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Kapitel 4. Matrix-Metalloproteinasen und deren Inhibitoren

4.1 Bedeutung von Matrix-Metalloproteinasen

Matrix-Metalloproteinasen als Tumormarker

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind endogene Proteinasen mit der Fähigkeit, extrazelluläre Matrix einschließlich der Basalmembran aufzuspalten. 63 , 64 MMPs gehören zu einer Gruppe von Enzymen, die an einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind und zum Um- und Abbau von Gewebe führen. 65 Bei physiologischen Prozessen, wie bei der Gewebsneubildung und dem Wachstum einschließlich Zellabbau bzw. Zellerneuerung ist die Funktion dieser Enzyme von wesentlicher Bedeutung für den Organismus. Aber auch bei pathologischen Veränderungen spielen die katalytischen Aktivitäten der MMPs und deren Regulierung eine wichtige Rolle. Solche Veränderungen wurden bei der rheumatoiden Arthritis, Leberzirrhose und bei Wundheilungsstörungen nachgewiesen. 65 , 66

Von verschiedenen Arbeitsgruppen wurde auf die Bedeutung der MMPs und ihrer spezifischen Inhibitoren (tissue inhibitors of metalloproteinases=TIMP) bei malignen Erkrankungen hingewiesen. 67 - 70 Im Mittelpunkt vielfacher Untersuchungen steht das Verhalten von MMPs und TIMPs bei den Mechanismen der Tumorprogression. Erhöhte bzw. veränderte Expressionsmuster wurden bei verschiedenen menschlichen Tumoren beobachtet. MMPs gelten als die wesentlichen Enzyme des Abbaus von Abgrenzungsbarrieren wie z.B. Basalmembranen, die einer lokalen Tumorzellausbreitung und -verschleppung bzw. -neuansiedlung entgegenstehen. 71

MMPs bilden eine Gruppe von zinkhaltigen Endopeptidasen. Die MMPs umfassen 15 Enzyme, die entsprechend ihrer bevorzugten Substratspezifität und Struktur in Subklassen eingeteilt werden. 63 , 65 Dies sind die Kollagenasen (MMP1, MMP8, MMP13), Gelatinasen (MMP2, MMP9), Stromelysine (MMP3, MMP10) und eine Subgruppe, die Matrylysin, Stromelysin und die membrangebundenen MMPs umfaßt. Es werden ständig neue MMPs beschrieben. 70 Die katalytische Aktivität der MMPs ist normalerweise durch spezifische und unspezifische Mechanismen streng reguliert:

• Freisetzung der MMPs als Zymogene und extrazelluläre Aktivierung,
• Beeinflussung der MMP-Synthese (Transkription),
• Hemmung der Aktivität durch TIMPs. 65 , 72

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Umfangreiche in vivo und in vitro Untersuchungen haben gezeigt, daß die Aktivität und Konzentration von MMPs mit dem invasiven und metastatischen Potential von menschlichen Tumoren assoziiert ist. 63 , 73 Das ist der Fall bei Mamma-, Kolon- und Lungenkarzinomen. 67 - 70 , 76 Die Bedeutung der MMPs bei den einzelnen Tumorentitäten ist jedoch verschieden und bisher noch nicht umfassend geklärt. Derzeit ist davon auszugehen, daß der MMP2 und der MMP9 eine besondere Bedeutung zukommt, da sie direkt an der Degradation der Basalmembran beteiligt sind. 77 Die Penetration bzw. die Aufhebung der Integrität dieser Membran durch Tumorzellverbände ist der Beweis für das Vorliegen eines invasiven Karzinoms. In jüngsten Untersuchungen wurde die Bedeutung der Balance von MMPs und TIMPs im Gewebe als positiver und negativer Modulator der Tumorprogression hervorgehoben. 65 , 73

Die Veränderungen der MMP-Expression im Gewebe können sich teilweise in biologischen Flüssigkeiten widerspiegeln. 71 Daraus resultiert die Möglichkeit, diese Komponenten mit einfachen, nichtinvasiven Methoden bei Patienten zu bestimmen. Informationen über das Verhalten der MMPs könnten dann möglicherweise in der Diagnostik und Verlaufskontrolle von Malignomen eingesetzt werden. So berichtet eine Arbeitsgruppe von erhöhten Konzentrationen des Komplexes MMP9/TIMP im Plasma von Patienten mit gastrointestinalen Karzinomen. 71

Die Bestimmungen der MMPs wurden in der Vergangenheit meist nach elektrophoretischer Trennung der Proteine im gelatinehaltigen Gel (Zymographie) durchgeführt. 78 Diese Verfahren sind arbeitsintensiv, nicht automatisierbar und weisen erhebliche Ungenauigkeiten auf. Erst seit einigen Jahren stehen kommerzielle ELISA-Testsysteme für MMPs und TIMPs zur Verfügung, die eine breite Anwendung und Einschätzung dieser Kenngrößen überhaupt erst ermöglichen. Dies darf aber nicht darüber

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Für die Übertragung und Verwendung von Untersuchungsergebnissen und deren Vergleichbarkeit mit Daten anderer Autoren ist die Angleichung und Standardisierung der analytischen und präanalytischen Bedingungen erforderlich. Diese Voraussetzungen sind häufig besonders bei der Erfassung von neuen Markern nicht realisiert. Es war deshalb ein besonderes Anliegen bei unseren Untersuchungen der MMPs und TIMPs, auf diese Problematik der Analytik aufmerksam zu machen. Diese Situation könnte einen Teil von kontroversen Studienergebnissen erklären.

Über die biologische Rolle von MMPs und deren mögliche diagnostische Bedeutung bei urologischen Malignomen ist wenig bekannt. 79 - 84 Zielstellung unserer Untersuchungen war es deshalb, Veränderungen dieser Komponenten im Tumorgewebe bzw. im Blut bei urologischen Tumoren nachzuweisen. Im Mittelpunkt meines Interesses stand dabei das Prostatakarzinom, es wurden aber auch Untersuchungen zum Nierenzellkarzinom durchgeführt.

Hemmung der Matrix-Metalloproteinasen-Aktivität

Nur die rechtzeitige Erfassung des Patienten mit einem lokalisierten, nichtmetastasierten PCa ermöglicht den Einsatz einer kurativen Therapie. 2 Das Standardverfahren ist hierbei die radikale Prostatektomie. Bei fortgeschrittenen Karzinomen oder beim Auftreten eines Tumorrezidivs wird im allgemeinen die antiandrogene Hormontherapie angewendet. Obwohl diese Therapieform für eine begrenzte Zeit wirksam ist, kommt es zum weiteren Progreß des Tumors und die Patienten versterben. Auch ein verlängertes Überleben konnte bisher durch die Hormontherapie nicht sicher nachgewiesen werden. Diese Faktoren erklären das enorme Interesse an neuen wirksamen Therapieverfahren beim PCa.

Im Rahmen der Evaluierung der Bedeutung von MMPs bei der Progression des PCa wurde ein Standardtiermodell in die Untersuchung einbezogen. 85 Dieses Tiermodell ermöglicht die Beurteilung von Therapieansätzen und -strategien, die aus den Untersuchungen mit den MMPs geschlußfolgert wurden.

Eine erfolgversprechende Strategie könnte der Einsatz von synthetischen Inhibitoren der MMPs darstellen. 86 , 87 Die Bedeutung der MMPs bei den essentiellen Prozessen der Invasion und Metastasierung von Tumoren ist in verschiedenen Untersuchungen gezeigt worden, obwohl die unmittelbaren Mechanismen bisher nur unzureichend bekannt sind. Es liegt daher nahe, die physiologischen Inhibitoren dieser Proteinasen und deren Funktion zu

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Batimastat ist ein relativ unspezifischer Breitspektrum-Inhibitor verschiedener MMPs, der über einen kompetitiven und reversiblen Hemmungsmechanismus funktioniert. In menschlichen Tumorzellinien, in tierexperimentellen Untersuchungen und auch in Studien am Menschen konnte eine Beeinflussung der Tumorprogression im Sinne eines Therapieeffektes belegt werden. 89 - 92 Untersuchungen zur Wirksamkeit von synthetischen Inhibitoren bei urologischen Karzinomen liegen nur in sehr begrenztem Umfang vor. 89 , 93 Es war daher ein wesentliches Anliegen meiner Arbeit, eine mögliche Wirksamkeit dieser Substanzgruppe an einem Standardtiermodell des PCa zu evaluieren. Gleichzeitig sollten in enger Zusammenarbeit mit der Industrie (Firma Roche) neue, selektiver wirkende synthetische Inhibitoren erprobt werden. Der Dunning-Tumor (MatLyLu, R3327) der Ratte wurde von mir bewußt gewählt. 85 , 94 , 95 Auf Grund seiner vergleichbaren Morphologie und des funktionellen Verhaltens bezüglich Chemo-, Strahlen- und Hormontherapie wird er international als ein Standardtiermodell des PCa angesehen.

4.2 Eigene Untersuchungen

4.2.1 Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren als Marker bei urologischen Tumoren

Aus den Ergebnissen verschiedener Arbeitsguppen über das veränderte Expressionsverhalten der MMPs und TIMPs bei Malignomen leiten sich diagnostische Strategien ab. Die Reflexion der Gewebsveränderungen im Blut eröffnet die Möglichkeit der einfachen, nichtinvasiven Bestimmung dieser Komponenten im Plasma. MMPs und TIMPs könnten sich zu interessanten Werkzeugen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei urologischen Tumoren entwickeln. Seit einigen Jahren stehen kommerzielle Testsysteme zur Verfügung. Die in der Literatur veröffentlichten Ergebnisse basieren häufig auf unterschiedlichen diagnostischen Ausgangsbedingungen. Dies schränkt die Vergleichbarkeit der Daten erheblich ein.

Um Fehlinterpretationen zu vermeiden, wurden in ersten Untersuchungen die präanalytischen und analytischen Bedingungen für MMP-Bestimmungen evaluiert (Artikel Nr. E10). K10 , K11 , K12 Es wurden verschiedene MMPs mit neu entwickelten ELISA-Testsystemen bestimmt. Die verwendeten Teste können insgesamt als analytisch zuverlässig

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Durch diese Experimente wurden wichtige präanalytische und analytische Bedingungen für die Bestimmung der MMPs und TIMPs ermittelt. Diese analytischen Einschätzungen der Testsysteme waren notwendig, um die Ergebnisse eigener fortführender Untersuchungen zu objektivieren und Fehlinterpretationen in Zukunft zu vermeiden.

Da für die Diagnostik und Therapiekontrolle des Nierenzellkarzinoms, wie bereits bei den Adhäsionsproteinen betont, keine geeigneten Marker zur Verfügung stehen, begründet sich aus urologischer Sicht das besondere Interesse für die Bestimmung der MMPs und TIMPs.

Die Bestimmungen von MMP2 und MMP9 sowie der TIMP1 und TIMP2 erfolgte sowohl im Nierengewebe als auch im Plasma, um eine mögliche Reflexion der Gewebsveränderungen im Blut nachweisen zu können (Artikel E11). Dies wäre eine wesentliche Voraussetzung für die Nutzung der Parameter in der Diagnostik des Nierenzellkarzinoms. Nach histologischer Sicherung wurden MMP2, MMP9, TIMP1 und TIMP2 im malignen Tumorgewebe und normalen Nierengewebe derselben Niere sowie im Plasma von Patienten mit Nierenzellkarzinom untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Konzentrationen von MMP9 im Tumorgewebe und im Blut signifikant erhöht waren. Diese Beobachtung untermauert die Hypothese einer möglichen Bedeutung von bestimmten MMPs bei der Entstehung und Progression von malignen Tumoren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die vermehrte MMP9-Expression im Tumorgewebe auch im Blut nachweisbar ist. Die errechnete geringe diagnostische Sensitivität der MMP9-Bestimmung im Plasma zur Erfassung des Nierenzellkarzinoms spricht gegen eine Anwendung dieses Parameters als diagnostischen Marker. Da auch bei diesem urologischen Tumor ein verändertes, für ein Karzinom typisches Expressionverhalten von MMPs festzustellen ist, nehme ich an, daß durch die gezielte Hemmung der MMP9 das Tumorwachstum und die Progression im Sinne eines therapeutischen Effektes beeinflußt werden könnte.

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Auch diese Untersuchungen wurden im Plasma und im Gewebe von PCa-Patienten durchgeführt (Artikel Nr. E12). Die gemessenen Konzentrationen von verschiedenen MMPs und TIMPs im Plasma bei PCa-Patienten ohne und mit gesicherter Metastasierung wurden den Plasma-Konzentrationen von gesunden Probanden und Patienten mit BPH gegenübergestellt. Im Gewebe erfolgte der Nachweis von veränderter MMP-Expression durch den Vergleich der Konzentrationen im histologisch gesicherten malignen Anteil und im normalen Gewebe ein und derselben Prostata. Im Plasma von Patienten mit metastasiertem PCa wurde eine erhöhte MMP3- und TIMP1-Konzentration nachgewiesen. Die vorliegenden Daten lassen TIMP1 als einen zusätzlichen Marker für eine fortgeschrittene Erkrankung brauchbar erscheinen. Im Gewebe wird der erniedrigte Quotient aus MMP und TIMP als eine tumorspezifische Veränderung interpretiert, so daß diese proteolytische Dysbalance durch synthetische Inhibitoren gezielt beeinflußt werden könnte.

Zusammenfassend kann eingeschätzt werden, daß auch beim PCa veränderte MMP- und TIMP-Expressionen wichtige Bestandteile bei der Tumorprogression sind. K13 , K14

Artikel (Erstautorenschaft): E10 , E11 , E12

Weitere Artikel mit Koautorenschaft: K10 , K11 , K12 , K13 , K14

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4.2.2 Tierexperimentelle Untersuchungen zu MMPs beim Prostatakarzinom

Der Dunning-Tumor der Copenhagen Ratte ist ein etabliertes Tiermodell für das menschliche PCa. 85 , 94 Auf Grund seines Verhaltens gegenüber verschiedenen Therapieformen wird er für die Überprüfung neuer Therapiestrategien beim PCa primär empfohlen. 85 Die verschiedenen Subformen dieses Tumors zeigen deutlich voneinander abweichende Eigenschaften. Es existieren hormonsensitive und hormonrefraktäre Zellinien, die sich auch durch ihr Metastasierungsverhalten und durch die Metastasierungslokalisation unterscheiden. Für unsere Untersuchungen wählten wir den sehr aggressiven hormonrefraktären MatLyLu R3327-Tumor der sowohl in die Lungen als auch in die Lymphknoten metastasiert. Die notwendigen Techniken habe ich während eines einjährigen Forschungsaufenthaltes in den USA (Harvard University, Boston) erlernt. Die in diesem Abschnitt vorgestellten Untersuchungen wurden von mir dort durchgeführt.

Bei allen Experimenten erfolgte die Induktion des Dunning-Tumors bei der männlichen Copenhagen Ratte durch subkutane oder orthotope (ventraler Prostatalappen) Injektion von 100000 Tumorzellen (Artikel Nr. E13). Die subkutanen und orthotopen Tumore unterschieden sich deutlich in ihrem Metastasierungsverhalten und Wachstum. Ein Teil der Ratten wurde einer lokalen Hyperthermie-Behandlung unterzogen. Die Hyperthermie wurde mit einem Nd-YAG-Laser induziert und in verschiedenen Dosierungen verabreicht. Diese Behandlung führte zu einer effektiven und dosisabhängigen Hemmung des lokalen Tumorwachstums. Eine wichtige Beobachtung war die nachweisbare Zunahme der Lungenmetastasierung bei den Tieren mit längerer Hyperthermie-Behandlung.

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Die Untersuchungen erlauben die Schlußfolgerung, daß MMP9 eine wichtige Bedeutung beim Wachstum auch dieses Standardtumors des menschlichen PCa zukommt, und daß sich die Gewebsveränderungen im Plasma widerspiegeln. Damit ist der Einsatz von synthetischen MMP-Inhibitoren in tierexperimentellen Untersuchungen als eine therapeutische Option beim PCa gerechtfertigt.

Artikel (Erstautorenschaft): E13

4.2.3 Einsatz von synthetischen Inhibitoren zur Blockierung der MMP-Aktivität beim Prostatakarzinom

Seit einigen Jahren stehen synthetische Inhibitoren von MMPs zur Verfügung. Batimastat der Firma British Biotech hat sich als Referenzsubstanz der synthetischen Inhibitoren der MMPs etabliert. Batimastat ist aufgrund der sehr schlechten Löslichkeit nur eingeschränkt einsetzbar. Aber auch Daten zum Marimastat, dem Nachfolgeprodukt mit verbesserten Lösungseigenschaften, liegen in Verbindung mit urologischen Malignomen nur wenige Informationen vor. Es war deshalb das Anliegen der fortführenden Experimente, eine mögliche Wirksamkeit dieser Substanz beim PCa als dem häufigsten Tumor des Mannes zu evaluieren (Artikel Nr. E14).

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Diese ermutigenden Daten haben mich dazu bewogen, neue, selektivere Inhibitoren der MMPs in diesem Modell zu untersuchen. Diese Experimente wurden in Kooperation mit der Firma Roche durchgeführt. Ziel der Untersuchung war es, die Grundlagen für die mögliche Anwendung dieser Substanz beim Menschen zu erarbeiten. Es wurden umfangreiche tierexperimentelle Studien mit einem neuentwickelten, hochselektiven Inhibitor der MMPs veranlaßt. Die Genehmigung zur Publikation der Untersuchungsergebnisse erteilte uns die Firma Roche dem Kooperationsvertrag zufolge erst vor kurzem, so daß in Abweichung von der bisherigen Darstellung der eigenen Ergebnisse nicht auf bereits publizierte Daten zurückgegriffen wird.

Die getestete Substanz wird als Icol (RO 28 2653) bezeichnet. Der Versuchsablauf entspricht den bereits vorgestellten Untersuchungen zum Batimastat (orthotope Tumorinduktion; 100000 MatLyLu-Zellen). Die neue Substanz wird oral verabreicht und reduziert das lokale orthotope Tumorwachstum um bis zu 90% (Abbildung 1). Die Experimente wurden unter gleichen Bedingungen wiederholt und waren reproduzierbar. Die Tumorgewichte und -volumina innerhalb der Behandlungs- und Kontrollgruppen zeigten eine erstaunlich geringe Streuung. Icol ist damit dem Batimastat an Wirksamkeit auf das lokale Tumorwachstum deutlich überlegen. Weiterhin konnte eine Dosis-Wirkung-Korrelation nachgewiesen werden (Abbildung 1 und 2). Um diese tierexperimentelle Studie an klinische Bedingungen anzugleichen, erfolgte die Applikation der Substanz auch mehrere Tage nach Tumorzellinjektion (Abbildung 2). Auch auf den bereits etablierten Tumor (6 Tage nach Tumorzellinjektion) konnte ein ausgeprägter Effekt beobachtet werden.

Bei einem möglichen Einsatz von MMP-Inhibitoren bei PCa-Patienten wäre eine Kombination mit anderen Therapieformen zur Induktion eines synergistischen Effektes vorteilhaft. Daher wurde diese Substanz mit einem etablierten Chemotherapeutikum (Etoposid) kombiniert. Diese Chemotherapie hat, wenn nur eine Substanz eingesetzt wird (Monosubstanz), beim PCa eine eingeschränkte Wirksamkeit. Die vorliegenden tierexperimentellen Ergebnisse zeigen jedoch, daß eine Kombination mit Icol eine sinnvolle

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Die vorliegenden Ergebnisse sowie Daten anderer Arbeitsgruppen der Firma Roche an anderen Tiermodellen (hier nicht gezeigt) haben die Firma dazu veranlaßt, klinische Verträglichkeits- und Toxizitätsstudien durchzuführen. Sollten diese Untersuchungen erfolgreich verlaufen, ist der klinische Einsatz von Icol vorgesehen. In diesem Fall wird die Urologische Klinik Studien im Rahmen von Kombinationstherapien bei PCa-Patienten nach Genehmigung durch die Ethikkommission durchführen.

Artikel (Erstautorenschaft): E14

Abbildung 1: Prostatatumorgewichte 20 Tage nach Tumorzellinjektion in den ventralen Prostatalappen. PBS (phosphate buffer saline) und Vehikel wurden einmal am Tag oral verabreicht. Der synthetische Inhibitor (Icol) wurde einmal am Tag oral vom 1. Tag nach Zellinjektion bis zum 20.Tag appliziert. Die Tumorgewichte der Behandlungsgruppen mit 30 mg bzw. 100 mg Icol/kg Körpergewicht unterscheiden sich signifikant von den PBS- und Vehikelkontrollen (p<0,05). Kennzeichnung der Mittelwerte.

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Abbildung 2: Prostatatumorgewichte 20 Tage nach Tumorzellinjektion in den ventralen Prostatalappen. PBS (phosphate buffer saline) und Vehikel wurden einmal am Tag oral verabreicht. Der synthetische Inhibitor (Icol) wurde einmal am Tag oral vom 6. Tag nach Zellinjektion bis zum 20.Tag appliziert. Die Tumorgewichte der Behandlungsgruppen mit 50 mg, 100 mg bzw. 200 mg Icol/kg Körpergewicht unterscheiden sich signifikant von den PBS- und Vehikelkontrollen (p<0,05). Kennzeichnung der Mittelwerte.

Abbildung 3: Prostatatumorgewichte 18 Tage nach Tumorzellinjektion in den ventralen Prostatalappen. Behandlungsbeginn am 6. Tag nach Tumorzellinjektion, einmal am Tag orale und intraperitoneale (i.p.) Gabe bis zum 17. Tag. Symbole: NaCl: oral NaCl-Lsg. und i.p. NaCl-Lsg.; Veh: oral Vehikel Icol und i.p. Vehikel Etoposid; Eto: oral Vehikel Icol und i.p. Etoposid (30 mg/kg KG); Icol: oral Icol (100 mg/kg KG) und i.p. Vehikel Etoposid; Eto+Icol: oral Icol (100 mg/kg KG) und i.p. Etoposid (30 mg/kg KG). Kennzeichnung der Mittelwerte.

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