Lindauer, Ute: Mechanismen und Mediatoren der neurovaskulären Kopplung im Gehirn

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Kapitel 1. Einleitung - Das Konzept der neurovaskulären Kopplung

Die Anwendung moderner Techniken in der klinischen Neurologie und neurologischen Forschung am Menschen und im Tierexperiment erlaubt es, aktive Areale des Gehirns während motorischer, sensorischer und kognitiver Aufgaben zeitlich hoch aufgelöst und bildgebend darzustellen. Funktionelle Kernspintomographie (functional magnetic resonance imaging, fMRI), Positronen-Emissionstomographie (PET), sowie optische Methoden wie die Nahinfrarot-Spektroskopie (NIRS), die Optical-Imaging-Spectroscopy (OIS) und die Laser-Doppler Blutflußmessung stehen hierbei im Mittelpunkt des Interesses. Funktionelles MRI, PET und NIRS werden darüberhinaus immer wichtiger in der Diagnostik und therapiebegleitenden Dokumentation während pathologischer Prozesse in der Neurologie.

Trotz dieses großen Potentials bildgebender Techniken im klinischen Ablauf von Diagnostik und Therapie sind diese mit einer wesentlichen Einschränkung der Interpretation der Befunde behaftet: Veränderungen in neuronaler und glialer Aktivität werden nicht direkt erfaßt, es dienen lediglich indirekte, mit der zellulären Aktivität assoziierte Veränderungen des zerebralen Blutflusses, der Blutoxygenierung und des Energiemetabolismus als Signal. Es ist allgemein akzeptiert, daß eine enge Beziehung zwischen neuronaler und glialer Aktivierung, dem Energiemetabolismus und dem zerebralen Gefäßbett besteht - als Phänomen der neurometabolischen und neurovaskulären Kopplung bekannt. Diese enge räumliche und zeitliche Korrelation von elektrischer und metabolischer Aktivität sowie dem regionalen zerebralen Blutfluß ist charakteristisch für das Gehirn und wurde erstmals von Roy und Sherrington im Jahre 1890 beschrieben .

Abb. 1: Konzept der neuro vaskulären Kopplung: Neuronale Aktivierung führt entweder direkt oder über eine Erhöhung des Sauerstoff- und Glukosemetabolisms (metabolische Kopplung) zu Veränderungen des regionalen zerebralen Blutflusses (vaskuläre Kopplung).


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Funktionelle Bildgebung bedient sich demnach metabolischer und vaskulärer Antworten, um regionale Hirnaktivität darzustellen. Um die gesamte Bandbreite der Informationen, die wir durch moderne funktionelle Bildgebung des Gehirns erhalten, sinnvoll in Diagnostik und Therapie ausschöpfen zu können, brauchen wir daher grundlegende Kenntnisse der physiologischen Vorgänge der neurometabolischen und neurovaskulären Kopplung. Im Rahmen von Krankheitsprozessen kann es zu Störungen neurovaskulärer Kopplung kommen, die ihrereseits selbst den Gewebeschaden verstärken können . Eine grundlegende Klärung physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge der neurovaskulären Kopplung könnte daher auch zur Entwicklung neuer Behandlungsstrategien bei akuten und chronischen ZNS Erkrankungen führen.

1.1 Tierexperimentelle Modelle zur Untersuchung neurovaskulärer Kopplung

Das Whisker-Stimulationsmodell in der Ratte

Untersuchungen zur Physiologie neurovaskulärer Kopplung können prinzipiell an gesunden, wachen Probanden mithilfe von nicht-invasiven Messtechniken durchgeführt werden. Pharmakologische Intervention zur Klärung beteiligter Mediatoren oder Modulatoren der Blutflußantwort kann allerdings nur über den systemischen Kreislauf und nur in begrenztem Ausmaß erfolgen.

Deshalb befaßten wir uns zu Beginn unserer Untersuchungen zur neurovaskulären Kopplung mit der Entwicklung eines geeigneten tierexperimentellen Modells. Aus Gründen der einfacheren Handhabung wählten wir als Tierspezies die Ratte (rattus norvegicus). Trotz der entwicklungsphysiologisch im Vergleich zum Menschen niedrigeren Stellung der Ratte und des Fehlens von kortikalen Gyri (lissencephale Spezies) sind keine grundlegend unterschiedlichen Mechanismen der neurovaskulären Kopplung zu erwarten. Bei der Etablierung des Modells stand neben eines möglichst physiologischen und standardisierbaren Stimulus auch die Wahl eines geeigneten Anästhetikums im Zentrum unseres Interesses.

Die Laser-Doppler Blutflußmethode (laser-Doppler flowmetry, LDF) diente zur Blutflußmessung , die uns eine kontinuierliche Darstellung des regionalen Blutflusses (rCBF) mit einer räumlichen Auflösung von ca. 1 mm3 (in Abhängigkeit des Lichtleiters) und einer zeitlichen Auflösung von 0,1 s erlaubte. Da mithilfe der LDF in der Ratte keine quantitative Messung in


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Absolutwerten möglich ist, Veränderungen eines vorhandenen Ruheflusses sich aber linear darstellen, berechneten wir relative Veränderungen des rCBF in % des Ausgangswertes.

In bisher in der Literatur beschriebenen Modellen zur zerebralen Blutflußregulation kamen elektrische Stimulationen des Gehirns selbst oder peripherer Nerven zum Einsatz, die, im Vergleich zu Untersuchungen am wachen Menschen in der Regel zu unphysiologisch hohen Blutflußantworten führen . Einen physiologischer Stimulus stellt dagegen die Auslenkung der Barthaare (Whisker-Haare) der Ratte dar. Die dicht innervierten Whisker Haare werden zudem von einem großes Areal innerhalb des primären somatosensorischen Kortex repräsentiert, dem sogenannten Barrel-Kortex, der präparatorisch leicht zugänglich im dorsolateralen Bereich des parietalen Kortex zu finden ist (s. A, S.2). Das System der Whisker-Haare und des Barrel-Kortex von Ratte und Maus wurde von Woolsey und Mitarbeitern und von Welker bereits gründlich beschrieben . Der Whisker-Barrel Bereich umfaßt ca. 20 % des gesamten SI Kortex von Ratte und Maus. Jedes Whisker-Haar ist in einem sogenannten kortikalen Barrel (Tönnchen), repräsentiert, welches wegen seiner Tonnen-förmigen Anordnung der kortikalen Zellen so bezeichnet wurde. Die vaskuläre Versorgung jedes Barrels erfolgt über eine penetrierende Arteriole im Versorgungsgebiet der mittleren Zerebralarterie (middle cerebral artery, MCA). Die 35 langen Sinus-Haare der Ratte entsprechen demnach 35 somatotopisch angeordneten Barrels mit einem gesamten Projektionsgebiet innerhalb des SI Kortex von 9,0 mm2 (s. A, S.3).

Die Untersuchung neurovaskulärer Kopplung erfolgt optimalerweise an wachen Individuen, da Anästhetika mehr oder weniger stark in die Informationsübertragung von peripheren Reizen zum somatosenorischen Kortex eingreifen. Da es allerdings im tierexperimentellen Ansatz zur Blutflußmessung und pharmakologischen Manipulation der Kopplungsvorgänge im Gehirn der Implantation eines kraniellen Fensters mit Entfernung der Dura mater bedarf, kann auf den Einsatz einer wirkungsvollen Schmerzausschaltung und Neurolepsie nicht verzichtet werden. Die einzusetzenden Anästhetika sollten dabei möglichst Monopräparate darstellen, um nicht durch multiple Wirkmechanismen verschiedener Anästhetika die Interpretation der Ergebnisse zu erschweren. In unserer ersten Studie im Rahmen der Etablierung des Modells verglichen wir daher drei der häufig in der Ratte verwendeten Narkosemittel - Halothan in Lachgas / Sauerstoff, Thiobarbiturat und á-Chloralose - unter jeweils vergleichbarer Narkosetiefe. Die gesamte vorbereitende Präparation


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der Tiere erfolgte unter Halothan in Lachgas / Sauerstoff, sodaß diese Anästhesie in der Halothangruppe weitergeführt wurde und als Vergleichswert des Ruheflusses für die anderen beiden Narkoseformen diente. Thiobarbiturat und á-Chloralose führten zu einer fast
50 % igen Abnahme des Ruheflusses nach Umstellung der Narkose, was auf eine deutliche Reduktion der Ruheaktivität des zerebralen Kortex im Vergleich zu Halothan hinweist. Zudem ist aber auch bekannt, daß Halothan, wahrscheinlich über einen Stickstoffmonoxid-vermittelten Mechanismus, zu einer Vasodilatation führt . Die Blutflußantwort auf somatosensorische Stimulation ist erhalten, volatile Anästhetika wie das Halothan führen allerdings zu deutlichen Schwankungen im Ruhefluß, wodurch der Einsatz dieser Substanzen in Untersuchungen zur neurovaskulären Kopplung nicht zu empfehlen ist. Anästhetika der Barbituratgruppe dagegen reduzieren den zerebralen Metabolismus, vermindern darüber den Ruhefluß und führen, wie wir zeigen konnten, zu deutlich kleineren Blutflußantworten auf somatosensorische Stimulation. Alpha-Chloralose alleine (s. A, S.1) oder in Kombination mit Urethan (s. G, S.2) erwies sich hingegen als das optimale Anästhetikum zur Untersuchung der neurovaskulären Kopplung, da es einerseits die zerebrale Grundaktivität und damit den Ruhefluß senkt, andererseits aber evozierte Antworten im somatosensorischen Kortex sowie deren vaskuläre Kopplung nicht wesentlich beeinflußt, sodaß es zu Blutflußantworten auf somatosensorische Stimulation kommt, die in Amplitude und Zeitverlauf denen des wachen Menschen entsprechen.

Neben der Whisker-Stimulation etablierten wir auch die elektrische Stimulation der Vorderpfote der Ratte, die zu identischem zeitlichen Verlauf der mittels LDF gemessenen Blutflußantwort führt.

Abb. 2: Somatosensorische Stimulation in der Ratte (A: Whisker-Stimulation, B: elektrische Stimulation der Vorderpfote) führt zu einem raschen Anstieg des mittels LDF gemessenen Ruheflusses, dessen Maximum nach 3-5 s erreicht ist. Unter fortdauernder Stimulation stellt sich ein Plateau ein, und mit Beendigung der Stimulation kehrt der regionale Blutfluß auf sein Ausgangsniveau zurück. Die Erhöhung des Blutflusses auf Whisker-Stimulation beträgt über die Stimulationsdauer von 60 s gemittelt 15 - 20 % des Ruheflusses, während elektrische Stimulation der Vorderpfote je nach Reizstärke zu höheren Blutflußantworten von 35-45 % führt.


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Einfluß der Substratzufuhr auf die Blutflußantwort auf somatosensorische Stimulation

Überlegungen zur neurovaskulären Kopplung befassen sich u.a. mit der zentralen Fragestellung nach dem Zweck der Blutflußantwort auf erhöhte neuronale Aktivität. Dient die Blutflußerhöhung dem Antransport der zentralen Substrate des Energiestoffwechsels, dem Sauerstoff und der Glukose, und wird die Vasodilatation getrieben von einem kurzzeitigen Abfall jeweils einer oder beider Substanzen, so müßte es zum einen zu einem kurzzeitigen und möglicherweise messbaren Abfall in der Sauerstoffspannung bzw des Glukosegehalts im Gewebe und im Blut kommen. Zum anderen müßte eine starke Erhöhung des Substrats im Gewebe vor der Stimulation zu einer Abnahme der Blutflußantworten führen. Beide Hypothesen haben wir im Rahmen unserer Studien auf ihre Richtigkeit hin untersucht.

Die Frage nach einem kurzzeitigen und messbaren Abfall in der Sauerstoffspannung zu Beginn erhöhter neuronaler Aktivität wird seit längerem kontrovers diskutiert.

Untersuchungen in unterschiedlichen Spezies und unterschiedlichen Stimulations-paradigmen wurden mit verschiedenen Techniken durchgeführt, es läßt sich aber zunächst keine einheitliche Aussage ableiten.


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Tabelle 1: Übersicht über Befunde zur frühen Hämoglobin-Deoxygenierung unter funktioneller Aktivierung

Zitat

Methode

Spezies

frühe Deoxygenierung ?

 

fMRI

Mensch

Ja

 

fMRI

Mensch

Ja

 

NIRS

Mensch

Nein

 

fMRI

Mensch

Ja

 

NIRS

Mensch

Nein

 

fMRI

Mensch

Nein

 

fMRI

Affe

Ja

 

OIS

Katze

Ja

 

O2 abh. PQ

Katze

Ja

 

fMRI

Katze

Ja

 

fMRI

Ratte

Nein

 

OIS

Ratte

Ja

 

OIS

Ratte

Ja

 

MRI

Ratte

Nein


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In unseren Untersuchungen zu Oxygenierungsveränderungen unter somatosenosorischer Stimulation bei der Ratte kamen zwei voneinander unabhängige Techniken zum Einsatz. Hämoglobinoxygenierungsveränderungen erfaßten wir mittel OIS, Veränderungen des physikalisch im Blut gelösten Sauerstoffs ermittelten wir, wie zuvor von Vanzetta und Grinvald in der Katze eingesetzt , durch Messung der Veränderung der Phosphoreszenz-Lebensdauer eines sauerstoffspannungsabhängigen Phosphoreszenz-Farbstoffs. Beide Methoden zeigten in der Ratte nach Whisker-Stimulation keinen frühen Anstieg im deoxygenierten Hämoglobin bzw. Abfall in der intravaskulären Sauerstoffspannung (s. B, S.6-8). Zudem konnten wir zeigen, daß der errechnete Verlauf des Deoxyhemoglobins vom Einsatz des Algorithmus zur Dekonvolution der gemessenen Spektren in der OIS abhängt, und nur durch Einführen eines wellenlängenabhängigen Korrekturfaktors (differential pathlength factor, DP(?)) die Spektren korrekt beschrieben werden können (s. C). Während ohne Einführung des DPF auch in unseren Experimenten an der Ratte in Übereinstimmung mit Untersuchungen an der Katze in einem Kooperationsprojekt mit A. Grinvald (s. D, S.3-4) eine frühe Deoxygenierung zu erkennen ist, verschwindet diese vollständig nach Analyse mit dem verbesserten Algorithmus (s. B, S.8).

Abb. 3: Hämoglobin-Oxygenierungsveränderungen gemessen mittels OIS während Whisker-Stimulation (A) und elektrischer Vorderpfoten-Stimulation (B) in der Ratte. Es gibt keinen Hinweis auf eine frühe Deoxygenierung, (erkennbar an dem Fehlen eines frühen Anstiegs des Deoxyhämoglobins vor der Hyperoxygenierung) als Signal für die nachfolgende Blutflußantwort, die zu einer Hyperoxygenierung der regionalen Zirkulation führt.

Diese mittels OIS von uns erhobenen Befunde bezüglich der Bedeutung des Berechnungsalgorithmus‘ können zumindest zum Teil die unterschiedlichen Ergebnisse zur frühen Deoxygenierung erklären, da die Analysen der Untersuchungen von sowohl Malonek


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und Grinvald und Malonek et al. (s. D) als auch Nemoto et al. ohne DP(ë) Korrektur durchgeführt wurden. Es bleibt dennoch unklar, inwieweit Spezies- oder Stimulationsparadigmen-Unterschiede darüberhinaus für kontroverse Befunde verantwortlich sind.

Unabhängig von den verwendeten Algorithmen zur Beschreibung der gemessenen Spektren ist aber darauf hinzuweisen, daß die bei Malonek und Grinvald (1996) und Malonek et al. (s. D) auftretende frühe Deoxygenierung während visueller Stimulation in der Katze immer zeitgleich mit der Oxygenierungsantwort erfolgt. Eine frühe Deoxygenierung als Signal für die Blutflußantwort müßte hingegen vor der Oxygenierungsantwort zu erkennen sein und sich in einem Anstieg im deoxygenierten Hämoglobin und parallel dazu in einem Abfall im oxygenierten Hämoglobin und damit einem Abfall in der Sauerstoff-Sättigung darstellen. Dieses Muster als Beweis einer Deoxygenierung als Signal der Blutflußantwort ist bisher nicht gezeigt worden. Somit kann eine derartige frühe Deoxygenierung als unwahrscheinlich angesehen werden. Wenn sie als grundlegender Kopplungsmechanismus existierte, müßte sie homogen in allen höheren Säugetierspezies auftreten und mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung der verfügbaren Techniken erfaßbar sein.

In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen zum Fehlen einer frühen Deoxygenierung bei Stimulationsbeginn führte weder eine Hyperoxygenierung noch eine Hyperglykämie während somatosensorischer Stimulation im Whisker-Modell zu einer Veränderung der mittels LDF gemessenen Blutflußantworten (s. E, S.4).

Somit gibt es anhand unserer Befunde keine Hinweise darauf, daß ein möglicherweise kurzzeitig auftretender Substratmangel im Gewebe registriert wird, und auf diesem Wege die Blutflußantwort auf funktionelle Stimulation initiiert wird.

Die Frage nach dem eigentlichen Signal für die Blutflußantwort und dem primären Ort der Regulation (Arteriole, Kapillare, Venole) bleibt weiterhin ungeklärt.


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Mon Sep 30 15:22:13 2002