad.lacZ transfiziert worden waren,.


[Seite 82↓]

Abb. 17 : Einfluß der Spenderorgan Transfektion mit Ad.lacZ auf die Enzymaktivität.

Die β-Galaktosidase-Aktivität im Lebergewebe wurde durch die Quantifizierung der Bildung von O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid spektrophotometrisch bei 420 nm bestimmt. Die Werte sind auf das Gesamtprotein bezogen. Alle Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben (*: p<0.001 Ad.lacZ im Vergleich zu allen anderen Gruppen, mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt, n = 6 pro Gruppe).

Superoxiddismutase

Im nächsten Schritt wurde die Effektivität des Gentransfers hinsichtlich des Zielproteins SOD untersucht. Da sowohl 2 Isoformen der intrazellulären SOD, als auch die extrazelluläre SOD-Isoform miteinander verglichen wurden, stand zunächst die Frage der Proteinkonzentration und –aktivität intrazellulär im Homogenat zur Klärung an.

Die erhaltenen Ergebnisse (siehe Abbildung 18 nächste Seite) waren hochinteressant:

  1. Die Alkoholadministration führt zu einer Reduktion der SOD-Aktivität intrazellulär, der Unterschied ist jedoch nicht signifikant.
  2. Die Aktivität der Cu/Zn-SOD ist intrazellulär höher als die der Mn-SOD, der Unterschied ist jedoch nicht signifikant.[Seite 83↓]
  3. Die Transfektion mit Ad.SOD3 führt nicht zu einer signifikanten Steigerung der SOD-Aktivität intrazellulär.

Um eine Aussage hinsichtlich der Effektivität der Transfektion mit Ad.SOD3 zu erhalten, wurde die SOD Aktivität auch im Serum der Organspender direkt vor der Organentnahme untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Überexpression von extrazellulärer SOD in der Tat vorhanden ist und gut funktioniert, denn sie war in den Ad.SOD3 infizierten Tieren gegenüber den nicht transfizierten Ratten um ca. 60% gesteigert und nur minimal in den Ad.SOD1 oder Ad.SOD2 Tieren erhöht (Abbildung 19). Im Gegensatz dazu war die SOD Aktivität im Serum der Empfängertiere 8 h nach Reperfusion in allen Gruppen weitgehend identisch (diese Daten sind nicht abgebildet). Die beschrieben Ergebnisse zeigen eindeutig, dass der adenovirale Gentransfer von Cu/Zn-SOD und Mn-SOD zu einer deutlichen Expression von funktionierenden Enzymen intrazellulär führt. Darüber hinaus wird nur die extrazelluläre Isoform in das Blut sezerniert.


[Seite 84↓]

Abb. 18 : Einfluß der Organtransfektion mit Ad.SOD1/2/3 auf die Enzymaktivität in der Leber.

Die SOD Aktivität wurde im Leberhomogenat der 8 h nach erfolgter LTx in den Empfängern gewonnenen Lebern durch die Quantifizierung der Inhibition der Superoxidproduktion, welche durch die Xanthin/Xanthin-Oxidase-Reaktion generiert worden war, bestimmt. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben; n=6 pro Gruppe. Die Signifikanzen: a: p<0.001 mittels Fisher’s Exakttest, die EtOH-kein Virus Gruppe vergleichend mit der Ad.SOD1 und Ad.SOD2 Gruppe; b: p<0.001 die Ad.lacZ Gruppe vergleichend mit der Ad.SOD1 Gruppe und der Ad.SOD2 Gruppe; c: p<0.001 die Ad.SOD1 Gruppe vergleichend mit der unbehandelten und der Ad.SOD3 Gruppe; d: p<0.001 die Ad.SOD2 Gruppe vergleichend mit der Ad.SOD3 Gruppe und der unbehandelten Gruppe. Es ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede beim Vergleich der EtOH-kein Virus Gruppe mit der Ad.lacZ Gruppe oder mit der Ad.SOD3 Gruppe oder mit der unbehandelten Gruppe. Es konnte ebenso kein statistisch signifikanter Unterschied beim Vergleich der Ad.SOD1 Gruppe mit der Ad.SOD2 Gruppe ermittelt werden.


[Seite 85↓]

Abb. 19 : Einfluß der Organtransfektion mit Ad.SOD1/2/3 auf die Enzymaktivität im Serum der Spendertiere vor Organentnahme

Die SOD Aktivität wurde 72 h nach Transfektion in den Spendern vor Organentnahme in identischer Weise wie oben beschrieben im Serum bestimmt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (*p<0.001 mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt für den Vergleich der Ad.SOD3-Gruppe mit der Ad.SOD1-Gruppe, n = 6 pro Gruppe). Der Unterschied zwischen Ad.SOD1 und den anderen 4 Gruppen war statistisch nicht signifikant, ermittelt mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test, n = 6 pro Gruppe.

3.4.2 Der Einfluß der 3 verschiedenen SOD-Isoformen auf den I/R-Schaden:

Zur Beurteilung der Effektivität dieser 3 verschiedenen Isoformen hinsichtlich der Verminderung des I/R-Schadens wurden das Überleben der Empfänger, die Histologie und die Kinase-Aktivitäten wie auch TNF-α herangezogen. Die Untersuchungen und Daten im Einzelnen:

Überleben

Die Ratten, also Spender verschiedenen Gruppen, wurden in der Reihenfolge der zu operierenden Tiere nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und der Transplantation unterzogen, um jeglichen Effekt der mit jedem Eingriff zunehmenden chirurgischen Routine über den [Seite 86↓]gesamten Zeitraum zu verhindern. Das Überleben war als Überleben von mindestens 7 Tagen nach Transplantation definiert. Alle Empfänger von gesunden, unbehandelten Lebern überlebten, jedoch nur 50% von den Empfängern von Lebern, welche durch Ethanol eine Leberverfettung erlitten hatten und entweder nicht infiziert waren, oder aber mit Ad.lacZ oder Ad.SOD3 infiziert worden waren. Etwa 75% aller Empfänger von Fettlebern, welche Mn-SOD überexprimierten, überlebten. Im Gegenasatz dazu überlebten alle Empfänger von Organen, welche Cu/Zn-SOD überexprimierten (siehe Abbildung 20). Folglich hat in vivo die Überexpression von ec-SOD keinerlei protektiven Effekt im Rahmen der Lebertransplantation. Jedoch kann das fatale Ergebnis der Transplantation von marginalen Fettlebern durch die Überexpression von Cu/Zn-SOD komplett verhindert werden. Auch die Überexpression der mitochondrialen Isoform von SOD erhöht die Überlebensrate nach Transplantation von Fettlebern, jedoch ist dieser Ansatz nicht so effektiv wie der der Überexpression der zytosolischen Isoform. Die Ergebnisse sind in Abbildung 20 graphisch dargestellt.


[Seite 87↓]

Abb. 20 : Einfluß des Gentransfers mit Ad.SOD1/2/3 auf das Überleben nach Lebertransplantation.

Den Organspendern wurde 72 h vor Organentnahme Ad.SOD1, oder Ad.SOD2, oder Ad.SOD3, oder Ad.lacZ oder aber Ringer’sche Lösung (unbehandelte Gruppe) intravenös injeziert. Die Organe wurden für 24 h in UW Lösung bei 1-4°C gelagert und dann die Transplantation einschließlich Rearterialisierung durchgeführt. Das Überleben wurde als ein Überleben von mindestens 7 Tagen nach Operation definiert. Als Überlebende ergaben sich 12 von 12 Ratten in der unbehandelten Gruppe, 8 von 16 Ratten überlebten in der Gruppe Fettlebern ohne Virus, 9 von 16 Empfänger überlebten in der Ethanol-Ad.lacZ Gruppe, 16 von 16 Ratten überlebten in der Ethanol-Ad.SOD1 Gruppe, 12 von 16 Tiere überlebten in der Ethanol-Ad.SOD2 Gruppe und 9 von 16 Ratten überlebten in der Ethanol-Ad.SOD3 Gruppe. (a: p<0.001 durch Fisher’s Exakttest, die Ethanol-kein Virus Gruppe verglichen mit der Ad.SOD1 Gruppe sowie mit der Ad.SOD2 Gruppe und der unbehandelten Gruppe; b: p<0.001 für die Ethanol-Ad.lacZ Gruppe verglichen mit der Ad.SOD1 Gruppe sowie mit der unbehandelten Gruppe und der Ad.SOD2 Gruppe; c: p<0.001 für die Ethanol-Ad.SOD1 Gruppe verglichen mit der Ad.SOD2 Gruppe, sowie mit der Ad.SOD3 Gruppe; d: p<0.001 für den Vergleich der Ethanol-Ad.SOD2 Gruppe mit der Ethanol-Ad.SOD3 Gruppe. Es konnte keinerlei statistische Signifikanz für den Vergleich der Ethanol-kein Virus Gruppe mit der Ethanol-Ad.lacZ Gruppe oder mit der Ethanol-Ad.SOD3 Gruppe ermittelt werden).


[Seite 88↓]

Lebertransaminasen und Histologie

Die Lebertransaminasen wurden wieder als Standardparameter zur Erfassung des hepatozellulären Schadens 8 h nach Reperfusion (im Allgemeinen dem Punktum maximum des Spiegelverlaufes) im Serum gemessen. Zu diesem Zeitpunkt betrugen die durchschnittlichen Werte für ALT 762 ± 72 U/l in der unbehandelten Gruppe und etwa 1800 U/l bei den Empfängern von Fettlebern, unabhängig davon ob sie ohne Virus, oder mit Ad.lacZ oder Ad.SOD3 infiziert worden waren. Im Gegensatz dazu zeigten sich bei den Empfängern von SOD überexprimierenden Fettlebern deutlich niedrigere ALT-Werte, nämlich 454 ± 52 U/l (Ad.SOD1) beziehungsweise 965 ± 115 U/l (Ad.SOD2). Die Bestimmungen der AST ergaben spiegelbildliche Ergebnisse für die jeweiligen Gruppen (die Daten sind in der Tabelle 2 unten aufgeführt). Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Cu/Zn-SOD im Vergleich zu Mn-SOD das wesentlich effektivere Enzym hinsicht der Minimierung des I/R-Schadens nach Lebertransplantation ist.

Etwa 15% aller Hepatozyten von unbehandelten Lebern waren 8 h nach Reperfusion nekrotisch (siehe Tabelle 2 und Abbildung 21). Bei den Fettlebern erhöhte sich diese Nekroserate auf etwa 28%. Im Gegensatz dazu waren nur ca. 6% aller Hepatozyten bei den Ad.SOD1 infizierten Fettlebern nekrotisch. Bei den Ad.SOD2 infizierten Fettlebern zeigte sich eine Nekroserate von 14% und bei den Empfängern von Ad.SOD3 infizierten Fettlebern ergab sich keine protektive Wirkung, die Nekroserate betrug 27% (alle Daten sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Apoptotische Zellen wurden, wie in Materialien & Methoden beschrieben, an Hand der kondensierten oder fragmentierten Zellkerne morphometrisch bestimmt. In den unbehandelten Transplantaten konnte eine Apoptoserate von 5.9 ± 0.9% ermittelt werden. Jedoch zeigte sich in den Fettlebern ohne Virusinfektion, sowie mit Ad.lacZ oder Ad.SOD3 Infektion eine Appoptoserate von etwa 10%. In den Lebern mit einer Cu/Zn-Überexpression war diese Rate um etwa 50% und in den Tieren mit Mn-SOD-Überexpression um etwa 30% reduziert (Tabelle 2).


[Seite 89↓]

Die Verfettung wurde durch die Überexpression der verschiedenen SOD Isoformen wie auch durch ß-Galaktosidase nicht beeinträchtigt.

Tabelle 2: Einfluß des Gentransfers mittels Ad.SOD1/2/3 auf die Lebertransaminasen, das Überleben, Nekroserate, Verfettung und Apoptose in den Lebertransplantaten 8 h nach Reperfusion

 

Unbehandelt

Ethanol kein Virus

Ethanol + Ad.lacZ

Ethanol + Ad.SOD1

Ethanol + Ad.SOD2

Ethanol + Ad.SOD3

AST (U/l)

1184 ± 152

4293 ± 456

4038 ± 439

857 ± 164 a

1899 ± 215 b

4526 ± 361

ALT (U/l)

762 ± 72

1604 ± 201

1843 ± 263

454 ± 52 a

965 ± 115 b

1855 ± 211

Nekrose (%)

15.3 ± 1.2

28.1 ± 1.1

26.6 ± 1.5

6.2 ± 0.9 a

14.2 ± 1.2 b

26.9 ± 1.6

Verfettung (%)

3 ± 0.3 c

28 ± 2.8

25 ± 3.1

26 ± 2.9

27 ± 3.2

25 ± 3.1

Apoptose (%)

5.9 ± 0.9 d

10.1 ± 0.9

9.5 ± 1.1

5.3 ± 0.8 a

7.1 ± 1.1 a

10.5 ± 1.4

a: p<0.05 die entsprechende Versuchsgruppe verglichen mit der Ethanol + Ad.lacZ Gruppe, mit der Ethanol kein Virus Gruppe, sowie mit der Ethanol + Ad.SOD3 Gruppe; b: p< 0.05 die entsprechende Versuchsgruppe verglichen mit Ethanol kein Virus, Ethanol + Ad.lacZ, Ethanol + Ad.SOD1 und Ethanol + Ad.SOD3; c, p<0.05 die entsprechende Versuchsgruppe verglichen mit allen anderen Versuchsgruppen mit Ethanolgabe; d, p<0.05 die entsprechende Versuchsgruppe verglichen mit der Ethanol + Ad.lacZ Gruppe, mit der Ethanol kein Virus Gruppe, sowie mit der Ethanol + Ad.SOD3 Gruppe.


[Seite 90↓]

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM beschrieben. Die Statistik wurde mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt, n = 8 pro Gruppe.

Abb. 21 : Repräsentative histopathologische Analyse der Lebertransplantate 8h nach Reperfusion.

Das Lebergewebe wurde für die lichtmikroskopische Untersuchung aufbereitet und die Gewebeschnitte mit Hematoxylin & Eosin angefärbt. Die roten Pfeile markieren nekrotische Areale. Ursprüngliche Vergrößerung 20X. Die Schnitte sind repräsentativ aus einer Anzahl von 8 Tieren pro Gruppe ausgewählt.


[Seite 91↓]

NF- κ B Electrophoretic Mobility Shift Assay

In denElectrophoretic Mobility Shift Assays konnten in fast allen untersuchten Leberproben deutliche Banden dargestellt werden, welche NF-κB repräsentierten (Abbildung 22A). Die Spezifität der markierten Oligonukleotide wurde durch die aktiven p50/p65 Untereinheiten von NF-κB im Gel Shift Assay verifiziert (Daten sind nicht abgebildet). Bei den Leberproben von der Ethanol-Ad.SOD1 Gruppe zeigte sich im Vergleich zu allen anderen Gruppen jedoch, dass die DNA Bindungsintensität deutlich geringer ausgefalllen war, was speziell bei dem Gewebe dieser Gruppe auf eine deutlich erniedrigte Aktivität von NF-κB hinwies. Darüber hinaus führte auch die die Überexpression von Mn-SOD zu einer deutlich erniedrigten Aktivierung von NF-κB, jedoch bei weitem nicht so ausgeprägt wie bei der Ad.SOD1-behandelten Gruppe. Im Vergleich mit den Fettlebern ohne Virus hatte die Transfektion mit Ad.SOD3 hatte keinerlei Effekt auf die NF-κB-Aktivierung.

Jun-N-terminale Kinase Aktivität

JNK war in allen transplantierten Lebern hochreguliert, erwartungsgemäß jedoch nicht in den Schein-operierten Tieren, welche keine Transplantation erfahren hatten. Überraschenderweise war auch bei den Cu/Zn-SOD überexprimierenden Lebern die JNK Aktivität deutlich vermindert. Ebenso war die JNK Aktiviät in den Ad.SOD2 transfizierten Lebern erniedrigt, jedoch nicht so ausgeprägt wie bei den Ad.SOD1 transfizierten Lebern und überhaupt nicht bei Ad.SOD3 transfizierten Organen (Abb. 22 A&B). Die Ethanol-Administration selbst hatte keinerlei Einfluß auf die Kinase Aktivität im Vergleich zu unbehandelten Organen (Abb. 22 A&B). Überraschenderweise war die IKK Kinase Aktivität von keinerlei Organmanipulation oder Transfektion zu beeinflussen und in den transplantierten Lebern nur knapp über der Aktivität der Schein-operierten Tieren (Daten sind nicht abgebildet).


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Abb. 22 : Einfluß von Ad.SOD1/2/3 Transfektion auf die NF- κ B und die JNK Kinase Aktivität.

Hepatische Zellkernextrakte wurden mit 32P-markierten, κB spezifischen Dopppelstrangoligonukleotiden inkubiert, um die NF-κB DNA Bindungsaktivität darzustellen. Hier ist ein repräsentativer EMSA abgebildet (Abb.22A). Rekombinantes GST-c-jun wurde mit Zellextrakten inkubiert. Die JNK-vermittelte Phosphorylierung von GST-c-jun wurde durch die Inkorporation von 32P-ATP dargestellt. Die einzelnen Banden repräsentieren GST-c-jun. Die in Abb.22B dargestellten Daten beruhen auf den densidometrischen Analysen der NF-κB and JNK Expression, dabei wurden die Werte der unbehandelten Gruppe als Bezugsgröße entsprechend 100% gesetzt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben (n=6 pro Gruppe). (a: p<0.001 mittels Fisher’s Exakttest, die Ethanol-kein Virus Gruppe verglichen mit der Ad.SOD1 Gruppe, der unbehandelten Gruppe und der Ad.SOD2 Gruppe. b: p<0.001 Ad.SOD1 Gruppe verglichen mit den Ad.SOD2, Ad.SOD3 und Ad.lacZ Gruppen. c: p<0.001 Ad.SOD2 Gruppe verglichen mit den Ad.SOD3, Ad.lacZ und unbehandelten Gruppen. Sonst ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.)


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Tumor-Nekrose-Faktor α

Um festzustellen ob TNFα-mRNA Spiegel durch die Gentherapie mit der Transfektion von Ad.SOD1/2/3 beeinflußt werden, wurden die Veränderungen des Spiegels der mRNA mittels eines RNA Protection Assays im Lebergewebe bestimmt, welches 70 min nach Reperfusion gewonnen wurde. Dieser Zeitpunkt wurde ausgewählt, weil er wahrscheinlich den Gipfel der Aktivierung nach Lebertransplantation darstellt [188]. Die Transkriptionsprodukte konnten in fast allen Geweben klar dargestellt werden. Jedoch zeigte sich erneut eine wesentliche Ausnahme, der Gentransfer von Cu/Zn-SOD reduzierte die Expression von TNFα mRNA signifikant auf etwa 30% der Spiegel von Fettlebern ohne Gentransfer (Abbildung 23 und 24). Auch die Transfektion mit Ad.SOD2 führte zu einer Reduktion der TNFα mRNA, jedoch nicht so ausgeprägt wie bei Ad.SOD1, und diese Spiegel betrugen etwa 55% derjenigen von Fettlebern ohne Gentransfer (Abbildung 23 und 24). Die Transfektion mit Ad.SOD3 hatte keinerlei Effekt auf die TNFα Aktivität verglichen mit Fettlebern ohne Gentransfer (Abbildung 23 und 24).

Zusammenfassend kann man feststellen, dass die 5. Fragestellung eindeutig beantwortet wurde, die zytosolische Isoform der der SOD zeigte die am besten ausgeprägten protektiven Eigenschaften und ist in dieser Hinsicht der Mn-SOD überlegen. Außerdem konnte man feststellen, dass die Überexpression von extrazellulärer SOD im Spenderorgan keinerlei protektive Wirkung nach Lebertransplantation in diesem Modell bewirkt.


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Abb. 23 : Der Einfluß der Transfektion mit Ad.SOD1/2/3 auf die TNF α Aktivität.

Gesamt RNA wurde aus dem Lebergewebe isoliert, welches 70 min nach Reperfusion gewonnen wurde. Das Rnase Protection Assay wurde sodann durchgeführt, wie es ausführlich in Materialien und Methoden beschrieben ist. 32P-markierte RNA probes wurden mit T7 Polymerase transkribiert und die RNA wurde mit der Probe über 12 h hybridisiert. Die Proben wurden dann mittels Rnase inkubiert, sodann folgte Proteinkinase K Inkubation, Extraktion und Ethanol Präzipitation. Die Proben wurden dann in einem Acrylamid-bisacrylamid Gel elektrophoretisch aufgetrennt und die darzustellenden Fragmente autoradiographisch dargestellt. Die Transkripte sind eindeutig erkennbar. Ein repräsentatives Gel ist hier abgebildet.


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Abb. 24 : Die hier abgebildeten Daten repräsentieren die densidometrische Analyse der TNF α Aktivität der einzelnen Experimente.

Die Daten der unbehandelten Gruppe wurden als 100% definiert. Die Daten stellen Mittelwerte ± SEM dar, n=6 pro Gruppe, Signifikanzen wurden mittels Fisher’s Exakttest ermittelt. a: p<0.001 Ethanol-kein Virus Gruppe verglichen mit der Ad.SOD1, Ad.SOD2 und unbehandelten Gruppe. b: p<0.001 Ad.SOD1 Gruppe vs. Ad.SOD2, Ad.SOD 3 und vs. Ad.lacZ Gruppe. c: p<0.001 Ad.SOD2 Gruppe vs. Ad.SOD3, Ad.lacZ, und der unbehandelten Gruppe. Es ergab sich kein statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich der Ethanol-kein Virus Gruppe mit der Ad.lacZ und der Ad.SOD3 Gruppe sowie zwischen der Ad.lacZ und der Ad.SOD3 Gruppe.

3.5 Welchen Einfluß haben die Sauerstoffradikale auf das Schadensausmaß und das Regenerationsverhalten einer transplantierten Teilleber – protektive Therapie durch Ad.SOD1 ?

In der Fragestellung Nr. 6 wurde die Frage aufgeworfen, ob die Sauerstoffradikale, welche im Rahmen der Reperfusion nach Organtransplantation massiv freigesetzt werden, einen Einfluß auf das Regenerationsverhalten einer Größen-reduzierten Leber haben. Somit ergibt sich die Frage, ob man durch Reduktion des postischämischen Schadens die Zellteilung beschleunigen und somit die Phase der kritisch kleinen Lebermasse einer Split-Leber verkürzen kann? Darf [Seite 96↓]man auf Grund des minimierten Zellschadens in protektiv vorbehandelten Organen eine etwas kleinere Lebermasse transplantieren, als gewöhnlich als Minimum gefordert wird?

Um diese Fragen beantworten zu können, wurde ein Modell entwickelt, welches einer Split-Leber beim Menschen entspricht. Hierzu wurden wesentliche Leberlappen des Explantates bei der sogenannten Backtable-Präparation des Organes entfernt und der jeweilige Gefäßstiel des Leberlappens mit einer Ligatur unterbunden.

Abb. 25 : Die Abbildungen zeigen die Organe nach Reperfusion. Links sind die zu resezierenden Anteile gelb markiert.

Für die Beantwortung der gestellten Fragen wurden mit den hier aufgeführten Versuchsgruppen folgende Untersuchungen durchgeführt:


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Schein-Operation

komplette Leber

Split-Leber Kein Virus

Split-Leber mit Ad.lacZ

Split-Leber mit Ad.SOD1

Größenreduktion in %

  

Ja

Ja

Ja

Relation Körpergewicht Spender - Empfänger

 

 

Ja

Ja

Ja

Relation Lebergewicht Spender - Empfänger

 

 

Ja

Ja

Ja

Expression β-Galaktosidase

 

Ja

Ja

Ja

Ja

Expression SOD

 

Ja

Ja

Ja

Ja

AST

 

Ja

Ja

Ja

Ja

ALT

 

Ja

Ja

Ja

Ja

Bilirubin im Serum

 

Ja

Ja

Ja

Ja

Histologie

 

Ja

Ja

Ja

Ja

Überleben

 

Ja

Ja

Ja

Ja

BrdU-Immunhistochemie

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Western Blot PCNA

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Western Blot Cyclin D1

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

Western Blot P21

Ja

Ja

Ja

Ja

Ja

3.5.1 Einfluß der Größenreduktion auf Organschaden nach Transplantation einer Split-Leber und protektive Wirkung von Ad.SOD1:

Größen- und Gewichtsrelation

Um jegliche Ungleichmäßigkeiten bei der Größenreduktion und Gewichtsrelation zwischen Spender, Spenderleber, Empfänger und Empfängerleber zu vermeiden, welche dann eventuell zu einem falschen Ergebnis geführt hätten, wurden diese Parameter bei jedem Spender/Empfängerpaar gemessen und in Relation zueinander gesetzt. Durch die gezielte Auswahl weitgehend identischer Paare konnten annähernd identische Gruppen mit Größen-reduzierten Organen erhalten werden (Abbildung 26).


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Abb. 26 : Die beiden Grafiken demonstrieren die sowohl die Gewichtsreduktion der Lebern, als auch die Körpergewichtsverhältnisse der Spender/Empfängerrelationen.

Die Indizes a und b bedeuten, dass die Ad.lacZ Gruppe und die Ad.SOD1 Gruppe keinerlei signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den jeweils anderen 2 Gruppen aufweisen.

Expression der überexprimierten Enzyme

Sowohl β-Galaktosidase, als auch Superoxiddismutase wurden hinsichtlich Ihrer Proteinaktivität im Leberhomogenat untersucht und dabei keine Änderung gegenüber der Versuchsgruppen aus dem Versuchsprotokoll unter 3.1 gefunden. Insbesondere hatte die Leberteilentfernung des zu transplantierenden Organes keinerlei Änderung der Proteinaktivität zur Folge: β-Galaktosidase war ausschließlich in der Ad.lacZ transfizierten [Seite 100↓]Leber zu messen, die SOD Aktivität in den SOD-überexprimierenden Organen war etwa 10-fach gegenüber den anderen Organen erhöht. Ein Vergleich mit nicht-resezierten, aber SOD-überexprimierenden Lebern zeigte keinerlei Unterschiede in der Proteinaktivität. Dieses Ergebnis war auch für nicht transfizierte Lebern zu erhalten, die Resektion hatte nach Transplantation keinen Einfluß auf die SOD Aktivität. Eine eventuell denkbare kompensatorische Hochregulation der SOD konnte unter den aufgeführten Versuchsbedingungen nicht gemessen werden. Diese Aussage ist vor dem Hintergrund interessant, dass einerseits extensiv viele Sauerstoffradikale nach Reperfusion aus dem Mesenterium über die Pfortader in die Leber eingeschwemmt werden und nun bei geringerer Detoxifikationsmasse noch schlechter abgebaut werden können und somit eine zusätzliche toxische Noxe darstellen. Diese Radikale könnten nach intrazellulär eingeschleust werden und dort zu einer Hochregulation der abbauenden Enzyme führen. Weiterhin führt die ausgeprägte Zufuhr und Hochregulation an Entzündungsmediatoren nach Reperfusion unter anderem zu Antworten auf der zellulären Ebene in der kleinen Restleber, was zu einer vermehrten Ausschüttung an SOD führen könnte. Auch vor diesem Hintergrund wurde die Analyse der SOD Aktivität durchgeführt, welche jedoch keine Veränderung der Split-Leber im Vergleich zur nicht resezierten Leber aufzeigte. Auf eine erneute grafische Darstellung der Ergebnisse wird auf Grund der Duplizität mit den vorangegangenen Untersuchungen und der identischen Ergebnisse zwischen den einzelnen Gruppen verzichtet.

Lebertransaminasen AST und ALT im Serum

Auch in diesem Versuch wurden die Transaminasen 8 h nach Reperfusion im Serum bestimmt. Die Transaminasen eignen sich als idealer Parameter zur Evaluation des hepatozellulären Schadens nach Ischämie und Reperfusion und im Modell der Lebertransplantation der Ratte werden die höchsten Spiegel etwa 8 h nach Reperfusion gemessen [199]. Zu diesem Zeitpunkt betrug der Wert für AST bei den Empfängern der nicht Größen-reduzierten Lebern 132 ± 12.82 U/l, jedoch um 900 U/l bei den Empfängern von [Seite 101↓]Split-Lebern, welche entweder ohne Gentransfer oder mit Transfektion von Ad.lacZ waren. Im Gegensatz dazu betrugen die AST Werte bei Empfängern von SOD-überexprimierenden Split-Lebern nur 249 ± 21 U/l (Abbildung 27). Die Werte für ALT entsprechen in der Relation derjenigen der AST-Bestimmung (Abb. 27).

Abb. 27 : Einfluß der Größenreduktion von Lebertransplantaten auf die Lebertransaminasen.

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM beschrieben. Die Statistik wurde mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt, n = 8 pro Gruppe. a: p<0.05 die kein Virus Gruppe verglichen mit der vollständigen Leber und der Ad.SOD1 Gruppe;b:, p< 0.05 die Ad.lacZ Gruppe verglichen der vollständigen Leber und der Ad.SOD1 Gruppe;c: p<0.05 die Ad.SOD1 Gruppe verglichen mit den beiden anderen Split-Leber Gruppen, nicht mit vollst. Leber. Keine signifikanten Unterschiede ergaben sich im Vgl. kein Virus vs. Ad.lacZ und vollst. Leber vs. Ad.SOD1.

Leberfunktion - Bilirubin

Die Aufgabe der Leber Bilirubin zu verstoffwechseln gilt neben den Gerinnungsfaktoren als ausgezeichneter Parameter, die Leberfunktion zu bestimmen. Hierzu wurde das Gesamt-Bilirubin im Serum direkt spektrophotometrisch bestimmt. Als geeigneter Zeitpunkt zur Bestimmung des Parameters erwies sich die Messung 24 h nach Transplantation, da dann ein beginnendes Leberversagen bzw. eine eindeutige Lebermalfunktion sich gut differenzieren ließ. Bei den vollständigen Lebern waren die Werte annähernd im Normbereich von [Seite 102↓]gesunden, nicht-transplantierten Tieren (am verwendeten Rattenstamm 0,05 – 0,15 mg%) und zeigten somit eine sehr gute Transplantatfunktion an, die Werte betrugen etwa 0,21 mg%. Bei den Empfängern von Split-Lebern der Gruppen kein Virus und Ad.lacZ betrugen die Werte hingegen durchschnittlich 2,7 mg%, waren also mehr als 12-fach erhöht. In der Gruppe der Ad.SOD1 transfizierten Split-Lebern betrug der durchschnittliche Wert jedoch nur 0,43 mg%. Somit stand fest, dass die SOD-überexprimierenden Split-Lebern in der Lage sind, den postischämischen Schaden abzuwehren und die Leberfunktion aufrecht zu erhalten.

Abb. 28 : Einfluß der Größenreduktion von Lebertransplantaten auf die Leberfunktion an Hand des Bilirubinstoffwechsels.

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM beschrieben. Die Statistik wurde mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt, n = 8 pro Gruppe.a: p<0.05 die kein Virus Gruppe verglichen mit der vollständigen Leber und der Ad.SOD1 Gruppe; b: p< 0.05 die Ad.lacZ Gruppe verglichen der vollständigen Leber und der Ad.SOD1 Gruppe;c: p<0.05 die Ad.SOD1 Gruppe verglichen mit den beiden anderen Split-Leber Gruppen, und auch mit der Gruppe vollständige Leber. Keine signifikanten Unterschiede ergaben sich im Vgl. kein Virus vs. Ad.lacZ.

Überleben

Nachdem nun eindeutig nachgewiesen worden war, dass eine verminderte funktionsfähige Lebermasse nach Reperfusion einen ausgeprägten postischämischen Parenchymschaden mit [Seite 103↓]verminderter Leberfunktion aufzeigt und dieses essentielle Problem sich durch die Überexpression von SOD dramatisch vermindern ließ, stellte sich weiter die Frage, ob denn der protektive Therapieansatz einen Einfluß auf das Überleben hat. Hierzu wurden das Überleben der transplantierten Empfänger der vier verschiedenen Gruppen für 7 Tage beobachtet. Alle Empfänger von vollständigen Lebern überlebten (16 von 16 Empfänger), jedoch nur 6 von 18 Empfängern von Split-Lebern ohne Virus und 4 von 20 Empfängern von Split-Lebern mit Ad.lacZ-Transfektion. Im Gegensatz überlebten alle 16 Empfänger von Split-Lebern mit Ad.SOD1-Transfektion (Abbildung 29). Dieses Ergebnis bedeutet, dass der deletäre Ausgang nach Transplantation einer zu geringen Lebermasse in Verbindung mit einem ausgeprägten Reperfusionssschaden komplett verhindert werden kann.

Abb. 29 : Einfluß der Größenreduktion von Lebertransplantaten auf das Überleben der Empfänger.

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM beschrieben. Die Statistik wurde mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt; n=16 Gruppe vollständige Leber, n=18 Gruppe kein Virus, n=20 Gruppe Ad.lacZ, n=16 Gruppe Ad.SOD1. a: p<0.05 die kein Virus Gruppe verglichen mit der vollständigen Leber und der Ad.SOD1 Gruppe; b: p<0.05 die Ad.lacZ Gruppe verglichen der vollständigen Leber und der Ad.SOD1 Gruppe. Keine signifikanten Unterschiede ergaben sich im Vergleich kein Virus vs. Ad.lacZ.


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Histologie

Bei den histologischen Untersuchungen der Lebertransplantate 24 h nach Reperfusion ergaben sich keine Überraschungen: Die Nekroserate von vollständigen Transplantaten betrug etwa 12%. Bei den Split-Lebern hingegen zeigten sich für die Gruppen kein Virus und Ad.lacZ Werte um 25% nekrotische Hepatozyten (siehe auch Abbildung 30-32). Bei den Split-Lebern mit SOD-Überexpression hingegen betrug diese Rate im Durchschnitt nur 6%. Auf Grund der Duplizität mit histologischen Analysen in den vorangegangenen Untersuchungen wird auf eine erneute Abbildung der Histologie an dieser Stelle verzichtet, die Aussage ist eindeutig, die Unterschiede der nekrotischen Areale in den verschiedenen Gruppen sind auch in den Abbildungen 30-32 zu erkennen.

3.5.2 Einfluß der Größenreduktion und des Organschadens nach Transplantation einer Split-Leber auf die Leberregeneration und protektive Wirkung von Ad.SOD1

BrdU - Immunhistochemie

Nachdem nun eindeutig gezeigt worden war, dass die kleinen Restlebern als Transplantate ausgeprägte postischämische Parenchymschäden aufwiesen und diese Problematik zur hohen Letalität führte, stellte sich nun die Frage, ob dies eine Auswirkung auf die Leberregeneration hat. Außerdem sollte geklärt werden, ob die Transfektion mit Ad.SOD1 zu einer positiven Veränderung des Regenerationsverhaltens führen kann. Zur Klärung dieser Frage wurden Untersuchungen zur Regeneration durchgeführt. Zunächst wurde eine Immunhistochemie der BrdU (Bromodeoxyuridin) Inkorporation in sich teilenden Hepatozyten durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass in einer vollständigen, transplantierten Leber annähernd keine sich teilende Hepatozyten nachweisbar sind. In der Split-Leber ohne Gentransfer zeigten sich wenige sich teilende Hepatozyten, wie auch in der Gruppe der Ad.lacZ-transfizierten Splitlebern. Bei den SOD-überexprimierenden Splitlebern konnten viele angefärbte Zellen gesehen werden, was [Seite 105↓]für eine aktivierte Zellteilung im Sinne einer Regeneration spricht. Die Abbildungen 30-32 verdeutlichen diese Beobachtung.

Abb. 30 : BrdU-Immunhistochemie zur Darstellung der regenerierenden Zellen; Vollständige Leber.

Die wenigen schwarz gefärbten Punkte zeigen sich teilende Zellen. Sie sind mit roten Pfeilen markiert.Repräsentativer Ausschnitt der histologischen Aufarbeitung von 8 Lebern dieser Versuchsgruppe.

Abb. 31 : BrdU-Immunhistochemie der Ad.lacZ transfizierten Split-Leber.

Die wenigen schwarz gefärbten Punkte zeigen sich teilende Zellen, welche teilweise mit roten Pfeilen markiert sind.Repräsentativer Ausschnitt der histologischen Aufarbeitung von 8 Lebern.


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Abb. 32 : BrdU-Immunhistochemie der Ad.SOD1 transfizierten Split-Leber

Die vielen schwarz gefärbten Punkte zeigen sich teilende Zellen. Auffallend ist die hohe Anzahl dieser Zellen im Vergleich zu den anderen Gruppen Repräsentativer Ausschnitt der histologischen Aufarbeitung von 8 Lebern.

Western Blots von von Cyclin D1 und p21

Die eindeutigen Ergebnisse der Regenerationsfähigkeit von SOD-überexprimierenden Split-Lebern aus der BrdU-Immunhistochemie wurden im nächsten Schritt durch den Nachweis von 2 entscheidenden Faktoren im Zellzyklus Signalweg bestätigt. Hierzu wurden Cyclin D1 und p21 als regulierende Faktoren gewählt, welche im Western Blot von homogenisiertem Gewebe 24 h nach Reperfusion untersucht wurden. Die Ergebnisse entsprachen denen aus der Immunhistochemie, die deutlich vermehrte Expression von Cyclin D1 und p21 läßt die Schlussfolgerung zu, dass die Organprotektion mittels Ad.SOD1 zu einer deutlich akzellerierten Zellproliferation führte. Diese Ergebnisse sind in der Abbildung 33 unten dargestellt, die gezeigten Blots sind repräsentativ für ein untersuchtes Kollektiv von 8 Tieren pro Gruppe.


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Abb. 33 : Expression von Cyclin D1 und p21.

Spur 1, 2: Scheinoperiertes Tier, Leber nicht manipuliert. Spur 3, 4: vollständige Leber, transplantiert. Spur 5, 6, 7: Splitleber, kein Virus. Spur 8: Splitleber, Gentransfer mitAd. lacZ. Spur 9, 10, 11: Splitleber, Gentransfer mit Ad.SOD1. Control: Positvkontrolle. α-Tubulin verwendet als positiver Marker und Quantifizierung der untersuchten Proteinmenge, welche pro Spalte identisch war.

Bestimmung der Lebermasse als Maß der Regenerationsfähigkeit

Neben diesen beiden eindeutigen Untersuchungstechniken und Nachweismethoden für Zellregeneration wurde auch noch das Lebergewicht als relativ „grober“, aber ebenso eindeutiger Parameter für die Leberregeneration bestimmt. Die Veränderungen im Lebergewicht wurden 1 Woche nach Transplantation bestimmt, die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung von einer möglichen Veränderung des Körpergewichtes entsprechend der unter Punkt 2.5 aufgeführten Berechnungsformel. Die zuvor erhobenen Befunde spiegelten sich in der deutlichen Größenzunahme des Ad.SOD1-behandelten Organes wieder, während die beiden anderen Größen-reduzierten Organe eher geringfügig an Gewicht im Vergleich zur Ausgangsbestimmung verloren hatten (Abb. 34). Die zum Vergleich untersuchten vollständigen Lebern 1 Woche nach Transplantation zeigten annähernd keine Gewichtsveränderung, oder aber minimale Gewichtssteigerungen, was möglicherweise ein Ausdruck eines geringfügigen Ödemes sein könnte (Daten nicht aufgeführt).


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Abb. 34 : Einfluß der protektiven Therapie mit Ad.SOD1 bei Splitlebertransplantaten auf die Leberregeneration im postoperativen Verlauf:

Die Lebertransplanate wurden vor Implantation und 1 Woche nach LTx gewogen. Die relative Veränderung (in %) wurde in Abhängigkeit von dem Gewicht des Empfängertieres bestimmt. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM beschrieben. Die Statistik wurde mittels zwei-Wege ANOVA in Verbindung mit dem Student-Newman-Keuls posthoc Test ermittelt; n=8 pro Gruppe. a: p<0.05 die Ad.lacZ Gruppe verglichen mit der Ad.SOD1 Gruppe.;b: p<0.05 die Ad.SOD1 Gruppe verglichen mit der kein Virus Gruppe. Keine signifikanten Unterschiede ergaben sich im Vergleich der Gruppen kein Virus vs. Ad.lacZ.


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14.12.2004