Aus der chirurgischen Klinik der Charite, Campus Virchow Klinikum
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Habilitationsschrift

Die Bedeutung der toxischen Sauerstoffradikale beim Ischämie/Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation in der Ratte
- protektive Therapie durch adenoviralen Gentransfer von Superoxiddismutase

Zur Erlangung der Lehrbefähigung für das Fach
Chirurgie

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dr.med.
Thorsten Lehmann
aus Weingarten/Württemberg

Dekane:
Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen und Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. P. Galle, Mainz
2. Prof. Dr. W.-O. Bechstein, Frankfurt/M.

Eingereicht beim Fakultätsrat am: 23. Februar 2004

Abstract

Einleitung: Der Ischämie/Reperfusionsschaden (I/R) ist die wesentliche Ursache des frühen Transplantatversagens nach Lebertransplantation (LTx). Fettlebern sind dabei besonders betroffen. Freie Sauerstoffradikale spielen bei der Pathogenese eine zentrale Rolle. Die Morphologie der so versagenden Transplantatleber ist charakterisiert durch Entzündung, Nekrose und Apoptose. Endogene Radikalfänger wie die Superoxiddismutase (SOD), nicht aber exogen zugefűhrte, bauen freie Radikale ab. Das Ziel der vorgelegten Studien war es, im Modell der LTx von gesunden und verfetteten Lebern in der Ratte mittels adenoviralem Gentransfer von SOD den I/R zu vermindern, die Überlebensrate zu erhöhen und zugrunde liegende Mechanismen aufzuzeigen. Methoden: Bei Experimenten mit verfetteten Lebern wurde eine ausgeprägte Steatose der Spenderlebern durch Füttern einer Ethanol- und fettreichen Diät (Lieber-DiCarli) erzeugt. Explantierte Lebern wurden für 24 h konserviert und orthotop transplantiert. Einigen Spendern wurde 72 h vor Organentnahme Cu/Zn-SOD enthaltendes Adenovirus (Ad.SOD1) i.v. appliziert. Als Kontrollen dienten Fettlebern, welche mit dem Gen von β-Galaktosidase (Ad.lacZ) transfiziert wurden, oder aber gesunde Lebern. Untersuchungsparameter waren neben Transfektionsparametern die Transaminasen, histopathologische Morphologie, Überlebensraten, sowie die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und deren Kinasen. Freie Radikale wurden in der Galle mittels Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nachgewiesen. In weiteren Experimenten wurden auch die mitochondriale und die extrazelluläre Isoform hinsichtlich ihrer protektiven Wirkung untersucht. Ebenso wurde die Auswirkung der freien Radikale auf die Regeneration nach Teillebertransplantation untersucht. Ergebnisse: 72 h nach Injektion von Ad.lacZ exprimierten etwa 80% aller Hepatozyten die β-Galaktosidase. In der Ad.SOD1 Gruppe war die Genexpression 3-fach, die Aktivität 12-fach erhöht. Im Vergleich zu den unbehandelten oder Ad.lacZ infizierten Empfängern von Fettlebern, stiegen die Transaminasen um etwa 50% bei der Ad.SOD1 Gruppe an. Alle Empfänger von Ad-SOD1 behandelten Fettlebern überlebten, hingegen nur 10% der Ad.lacZ Gruppe. Etwa 35% der Hepatozyten von Fettlebern waren nekrotisch, jedoch nur 10% in Ad.SOD1-behandelten Fettlebern. Ad.SOD1 halbierte die Freisetzung von freien Radikalen und minimierte die Aktivierung von NF-κB. Die Aktivität der Kinase IKK wurde nicht reduziert, der Anstieg der Aktivität von JNK jedoch komplett inhibiert. Die Freisetzung von TNFα wurde nicht beeinflußt. Als wirksamste Isoform hat sich die zytosolische erwiesen, die extrazelluläre ist nach Überexpression ohne protektive Wirkung. Die Leberregeneration läßt sich nach Transplantation durch SOD-Überexpression massiv anregen und das Organversagen bei kritischer Leberzellmasse vermeiden. Schlußfolgerung: Diese Studie zeigt erstmals die Wirksamkeit einer neuen Strategie zur Organprotektion fűr gesunde Lebern und Fettlebern. Die Eliminierung von Sauerstoffradikalen spielt bei der Pathogenese eine Schlüsselrolle. Der adenoviraler Gentransfer von SOD stellt ein gangbares therapeutisches Verfahren für die Zukunft dar, um auch marginale, verfettete Organe vor reperfusionsbedingtem Versagen zu schützen. Dabei ist die zytosolische SOD am effektivsten. Auch bei der Teilleber-Transplantation ist diese Therapieform erfolgversprechend.

Eigene Schlagworte: Lebertransplantation, Ischämie / Reperfusionsschaden, Gentransfer, Superoxiddismutase

Abstract

Background: Oxygen-derived free radicals play a central role in pathomechanisms of reperfusion injury after organ transplantation, and fatty livers are particularly susceptible. Endogenous radical scavenger systems such as superoxide dismutase (SOD) degrade toxic radicals; however, SOD is degraded rapidly when given exogenously. Therefore, the hypothesis that treatment of the donor liver with an adenoviral vector encoding the Cu/Zn-SOD gene (Ad.SOD1), or the Mn-SOD gene or the ec-SOD gene would lead to permanent gene expression and therefore protect the organ against injury and increase survival in a rat model of liver transplantation including fatty livers was tested. Transplantation of reduced-size livers may lead to a hypermetabolic state and increased production of oxygen radicals. Since oxygen radicals may cause liver injury and impair liver regeneration, we tested the hypothesis that overexpression of superoxide dismutase (SOD) in reduced-size livers (RSL) would accelerate regeneration and reduce injury in a rat model of transplantation of RSL. Methods: Donors received chow diet (untreated), high-fat diet, or ethanol-containing high-fat diet. Some donors were infected with Ad-SOD1, while untreated grafts and livers infected with the indicator gene lacZ encoding bacterial β-galactosidase (Ad.lacZ) served as controls. Some livers were harvested 72 hours later, reduced to 45% of weight, and transplanted. After liver transplantation, SOD activity and protein expression in liver, survival, histopathology, release of transaminases, free radical adducts in bile and activation of NF-κB, IκB kinase (IKK), Jun-N-terminal kinase (JNK) and TNFα were evaluated. Moreover, in transplanted split-livers regeneration was evaluated by Brdu-staining, and measurement of cyclinD1 and p21. Results: Approximately 80% of hepatocytes expressed β-galactosidase 72h after injection of Ad-lacZ. Moreover, SOD1 gene expression and activity were increased 3- and 10-fold in the Ad-SOD1 group, respectively. Following transplantation, 20-25% of rats treated with Ad.lacZ survived. In contrast, all SOD1-treated animals survived. Transaminases measured 8h after transplantation in Ad-SOD1 rats were only 40% of those in controls which increased 40-fold above normal values. Approximately 20% of hepatocytes in untreated and Ad.lacZ-infected organs were necrotic 8h after reperfusion, whereas necrosis was nearly undetectable in grafts from rats treated with Ad.SOD1. Free radical adducts were increased 2-fold in the ethanol group compared to untreated controls. Ad.SOD1 blunted this increase and reduced the activation of NF-κB, which was similar in untreated and ethanol-treated groups. Ad.SOD1 did not affect activity of IKK, but JNK activity was blunted. Release of TNFα was not affected. In recipients of Ad.SOD1-RSL survival was dramatically increased (100% vs. 20% in Ad.lacZ-RSL), and peak levels of AST/ALT and bilirubin levels were reduced by 75% and 87.5%, respectively (p<0,001). In histological sections, hepatocyte necrosis decreased from 24% after Ad.lacZ–treatment to 6% after Ad.SOD1-treatment (p<0,001). Regeneration was also accelerated after Ad.SOD1-treatment as demonstrated by an increase of BrdU-stained cells 24 hours after reperfusion and increased liver weight after 1 week. Conclusions: This study provides clear evidence for the first time that gene therapy with Ad.SOD1 increases survival and decreases hepatic injury after liver transplantation and protects marginal livers from failure after transplantation and may be related to lowered NF-κB and JNK activity due to reduced oxygen radical production. Genetic modification of the liver represents a future approach to protect organs against injury where oxygen derived free radicals are involved. Moreover, overexpression of SOD1 in RSL prevents primary non-function of reduced-size liver grafts and accelerates liver regeneration.

Keywords: liver transplantation, ischemia / reperfusion injury, genetransfer, superoxide dismutase

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14.12.2004