4 Diskussion

4.1 Leberdysfunktion und Ischämie/Reperfusionsschaden

Da sich ein primäres Organversagen trotz der seit nunmehr über 2 Jahrzehnten bestehenden erfolgreichen Entwicklung der Lebertransplantation immer noch in 5-30% aller Lebertransplantationen entwickelt, die klinischen Studien hierzu zeigen eine weite Variationsbreite und die Definition des Organversagens, welches zu einer substantiellen Morbidität und Mortalität führt, ist nicht einheitlich, ist die Etablierung neuer, suffizienter Therapieformen dringend notwendig. Das primäre Organversagen stellt eine wesentliche Ursache der frühen postoperativen Morbidität und Mortalität nach Lebertransplantation dar und steht im Mittelpunkt der pathophysiologischen Mechanismen, welche zum Organversagen führen [199, 85]. Freie Sauerstoffradikale sind entscheidend an diesem pathologischen Geschehen beteiligt, sie werden im Wesentlichen von Kupfferzellen, Leukozyten und Hepatozyten produziert [57, 200, 201]. Freie Sauerstoffradikale entstehen auch an anderen Quellen, wie Mitochondrien, dem Cyclooxygenasestoffwechsel und dem Xanthinoxidasestoffwechsel, welche nicht nur in Kupfferzellen, sondern auch in Hepatozyten lokalisiert sind [202]. Diese toxischen Sauerstoffradikale führen zu schwerem hepatozellulären Schaden [57]. Verschiedene Versuche und Ansätze wurden durchgeführt und evaluiert, um den I/R-Schaden nach warmer Organischämie oder aber Organtransplantation durch die Administration von externen Radikalfängern zu vermindern. Beispielsweise wurden die Transplantate vor der Implantation mit einer speziellen Lösung (Carolina Rinse Solution) gespült, welche Antioxidantien und Radikalfänger enthielt. Durch diese Lösung konnte im Tierexperiment der Parenchymschaden nach Lebertransplantation vermindert werden und die Überlebenswahrscheinlichkeit gesteigert werden [71]. Durch die intravenöse Injektion von extrazellulärer SOD [203] konnten die Lipidperoxide vermindert werden und das Überleben geringfügig gesteigert werden, jedoch wurden die Lebertransaminasen durch diese Therapie [Seite 110↓]nicht vermindert, was auf einen minimalen Effekt auf den Parenchymschaden zurückzuführen ist [140]. Im Gegensatz zur externen Zufuhr von SOD, bei der die externen Proteine im Blutstrom durch die Proteasen rasch zerstört werden, sollte folglich ein Anstieg der antioxidativen Enzyme im Parenchym des Transplantates im Sinne einer kontinuierlichen Expressions- und Aktivitätssteigerung vor der Transplantation zu einer drastischen Minimierung des Organschadens führen.

Der Gentransfer stellt erstmals eine suffiziente Möglichkeit dar, intrazellulär ein gewünschtes Protein zu exprimieren und seine Aktivität und Funktion entsprechend der Zielvorgaben zu steuern, was insbesondere eine maximale Expression bedeuten kann. Dabei kann die gesteigerte Expression des funktionstüchtigen Proteins von lange anhaltender Dauer sein. Diese Ziele konnten in der Vergangenheit durch die externe Administration eines Proteins nicht erzielt werden. Als neue Entwicklung der vergangenen Jahre haben sich rekombinante Adenoviren in verschiedenen Modellen als hocheffektive Vektoren dargestellt und sie sind in der in vivo Forschung etabliert, auch wenn verschiedene negative Nebenwirkungen in Betracht zu ziehen sind und die Applikationsmenge auf Grund von immunologischen Reaktionen beim Empfänger limitiert ist. Erste klinische Versuche waren nicht nur erfolgreich, sondern im Gegensatz auch von fatalem Ausgang gekennzeichnet. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass der adenovirale Gentransfer von SOD den Organschaden nach warmer Ischämie von Leber [166] und Myokard [167] deutlich minimieren kann. In diesen Studien konnte eine substanzielle Reduktion von Parenchymschaden und Verbesserung der Organfunktion nachgewiesen werden. Das gleiche Konzept wurde im Modell der warmen intestinalen Ischämie in transgenen Mäusen, welche Cu/Zn-SOD überexprimierten, verfolgt und als höchst effektiv empfohlen [204]. Dieser beschriebene therapeutische Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals auf die Organtransplantation ausgedehnt und angewendet. Dabei wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine dauerhaft erhöhte Expression von SOD, deren Gen mittels eines Adenovirus in die [Seite 111↓]Hepatozyten eingeschleust worden war, die Leber vor dem Ischämie/Reperfusionsschaden in einem Modell der Lebertransplantation der Ratte schützen würde. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht.

4.2 Adenovirale Gene werden erfolgreich in die Leber importiert

Es konnte bereits in der Vergangenheit demonstriert werden, dass der adenovirale Gentransfer auch bei Lebern erfolgreich ist, welche als Organtransplantate benutzt werden und hierzu für einen bestimmten Zeitraum kalt konserviert werden, und die Organkonservierung beeinflußt den Gentransfer nicht [165, 168, 205]. Auch in der vorliegenden Studie konnte in Übereinstimmung mit den genannten Arbeiten eindeutig gezeigt werden, dass der adenovirale Gentransfer erfolgreich für die Transplantationsmedizin genutzt werden kann. Zum Beispiel zeigte die immunhistochemische Darstellung der β-Galaktosidase, dass mindestens 80% aller Hepatozyten das transfizierte Gen exprimieren. Diese Aussage gilt nicht nur für gesunde Lebern, sondern auch für die vorgeschädigten, marginalen Lebern (Abbildungen 3 und 10). Hierbei handelt es sich um eine neue Erkenntnis, bisher wurde der suffiziente adenovirale Gentransfer in marginalen, verfetteten Lebern nicht beschrieben. Überaus erfolgreich war der adenovirale Gentransfer von dem Zielprotein SOD (Abbildungen 5, 11, 12, 18). Der quantitative Unterschied zwischen Dichtebestimmung des Western Blots und der Aktivitätsanalyse im Homogenat kann mit der relativen Unschärfe der Dichtemessung erklärt werden, die Visualisation der Relationen und damit das Ziel dieser Untersuchungen ist jedoch eindeutig. War es noch relativ offensichtlich, ein pflanzliches Protein in einem Säugetierorganismus nachzuweisen und die Aktivität des unnatürlichen Proteins darzustellen, so war es um so spannender, ein im Organismus des Tieres ubiquitär vorkommendes Enzym in deutlich erhöhter Konzentration vorzufinden. Dabei gilt diese Feststellung unabhängig von der Phase der kalten Ischämie und der Dauer dieser, da die Aktivitäten vor und nach kalter [Seite 112↓]Ischämie identisch waren. Hinsichtlich der SOD Aktivität ist jedoch festzustellen, dass die Proteinaktivität im Homogenat unter der Verfettung der Leber leidet: Sowohl bei den grobtropfig als auch bei den feintropfig verfetteten Lebern zeigte sich ein Unterschied in den SOD Aktivitäten bei den gesunden und verfetteten Lebern, die verfetteten Lebern zeigten eine geringere Steigerung der SOD-Aktivität, auch wenn dieser Unterschied in den hier gezeigten Versuchsreihen nicht signifikant ist. Dies könnte man durch eine relative kleine Tieranzahl pro Gruppe erklären, wobei bei der berechneten Statistik die Power des einzelnen Vergleiches im geforderten Zielbereich war, die statistische Berechnung und Aussage war ohne jegliche Einschränkung und somit war das Argument entkräftet. Ebenso zeigte sich ein deutlicher Unterschied in der maximalen Aktivität der SOD überexprimierenden Tiere zwischen gesund und verfettet, die gesunden Lebern erreichten deutlich höhere Aktivitätswerte, die Methodik der Berechnung war identisch (vergleiche Abbildung 5 mit 11-12). Auf das herausragend gute Endresultat der SOD-überexprimierenden Lebern hatte dies jedoch keinen Einfluß.

4.3 Die Verwendung der zytosolischen Isoform der SOD

In der ersten Studie zur Beantwortung der Fragestellung 2 (Welchen Einfluß hat die Überexpression von Superoxiddismutase auf die Transplantatfunktion, den postischämischen Transplantatschaden und folglich auf das Überleben nach Lebertransplantation?) wurde die zytosolische Isoform der SOD (Cu/Zn-SOD) als das effektivste „Radikalfängersystem“ angesehen und ausgewählt. Die Auswahl beruhte auf der Überlegung, dass die Radikalbildung nicht nur in Mitochondrien, sondern auch im Zytosol der Mitochondrien stattfindet und somit die Cu/Zn-SOD am besten die zytotoxischen Eigenschaften der Sauerstoffradikale neutralisieren könnte. Wie bereits oben angesprochen, werden bei der Reperfusion der Leber die toxischen Radikale hauptsächlich von aktivierten Kupfferzellen und teilweise von Leukozyten gebildet [57, 200, 201, 200, 201]. Die zytosolische Isoform könnte der mitochondrialen Isoform in der Zellprotektion insofern überlegen sein, als dass [Seite 113↓]wahrscheinlich nach Reperfusion der Großteil der Sauerstoffradikale von Kupfferzellen produziert wird und zuerst das Zytosol der Hepatozyten nach Aufnahme in die Zelle erreicht, bevor die Radikale die Mitochondrien erreichen. Im Model der warmen hepatischen Ischämie in der Maus wurden sehr hohe Titer der mitochondrialen Isofom verwendet (1x1011 PFU), welche dann auch einen überzeugend protektiven Effekt zeigten [166]. In der in dieser Arbeit vorgestellten Studie wurde in einem wesentlich größeren Säugetier eine um etwa 1,7 Potenzen niedrigere Dosierung eines Adenovirus jedoch mit dem Gen für die zytosolische Isoform benutzt (Ad.SOD1, 3x109 PFU) und in diesem Model mit wesentlich ausgeprägterem Schaden ein deutlich protektiverer Effekt erzielt. Folglich darf man daraus schließen, dass die zytosolische Cu/Zn-Isoform der Superoxiddismutase weitaus effektiver in der Minimierung der zerstörenden Wirkung von Sauerstoffradikalen in Hepatozyten als die Mn-Isoform ist.

4.4 Der protektive Effekt von SOD auf Leberschädigung und Überleben nach LTx

Wie oben dargestellt führt der Gentransfer von Cu/Zn-SOD und die Inkubation über 72 h zu einem deutlichen Anstieg der SOD Aktivität in den transplantierten Lebern, welche 8 h nach Reperfusion untersucht werden. Dieser minimierte Parenchymschaden konnte an Hand der um mindestens 50% reduzierten Lebertransaminasen und den deutlich reduzierten Leberzellnekrosen bewiesen werden. In der Transplantationsmedizin läßt sich die Effektivität einer therapeutischen Maßnahme, welche das Transplantat als Ziel hat, am Überleben des Organempfängers schlußendlich beurteilen (Abbildungen 6 und 7). In der ersten Studie dieser Arbeit konnte das Überleben durch den Gentransfer von 20 auf 100% verbessert werden. Dieses Ergebnis beweist eindeutig, dass die Überexpression von Cu/Zn-SOD äußerst effektiv darin ist, den postischämischen Leberschaden nach Transplantation zu minimieren und diese Therapie resultiert in einer wesentlich verbesserten Organfunktion. Die Beobachtungen [Seite 114↓]stützen die Hypothese, dass Sauerstoffradikale eine im Zentrum stehende Ursache des Ischämie/Reperfusions-bedingten Organschadens nach Lebertransplantation darstellen.

4.5 Das Problem der marginalen, verfetteten Lebern als Spenderorgane

Ein nicht geringer Anteil der Spenderorgane zeigt einen nicht unerheblichen Verfettungsgrad auf, wobei die Zahlen in der Literatur leider uneinheitlich sind. Jedoch ist es eindeutig bewiesen, dass die Leberverfettung, welche in aller Regel durch chronischen Alkoholkonsum hervorgerufen wird, eine deutlich erhöhte Rate an primärem Organversagen bzw. Organdysfunktion als Transplantat nach Lebertransplantation aufweisen [33]. Folglich werden viele potentiellen Spenderorgane auf Grund ihrer Verfettung abgewiesen, obwohl diese Organe dringend benötigt würden. Neue Therapiemöglichkeiten sind erforderlich, um diese gesuchten Organe „transplantabel“ zu machen und den Spenderpool zu erweitern. Die durch chronischen Alkoholgenuß verfetteten Lebern zeigten in einem Leberperfusionsmodell eine erhöhte Sauerstoffradikalproduktion [174]. Weiterhin konnte in einem Modell der Transplantation von Fettlebern gezeigt werden, dass der Reperfusionsschaden durch die Minimierung von Sauerstoffradikalen, was durch eine Inaktivierung der Kupfferzellen erreicht wurde, dramatisch vermindert werden konnte [206]. Der adenovirale Gentransfer von SOD könnte folglich auch marginale Lebern zu sicher verwendbaren Transplantaten verändern.

Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit bewiesen, die Cu/Zn-SOD überexprimierenden Fettlebern zeigten nach Transplantation nicht nur einen deutlich verminderten Parenchymschaden (Abb. 13, Tabelle 1), sondern auch eine hochsignifikante Verbesserung des Überlebens der Empfänger: Die Empfänger von verfetteten Organen überlebten nicht, jedoch überlebten alle Empfänger von SOD-überexprimierenden Fettlebern (Tabelle 1). Diese Daten beweisen eindeutig, dass der Gentransfer von Cu/Zn-SOD ein [Seite 115↓]geeignetes Therapieverfahren darstellt, um auch hochgradig verfettete Spenderlebern dem Organpool als „hochwertige“ Transplantate zuzuführen und das primäre Organversagen dieser Lebern zu verhindern. Dieses Verfahren würde zu der dringend benötigten Erweiterung des Spenderpools führen und könnte dazu beitragen, die Versterberate der Patienten auf der Warteliste zu reduzieren.

4.6 Die Rolle der Sauerstoffradikale und der Einfluß auf Transkriptionsfaktoren

Zuvor wurde auf die zweifelsfrei entscheidende Rolle der Sauerstoffradikale beim Ischämie/Reperfusionsschaden eingegangen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die SOD-Überexpression zu einer deutlichen Verminderung der freien Sauerstoffradikale in der Leber führen würde und dies sei der wesentliche Mechanismus der protektiven Wirkung der Ad.SOD1-Therapie. Um diese Hypothese zu beweisen wurden mittels der ESR-Methode (ausführliche Beschreibung der Technik unter Materialien und Methoden) freie Radikaladdukte in der sezernierten Galleflüssigkeit 3 h nach Reperfusion gemessen. Hierbei konnte eindeutig festgestellt werden, dass in der Tat diejenigen Lebern deutlich vermindert freie Radikale sezernieren, welche Cu/Zn-SOD überexprimieren (Abb. 14, 15). Darüber hinaus unterstützen diese ESR-Ergebnisse die bekannte Hypothese, dass toxische Sauerstoffradikale eine wesentliche Ursache des Ischämie/Reperfusions-bedingten Organschadens nach Lebertransplantation darstellen.

Die Transkriptionsfaktoren wie NF-κB sind wesentliche Mediatoren des zellulären Stresses und außerordentlich sensibel hinsichtlich Veränderungen im Redoxstatus der Zelle [166]. NF-κB hat sowohl protektive, als auch schädigende Einflüsse auf den Ischämie/Reperfusionsschaden der Leber und wahrscheinlich besteht im Normalzustand ein Gleichgewicht zwischen proinflammatorischen und antiapoptotischen Funktionen von NF-κB [166, 207]. In den hier gezeigten Experimenten führte die kalte Ischämie und Reperfusion der [Seite 116↓]Lebern verbunden mit der übermäßigen Produktion von freien Sauerstoffradikalen zu einer deutlichen Aktivierung von NF-κB und JNK nach Transplantation. In der Vergangenheit konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob die JNK Aktivierung als Antwort auf den I/R Schaden protektiv oder aber zellzerstörend wirkt [188]. Erstmals konnte in der vorliegenden Studie nachgewiesen werden, dass die reduzierte Bildung von freien Radikalen in den Cu/Zn-SOD überexprimierenden Lebern auch zu einer Reduktion der Aktivierung von NF-κB und JNK nach Transplantation führt. Mit anderen Worten, die Korrelation von hepatozellulärem Schaden und Überleben mit der JNK Aktivierung zeigt, dass die JNK Aktivierung nach Reperfusion offensichtlich zytotoxisch wirkt. Diese Ergebnisse legen die Schlußfolgerung nahe, dass es ein Zusammenspiel zwischen dem Redoxstatus in Hepatozyten nach Reperfusion und der Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren geben muß.

JNK war der einzige, hier untersuchte Vertreter der MAP-Kinase Gruppe, der durch Ischämie/Reperfusion kräftig aktiviert wurde und durch CU/Zn-SOD Überexpression annähernd vollständig inhibiert wurde. Wie bereits in anderen Studien gezeigt wurde, war p38 durch Ischämie/Reperfusion nicht aktiviert worden [188]. Überraschenderweise wurde die IKK Aktivität durch Ischämie/Reperfusion nur geringfügig aktiviert, obwohl eine ausgeprägte Aktivierung von NF-κB zu verzeichnen war. Im Allgemeinen bedarf die Aktivierung von NF-κB die Aktivierung des IKK Komplexes, um den Inhibitor von κB zu phosphorylieren und zu degradieren und somit NF-κB freizusetzen. Jedoch scheint NF-κB in diesem Falle über einen IKK unabhängigen Mechanismus aktiviert zu werden, wie es unter den Bedingungen des oxidativen Stresses vorkommen kann [208]. Somit können die hier dargestellten Ergebnisse erklärt werden und unterstützen die von Li und Karin beschriebenen Beobachtungen, welche die Ischämie/Reperfusions-bedingte Aktivierung von NF-κB beschrieben hatten.

Die Überexpression von Cu/Zn-SOD führte zur annähernd kompletten Inhibition der JNK Aktivität, jedoch war die AP1 Bindungsaktivität noch eindeutig darstellbar (diese Daten [Seite 117↓]wurden oben nicht gezeigt). Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit einer anderen Studie, welche in vitro den Einfluß der Überexpression von Mn-SOD auf die TNFα Aktivierung untersuchte und eine reduzierte Aktvitität von NF-κB und JNK beschrieb [209]. In dem hier durchgeführten in vivo Modell blockiert die Überexpression von Cu/Zn-SOD sowohl NF-κB, als auch JNK und dieser Effekt hängt mit der verbesserten Transplantatfunktion und höherer Überlebensrate zusammen. Es ist also denkbar, dass die JNK Aktivierung durch Sauerstoffradikale vermittelt wird und ein zytotoxisches Signal freisetzt, welches durch Ad.SOD1 vermindert werden kann. Die JNK Aktivierung durch maximale Radikalstimulation kann fatale Folgen haben, im Gegensatz dazu zeigen Ad.SOD1 transfizierte Lebern nur geringe Zeichen des zellulären Schadens und funktionieren problemlos. Die positiven Effekte der Verminderung der NF-κB Aktivierung durch Ad.SOD1 können auch damit erklärt werden, dass NF-κB den Zelltod mittels des Fas/FasL Systemes steuert [210].

Es ist bekannt, dass die JNK Aktivierung eine Rolle bei der Induktion der Apoptose spielt, im Gegensatz dazu inhibiert NF-κB die Apoptose [211]. Die komplette Inhibition von NF-κB führte zu verstärktem Leberzellschaden und induzierte die Apoptose von Hepatozyten [207]. Folglich ist die komplette Inhibition von NF-κB im Rahmen des Ischämie/Reperfusionsschadens nicht nützlich. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse legen die Schlußfolgerung nahe, dass eine partielle Inhibition der Aktivierung von NF-κB in Verbindung mit einer reduzierten JNK Aktivierung zu einer verminderten Apoptoserate führt und somit ein gewünschtes Ziel der Organprotektion nach Reperfusion darstellt. Offensichtlich ist dieser Mechanismus streng von der Quantität der toxischen Sauerstoffradikale intrazellulär abhängig, da die Apoptoserate direkt in Relation mit dem protektiven Potential der überexprimierten SOD-Isoform steht (siehe Tabelle 2). In den hier gezeigten Experimenten war der hepatozelluläre Schaden immer mit minimaler Apoptose, [Seite 118↓]geringer NF-κB und JNK Aktivierung vergesellschaftet. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei ausgeprägtem Parenchymschaden immer eine hohe Apoptoserate, sowie eine ausgeprägte NF-κB und JNK Aktivierung. Diese Ergebnisse unterstützen die oben bereits zitierte Hypothese, dass ein günstiges Gleichgewicht zwischen proinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften von NF-κB bestehen muß, um den hepatozellulären Schaden nach Ischämie/Reperfusion zu minimieren.

4.7 Das protektive Potential der drei SOD-Isoformen

Wie in der Einleitung bereits ausführlich dargelegt existieren in der Leber drei verschiedene Isoformen der Superoxiddismutase, welche den jeweiligen Zellkompartimenten zugeordnet werden. Es wurde die Frage gestellt, welchen Einfluß die Überexpression jeder einzelnen Isoform jeweils auf den Reperfusionsschaden hat und diese Frage konnte mit den erhaltenen Ergebnissen eindeutig beantwortet werden. Wie oben ausführlich beschrieben und diskutiert vermindert die SOD-Überexpression die freien Radikale, also das wahrscheinlich wichtigste toxische Agens nach Reperfusion in der Leber, und vermindert somit die Organschädigung. Die Kupfferzellen produzieren den größten Anteil an freien Radikalen und sezernieren diese in den extrazellulären Raum. Von dort aus werden die toxischen Radikale zuerst in das Zytosol der Hepatozyten aufgenommen und richten dort zellulären Schaden an, bevor sie in die Mitochondrien eingeschleust werden können. Folglich läßt es sich einfach erklären, warum die zytosolische Isoform der SOD so effektiv in ihrer protektiven Wirkung ist, denn sie detoxifiziert die Radikale, welche im Zytosol produziert werden, aus dem extrazellulären Raum aufgenommen werden und im Mitochondrien produziert werden, die dort im Überschuß vorhanden sind und in das Zytosol abgegeben werden. Somit kann man auch erklären, warum unter identischen Grundvoraussetzungen die Überexpression von Mn-SOD weniger protektiv ist als diejenige von Cu/Zn-SOD. In dieser Studie wurde außerdem festgestellt, dass die SOD Aktivität in der Leber in den mit Ad.SOD1 transfizierten Organen [Seite 119↓]etwas höher war, als in den mit Ad.SOD2 transfizierten Lebern, obwohl die Konzentration an adenoviralem Vektor (3x109 PFU) in jeder Gruppe identisch war. Die Differenz war jedoch statistisch nicht signifikant.

Sauerstoffradikale, welche im Überschuß in Mitochondrien produziert werden, diffundieren wahrscheinlich in das Zytosol. Außerdem beeinflußt der Status der Radikale in Mitochondrien die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren [209]. Sobald exzessive Mengen an freien Radikalen in Mitochondrien anfallen und in die Funktion derer eingreifen, stirbt die Zelle auf Grund des Energiemangels [212]. Dies mag die Erklärung für die Zellprotektion durch Überexpression von Mn-SOD sein. Außerdem kann man spekulieren, dass Mn-SOD in das Zytosol transportiert wird und dort freie Radikale abbauen kann.

In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Transfektion der Spenderleber mit Ad.SOD3 keinen Einfluß auf den Ischämie/Reperfusionsschaden hat (Abb. 20, Tabelle 2). Im Serum der Spendertiere kann man 72 h nach Injektion von Ad.SOD3 deutlich erhöhte Konzentrationen von SOD nachweisen, da Ad.SOD3 in vielen verschiedenen Organen zur Produktion von extrazellulärer SOD führt (Abb. 19). Im Gegensatz dazu kann man in den Empfängern von Ec-SOD überexprimierenden Lebern keine erhöhte Serumkonzentration von SOD 8 h nach Reperfusion nachweisen. Zumindest sind die in diesen Versuchen verwendeten Dosierungen des adenoviralen Vektors nicht dazu geeignet, systemisch eine Wirkung bei „Ein-Organ-Transfektion“ hervorzurufen. Die Quantität der Ec-SOD, welche in dem hier vorliegenden Fall der genetisch modifizierten, transplantierten Leber hauptsächlich von Kupfferzellen produziert wird, erscheint im Vergleich mit der Gesamtmenge an SOD im Serum sehr gering zu sein, sodass Veränderung aus den Kupfferzellen heraus insgesamt nicht ins Gewicht fallen. Aus den Ergebnissen läßt sich folgern, dass die Überexpression der Ec-SOD überwiegend von Kupfferzellen, welche in der Tat in vivo von Adenoviren infiziert werden [213], nicht [Seite 120↓]ausreichend ist, um die großen Mengen von Sauerstoffradikalen, welche von den Kupfferzellen gebildet werden, unter den gegebenen Bedingungen dieser Studie abzubauen.

Vor Kurzem konnte in einer experimentellen Studie gezeigt werden, dass die intramuskuläre Infektion mit Ad.SOD3 zu einem deutlichen Anstieg der gesamten SOD Aktivität im Serum führt und signifikant den Ischämie/Reperfusionsschaden in einem Modell der warmen Leberischämie in der Ratte minimiert [214]. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass die von Kupfferzellen produzierten Radikale wesentlich am pathologischen Geschehen beteiligt sind und dass die SOD offensichtlich auch durch zelluläre Membranen transportiert wird. Jedoch kann diese einfache Strategie der intramuskulären Infektion von einem adenoviralen Vektor nicht in die klinische Anwendung übertragen werden, da die Transplantatempfänger immunsuppremiert sind und sich unvorhersehbare, unkontrollierbare immunologische Zwischenfälle ereignen könnten.

Auch in den mit Ad.SOD2 transfizierten Lebern zeigte sich eine deutliche Reduktion der Aktivität von NF-κB und JNK, welche jedoch bei Weitem nicht so ausgeprägt war wie bei Ad.SOD1 infizierten Lebern. Dieses Ergebnis kann man insofern erklären, als dass eine geringere protektivere Wirkung von der Ad.SOD2 Therapie festzustellen war, was wahrscheinlich auf eine geringere Kapazität der Detoxifikation von Sauerstoffradikalen beruht und folglich auch zu einer gesteigerten Aktivierung von NF-κB und JNK führt. In Zusammenschau mit den Ergebnissen der Ad.SOD1 transfizierten Lebern ergibt sich ein weiterer Hinweis darauf, dass Sauerstoffradikale als zentrale Vermittler der NF-κB und JNK Aktivierung dienen.

Wie es zu erwarten war, hatte Ad.SOD3 keinen Einfluß auf NF-κB und JNK, da die intrazellulären Radikale nicht von SOD3 detoxifiziert wurden.


[Seite 121↓]

4.8  TNFα Aktivität

Die TNFα Produktion durch aktivierte Kupfferzellen, welche durch Ischämie/Reperfusion verstärkt wird, spielt eine zentrale Rolle in der initialen Phase nach pathophysiologischer Ischämie und Reperfusion und zählt zu den verantwortlichen Stimulatoren für NF-κB und JNK [215, 216]. In der bereits oben beschriebenen Arbeit von Zwacka et al. in Nature Medicine von 1998 wird beschrieben, daß die Veränderung von freien Radikalen theoretisch auch zur Reduktion von TNFα Aktivität führen müßte. Nur dazu konnten die Autoren keine eindeutige Untersuchung zeigen, da Sie keine verwertbaren Ergebnisse in ihrem Modell erhalten hatten. Im Gegensatz dazu wurden in der hier vorliegenden Studie diese Fragestellung in dem Modell der Lebertransplatation mit einer sensibleren Technik untersucht und dann mittels eines RNA-Protection Assay sehr interessante Ergebnisse erhalten. Darin kommt eindeutig zum Ausdruck, daß bei dem hochkomplexen und multifaktoriellen Modell der Lebertransplantation von Fettlebern ein deutlicher Einfluß der Generierung von freien Radikalen auf die Aktivität von TNFα zu verzeichnen ist und sowohl die Überexpression von Cu/Zn-SOD wie auch von Mn-SOD zu einer signifikanten Reduktion der TNFα-Aktivität führt mit dem Unterschied, dass die protektive Wirkung von Cu/Zn-SOD erneut ausgeprägter ist, als die von Mn-SOD. Die Ec-SOD Behandlung hat auch in dieser Hinsicht keinerlei protektive Wirkung zeigen können. Diese Ergebnisse hinsichtlich der SOD-Einwirkung auf TNFα sind eine neue Erkenntnis, sie wurden in der Vergangenheit nicht dargestellt. Die offensichtlich enge Kommunikation zwischen Sauerstoffradikalen und TNFα Aktivierung wurde hiermit erstmals aufgezeigt.

4.9 Protektion von Split-Lebern durch Gentransfer von SOD

Aus den Ergebnissen der Vorarbeiten und der bearbeiteten Teilprojekte ergab sich, dass der adenovirale Gentransfer einen wesentlichen Nachteil für die Lebertransplantation aufweist und dies ist der Faktor Zeit. Unter klinischen Bedingungen wird ein hirntoter Patient zum [Seite 122↓]Organspender nach vollständiger Hirntoddiagnostik und gegebener Einverständnis entsprechend der nationalen Gesetzgebung des jeweiligen Landes. Nach Freigabe zur Organspende vergehen i.d.R. nur wenige Stunden, bis die Organentnahme stattfindet. Einem hirntoten Organspender sollten zügig nach abgeschlossener Hirntoddiagnostik die Organe entnommen werden, da der Verstorbene häufig zunehmend kardiozirkulatorisch instabil wird, infektionsgefährdet ist, das Immunsystem schrittweise versagt, die Nierenfunktion instabil wird und die Temperaturregulation versagt. Trotz intensivmedizinischer Maßnahmen ist diese Spirale, welche zum Multiorganversagen führt, kaum zu verzögern.

Daher ist ein benötigtes Zeitintervall von 72 Stunden zwischen Injektion eines adenoviralen Vektors und der maximalen Proteinexpression deutlich zu lange für diese Anwendung in einer klinischen Studie zum gegenwärtigen Zeitpunkt. Einen hochwahrscheinlichen Organspender bei noch nicht abgeschlossener Hirntoddiagnostik quasi prophylaktisch mit einem viralen Konstrukt zu infizieren, ist aus vielerlei Gründen nicht durchführbar. Bei den Überlegungen zu einem möglichen klinischen Hintergrund bzw. Anwendungsbereich des Gentransfers durch einen Vektor wurde die neue klinische Entwicklung der Lebendspende definiert. Hierbei könnte man geplant den Organspender mit einem adenoviralen Gentransfer von Cu/Zn-SOD behandeln und würde damit folgende Verbesserungen erzielen:

  1. Die zu entnehmende Lebermasse kann vermindert werden, da statt etwa 15-20% Leberzellnekrose nach Reperfusion nur noch mit etwa 2%-5% gerechnet werden muß. Somit reduziert sich das minimal zu transplantierende Organvolumen.
  2. Der Organspender wird zusätzlich vor einem Organversagen geschützt. Bei der Organentnahme muß die Leber des Spenders häufig einer kurzzeitigen warmen Ischämie (Pringle-Manöver) unterzogen werden, welche zu einem zusätzlichen Schaden auch für das verbleibende Organ führt. Durch den Gentransfer kann dieser Schaden minimiert werden, der im Spender verbleibende Organanteil kann die anfallenden freien Radikale besser abbauen. Zudem könnte bei Bedarf oder anatomischen Gegebenheiten auch etwas mehr Lebergewebe als üblich entnommen werden, ohne den Spender zu gefährden, und somit dem Empfänger mehr [Seite 123↓]Parenchym zur Verfügung zu stellen, um dem Ischämie/Reperfusionsschaden besser verarbeiten zu können. Dies ist insbesondere wichtig, da die linke oder auch rechte Hemileber in ihrer Größe ausgeprägten individuellen Schwankungen unterliegt. Weiterhin wird zur Leberlebendspende für erwachsene Empfänger an den meisten Zentren große Teile der rechtseitigen Hemileber verwendet. Das Organversagen der Restleber stellt eine mögliche, gravierende Komplikation dar.
  3. Protektion des Spenderorganes: Die Leberlebendspende wurde initial vornehmlich für die pädiatrische Organtransplantation eingeführt. Mittlerweile wurde dieses Verfahren vor dem Hintergrund des weltweiten Organmangels und der Todesrate auf der Warteliste auch für die adulte Lebertransplantation weiterentwickelt. Religiöse Hintergründe hinsichtlich der Leichenspende im asiatischen Raum stellen eine weitere Motivation zu diesem Verfahren insbesondere in diesen Länderen dar. Patienten, welche sonst kaum eine realistische Chance auf ein Spenderorgan hätten (maligne Grunderkrankung wie z.B. Hepatozelluläres Carcinom, oder Alter über 65 Jahre), können so transplantiert werden. Bei den adulten Empfängern ist die mögliche Rate an primärem Organversagen wegen “small for size liver“ besonders kritisch und dies ist eine gefürchtete Komplikation. Wenn man z.B. 60% einer adulten Leber transplantiert, fallen quasi rund 20% dieser Restleber wegen postischämischer Nekrose weg, d.h. das eigentlich transplantierte Volumen an funktionsfähigen Hepatozyten reduziert sich deutlich. Dieses Problem könnte man durch den Gentransfer von Cu/Zn-SOD verhindern, das aktive, funktionierende Volumen an Hepatozyten wäre größer und somit wahrscheinlich die Rate an primärem Organversagen niedriger.
  4. Die Leberlebendspende ist ein elektiver Eingriff, die Lebertransplantation wird geplant. Daher wäre eine adenovirale Infektion oder anderes Gentransferverfahren des Spenders und ein nachfolgendes Zuwarten von 3 Tagen vor Organteilexplantation problemlos möglich. Somit ist ein wesentlicher Nachteil des Gentransfer-Verfahrens für diese Anwendung nicht mehr existent.
  5. Aus Literaturangaben ist bekannt, dass ischämisch geschädigte Organe nach partieller Resektion eine deutlich schlechtere Regeneration zeigen, als reduzierte Organe ohne zusätzlichen ischämischen Schaden. Daraus ist zu folgern, dass Cu/Zn-SOD überexprimierende Organe eine deutlich bessere Regeneration aufweisen müssten, als solche ohne Gentransfer. Somit könnte die kritische Phase nach Reperfusion insbesondere von small for size Organen deutlich verkürzt werden.[Seite 124↓]
  6. Als einzige, aber entscheidende und limitierende Unsicherheit steht die Reaktion des gesunden Spenders auf ein adenovirales Konstrukt im Raum. In den hier dargestellten Tierversuchen wurde bei der gewählten Konstellation einen Anstieg von Lebertransaminasen und ein angedeutestes Bild einer allgemeinen Erkrankung (viraler Infekt) beobachtet, welches sich 48 Stunden nach Injektion wieder gegeben hatte. Für eine mögliche Anwendung im humanen Bereich steht diese Frage bei adenoviralen Vektoren als momentan noch nicht geklärt im Raum, auf die fatalen Komplikationen nach klinischer Anwendung von adenoviralen Vekrtoren im Jahre 1999 sei nochmals hingewiesen [217].

In den hier beschriebenen Versuchen war es das Ziel, die eben genannten Hypothesen zu untersuchen. Für die Experimente wurde eine Versuchsreihe so etabliert, daß alle unbehandelten Kontrollen überlebten, jedoch nach 24 h Konservierung nur etwa 30% der Empfänger von reduced size Lebern. Die reduzierte Lebern entsprachen etwa 40% der Ausgangsgewichte. Die Lebertransaminasen verdeutlichen den ausgeprägt protektiven Effekt der Cu/Zn-SOD Überexpression auf den zellulären Schaden nach Lebertransplantation von reduzierten Lebern. Warum die Reduktion per se zu einem Anstieg der Transaminasen führt, ist nicht definitiv zu erklären. Möglicherweise unterliegen sie durch die Manipulation backtable im Rahmen der Vorbereitung auf die Implantation und Größenreduktion einer Schädigung, wobei es sich eher um eine geringfügige Schädigung handelt, da diese Prozeduren mit äußerster Vorsicht hinsichtlich Manipulation durchgeführt worden waren. Zudem potenziert sich bei einem reduzierten Organ durch Einschwemmung verschiedener Mediatoren und Faktoren wie z.B. Endotoxin die schädigende Potenz durch verminderte Parenchymmasse und es ist anzunehmen, dass dies die entscheidende Rolle spielen könnte. Ganz offensichtlich kommt den toxischen Radikalen, auch den extern produzierten Radikalen, eine wesentliche Bedeutung zu, da bei Ad.SOD1 infizierten Organen solch ein ausgeprägt protektiver Effekt zu verzeichnen war.

Die Lebertransaminasen spiegeln die parenchymatöse Schädigung wieder. Das gesamte Bilirubin im Serum hingegen ist ein Parameter der zellulären Exkretion und diese ist ein sehr [Seite 125↓]guter Parameter für die Leberfunktion, welcher 24 h nach Reperfusion im Serum gemessen wurde. Die Ergebnisse überraschten nicht, eine verminderte Zellschädigung führte zu einer verbesserten zellulären Exkretion als Parameter der Zellfunktion (Abb. 28). Durch Gentransfer mittels Ad.SOD1 ist es bei Split-Lebern möglich, die Zellfunktion auf dem Niveau einer vollständigen Transplantatleber unter identischen Bedingungen zu halten (Abb. 27 & 29).

Nachdem gezeigt worden war, dass die Überexpression von SOD auch bei reduced size Lebern zu einer hervorragenden Organprotektion führt, galt es zu überprüfen, welchen Einfluß diese Maßnahme auf den entscheidenden Parameter, das Überleben haben würde. Das drastisch verbesserte Überleben bei den Ad.SOD1 Tieren (Abb. 29) läßt sich neben deutlich vermindertem zelluläre Schaden und dem damit einhergehenden signifikant besseren Regenerationsvermögen (s.u.) begründen (Abb.30-32).

Um das Regenerationsverhalten der reduzierten Lebern zu untersuchen, wurden neben dem BrdU-Staining (Immunhistochemie) auch molekulare Marker, sowie auch ganz einfach das Gewicht von Lebergewebe untersucht. Das Gewicht der Lebern hängt postoperativ stark vom Schwellungszustand des Organes (Ödem) ab, sodass sowohl feuchtes, als auch Lebertrockengewicht bestimmt wurde. Nach 7 postoperativen Tagen zeigte sich, dass die Ad.SOD1 Lebern bereits signifikant an Masse im Vergleich zum Ausgangsgewicht zugenommen hatten, was trotz der relativ unsensiblen Messung für eine gesteigerte Regenerationsfähigkeit spricht.

Als sensibleres Verfahren wurde das immunhistochemische Nachweisverfahren von BrdU (5-Bromo-2'-Deoxyuridin) angewendet, welches in sich teilende Zellkerne eingebaut wird und so einen sehr eindeutigen Überblick in histologischen Untersuchungen erlaubt. Die morphometrische Auswertung zeigte eindeutig die BrdU-positiven Zellen 24h nach [Seite 126↓]Reperfusion, welche für eine dramatisch gesteigerte Regeneration bei Ad.SOD1 behandelten Split-Lebern sprach (Abb. 30-32).

Diese eindeutigen Ergebnissen sollten durch den Nachweis von entsprechenden Faktoren im Zellzyklus Signalweg bestätigt werden. Hierzu boten sich insbesondere Cyclin D1 und p21 als regulierende Faktoren an. Diese wurden im Western Blot von homogenisiertem Gewebe ebenso 24h nach Reperfusion untersucht. Auch hier erkannte man, dass Organprotektion mittels Ad.SOD1 zu einer deutlich akzellerierten Zellproliferation führte (Abb. 33). Somit stimmten die beschriebenen Beobachtungen überein und es konnte eindeutig die Aussage getroffen werden, dass die ausgezeichneten Überlebensdaten auch mit der verkürzten kritischen Phase von grenzwertig wenig bzw. zu wenig Lebermasse erklärt werden können.

Zusammenfassend konnte eindeutig bewiesen werden, dass ein verbesserter Schutz mittels Überexpression von Cu/Zn-SOD vor dem Ischämie/Reperfusionsschaden von größenreduzierten Lebertransplantaten zu einer deutlich beschleunigteren und ausgeprägteren Organregeneration führt. Somit kann man die kritische Phase insbesondere bei grenzwertiger Organgröße sehr kurz halten. Zudem werden die Organe vor dem Ischämie/Reperfusionnschaden geschützt mit der Folge, dass nicht nur die Rate an primärem Organversagen sinkt, sondern somit vor allem auch die minimale Größe eines gerade noch transplantierbaren Teilorganes sinkt. Folglich erhält man einen etwas großzügigeren Sicherheitsspielraum, um eine Implantation durchführen zu können. Weiterhin kann man durch den Gentransfer von SOD, durchgeführt beim Organlebendspender, das im Spender verbleibende Restorgan vor den Folgen einer warmen Ischämie und auch der Manpulation schützen. Mit dieser faszinierenden Technik könnte man in Zukunft den Empfängerpool von Lebertransplantaten um eine Gruppe erweitern, welche derzeit überhaupt kein geeignetes Organ erhalten kann, oder aber dieses quasi zu spät erhalten könnte. Hierbei ist in erster Linie [Seite 127↓]an Patienten mit hepatozellulärem Karzinom oder aber Patienten in einem Alter von über 65 Jahre zu denken.

4.10 Klinische Relevanz der dargestellten Versuche

Wie bereits unter 4.9 dargestellt ist stellt sich bei der Verwendung von Adenoviren als Vektoren im Rahmen der Lebertransplantation als der wesentlicher Nachteil für die Lebertransplantation der Faktor Zeit ein. Wie bereits angedeutet ist dieses Zeitintervall von 72 h äußerst kritisch für die Anwendung von Gentransfertechniken unter klinischen Bedingungen, da das Zeitintervall von Hirntoddiagnostik und Einverständnis bis zur Organentnahme deutlich kürzer als 72 h, ja sogar kürzer als 48 h ist. Folglich sollte bei einem potentiellen Organspender der Gentransfer so früh wie möglich durchgeführt werden, um hohe Spiegel der Proteinexpression vor Organentnahme zu erreichen, sofern die individuellen, ethischen und juristischen Gegebenheiten dies überhaupt erlauben. Ein wichtiges Einsatzgebiert des adenoviralen Gentransfers stellt die „elektive“ Lebertransplantation in Form der Leberlebendspende dar, welche das Problem der zeitlich ausreichenden Inkubationsphase nicht kennt, wie dies oben ausführlich dargestellt wurde.

Ein weiterer möglicher Nachteil des Einsatzes eines Adenovirus unter klinischen Bedingungen scheint die Tatsache zu sein, dass Adenoviren zu einer akuten Hepatitis führen können, indem sie das Immunsystem aktivieren [218]. Diese Reaktion ist abhängig von der Dosierung und der Inkubationszeit. In den hier gezeigten Versuchen konnte kein zusätzlicher Schaden für Spendertiere oder Transplantate selbst aufgezeigt werden. Folglich kann man davon ausgehen, dass die durch das Adenovirus getriggerte Immunantwort durch eine niedrige Virusdosierung minimiert werden kann [154]. Außerdem ist es anzunehmen, dass unter klinischen Bedingungen die im Transplantat verbliebenen Adenoviren im Empfänger keine immunologische Reaktion hervorrufen können, da der Empfänger immunsupprimiert ist. Die Hemmung der Immunreaktion auf Adenoviren wurde durch Einsatz des [Seite 128↓]Immunsuppressivums Cyclosporin A gezeigt [147]. Da die rekombinanten Adenoviren apathogen sind, sind andere Erkrankungen als die immunologische Reaktion unwahrscheinlich. Die genannten Nachteile des Verfahrens des adenoviralen Gentransfers scheinen überwindbar zu sein und sollten nicht die herausragenden Vorteile und die überzeugende Effektivität des Technik abschwächen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der adenovirale Gentransfer dazu geeignet ist, das gewünschte Protein in der Leber erfolgreich zu überexprimieren. Diese Studie weist zum ersten Mal nach, dass ein adenoviraler Gentransfer mit SOD die Organschädigung nach Lebertransplantation vermindert und die Überlebensrate erhöht. Der adenovirale Gentransfer von SOD stellt ein ausgezeichnetes therapeutisches Verfahren für die Zukunft dar, um Organe vor reperfusionsbedingtem Versagen zu schützen. Insbesondere grenzwertig verfettete Spenderlebern könnten hiermit genetisch modifiziert werden, um die hohe primäre Versagensquote dieser Organe zu vermindern und das Überleben der Empfänger sicherzustellen. Marginale Organe könnten ohne erhöhtes Risiko für den Empfänger eingesetzt werden. Der Gentransfer unter Einsatz von sicheren und apathogenen Vektorsystemen könnte also den Einsatz von bisher marginalen Organen sichern und somit den Spenderpool erweitern, was zu einer niedrigeren Todesrate auf der Warteliste führen würde.


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