Lindauer, Ute: Mechanismen und Mediatoren der neurovaskulären Kopplung im Gehirn

Kapitel 2. Rolle des NO bei der neurovaskulären Kopplung

Eine Reihe von Mechanismen oder Mediatoren können im Rahmen der Frage nach initiierenden und unterhaltenden Faktoren der Blutflußantwort diskutiert werden . Neben Metaboliten des Zellstoffwechsels wie Adenosin und H+ / CO2


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werden neurogene Mechanismen für die Blutflußantwort verantwortlich gemacht .

Das Bioradikal Stickstoffmonoxid (nitric oxide, NO) steht seit Jahren im Zentrum des Interesses als idealer Kandidat der neurovaskulären Kopplung. Neben seiner Eigenschaft als starker Vasodilatator mit kurzer Halbwertszeit wird es von vaskulären Endothelzellen, Astrozyten und Neuronen konstitutiv produziert und kann auf einen Glutamat-Rezeptor vermittelten Mechanismus hin freigesetzt werden. In den im folgenden zusammengefaßten Untersuchungen beschäftigten wir uns speziell mit der Rolle des NO bei der Whisker-stimulationsvermittelten Blutflußantwort und einem möglichen Zusammenspiel von NO mit H+ und CO2.

2.1 Beteiligung des NO am basalen zerebralen Blutfluß

Das NO produzierende Enzym NO Synthase liegt in drei Isoformen vor, der konstititiv exprimierten endothelialen und neuronalen NO Synthase (cNOS: Typ I, nNOS und Typ III, eNOS, Tabelle 2) sowie der induzierbaren NO Synthase (iNOS, Typ II, Tabelle 2), die im Rahmen von inflammatorischen Prozessen in einer Vielzahl von Zellen induziert werden kann.

Tabelle 2: Isoformen der NOS

Isoform

Zelltyp

Ca2+/Calmodulin abhängig

NO
Produktion

Konstitutiv exprimiert: cNOS

Typ I:
neuronale NOS, nNOS

Typ III:
endotheliale NOS, eNOS

Neuron
Astrozyt, Endothelzelle

Endothelzelle
Neuron, Astrozyt

+

kurzzeitig
in pM

Induzierbar: iNOS

Typ II:
induzierbare NOS, iNOS

Makrophage, Mikroglia
Endothelzelle, Astrozyt, Neuron, glatte Gefäß-muskelzelle

-

langdauernd
in nM


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Während die iNOS auf proinflammatorische Stimuli hin de novo exprimiert wird und daraufhin unabhängig von intrazelluärem Calcium NO in nanomolaren Konzentrationen produziert wird, führt die Aktivität der cNOS in erster Linie zu einer Calcium/Calmodulin-abhängigen, kontinuierlichen basalen NO Produktion in picomolaren Konzentrationen .

Der einzige einheitlich beschriebene und bisher bewiesene Rezeptor für NO im biologischen System stellt die lösliche Guanylatzyklase (soluble guanylate cyclase, sGC) dar. Nach Bindung von NO an der Häm-Gruppe des Enzyms wird die Produktion von zyklischem Guanosin-3‘,5‘-Monophosphat (cyclic GMP, cGMP) aus Guanosin-5‘-Triphosphat (GTP) katalysiert. Das initiale NO Signal wird somit über cGMP im Rahmen der Signalkaskade an cGMP-abhängige Proteinkinasen, Ionen-Kanäle und Phosphodiesterasen weitergeleitet und in zelluläre Reaktivität übersetzt. So wird zum Beispiel der Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptor in der glatten Gefäßmuskelzelle durch Aktivierung der cGMP abhängigen Proteinkinase phosphoryliert. Diese Phosphorylierung führt letztlich zu einem Abfall der intrazellulären Calcium-Konzentration und damit zur Relaxation der Zelle. Neben der gut beschriebenen, cGMP abhängigen Signalkaskade existieren aber auch eine Reihe von cGMP unabhängigen Reaktionswegen des NO, die in ihrem Ablauf bisher weitaus weniger gut aufgeklärt sind. Ein zentraler Mechanismus hierbei schein die S-Nitrosylierung von Effektorproteinen durch physiologische wie auch pathophysiologisch erhöhte NO Konzentrationen im Gewebe darzustellen. Im Rahmen der neurovaskulären Kopplung sind hierbei Befunde zur direkten Modulierung der Leitfähigkeit von Kalium-Kanälen durch NO von Bedeutung (zur Übersicht siehe ).

Im Rahmen unserer Untersuchungen zur Rolle des NO bei der neurovaskulären Kopplung konnten wir zeigen, daß pharmakologische Inhibition der konstitutiven NOS zu einer signifikanten Abnahme des Ruheflusses in vivo (s. F, S.2) führt. Die Bereitstellung des basalen NO Spiegels scheint darüberhinaus in erster Linie durch die Aktivität der neuronalen Isoform der NOS zu erfolgen, da selektive Inhibition dieser durch Applikation des spezifischen nNOS Blockers 7-Nitroindazole zu einer vergleichbaren Abnahme des zerebralen Blutflusses unter Ruhebedingungen führt (s. G, S.7). Weiterhin konnten wir zeigen, daß zumindest ein signifikanter Teil der basalen vaskulären NO Wirkung über cGMP vermittelt wird, da spezifische Inhibition der löslichen Guanylatzyklase ebenfalls zu signifikanter Vasokonstriktion und damit Abnahme des Ruheflusses führt (s. G, S.8). Dieser


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Befund zeigt, daß der basale NO Spiegel im Gewebe funktionell von Bedeutung ist. Zerebrale Gefäße verfügen somit über einen physiologischen, NO vermittelten vasodilatatorischen Tonus, der zu signifikantem Anteil über einen basalen cGMP-Spiegel in der glatten Gefäßmuskelzelle verursacht wird.

Neben seiner direkten vaskulären Funktion an der glatten Gefäßmuskelzelle nimmt NO zusätzlich eine wichtige antiadhäsive Funktion im Rahmen der Leukozyten-Endothel-Interaktion ein. Deshalb war es für weitere Untersuchungen der Rolle des NO bei der physiologischen neurovaskulären Kopplung von Bedeutung, vorab zu untersuchen, inwieweit eine Senkung des basalen zerebralen NO Spiegels durch pharmakologische Blockade der cNOS über eine mögliche Aktivierung der Leukozyten-Endothel-Interaktion zu Störungen des Blutflusses in der Mikrozirkulation führt und darüber die Interpretation der Befunde zur neurovaskulären Kopplung erschweren würde.

Unter Verwendung intravitaler konfokaler Laser-scanning Mikroskopie konnten wir allerdings zeigen, daß pharmakologische Inhibition der NOS unter physiologischen Bedingungen zu keiner Aktivierung der Leukozyten-Endothel-Interaktion und daher zu keiner Beeinträchtigung der Fließeigenschaften des Blutes in der zerebralen Zirkulation führt. Lediglich in inflammatorisch vorgeschädigtem Hirngewebe führt die Abnahme des basalen NO Spiegels nach NOS Inhibition zu einer signifikanten Aktivierung des Anheftungsprozesses von Leukozyten am zerebrovaskulären Endothel (s. H, S.4-7).

2.2 Rolle des NO bei der zerebralen Blutflußantwort auf funktionelle Stimulation

Die signifikante Beteiligung des NO / cGMP Systems am regionalen zerebralen Blutfluß des somatosensorischen Kortex der Ratte unter Ruhebedingungen legt die Hypothese nahe, daß dieses auch für somatosensorisch evozierte Veränderungen des Blutflusses von Bedeutung ist.

In unserer frühen Untersuchung zur Rolle des NO bei der neurovaskulären Kopplung konnten wir erstmalig zeigen, daß eine solchermaßen postulierte Beteiligung des NO tatsächlich existiert. Sowohl systemische wie auch topische Gabe des unspezifischen NOS Inhibitors L-NNA (Nù-Nitro-L-Arginin) führt zu einer ca. 50% igen Reduktion der mittels LDF gemessenen Blutflußantwort auf Whisker-Stimulation der Ratte. Interessanterweise wird nach topischer NOS-Inhibitor Applikation die Blutflußantwort auf Hyperkapnie wie auch auf topisch induzierte, extrazelluläre Azidifizierung, welche beide globale vasodilatatorische


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Stimuli darstellen, um mehr als 90 % reduziert (s. F, S.2, sowie I, S.3).
Die neuronale Aktivität selbst wird durch NOS Blockade nicht beeinflußt, wie sowohl im Whisker-Modell als auch im Modell der elektrischen Vorderpfotenstimulation durch Vergleich der somatosensorisch evozierten Potentiale vor und nach NOS-Inhibitor Applikation gezeigt wurde (s. K, S.3).

Die Beteiligung des NO / cGMP Systems bei funktionell fokalen wie auch globalen vasodilatatorischen Stimuli der zerebralen Zirkulation ist prinzipiell auf zwei Wegen vorstellbar:

- Mediator-Funktion des NO / cGMP: auf erhöhte neuronale Aktivität hin wird über einen Glutamat-vermittelten postsynaptischen Ca2+-Einstrom die Aktivität der dort lokalisierten nNOS erhöht, zellmembrangängiges NO diffundiert zum Gefäß und führt über die Erhöhung des cGMP in der glatten Gefäßmuskelzelle zur Vasodilatation.

- Modulator-Funktion des NO / cGMP: der basale NO / cGMP Spiegel im kortikalen Gewebe fürt über Nitrosylierung bzw. Phosphorylierung zu einer Konformationsänderung von Zellproteinen (z.B. an Ionenkanälen mit der Folge einer veränderten Leitfähigkeit) und ermöglicht somit die Relaxation der glatten Gefäßmuskelzelle auf Vasodilatatoren, die bei erhöhter neuronaler Aktivität freigesetzt werden.

Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen zeigten, daß im Rahmen der Blutflußantwort auf Hyperkapnie das NO / cGMP System sowohl im parietalen Kortex als auch im Kleinhirn eine modulatorische Rolle einnimmt , während die Blutflußantwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern des Kleinhirns, welches ein rein glutamaterges monosynaptisches System darstellt, im Sinne eines echten Mediators durch NO / cGMP vermittelt wird . Auch die Vasodilatation im Bereich des parietalen Kortex auf elektrische Stimulation des basalen Vorderhirns, eine primär endotheliale, Acetylcholin vermittelte Reaktion, wird über NO als Mediator vermittelt .

So war es für das allgemeine Verständnis der Rolle des NO im somatosensorischen Kortex, dessen Gehalt an konstitutiver NOS signifikant unter der des Kleinhirns liegt , von herausragender Bedeutung zu klären, inwieweit der basale NO / cGMP Spiegel die funktionelle neurovaskuläre Kopplung bestimmt:


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Unspezifische NOS Inhibition, spezifische Inhibition der neuronalen NOS sowie Inhibition der NO-abhängigen Guanylatzyklase führt neben der Abnahme des Ruheflusses zu einer etwa 50 % igen Reduktion der Blutflußantwort auf funktionelle Stimulation. Unter fortdauernder NOS Blockade ist es mittels topischer Applikation von unterschiedlichen NO Donoren sowie eines Zellmembran-gängigen cGMP Analogs möglich, das Niveau des Ruheflusses und somit den ursprünglichen basalen NO / cGMP Spiegel vor Applikation des NOS Inhibitors wiederherzustellen, um die Wirkung der basalen NO / cGMP Konzentration von einer echten Mediatorfunktion zu trennen. Die Wiederherstellung des basalen NO wie auch cGMP Spiegels führt zu einer Restitution der Blutflußantwort auf funktionelle Stimulation unter NOS Blockade, die Applikation von cGMP während fortdauernder Guanylatzyklase Inhibition führt zu gleichem Ergebnis. Wiederherstellung des Ruhetonus der Gefäße unter Verwendung des NO unabhängigen Vasodilatators Papaverin führt hingegen zu keiner Erhöhung der durch NOS Blockade verminderten vaskulären Antwort auf funktionelle Stimulation (s. G, S.5-8).

Das NO / cGMP System im somatosensorischen Kortex agiert somit, entsprechend seiner Funktion während experimenteller Hyperkapnie, durch seinen basalen Gewebespiegel als Modulator im Rahmen der Blutflußantwort während neurovaskulärer Kopplung.

Die Frage nach den eigentlichen Mediatoren der vaskulären Antwort auf funktionelle Stimulation bleibt daher weiterhin ungeklärt. Metaboliten des Zellstoffwechsels wie Adenosin und H+ / CO2 , aber auch das in Konzentrationen bis zu 20 mM stark vasodilatatorisch wirkende Kalium, welches bei neuronaler Depolarisation freigesetzt wird, werden nach wie vor als mögliche Kandidaten diskutiert. Vor allem die Rolle des Kaliums, dessen vasodilatatorische Wirkung ebenfalls durch NO modulatorisch beeinflusst wird , wird im Rahmen eines astrozytären Kaliumtransports von der Synapse zum regionalen Blutgefäß als potentieller Mechanismus formuliert - eine Hypothese, die in einem zukünftigen Projekt auf ihre Gültigkeit hin zu überprüfen ist.

2.3 NO und rhythmische Oszillationen des zerebralen Blutflusses

Das Phänomen periodischer Oszillationen des lokalen zerebralen Blutflusses im Frequenzbereich von 0,1 Hz, auch Vasomotion genannt, ist seit langem bekannt, die hierbei zugrunde liegenden Mechanismen sind aber nach wie vor ungeklärt. Unregelmäßiges Auftreten von kleinamplitudigen Oszillationen ist unter physiologischen Bedingungen häufig


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zu beobachten. Ein robuster Induktor sehr regelmäßiger Vasomotion mit großer Amplitude allerdings stellt die NOS Inhibition dar. Amplitudenausschläge in der Größenordnung von bis zu 20 % des Ausgangsflusses sind keine Seltenheit (s. L, S.3-4).

Diese Beobachtung legt den Schluß nahe, daß der vasodilatatorische Tonus des basalen NO im Gewebe einen vorhandenen Grundrhythmus der Gefäße überlagert. Hierbei scheint es sich aber eher um einen direkten, cGMP unabhängigen Effekt des NO zu handeln, da zwar NO- Donor Applikation, nicht aber cGMP-Analoga Applikation zu einer deutlichen Verminderung der Oszillationen bei fortbestehender NOS Inhibition führt. Auch kommt es nach Guanylatzyklase-Inhibition zu nur geringgradiger Vasomotion. Interessanterweise reduziert aber der NO unabhängige Vasodilatator Papaverin ebenfalls die NOS Inhibition-vermittelte Vasomotion, was auf eine Beteiligung des Calciums bei der rhythmischen Blutflußoszillation schließen läßt. Daß das Auftreten von Vasomotion allerdings keinen Einfluß auf die Reaktivität zerebraler Gefäße auf funktionelle Stimulation hat, beweist die Tatsache, daß nach NOS Inhibition mit nachfolgender cGMP Substitution die Blutflußantwort auf Whisker-Stimulation restituiert, die Vasomotion aber unverändert erhalten ist (s.G, S.8-9).

Welche Mediatoren oder Modulatoren neben dem NO an der Vasomotion beteiligt sind, und inwieweit diese bei starkem Auftreten als Marker gestörter vaskulärer Funktion angesehen werden können, bedarf weiterer Untersuchung.


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Mon Sep 30 15:22:13 2002