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Anhang über weitere themenbezogene Forschungsprojekte

Projekt 1:

Konkordanzanalyse zur s-HER-2/neu-Expression von Mammakarzinomen und ihren metachronen Fernmetastasen mittels IHC, FISH und Serum-HER-2/neu-Status

Da die Fallzahl aus der Konkordanzanalyse begrenzt war, begannen wir in Zusammenarbeit mit den Instituten für Pathologie des Universitätsklinikums Charité am Campus Mitte und des Universitätsklinikums Benjamin Franklin eine große Konkordanzanalyse mit einer gemäß statistischer Berechnung notwendigen Fallzahl von n=156. Hierfür wurden in beiden Instituten nach Paaren von primären Mammakarzinomen und deren metachronen Metastasen gesucht. Diese wurden dann auf die Expression von HER-2/neu mittels einer Immunhistochemie nach dem DAKO-Standard sowie mit der FISH-Methodik untersucht. Von 25 dieser Patientinnen lag gleichzeitig Serum vom Zeitpunkt der Fernmetastasierung vor.

Bislang konnten 60 dieser Paare gefunden werden. Die Paraffinblöcke werden derzeit geschnitten und immunhistochemisch gefärbt. Gleichzeitig werden Schnitte für die FISH-Untersuchung asserviert. Es ist damit zu rechnen, daß die Untersuchung ungefähr im 2. Quartal 2003 abgeschlossen werden kann.

Ziel ist die Konkordanzbestimmung für die HER-2/neu-Gewebeergebnisse aus der IHC und der FISH-Methodik. Damit soll hinterfragt werden, ob es während der Metastasierung zu einer klonalen Veränderung der HER-2/neu-Expression kommt.


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Projekt 2:

Kardiale Sicherheit des rekombinanten, humanisierten anti-p185HER2 monoklonalen Antikörpers Trastuzumab (Herceptin ® ) in Kombination mit Epirubicin/Cyclophosphamid als Erstlinientherapie bei Anthracyclin-naiven Patientinnen mit HER-2/neu-überexprimierenden, metastasiertem Mammakarzinom

Ziel dieser prospektiv randomisierten Multicenterstudie ist die Evaluierung der Sicherheit und Wirksamkeit der Kombination aus Herceptin plus Epirubicin und Cyclophosphamid als Erstlinientherapie von HER-2/neu-positiven Mammakarzinompatientinnen im Stadium der Fernmetastasierung. Die Studie wird durch einen Vergleichsarm, in dem HER-2/neu-negative Patientinnen mit Epirubicin und Cyclophosphamid allein behandelt werden, kontrolliert. Insgesamt werden 125 Patientinnen in jeden Arm aufgenommen. Dabei erfolgt die Therapie in jedem Arm in Form einer Dosiseskalation auf 2 Dosierungsstufen. In der Dosisstufe 1 (n=25) wird Epirubicin in einer Dosierung von 60 mg/m2 verabreicht. Beim Ausbleiben von kardialen Nebenwirkungen wird die Dosis von Epirubicin auf 90 mg/m2 erhöht und weitere 100 Patientinnen auf dieser Dosisstufe behandelt. Cyclophosphamid wird dabei stets in einer Dosierung von 600 mg/m2 appliziert.

Einschlußkriterien: Patientinnen im Alter von 18 bis 70 Jahren; histologisch gesichertes Mammakarzinom; klinisch oder bildgebend gesicherte Fernmetastasierung; meßbare oder evaluierbare Erkrankung; Performancestatus besser als 70%; Lebenserwartung von mindestens 3 Monaten; schriftliches Einverständnis.

Ausschlußkriterien: Vorangegangene Chemotherapie für die metastasierte Erkrankung (eine adjuvante nicht-anthrazyklinhaltige Chemotherapie oder auch eine Hormontherapie für die metastasierte Erkrankung sind möglich); vorangegangene Anthrazyklintherapie; vorangegangene Hochdosistherapie; Knochenmetastasen als einzige Tumormanifestation; Hirnmetastasierung bei Studieneinschluß; vorangegangene, andere maligne Erkrankung außer Carcinoma in situ der Cervix und Karzinome der Haut außer Melanom; Beeinträchtigung der hämatologischen Reserve oder unzureichende Leber- und Nierenfunktionsparameter; unkontrollierte Infektions- oder andere chronische Erkrankung, welche die Teilnahme an der Studie kompromittieren könnten. [Seite 181↓] Kardiale Ausschlußkriterien: Vorbehandlung mit kardiotoxischen Zytostatika; bekannte koronare Herzerkrankung; behandlungsbedürftige Erkrankung der Herzklappen; bekannte Kardiomyopathie; akute Myokarditis; Herzinsuffizienz mit definierter Symptomatik; Ejektionsfraktion <60% oder linksventrikulärer Durchmesser >56 mm; schlecht eingestellter arterieller Hypertonus; vorangegangene Mediastinalbestrahlung.

In den einzelnen Zentren werden zu Therapiebeginn, dann wöchentlich über 7 Wochen und im Anschluß alle 3 Wochen EDTA-Plasmaproben abgenommen und per Kurier an ein Zentrallabor geschickt, wo sie bei 1000 g über 15 min zentrifugiert, aliquotiert und bei -80 °C asserviert werden. In größeren batches werden diese Proben auf Trockeneis nach Berlin geschickt und dort mit dem manuellen Oncogene-Assay auf s-HER-2/neu und CA 27.29 untersucht.

Eine erste vorläufige Analyse der Patientinnen auf Dosisstufe I zeigte, daß zur Woche 4 der s-HER-2/neu-Spiegel bei respondern im Mittel um 138,6 ng/ml gesunken war, was einem relativen Abfall von 73,8% im Vergleich zu baseline entspricht. In der gleichen Zeit sank der CA 27.29-Spiegel nur um 59 U/ml ab. In der Woche 10 lag der mittlere s-HER-2/neu-Spiegel bei Patientinnen mit objektivem Ansprechen bei einem Niveau von 9% im Vergleich zu baseline.


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Projekt 3:

Evaluierung des automatisierten Serum-HER-2/neu-Immuno 1-Assays sowie des manuellen Serum-HER-2/neu-Oncogene Sciene-ELISA-Assays bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom unter Herceptin-Therapie

Mit dem 2. Quartal 2002 nimmt die Tumormarkergruppe der Medizinischen Klinik II erneut an einer FDA-Studie zur Bedeutung von s-HER-2/neu teil. Bei dieser Untersuchung wird von Patientinnen unter einer Herceptin-basierten systemischen Therapie zum Zeitpunkt der Therapieeinleitung sowie im regelmäßigen, longitudinalen follow-up Serum asserviert und auf s-HER-2/neu mittels manuellem Oncogene ELISA-Assay wie auch auf dem klinisch-chemischen Analysenapparat Immuno 1 untersucht.

Die primären Endpunkt der Studie sind die Monitoringqualität von s-HER-2/neu unter Herceptin-Therapie sowie die prädiktive Wertigkeit des baseline-s-HER-2/neu-Spiegels und des relativen Abfalls von s-HER-2/neu innerhalb der ersten 8 Wochen nach Therapieeinleitung. Des Weiteren soll untersucht werden, ob eine langfristige Normalisierung von s-HER-2/neu unter den oberen cut-off-Wert von 15 ng/ml zu einem verbesserten outcome, insbesondere einer längeren Zeit bis zur Progression, führt.

Es handelt sich um eine Multicenter-Studie, an der noch 3 weitere, amerikanische Zentren (D. Slamon, UCLA Los Angeles; M. Schwartz, MSKCC New York; F. Esteva, M.D. Anderson Cancer Center, Houston) teilnehmen. Das Rekrutierungsziel liegt bei 125 Patientinnen innerhalb von 6 Monaten. In einer Substudie untersucht die Medizinische Klinik II der Charité als ausgewähltes Studienzentrum die s-HER-2/neu-Spiegel vor und 1 Stunde nach Herceptin-Gabe. Es sollen aus diesen Proben sowohl die s-HER-2/neu-Spiegel wie auch die Komplexe von s-HER-2/neu und dem therapeutischen Antikörper Herceptin bestimmt werden, um den Einfluß von s-HER-2/neu auf die Pharmakokinetik von Herceptin näher zu beschreiben.

Die Messungen von s-HER-2/neu erfolgen sowohl multizentrisch innerhalb der Studienzentren sowie auch monozentrisch in einem Zentrallabor des Sponsors Bayer Diagnostics.


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Projekt 4:

Hochdosischemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation im Vergleich zu einer intensiven, konventionellen Polychemotherapie

Zwischen den Jahren 1998 und 2002 untersuchten wir den Nutzen einer up front-Doppelhochdosistherapie mit Cyclophosphamid, Mitoxantron und Etoposid (CNV) im Vergleich zu der zum Untersuchungsbeginn als beste, konventionelle Chemotherapie eingeschätzten Therapie mit Doxorubicin und Paclitaxel (AT). Die Datenlage wies dabei auf einen möglichen Nutzen der Hochdosistherapie für die Subgruppe der HER-2/neu-positiven Patientinnen hin. Im Sinne der Fragestellung nach dem Einfluß der HER-2/neu-Positivität auf den Nutzen der beiden Chemotherapie-Ansätze wurden die Patientinnen gemäß dem immunhistochemischen HER-2/neu-Status sowie dem s-HER-2/neu-Status zum Zeitpunkt der Erstdiagnose des Stadiums IV der Erkrankung eingeteilt. Die finale Auswertung wird mit Komplettierung des Datensatzes im 3. Quartal 2003 erwartet.

Einschlußkriterien: histologisch gesichertes Mammakarzinom in fernmetastasierter Situation; Indikation für eine systemische Chemotherapie; meßbare oder evaluierbare Metastasen in mindestens 1 Organsystem; Alter >18 Jahre und <60 Jahre; rezidivfreies Intervall >6 Monate nach adjuvanter zytostatischer Therapie; Ausschluß einer Schwangerschaft; adäquate hämatologische Funktionsparameter; Kooperationsfähigkeit und informed consent. Ausschlußkriterien: adjuvante Hochdosischemotherapie; zerebrale Metastasierung; alleinige Knochenmetastasierung; vorangegangene palliative zytostatische Chemotherapie; Überlebenswahrscheinlichkeit <12 Wochen; vorbestehende, schwere Begleiterkrankungen; Leber- oder Nierenfunktionseinschränkung mit Transaminasen bzw. Serumkreatinin >1,25-fache des oberen Referenzwertes; relevante infektiöse Begleiterkrankungen; kardiale Begleiterkrankungen, insbesondere manifeste arterielle Hypertonie mit diastolischen Blutdruckwerten >120 mmHg, hämodynamisch relevanter Herzklappenfehler, Arrhythmien >Lown IIIa, Endokarditis, latente oder manifeste Herzinsuffizienz, Ejektionsfraktion <50%, Anamnese eines Myokardinfarktes; unzureichende Kooperationsfähigkeit; Zweitkarzinom; Teilnahme an einer anderen klinischen Studie.


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Die Randomisierung erfolgte in 2 Therapiearme: Die Hochdosisgruppe erhielt den ersten Hochdosisblock der Doppelhochdosischemotherapie mit Cyclophosphamid 2000 mg/m2 als 1-stündige Infusion am Tag 1 unter Protektion mit Uromitexan (Kurzinfusionen mit 500 mg/m2 alle 6 Stunden), Mitoxantron 45 mg/m2 am Tag 1 als Kurzinfusion und Etoposid 2500 mg/m2 ebenfalls am Tag 1 mit Gabe von je 500 mg absolut in 1000 ml NaCl 0,9% über je 2 Stunden. Nach einem Intervall von 24 Stunden nach Ende der Hochdosistherapie erfolgte die Stammzelltransplantation in Form von kryokonservierten, CD34-positiven Stammzellen. Diese wurden vor der 1. Hochdosistherapie nach Cycloposphamid-Gabe mit 2000 mg/m2 unter üblichem Uromitexan-Schutz und anschließender G-CSF-Gabe mit 10 µg/kg Körpergewicht (KG) gewonnen. Spätestens ab Tag 5 nach der Transplantation wurde das engraftment durch die Gabe von G-CSF in einer Dosis von 10 µg/kg KG unterstützt. Ab Tag 3 bis zum Wiederanstieg der Leukozyten über 1000/µl erfolgte eine selektive Darmdekontamination mit Cotrimoxazol (800 mg Sulfamethoxazol, 160 mg Trimethoprim) 3 x täglich, Colistin 3 x 200 mg täglich sowie Amphothericin B-Suspension 4 x 1 mg/Tag. Sobald wieder eine Leukozytenzahl von >5000/µl nach der Regeneration der Zellzahlen erreicht war, wurden erneut CD34-positive Stammzellen für den 2. Block der Doppelhochdosischemotherapie separiert. Die 2. Hochdosistherapie unterschied sich vom 1. Block durch eine höhere Dosis von Cyclophosphamid mit 4400 mg/m2 und Uromitexan mit 1000 mg/m2 alle 6 Stunden.

Im konventionellen Therapiearm wurde im Abstand von 3 Wochen nach üblicher Prämedikation eine Chemotherapie mit Paclitaxel 200 mg/m2 als 3-Stundeninfusion und Doxorubicin 60 mg/m2 als Kurzinfusion verabreicht. Die Therapie war über 6 Zyklen bzw. bis zur Progression vorgesehen. War nach 6 Zyklen eine partielle Remission (PR) erreicht und eine komplette Remission (CR) abzusehen, wurde die zytostatische Behandlung als Paclitaxel-Monotherapie um 3 weitere Zyklen fortgesetzt. Nach den Zyklen 2 bzw. 4 wurde G-CSF subkutan in einer Dosis von 5 µg/kg KG bzw. 10 µg/kg KG zur Stammzellmobilisation verabreicht.

Patientinnen mit Knochenmetastasen erhielten in beiden Therapiearmen zusätzlich zur Chemotherapie eine Behandlung mit Pamidronat 90 mg alle 3 Wochen. Mit dem Ziel der Remissionserhaltung wurden alle Patientinnen mit CR nach Abschluß der Chemotherapie [Seite 185↓]mit Tamoxifen (20 mg/Tag) oder nach vorangegangener Antiöstrogentherapie mit Letrozol (2,5 mg/Tag) bis zum Nachweis der Progression behandelt.

Die gesamte Studie war in einem cross-over der beiden Therapiearme konzipiert: Die Patientinnen mit CR auf eine der beiden geschilderten Therapien wurden bei erneuter Progression in den anderen Randomisationsarm gekreuzt. Voraussetzung für das cross-over aus dem Doppelhochdosisarm war eine kardiale Ejektionsfraktion (EF) >50%. Falls die EF <50% lag, wurde Doxorubicin durch Vinorelbin in einer Dosis von 15 mg/m2 ersetzt. Beim cross-over aus dem konventionellen Therapiearm erhielten die Patientinnen bei einer EF <50% anstelle von Mitoxantron Carboplatin in einer Dosis von 1500 mg/m2. Dann wurde die Stammzelltransplantation aufgrund der längeren Halbwertszeit erst 48 Stunden nach Beendigung der Chemotherapie durchgeführt.

Mit der Randomisationszuordnung der individuellen Patientin wurden den Zentren die Plastikgefäße für die Asservierung der Serum-aliquots mit den entsprechenden Aufklebern zugesandt. Die Serumproben für die HER-2/neu-Bestimmungen wurden gemäß dem Amendment für Begleituntersuchungen direkt in den Zentren abgenommen und verarbeitet: 10 ml venöses Blut wurde zentrifugiert, in 2 aliquots portioniert und bei –30 °C vor Ort eingefroren. Die Abnahmen erfolgten im Hochdosisarm vor Hochdosis 1, 4 Wochen nach Hochdosis 1, unmittelbar vor Hochdosis 2, 4 Wochen nach Hochdosis 2 und im weiteren Verlauf alle 2 Monate bis zum cross-over oder Studienende. Im konventionellen Therapiearm wurde zu jedem Therapiezyklus, im Monat 1 nach dem letzten Zyklus und weiterhin ebenfalls alle 2 Monate Serum asserviert.

In einer Zwischenanalyse, in der die Patientinnen mit erhöhtem s-HER-2/neu im Vergleich zu normalem s-HER-2/neu-Spiegel unabhängig vom Behandlungsarm verglichen wurden, zeigte sich bislang kein Unterschied in der Rate an objektiven Remissionen. Dieses vorläufige Ergebnis stützt die Meinung, daß HER-2/neu-positive Patientinnen von einer sehr intensiven Chemotherapie profitieren und sich in ihrem outcome nicht mehr von den HER-2/neu-negativen Patientinnen unterscheiden. Eine Verschiebung dieses Ergebnisses ist noch vorstellbar, wenn mit einer höheren Patientenzahl eine getrennte Analyse der beiden Studienarme möglich wird.


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Projekt 5:

Cyclophosphamid und Epirubicin mit nachfolgender Gabe von Taxol in 21-Tage-Intervallen versus intensivierte Gabe von Epirubicin gefolgt von Taxol in 14-Tage-Intervallen in der adjuvanten Behandlung des Mammakarzinoms mit 1-3 befallenen Lymphknoten (1-3 LK+)

Ziel der Zusatzuntersuchung zu oben genannter Phase III-Studie für die adjuvante Chemotherapie ist die Abschätzung der prognostischen Bedeutung des s-HER-2/neu-Spiegels bei nodal-positiven Mammakarzinompatientinnen mit 1-3 befallenen Lymphknoten im allgemeinen sowie im Vergleich einer konventionellen adjuvanten Chemotherapie mit einem dosisintensivierten Therapieschema. In einer retrospektiven Studie an 78 Mammakarzinompatientinnen konnte die Anzahl der befallenen Lymphknoten (>3 LK versus <3 LK) und der s-HER-2/neu-Spiegel als einzige prognostisch relevante Faktoren identifiziert werden. Allerdings reichte die statistische power nur aus, die prognostische Wertigkeit des s-HER-2/neu-Spiegels für Patientinnen mit >3 LK zu sichern. Für die Gruppe mit <3 LK war die Fallzahl für eine signifikante Aussage zu gering. Des Weiteren möchten wir die Frage klären, ob durch die zusätzliche Messung von s-HER-2/neu eine Subgruppe von Patientinnen mit 1-3 LK identifiziert werden kann, die potentiell von einer dosisdichten Therapie profitiert.

Als weiterer Aspekt ist die Korrelation zwischen der HER-2/neu-Expression des Primärtumors im Vergleich zu seiner Metastase Teil dieser Zusatzuntersuchung. Gegenwärtig gehen die Kliniker davon aus, daß die HER-2/neu-Expressionen des Primärtumors und seiner metachronen Metastasen identisch sind. Es ist aber nicht auszuschließen, daß, ähnlich wie beim Steroidhormonrezeptorstatus, während der Metastasierung klonale Veränderungen stattfinden.

Die hohe Fallzahl in dieser Studie (n=890) wird es auch ermöglichen, die Ergebnisse zur Regulation von HER-2/neu aus der Table-Studie zu verifizieren. Die Frage nach einem Anstieg von s-HER-2/neu unter hormoneller Ablation kann getrennt für prämenopausale und postmenopausale Patientinnen gestellt werden. In einer vorläufigen, orientierenden Analyse zeigt sich ähnlich wie bei der Table-Studie ein Anstieg von s-HER-2/neu um rund [Seite 187↓]2 ng/ml, ohne daß der obere cut-off-Wert von 15 ng/ml überschritten wird. Es ist zu beachten, daß die meisten Patientinnen in dieser Studie bei Ersterkrankung bereits postmenopausal sind.

Als weiteren Teilaspekt werden wir erstmals die Bedeutung von s-EGFR und s-uPA im Komplex mit seinem Antagonisten PAI-1 für die adjuvante Situation des Mammakarzinoms überprüfen. Es ist unbekannt, ob auch in der adjuvanten Situation ein Teil der Mammakarzinompatientinnen einen erniedrigten s-EGFR-Spiegel aufweist. Durch die Größe der Studie wird es möglich sein, Subgruppen anhand der s-EGFR- und s-HER-2/neu-Spiegel bilden zu können. Außerdem gilt es, die prognostische Bedeutung von s-uPA mit den Daten zu uPA und PAI-1 im Gewebe zu vergleichen.

Um all diese Fragen zu beantworten, wird im Sinne eines „limited samplings“ zur Reduktion des logistischen Aufwands jeweils zum ersten und zum letzten Chemotherapiezyklus sowie im Rezidiv ein Serumröhrchen auf dem Eilpostweg von den Zentren in unser Labor versandt. Des Weiteren erfolgt eine immunhistochemische Färbung des HER-2/neu-Status am Primärtumor sowie am Rezidivgewebe, sofern dies bei leicht zugänglichen Tumormanifestationen wie Haut, Lymphknoten oder Lokalrezidiv bzw. Brustwand gefahrlos und mit dem Einverständnis der Patientin möglich ist.


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06.02.2004