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4  Material und Methoden

4.1 Gesunde Referenzkollektive gemäß Blutspenderkriterien

Zur Definition der cut-off-werte für s-HER-2/neu, CA 27.29, s-EGFR und s-uPA mußte jeweils ein Kollektiv von Mammakarzinompatientinnen in der fortgeschrittenen Erkrankungssituation mit einem gesunden Referenzkollektiv verglichen werden. Dies erfolgte zunächst monozentrisch an der Charité für die manuellen Enzymimmunoassays und wurde in der Folge in einer multizentrischen Untersuchung zur s-HER-2/neu-Bestimmung auf dem klinisch-chemischen Analysenapparat Immuno 1® bestätigt.

4.1.1 Monozentrische Untersuchungen

Im Rahmen der monozentrischen Bestimmungen zu den cut-off-Bereichen der verschiedenen Serumparameter wurde von gesunden Frauen, welche die allgemeinen Kriterien von Blutspendern erfüllten (keine akute oder chronische Erkrankung, keine Impfung innerhalb der letzten 3 Monate, keine Einnahme von Medikamenten, keine Infektions- oder maligne Vorerkrankung), eine 10 ml-Serummonovette venöses Blut abgenommen. Dieses wurde bei 500 g zentrifugiert und der Überstand in 3-4 aliquots à 1,5 ml in Plastikgefäßen bei –30 °C eingefroren. Nach Auftauen für Messungen wurden die benutzten aliquots markiert, um bei Folgemessungen keine freeze-and-thaw-Effekte zu übersehen.

Das Kontrollkollektiv für die s-HER-2/neu-Bestimmungen bestand aus n=54 Patientinnen. Für die cut-off-Bestimmungen von s-EGFR- und s-uPA konnten wir das Vergleichkollektiv auf n=76 erweitern.


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4.1.2  Multizentrische Untersuchung für automatisierten s-HER-2/neu-Assay

Für die Untersuchung zu s-HER-2/neu mit dem voll automatisierten Immuno 1-s-HER-2/neu-Assay wurden alle Seren von Patientinnen und Kontrollen im Rahmen einer multizentrischen Studie an insgesamt 3 Zentren gewonnen. Unsere Studiengruppe war maßgeblich an der Auswertung und Publikation der Resultate beteiligt (25).

Ähnlich wie für die monozentrische Studie wurde für den Immuno 1-Analysenapparat der obere cut-off für s-HER-2/neu als die niedrigste Serumkonzentration definiert, welche 95% der Serumspiegel eines Kontrollkollektivs aus gesunden prä- und postmenopausalen (jeweils n=121) Frauen gerade überschritt. Auch für diese Frauen galten die üblichen Kriterien für gesunde Blutspender, ergänzt durch eine leere Anamnese bezüglich benigner Brusterkrankungen. Die Altersverteilung in dieser gesunden Vergleichsgruppe war wie folgt: n=12 < 25 Jahre; n=100 von 25-45 Jahren; n=54 von 46-60 Jahren; n=76 >60 Jahre.

Das Kollektiv zur Bestimmung der Spezifität des Immuno 1-s-HER-2/neu-Tests für das Mammakarzinom setzte sich zusammen aus 280 gesunden Frauen (inklusive der gerade erwähnten 242 Patientinnen zur cut-off-Bestimmung), 100 Patientinnen mit benignen Brusterkrankungen und 110 Frauen mit anderen, nicht-malignen Erkrankungen ohne Beteiligung der Brustdrüse. Zu den benignen Brusterkrankungen zählten Mikrokalk, Mastalgie, Mastitis, duktale Hyperplasie oder Ektasie, apokrine Metaplasie, Adenome, Fibroadenome mit oder ohne Zysten und Papillome. Unter den nicht-malignen Erkrankungen standen chronische Lebererkrankungen wie Leberzirrhose oder Hepatitis, rheumatiode Arthritis, verschiedene Lungenerkrankungen und chronische Infektionserkrankungen im Vordergrund.

Die Sensitivität des Immuno 1-Assays wurde mit den s-HER-2/neu-Ergebnissen von 204 Mammakarzinompatientinnen in den Stadien I-IV der Erkrankung bestimmt. Für die Stadien I-III erfolgte die Blutentnahme vor der Primäroperation und der Einleitung einer systemischen Therapie. Alle tumorspezifischen und pathologischen Angaben sowie die Therapiedaten zum Probenzeitpunkt lagen vor. Die Proben zum Stadium IV wurden zum Zeitpunkt der Fernmetastasierung abgenommen.


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4.2  Patientinnenkollektiv in den Stadien I-III: Table-Studie

Die prognostische Bedeutung von Serum-HER-2/neu sollte an einem Patientinnenkollektiv unter adjuvanter Behandlung im Rahmen der sogenannten Table-Studie untersucht werden. In dieser prospektiv randomisierten Phase III-Studie wurden die Wirksamkeit und Sicherheit einer 2-jährigen, postoperativen, hormonablativen Therapie mit Leuprorelinacetat im Vergleich zu einer adjuvanten Chemotherapie nach dem CMF-Schema (Cyclosphosphamid, Methotrexat, 5-Fluorouracil) untersucht.

Die Rekrutierungskriterien für diese nach GCP-Kriterien durchgeführte und von der Ethikkommission der Charité zustimmend geprüfte Studie waren wie folgt: Einschlußkriterien: histologisch gesichertes Mammakarzinom nach Primäroperation; Alter >18 Jahre; prämenopausale Patientin gemäß FSH-Status; Behandlungsbeginn innerhalb von 6 Wochen nach Operation; postoperative Beurteilung der Tumorgröße als T1-3; Metastasierung in die lokoregionären Lymphknoten, wobei 1-9 von mindestens 10 untersuchten Lymphknoten befallen sein sollten; Ausschluß einer Fernmetastasierung; positiver Östrogenrezeptorstatus; adäquate, nicht-hormonelle Kontrazeption während der Therapie; negativer Schwangerschaftstest; Therapiebeginn nicht während einer Stillphase; guter Allgemeinzustand; keine relevanten chronischen Erkrankungen; keine relevanten Abnormalitäten in klinischen und Laboruntersuchungen; schriftlicher informed consent. Ausschlußkriterien: medikamentöse Krebstherapie innerhalb der letzten 6 Monate; Teilnahme an einer klinischen Studie innerhalb der letzten 30 Tage; endokrine Störung; Herzinsuffizienz >NYHA III; chronische Steroidtherapie; begleitende Antibiotikatherapie; Serumkreatinin >1,5 mg/dl; Zustand nach bilateraler Ovarektomie, Radiomenolyse, Adrenalektomie oder Hypophysektomie; chronische Einnahme von Phenothiazin; Einnahme von Hormonen, Reserpin, α-Methyldopa in den letzten 2 Wochen vor Studienbeginn.

Die Randomisierung erfolgte in 2 Therapiearme: Die Kontrollgruppe erhielt eine CMF-Chemotherapie mit Cyclophosphamid 500 mg/m2 an den Tagen 1 und 8, Methotrexat 40 mg/m2 an den Tagen 1 und 8 und 5-Fluorouracil 600 mg/m2 ebenfalls an den Tagen 1 und 8. Insgesamt wurden planungsmäßig 6 Zyklen im Abstand von 28 Tagen verabreicht. Im [Seite 35↓]Untersuchungsarm wurden die Patientinnen alle 3 Monate mit Leuprorelinacetat in Form einer subkutanen Depotinjektion und einer Dosis von 11,25 mg behandelt. Diese Therapie wurde bis zum Rezidiv, maximal aber über 2 Jahre, fortgesetzt.

Als primäres Zielkriterium für die Beurteilung der Wirksamkeit wurde die Anzahl der nach 2 Jahren rezidivfrei Überlebenden zwischen den beiden Gruppen verglichen unter der Ausgangshypothese, daß die beiden Therapieformen äquieffektiv sind. Als weitere Endpunkte wurden das rezidivfreie und das Gesamtüberleben nach Kaplan-Meier überprüft.

Die Nachsorge der Patientinnen erfolgte im üblichen Modus mittels Anamnese, eingehender körperlicher Untersuchung inklusive EKG sowie bildgebenden Verfahren (Röntgen Thorax, Sonographie Abdomen, Skelettszintigramm und andere entsprechend klinischer Notwendigkeit). Das Rezidiv des Mammakarzinoms galt als gesichert, wenn bei einem Lokalrezidiv ein positiver zytologischer oder histologischer Befund erhoben wurde. Fernmetastasen wurden mittels Bildgebung diagnostiziert.

Zur Dokumentation des endokrinen Status (LH und Östradiol bei allen Patientinnen, zusätzlich FSH und Leuprorelinacetat bei den deutschen Patientinnen) waren im Protokoll regelmäßige Blutentnahmen in folgenden Zeitabständen vorgesehen: Monat 0 (= baseline), Monat 3, Monat 6 (= Ende der CMF-Chemotherapie), Monat 12, Monat 18 und Monat 24 (= Ende der Leuprorelin-Therapie). Alle Patientinnen wurden endokrinologisch nachbeobachtet, bis sie sicher postmenopausal (FSH >50 U/l) waren. Ein Wiedereinsetzen der Menstruation wurde dokumentiert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden zudem das Blutbild mit Differentialblutbild, der Quick-Wert und übliche Parameter der Standardserumchemie bestimmt.

Im Rahmen der Table-Studie wurde das Material wie folgt aufgearbeitet: Nach dem Ausgerinnen wurden 10 ml Vollblut zentrifugiert, das gewonnene Serum abdekantiert, beschriftet, bei –20 °C eingefroren und in batches in ein Zentrallabor geschickt, wo es in der Folge bei –80 °C gelagert wurde. Für die HER-2/neu-Bestimmungen stand der Arbeitsgruppe jeweils ein aliquot Serum zur Verfügung. Zusätzlich zu HER-2/neu wurde [Seite 36↓]auch CA 27.29 bestimmt. Aus den Seren der Table-Studie wurde HER-2/neu anhand der hohen Probenzahl auf der automatisierten Plattform Immuno 1 getestet (Methodik siehe 4.1.2). Jede 10. Probe wurde im gleichen Auftauvorgang parallel mit dem manuellen Oncogene®-Test gemessen, um die Korrelation zwischen den beiden Verfahren zu untersuchen.

4.3 Patientinnenkollektive im Stadium IV zur Verlaufsbeobachtung

Insgesamt untersuchten wir 3 verschiedene Patientinnenkollektive mit metastasiertem Mammakarzinom: Patientinnen aus einer Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel als Zweit- oder Mehrlinientherapie, ein gemischtes Patientinnenkollektiv unter unterschiedlichen Formen und Linien der Chemotherapie sowie ein drittes Kollektiv unter einer Herceptin-basierten systemischen Behandlung.

4.3.1 Wöchentlich fraktioniertes Paclitaxel als Zweit- oder Drittlinientherapie

Die ersten longitudinalen Daten zu HER-2/neu im Serum wurden im Rahmen einer Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem, dosisintensivierten Paclitaxel erhoben. Insgesamt war für diese Studie eine Fallzahl von 50 Patientinnen errechnet worden, wobei das Amendment für die Serum-HER-2/neu-Begleituntersuchung ab der Patientin 11 aktiviert wurde.

Bei der Studie handelte es sich um eine monozentrische Untersuchung mit folgenden Rekrutierungsrichtlinien: Einschlußkriterien: Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom mit evaluierbarer Erkrankung (Größenbestimmung definierter Referenzmetastasen, Verlaufsbeobachtung von Ergüssen); zytostatische palliative Vorbehandlung (Versagen einer anthrazyklinhaltigen Therapie; bei Kontraindikationen gegen Anthrazykline auch Erstlinientherapie möglich); Karnofsky-Index >70%; [Seite 37↓]ausreichende Knochenmarksreserve; Alter 18-80 Jahre; geschätzte Lebenserwartung >12 Wochen; Fähigkeit, Inhalt und Konzept der Studie zu verstehen; schriftliche Einverständniserklärung. Ausschlußkriterien: bekannte Allergie gegen Paclitaxel oder einen Bestandteil der Zubereitung; vorbestehende, periphere Neuropathie; Knochenmarkinsuffizienz (Leukozyten <3000/µl, Hb <6,7 mmol/l, Thrombozyten <100.000/µl); schwere kardiale Begleiterkrankungen; klinisch relevante Leber- oder Nierenfunktionsstörungen (Bilirubin >2-fache der oberen Norm und/oder ALAT >3-fache der oberen Norm; bei Lebermetastasierung keine Transaminasenerhöhung >5-fache der oberen Norm; Kreatinin oder Harnstoff >1,5-fache der oberen Norm); Schwangerschaft oder Stillperiode. Die Studie wurde nach GCP-Kriterien durchgeführt und von der Ethikkommission der Charité zustimmend geprüft.

Die fraktionierte Paclitaxel-Therapie wurde als halbstündige Infusion wöchentlich über insgesamt 6 Wochen mit Wiederholung des Zyklus ab Tag 50 (d. h. mit einer Therapiepause von 14 Tagen) verabreicht. Eine halbe Stunde vor Infusion erhielten die Patientinnen eine Prämedikation mit 16 mg Dexamethason, 200 mg Cimetidin und 2 mg Clemastin. Es wurden PVC-freie Infusionssysteme verwendet. Die Therapie wurde bis zur Progression, maximal aber über 4 Zyklen (entsprechend ca. einem halben Jahr) durchgeführt, da bei Initiierung der Studie über die Gefahr einer peripheren Neurotoxizität unter fraktionierter Paclitaxel-Gabe und langer Behandlungsdauer kaum Daten vorlagen. Im Protokoll waren bei eingeschränkter Knochenmarksregeneration unter Therapie primär keine Dosisreduktionen, sondern Therapieverschiebungen von 1 oder 2 Wochen vorgesehen.

Das restaging der Patientinnen erfolgte durch eine körperliche Untersuchung sowie bildgebende Verfahren (Röntgen Thorax, Sonographie Abdomen, Skelettszintigramm, Computertomographie und andere entsprechend klinischer Notwendigkeit). Die Lebensqualität wurde mit Hilfe standardisierter und validierter Befindlichkeitsbögen erfaßt. Zentrale Endpunkte waren die objektive Remissionsrate sowie das progressionsfreie Intervall (26). Zur Beschreibung der Tumorlast wurde für die Auswertung zum einen die Anzahl der befallenen Organe gezählt; hierbei galten zum Beispiel eine Lungenmetastasierung und Pleuraergüsse als 2 Organe. Zum anderen wurden drei [Seite 38↓]Hauptmanifestationsmöglichkeiten definiert als vorherrschend viszeraler, Knochen- oder Weichteilbefall.

Bei allen untersuchten Patientinnenkollektiven mit metastasiertem Mammakarzinom galten folgende Kritierien für die Remissionsbeurteilung: Zweidimensional meßbare Metastasen wurden als Referenzläsionen gewählt. Hierbei wurde als Größenmaß die Summe der Produkte des jeweils längsten und des dazu rechtwinkligen Durchmessers gewählt. Evaluierbare, aber nicht meßbare Metastasen (z. B. Ergüsse oder eine Lymphangiosis carcinomatosa der Lunge) wurden ebenfalls berücksichtigt. Eine komplette Remission (CR) wurde bei Verschwinden aller Tumormanifestationen und Bestätigung des Befundes nach mindestens 4 Wochen diagnostiziert. Zum Erreichen einer partiellen Remission (PR) mußte die Tumorlast im Vergleich zu Therapiebeginn um mehr als 50% reduziert werden; auch dieser Befund bedurfte der Bestätigung nach 4 Wochen. Jede neue Tumormanifestation oder eine mehr als 25%-ige Größenzunahme einer Läsion führte zur Einstufung als Progression (PD). Die Erkrankung wurde als stabil (SD) betrachtet, wenn weder die Kriterien einer PR noch einer PD zutrafen. Eine SD einer evaluierbaren Läsion bei gleichzeitiger CR der meßbaren Tumormanifestationen führte zur Gesamtbeurteilung als PR, wärend eine stabile, nicht-meßbare Läsion die Diagnose einer PR nicht einschränkte. Das progressionsfreie Intervall wurde definiert als Zeitraum von der Einleitung einer Therapie bis zur Diagnose der Erkrankungsprogression. Als Dauer der Remission galt der Zeitraum vom Erreichen der PR bis zum Zeitpunkt der Progression.

Mit den wöchentlich notwendigen Blutbildkontrollen vor Durchführung der Chemotherapie wurde Serum nach Zentrifugation bei 500 g aliquotiert und bei –30 °C asserviert. In den Jahren 1996-1999 wurden alle Seren auf HER-2/neu mit dem Chiron-Assay (Methodik siehe 4.5.1.) getestet. Da dieser Test ab 1999 nicht mehr kommerziell verfügbar war und durch eine modifizierte und später von der FDA zugelassene Version ersetzt wurde, testeten wir alle Seren (unaufgetaute aliquots) erneut mit diesem durch Oncogene Science vertriebenen kit (Methodik siehe 4.5.2.). Da die Asservierung von Serum nach Befürwortung des entsprechenden Protokollamendments durch die Ethikkommission erst einige Wochen nach Studienstart beginnen konnte und wenige Patientinnen wegen Nebenwirkungen den ersten Zyklus mit wöchentlich fraktioniertem [Seite 39↓]Paclitaxel nicht beenden konnten, qualifizierten insgesamt 35 Patientinnen aus dieser Studie für die s-HER/neu-Analyse.

4.3.2 Patientinnenkollektiv unter diversen Arten und Linien der Chemotherapie

Die Zahl an Patientinnen zur Untersuchung der Bedeutung von s-HER-2/neu aus der Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel war für eine multivariate Analyse nicht ausreichend und enthielt zudem ein selektioniertes Patientinnengut. Wir dehnten die Untersuchung daher auf alle sukzessiven Patientinnen aus, die sich in unserer Mamma-Ambulanz neu einer Chemotherapie unterziehen mussten und uns schriftlich ihr Einverständnis für die longitudinalen Blutuntersuchungen gaben. Diese Patientinnen durften die Chemotherapie unter Studienbedingungen und als Standardtherapie außerhalb einer Studie erhalten. Sowohl Frauen vor Erstlinienchemotherapie wie auch Patientinnen nach mehrfacher chemotherapeutischer Vorbehandlung konnten in die Untersuchung eingehen. Patientinnen unter Hormontherapie wurden nicht eingeschlossen. Insgesamt konnten im Laufe von 3 Jahren 111 Patientinnen rekrutiert werden, deren Serumverlauf repräsentativ war.

4.3.3 Kombination von Chemotherapie und Herceptin

Da Herceptin in Deutschland erst im September 2000 zugelassen wurde und zuvor ca. 2 Jahre lang nur über internationale Apotheken erhältlich war, ist die Anzahl an Herceptin-Patientinnen pro Zentrum sehr begrenzt. Dennoch wurde in einer ersten orientierenden Analyse versucht, die Übereinstimmung von s-HER-2/neu im longitudinalen Verlauf mit dem klinischen Ansprechen zu korrelieren. Hierzu wurden alle Patientinnen herangezogen, die an der Medizinischen Klinik II der Charité am Campus Mitte jemals mit Herceptin behandelt wurden. Diese Patientinnengruppe ist relativ heterogen, was die Anzahl der Vortherapien wie auch die zytostatischen Kombinationspartner von Herceptin angeht. Insgesamt konnten 27 auswertbare Patientinnen aus der Charité in die Analyse eingehen.


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Um die Patientinnenzahl zu erweitern, wurden uns aus der Frauenklinik des Universitätsklinikums Benjamin Franklin freundlicherweise mehrere Hundert Verlaufsproben und die klinischen Daten von weiteren 27 Patientinnen unter Herceptin-Therapie zur Verfügung gestellt. Diese Proben waren im Rahmen einer Untersuchung zur Kardiotoxizität von Herceptin abgenommen worden. In Herzbiopsien wurde die Expression der Rezeptoren EGFR, HER-2/neu, HER-3 und HER-4 gemessen, während parallel im Serum einige Zytokine bestimmt wurden mit der Frage, ob eine akute-Phase-Reaktion durch Herceptin ausgelöst werden würde.

Identisch zu dem bereits beschriebenen Vorgehen der Serumasservierung wurde auch bei den Herceptin-Patientinnen mit den wöchentlich notwendigen Blutbildkontrollen vor Durchführung der Antikörper- und ggf. Chemotherapie das Serum nach Zentrifugation bei 500 g aliquotiert und bei –30 °C asserviert. Die Seren wurden dann in batches auf s-HER-2/neu mit dem Oncogene-Assay getestet.

4.4 Patientinnenkollektive zur HER-2/neu-Konkordanzanalyse

Ein wesentliches Ziel der Untersuchungen von s-HER-2/neu bestand darin, die Wertigkeit der Bestimmung des shed antigens im Serum in Relation zu den verschiedenen HER-2/neu-Gewebetesten zu setzen. Hierfür war es zunächst notwendig, den Prozentsatz der Patientinnen mit HER-2/neu-Überexpression im Gewebe zu bestimmen, die auch im Serum zum Zeitpunkt der Fernmetastasierung einen erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel aufzeigten. Diese Fragestellung erlaubte es auch, den Anteil der non-shedder zu evaluieren. Zudem würde sich zeigen, wieviele Patientinnen mit fehlender HER-2/neu-Überexpression im Gewebe dennoch im Stadium IV der Erkrankung eine erhöhte Konzentration von s-HER-2/neu aufweisen. Diese Fragestellung entspricht statistisch einer Vierfeldertafel.


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4.4.1  Immunhistochemie des Primärtumors und s-HER-2/neu im Stadium IV

Diese gerade beschriebene Evaluierung erfolgte zum 31. Juni 2001 als Stichtag und bezog sich auf alle immunhistochemisch gesicherten HER-2/neu-Gewebeergebnisse der Mamma-Ambulanz der Medizinischen Klinik II der Charité. Es wurden alle Patientinnen berücksichtigt, von denen der HER-2/neu-Status im Gewebe bekannt war und von denen auch eine Serumprobe zum Zeitpunkt der Progression der metastasierten Erkrankung in der Probenbank asserviert worden war. Es ergab sich eine Fallzahl von 101 Patientinnen mit komplettem Datensatz.

4.4.2 Subgruppenanalyse mit IHC des Primärtumors, computerisierter IHC-Befundung, FISH und s-HER-2/neu im Stadium IV

Die oben erwähnten 101 immunhistochemischen Färbungen auf HER-2/neu waren multizentrisch und mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt worden. Um monozentrisch eine standardisierte IHC auf HER-2/neu durchführen zu können, schrieben wir alle Institute und Praxen für Pathologie an, um entweder die Paraffinblöcke oder Schnitte von diesen Paraffinblöcken zu erhalten. Trotz hohen logistischen und zeitlichen Aufwands konnten wir nur von 30 Patientinnen Tumormaterial erhalten. Dieses Material ging aber über die Primärtumoren hinaus und erstreckte sich insgesamt auf 61 Schnitte von Primärtumoren, lokoregionären Lymphknotenmetastasen, Lokalrezidiven und Fernmetastasen. Von all diesen Schnitten wurden eine standardisierte IHC nach DAKO und eine FISH-Analyse durchgeführt. Zudem wurden die standardisiert gefärbten IHC-Schnitte nicht nur konventionell unter dem Lichtmikroskop von einem erfahrenen Pathologen beurteilt, sondern auch einer computergestützten Befundung auf dem ACIS-System von Chromavision® zugeführt.


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4.5  Methoden der s-HER-2/neu-Bestimmung

Bis 1999 stand für die Messung von s-HER-2/neu ein ELISA-Assay der amerikanischen Firma Chiron Diagnostics® zur Verfügung. Dieser wurde in der Folge durch eine Weiterentwicklung der Firma Oncogene Science® ersetzt. Oncogene Science wurde später durch Bayer Diagnostics® aufgekauft, welche die Serummessung von HER-2/neu auch für den klinisch-chemischen Analysenapparat Immuno 1 adaptierten. Während also der Chiron-Assay nur für die Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel zur Verfügung stand, wurden alle weiteren Analysen mit dem ELISA-kit von Oncogene durchgeführt. Lediglich die Seren der Table-Studie wurden automatisiert auf dem Immuno 1 gemessen, da sie als letztes und zeitlich kongruent mit der Zulassung des Immuno 1-Assays zur Verfügung standen und das hohe Probenaufkommen für die automatisierte Testversion besonders geeignet erschien.

Die im folgenden beschriebenen Serummessungen für alle biochemischen Marker erfolgten unabhängig von der Methodik in Doppelbestimmung, um Fehler eingrenzen zu können.

4.5.1 Chiron®-Assay

Bei Beginn der Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel stand als standardisierte Methode zur Serum-HER-2/neu-Bestimmung der Chiron®-Assay zur Verfügung. Bei diesem Test wird eine Serumprobe (50µl) in einem Streptavidin-beschichteten Röhrchen mit 200 µl SSC-Puffer verdünnt, gemischt und im Anschluß mit 200 µl eines gemischten Antikörperkonjugates versetzt. Dieses besteht aus anti-HER-2/neu-Antikörpern, die mit Meerrettichperoxidase und Isothiocyanat (FITC) markiert sind. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden werden 200 µl eines biotinylierten Antikörpers (Tab 257) zugegeben, der im nächsten, 2-stündigen Inkubationsschritt mit FITC reagiert. Nach dem Dekantieren der Röhrchen und 3 Waschschritten wird der Farbumschlag durch Zugabe von Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid zunächst in Gang gesetzt [Seite 43↓]und nach weiteren 25 min durch die Zugabe von 1 ml einer 1-molaren Phosphorsäure beendet. Die Farbintensität wird bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt. Das Meßergebnis läßt sich auf einer Standardkurve ablesen, die mit Hilfe von 4 Standardsaufgestellt und mit einer parallel mitgeführten Kontrolle überprüft wurde. Das Meßergebnis wird in U/ml angegeben.

4.5.2 Oncogene Science®-Assay

Nachdem der Chiron®-Assay kommerziell nicht mehr erhältlich war, wurden die weiteren Untersuchungen mit dem Oncogene Science®-Assay durchgeführt. Auch hierbei handelt es sich um einen Enzymimmuno-Assay, bei dem ein monoklonaler anti-HER-2/neu-Antikörper als Beschichtung („capture reagent“) auf einer Mikrotiterplatte spezifisch an die extrazelluläre Domaine von HER-2/neu bindet. Bei dem Test werden 20 1l Serum mit 980 1l gepuffertem „sample diluent“ gemischt und in der Folge 100 1l dieser Verdünnung in die Mikrotiterplatten-wells pipettiert. Nach einer Inkubationsphase von 3 Stunden bei 371C und 3 Waschschritten werden 100 1l des monoklonalen, murinen Detektionsantikörpers in jedes well zugefügt. Nach diesem Schritt folgen eine weitere, einstündige Inkubationsphase bei 37 °C und 3 Waschschritte, bei denen ungebundene Moleküle entfernt werden. Während der Inkubation reagieren die Detektorreagentien mit der immobilisierten, extrazellulären Domaine von HER-2/neu. Die Menge des biotinylierten, nunmehr an das Antigen gebundenen Detektorantikörpers wird durch die Koppelung an ein Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat (100 µl) bestimmt. Das Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat bindet an Biotin an und katalysiert den roten Farbumschlag des chromogenen Substrates O-Phenylendiamin (100 1l), welches nach einer halbstündigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur und 3 abschließenden Waschschritten hinzugefügt wird. Die Platte wird dann nochmals für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert, ehe die Reaktion mit 100 1l Stoplösung (2,5 N H2SO4) beendet wird. Die Farbreaktion wird photometrisch bei 490 nm quantifiziert. Insgesamt werden bei dem Test 6 Standards und 1 Kontrolle zur Aufstellung und Verifizierung der Eichkurve [Seite 44↓]mitgeführt. Das Meßergebnis trägt die Einheit ng/ml bei einem analytischen Range der unverdünnten Probe von 3,6-36 ng/ml.

4.5.3 Immuno 1®-Plattform

Bei dem HER-2/neu-Serum-Assay auf der Immuno 1®-Plattform handelt es sich um einen magnetischen Separationsimmunoassay. Bei dem Test werden die gleichen monoklonalen Antikörper (NB-3 und TA-1) eingesetzt wie beim oben beschriebenen Oncogene-Assay. Sie docken an jeweils unterschiedliche Bindungsstellen der extrazellulären Domaine von HER-2/neu an. Das Reagenz 1 besteht aus dem Antikörper NB-3, der mit Fluorescein markiert ist. Reagenz 2 entspricht dem Fab-Fragment von TA-1, das seinerseits an die alkalische Phosphatase als ausführendem Enzym gekoppelt ist. Reagenz 1 (65 µl), Reagenz 2 (65 µl) und die gewünschte Serumprobe bzw. Standard oder Kontrolle (20 µl) werden bei 37 °C für 20 min auf der Plattform inkubiert. Im nächsten Schritt werden Magnetpartikel, die kovalent an einen anti-Fluorescein-Antikörper (20 µl) gebunden sind, zugefügt, um Sandwich-Immunkomplexe auszubilden. Nach 28 min werden die Magnetpartikel-Antikörper-Komplexe durch Waschvorgänge von den ungebundenen Molekülen getrennt und das chromogene Substrat (p-Nitrophenylphosphat) der alkalischen Phosphatase zugefügt, welche die Reaktion von p-Nitrophenylphosphat und Wasser in p-Nitrophenoxid und Phosphat katalysiert. Die Absorption wird bei 405 nm und 450 nm gemessen und die Probenkonzentration von Serum-HER-2/neu anhand der mit 6 Standards aufgestellten Eichkurve bestimmt. Für unverdünnte Proben reicht der analytische Range von 0,1-250 ng/ml.

Zum Ausschluß eines Einflusses einer Medikation mit Herceptin auf die s-HER-2/neu- Bestimmung wurde mit einer Herceptin-Stammlösung in Patienten- und Kontrollseren eine Verdünnungsreihe aufgestellt, die Endkonzentrationen von Herceptin im Meßsubstrat von 0-410 µg/l ergab. Auch diese Seren wurden im Anschluß auf dem Immuno 1 analysiert. Diese Untersuchung führten wir nicht im eigenen Labor durch (Bayer Diagnostics Business Group, data on file und publiziert in verschiedenen Produktinformationen, z. B. [Seite 45↓](27)). Sie sollen hier nur erwähnt und im Ergebnisteil zitiert werden, da sie für die Reliabilität und Interpretation der Messungen an Herceptin-Patientinnen relevant sind.

4.6 Methodik der s-EGFR-Bestimmung

Auch bei dem s-EGFR-Test handelt es sich um einen Doppelsandwich-Immunoassay, der einen capture-Antikörper von der Maus und einen ebenfalls murinen, mit alkalischer Phosphatase-markierten Detektionsantikörper einsetzt. Beide Reagentien binden spezifisch an die extrazelluläre Domaine von EGFR. Es ist wichtig, daß der Detektionsantikörper keine Kreuzreaktion mit der extrazellulären Domaine von HER-2/neu eingeht. Die Mikrotiterplatten-wells sind mit dem capture-Antikörper beschichtet. Für den Test werden in jedes well 100 µl der Probe pipettiert und für 90 min bei 37 °C inkubiert. Danach werden alle wells 6 mal mit 300 µl Waschlösung gewaschen. Dabei wird nach 3 Waschschritten die Mikrotiterplatte um 180 Grad gedreht. Das immobilisierte Antigen wird dann dem mit alkalischer Phosphatase markierten Detektionsantikörper (100 µl) ausgesetzt und für 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Im nächsten Schritt werden 100 µl des Substrates der alkalischen Phosphatase (p-Nitrophenylphosphat) zugegeben und für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 100 µl der Stoplösung wird die Reaktion beendet. Die photometrische Messung der Färbung sollte innerhalb von 15 min bei einer Wellenlänge von 405 nm stattfinden. Die EGFR-Konzentration im Serum wird mit Hilfe einer an 6 Standards aufgestellten Eichkurve ermittelt. Der analytische Range unterdünnter Proben reicht bis 300 ng/ml.

4.7 Methodik der s-uPA-Bestimmung

Bei dem Oncogene Science® s-uPA-ELISA-Test handelt es sich ebenfalls um einen Sandwich-Immunoassay, der 2 monoklonale Antikörper gegen menschliches uPA als capture-Reagentien einsetzt, mit welchen die innere Oberfläche der Mikrotiterplatten-wells [Seite 46↓]beschichtet ist. Bei dem Test werden 100 µl vorverdünnten Serums in Doppelbestimmung in die beschichteten wells pipettiert und über Nacht (12 bis 18 Stunden) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden alle wells 6 mal mit je 300 µl Waschlösung per well gewaschen. Ähnlich wie beim EGFR-Assay wird nach 3 Waschschritten die Mikrotiterplatte um 180 Grad gedreht. Im nächsten Schritt werden 100 µl des Detektorantikörpers (vom Kaninchen) hinzupipettiert und bei Raumtemperatur für 60 min inkubiert. Die Menge des an das Antigen gebundenen Detektorantikörpers wird dadurch bestimmt, daß 100 µl eines mit Meerrettichperoxidase markierten anti-Kaninchen-Antikörpers (von der Ziege) vom IgG-Typ zugegeben werden und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert bleiben. Als Substrat der Meerrettichperoxidase dient O-Phenylendiamin (100 µl) als chromogenes Substrat. Dieses inkubiert bei Raumtemperatur für 45 min unter Lichtschutz. Durch die Zugabe von 100 µl der Stoplösung wird die Reaktion beendet und die Absorption photometrisch innerhalb von 30 min mit einem 490 nm-Filter gemessen. Anhand einer Standardkurve aus 6 Standards wird eine Eichkurve aufgestellt und die uPA-Konzentration in der Einheit pg/ml abgelesen. Der analytische Range unverdünnter Proben reicht bis 3500 pg/ml.

4.8 Methodik der CA 27.29-Bestimmung

CA 27.29 wurde auf dem klinisch-chemischen Analysenapparat ACS:180® gemessen. Bei dem Test handelt es sich um einen kompetitiven Immunoassay auf Chemilumineszenzbasis. Hierbei werden 25 µl unverdünntes Serum simultan mit den beiden folgenden Reagentien inkubiert: Das lite-Reagenz (50 µl) enthält einen spezifischen, monoklonalen Anti-CA 15-3-Antikörper (B27.29), der als tracer mit einem Acridiniumester markiert ist. B 27.29 bindet an die Tandemregion von MUC-1. Das „solide phase“-Reagenz (250 µl) enthält angereichertes CA 15-3, das kovalent an paramagnetische Partikel gebunden ist. Nach der Inkubationszeit von 7,5 min bei 37 °C werden die Partikel magnetisch separiert und gewaschen. Eine Chemilumineszenzreaktion wird gestartet und die Menge an emittiertem Licht wird in sogenannten „relative light units“ (RLU) gemessen. Die CA 27.29-Spiegel werden mit Hilfe einer Eichkurve [Seite 47↓](insgesamt 7 Standards) berechnet und in U/ml angegeben. Für unverdünnte Proben reicht der analytische Range bis 450 U/ml.

4.9 Methodik der HER-2/neu-Immunhistochemie

Die standardisierte, immunhistochemische Bestimmung der HER-2/neu-Expression wurde gemäß der Produktbeschreibung des Herstellers (DAKO HercepTest®) durchgeführt. Von dem archivierten Paraffinmaterial werden 4 µm dicke Schnitte angefertigt und auf sialinisierte Objektträger aufgezogen. In der Folge werden die Schnitte auf 60 °C erwärmt, bis das Paraffin schmilzt. Die Gewebeschnitte werden in Xylol (2 x 5 min) entparaffinisiert und in einer Reihe von Alkohol (2 x 3 min 95% Ethanol, gefolgt von 2 x 3 min 70% Ethanol) und destilliertem Wasser (30 sec) rehydriert.

Danach wird die 1:10 verdünnte „epitope retrieval“-Lösung in einer Küvette in ein Wasserbad gestellt und auf 95-99 °C temperiert. Die entparaffinisierten Gewebeschnitte werden hierin über die Dauer von 40 min inkubiert, nach dieser Zeit für 20 min bei Raumtemperatur zum Abkühlen stehengelassen und schließlich in einem Waschpufferbad gewaschen. Danach werden die Schnitte mit 100 µl Peroxidase-Blockungsreagenz überdeckt, für 5 min inkubiert und erneut mehrfach in destilliertem Wasser und Waschpuffer gewaschen. Als nächster Schritt werden die Schnitte mit dem primären, monoklonalem Anti-Human-HER-2/neu-Antikörper (vom Kaninchen) für 30 min inkubiert. Die Immunreaktion wird nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit dem DAKO Visualisationsreagenz, einem Konjugat aus Dextranpolymer, Meerrettichperoxidase und anti-Kaninchen-Immunglobulin (von der Ziege), sichtbar gemacht. Als Chromogen werden 30 µl 3,3‘-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) eingesetzt, für 10 min inkubiert, die Schnitte dann mit Hämatoxyllin gegengefärbt und abschließend mehrfach in destilliertem Wasser gewaschen. Bei den negativen Kontrollen wird der primäre Antikörper durch normales Kaninchenserum ersetzt.


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Die Beurteilung der HER-2/neu-Färbung erfolgt durch einen erfahrenen Pathologen gemäß eines standardisierten Scoring-Systems: Die Färbung wird als 0 eingestuft, wenn keine oder weniger als 10% der Zellen eine Membranfärbung aufweisen. Wenn eine kaum erkenntliche oder geringe Membranfärbung bei mehr als 10% der Zellen sichtbar ist, wird der Tumor als +1 eingestuft. Die Score +2 oder +3 werden vergeben, wenn die Membranfärbung bei mehr als 10% der Zellen mäßig oder stark ausgeprägt ist. Als Überexpression werden gemäß den Zulassungsbedingungen von Herceptin in den USA die Scores +2 und +3 gewertet.

4.10 Methodik der computerisierten HER-2/neu-IHC-Befundung

Das computerisierte „Automated Cellular Imaging®”-System (ACIS-System) wurde zur sekundären Befundung der nach DAKO auf HER-2/neu gefärbten Gewebeschnitte eingesetzt mit dem Ziel, den Einfluß des individuellen Untersuchers zu eliminieren. Bei dem ACIS-System handelt es sich um ein interaktives Verfahren, bei dem eine automatisierte Mikroskopie mit einer computergestützten Bildverarbeitung kombiniert wird (siehe Abbildung 5).

Abbildung 5: Hardware des ACIS-Systems mit automatisierter Lichtmikroskopie und nachgeschalteter Bildverarbeitung am Computer (mit freundlicher Genehmigung von ChromaVision® Medical Systems, San Juan Capistrano, USA).


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Der automatisierten Gewebebefundung liegt ein Scoring-Algorithmus zugrunde, der eine präzise Quantifizierung der Färbungsintensität im Sinne eines voll quantitativen Tests erlaubt. Das ACIS-System integriert die Prinzipien der sogenannten „Color Space Transformation”, des „Morphological Sorting” und des „Rapid Counting”, welche in der Summe eine rasche Erkennung und Bearbeitung der Zielregionen auf der Basis von Farbe, Größe und Gestalt erlauben (28;29).

Durch die hochflexible „Color Space Transformation” kann in jedem einzelnen histologischen Gewebeschnitt die exakte Farbzusammenstellung identifiziert werden. Die digitalen Bilder, die durch das ACIS-System erfaßt werden, bestehen aus distinkten Pixels, die sich wiederum aus den drei Farben Rot, Grün und Blau zusammensetzen. Innerhalb dieser drei Farbbänder wird die Pixelintensität von 0–255 auf einer metrischen Skala definiert. Der mathematische Aufbau dieses Algorithmus erlaubt es dem System, alle wichtigen Pixel einer spezifischen Farbe jenseits des Schwellenwertes, einer spezifischen Gestalt oder einer definierten Intensität in dem Programm zu identifizieren. Sobald all diese Pixel gefunden wurden, wird das Farbbild in ein Schwarzweißbild mit starkem Kontrast konvertiert, indem die Pixel jenseits des Schwellenwertes in Weiß vor einem schwarzen Hintergrund abgebildet werden. So wird selbst die Abgrenzung eines einzigen Pixels möglich, was die Qualität des Ergebnisses und auch die Untersuchungszeit optimiert und gleichzeitig relativ wenig Speicherplatz notwendig macht. Das „Morphological Sorting” unterscheidet mehr als 50 Gestaltparameter, um die Zielstrukturen morphologisch genau einzuordnen. Der “Rapid Counting”-Prozeß ist für die absolute und relative Quantifizierung von möglichen Zielstrukturen und anderen Gewebebestandteilen wie Stromazellen und Gefäßen verantwortlich. Durch diese 3 genannten Techniken ist eine exakte histologische Rekonstruktion des Präparateschnitte auf dem Computerbildschirm möglich.

Die HER-2/neu-Befundung auf dem digitalen ACIS-Mikroskop findet wie folgt statt: Aus dem Slidekarussell wird automatisch der nächste Schnitt auf den Objektträgertisch des Mikroskopes transportiert. Gemäß den oben geschilderten Techniken wird ein Übersichtsbild des gesamten Schnittes gescannt. Der Pathologe wählt aus dieser Übersicht mindestens 6 interessierende, korrekt gefärbte Bereiche für die Beurteilung aus. Für jede [Seite 50↓]dieser regions of interest bestimmt das System einen eigenen Score und mittelt das Endergebnis über die Einzelergebnisse. Der HER-2/neu-Score entspricht damit der mittleren Braunfärbung der Pixel jenseits einer vordefinierten Farbschwelle für die DAB-Färbung des DAKO HercepTests. Diese Pixel werden mit Hilfe eines Algorithmus innerhalb der region of interest nur dann identifiziert, wenn sie sicher der Plasmamembran zuzuordnen sind. Die ACIS-Skala für die immunhistochemischen HER-2/neu-Färbung reicht von 0-255 und wird auf den üblichen DAKO HercepTest-Score umgerechnet. Da sich das ACIS-Scoring über einen großen Pixelrange erstreckt, kann das System aber innerhalb des DAKO HercepTest-Scores von +3 noch weiter auflösen und das Scoring-Resultat auf +4 und +5 erweitern. Durch die höhere Genauigkeit der digitalen Mikroskopie können die Ergebnisse auch in Zehntelbruchteilen als lineares, metrisches Ergebnis ausgegeben werden (zum Beispiel 1,3 oder 2,1). Als HER-2/neu- positiv werden Präparate mit einem Durchschnittsergebnis >2,0 angegeben.

4.11 Methodik der HER-2/neu-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung

Die Anzahl der Genamplifikate von HER-2/neu für die Konkordanzanalyse verschiedener Nachweismethoden von HER-2/neu wurde an Paraffinschnitten von Primärtumoren und Metastasen mittels des Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsassays der Firma Ventana ® bestimmt. Hierfür müssen die Schnitte wie folgt präpariert werden: Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete Mammakarzinomschnitte mit einer Dicke von 4 µm werden auf sialinisierte Objektträger aufgezogen, über Nacht bei 60 °C erhitzt, in Xylen über 2 x 5 min entparaffinisiert und schließlich 2 x 5 min in 100%-igem Ethanol gebadet. Nach dem Trocknen werden die Schnitte über 15 min bei 42 °C mit der Vorlösung behandelt und mit saline sodium citrate (SSC)-Puffer (pH = 7,0) für 2 min gewaschen.

Für den Proteinverdau werden die Gewebeschnitte über 1 Stunde bei 42 °C mit einer Proteaselösung [0,25 mg/ml, 40 ml 2x SSC + 400 µl protein digestion enzyme PDE in einer Konzentration von 25 mg/ml] inkubiert. Nach dem Proteinverdau werden die Schnitte über 10 sec bei Raumtemperatur in 2x SSC gewaschen. Danach werden 10 µl [Seite 51↓]Propidiumiodid/Antifade-Gegenfarbe auf den Schnitt aufgebracht. Der Objektträger wird mit einem Deckgläschen abgedeckt und auf einen korrekten Verdau untersucht. Sofern dieser noch nicht als ausreichend eingestuft werden kann, werden beide Schritte (Vorbehandlung mit Vorlösung und Verdau) wiederholt. Vor der Hybridisierung werden die Schnitte erneut zweimal für 10 sec bei Raumtemperatur in 2x SSC-Lösung gewaschen. Als nächstes folgt die Dehydratation über jeweils 1 min in zunächst 70%-igem Ethanol, dann 80%-igem Ethanol und schließlich 95%-igem Ethanol. Die Schnitte werden luftgetrocknet.

Die Digoxigenin (DIG)-markierte HER-2/neu-Sonde wird vor dem Auftragen über 5 min bei 37 °C erwärmt und dann in einer Menge von 10 µl auf jeden aufgezogenen Gewebeschnitt aufgetragen. In der Folge werden die Schnitte über 10 min bei 72 °C denaturiert. Die Schnitte werden mit einem Deckglas abgedeckt und über Nacht bei 37 °C in einer feuchten Kammer hybridisiert. Danach werden die Schnitte zunächst zweimal bei 72 °C in 2x SSC und dann einmal in 1x PBD (phosphatgepuffertes Detergens) bei Raumtemperatur über jeweils 2 min gewaschen.

Die Detektion erfolgt mit 60 µl Fluoreszein-markiertem Anti-DIG. Das Detektionsreagenz wird auf die Schnitte aufgebracht und das Material in der Folge in einer vorgewärmten feuchten Kammer bei 37 °C über 10 min inkubiert. Dann werden die Schnitte 3 x für jeweils 2 min in 1x PBD gewaschen. Die Zellkerne werden mit 10 µl Propidiumiodid/Antifade gegengefärbt.

Die Hybridisierungssignale werden an 100 Interphasekernen pro Schnitt ausgezählt. Überlappende Zellkerne und Kerne ohne Hybridisierungssignale werden nicht berücksichtigt. Die Mikroskopie und Photographie erfolgt in unserem Fall mit einem Zeiss ® Fluoreszenzmikroskop, das mit einer 100 W Quecksilberdampflampe und Objektiven hoher numerischer Apertur ausgestattet ist. Die Schnitte werden bei 40-facher Vergrößerung nach Propidiumjodid-Exzitation gescannt, um die Areale zu lokalisieren, die bereits im Vorfeld am Hämatoxylin-Eosin-Schnitt histopathologisch charakterisiert wurden (siehe Tabelle 1). Die Befunde werden durch konventionelle Photomikrographie dokumentiert. Die Lichtanregung von Fluorescein und Propidiumjodid erfolgt unter [Seite 52↓] Fluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberdampflampe bei passenden Filtern für die Emission von gelbgrünem und rotem Licht.

Tabelle 1: Filter und Wellenlängen für die HER-2/neu-Fluoreszenzmikroskopie

Chromogen

Farbe

Filter

FITC

gelb-grün

490/525

PJ

rot

520/610

Das Auszählen der Signale erfolgt bei 100-facher Vergrößerung an 100 unselektierten Tumorzellkernen. Tumoren, die bis zu 4 HER-2/neu-Signale pro Zellkern aufweisen, werden als normal, d. h. HER-2/neu negativ, befundet. Überamplifizierende Tumoren werden in die Gruppen mit moderater Überamplifikation (5-10 Genkopien pro Nucleus) und starker Überamplifikation (>10 Genkopien pro Nucleus) eingeteilt.

4.12 Begriffliche Definitionen

Diese Schrift beschäftigt sich bevorzugt mit der prädiktiven Bedeutung von HER-2/neu im Serum. Die Begriffe „Prädiktion“ und „Prognose“ stehen in der aktuellen Forschung und Literatur zum Mammakarzinom sehr im Vordergrund, werden aber häufig mißverständlich eingesetzt. Dies liegt in der Natur der Sache, da kaum ein prognostischer oder prädiktiver Faktor ausschließlich als prognostisch oder prädiktiv eingestuft werden kann. Die meisten demographisch oder tumorbiologisch wichtigen Faktoren des Mammakarzinoms haben sowohl prognostische wie auch prädiktive Qualität. Im folgenden sollen als Voraussetzung für die weitere Arbeit die Begriffe Prognose und Prädiktion durch Definitionen so weit wie möglich und sinnvoll abgegrenzt werden.


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4.12.1  Prognose

Prognostische Faktoren sind direkt mit der Aggressivität und dem Metastasierungspotential des Primärtumors assoziiert. Ein rein prognostischer Faktor trennt ein erkranktes Kollektiv unabhängig von der Behandlung in die Gruppen mit günstigem und ungünstigem Verlauf auf. Dies bedeutet, daß eine Patientin ihre durch den Faktor definierte Subgruppe auch durch die Kombination von mehreren, ggf. auch höchst intensiven Maßnahmen, nicht verlassen kann (siehe Abbildung 6). Als typisches Meßkriterium für das Mammakarzinom gilt das Gesamtüberleben, ein typischer prognostischer Faktor für das Mammakarzinom ist der Nodalstatus. Diese Definition eines prognostischen Faktors impliziert auch, daß die Identifikation im Vergleich zu einem unbehandelten Kontrollkollektiv stattfinden sollte. Nach der Sicherung der Wirkung der adjuvanten Therapie ist es (bis auf die seltene Situation des sehr kleinen, nodal-negativen Primärtumors) allerdings nicht mehr vertretbar, größere unbehandelte Kontrollkollektive zu bilden. Gleichzeitig können historische Referenzkollektive wegen der unterschiedlichen Identifikation von Primärtumoren durch die Frühdiagnostik ebenfalls nicht mehr herangezogen werden. Insofern ist die Abgrenzung eines prognostischen Faktors aktuell nur sehr bedingt möglich.

Abbildung 6: Konzeptionelle Darstellung eines prognostischen Faktors (nach Hayes et al., 1998) (30)


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4.12.2  Prädiktivität

Prädiktive Faktoren werden durch die relative Empfindlichkeit bzw. Resistenz eines Tumors gegenüber Therapiemaßnahmen und Medikamenten bestimmt. Diese Sensitivität bzw. Resistenz beruht auf der Anwesenheit bzw. Abwesenheit von spezifischen Faktoren, die Voraussetzung für die Wahl entsprechend angepaßter Therapieformen sind. Dies bedingt auch, daß ein eigentlich günstiger, prädiktiver Faktor ohne Einleitung einer spezifisch darauf abgestimmten Therapie klinisch nicht ausreichend apparent wird und der Verlauf von Patientinnen mit und ohne diesen günstigen prädiktiven Faktor sich angleicht. Bei Einleitung dieser spezifisch gerichteten Behandlung trennen sich die beiden Untergruppen auf (siehe Abbildung 7). Der bislang beste prädiktive Faktor in der Therapie des Mammakarzinoms ist der Steroidhormonrezeptorstatus, wenngleich dieser auch prognostische Qualitäten hat (siehe Kapitel 4.12.1.).

Abbildung 7: Konzeptionelle Darstellung eines prädiktiven Faktors (nach Hayes et al., 1998) (30)


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4.12.3  Gemischt prognostische und prädiktive Faktoren

Natürlich kann ein biochemischer Faktor sowohl prognostische wie auch prädiktive Qualität haben. Dies ist sogar für die meisten Parameter die Regel. Ein gemischter, prognostisch-prädiktiver Faktor trennt das Erkrankungskollektiv unabhängig von Therapieinterventionen zu einem gewissen Maße in Untergruppen auf. Bei Einleitung einer gerichteten Therapie wird diese Separation aber nochmals deutlich akzentuiert, wenn dadurch ein spezifischer Faktor verbessert genutzt wird (siehe Abbildung 8).

Abbildung 8: Konzeptionelle Darstellung eines kombiniert prognostischen und prädiktiven Faktors (nach Hayes et al., 1998) (30)

Es muß nochmals betont werden, daß die Entdeckung eines rein prognostischen Faktors an Studien mit unbehandeltem Kontrollkollektiv gebunden ist. Mit Erweiterung der Therapieoptionen für das Mammakarzinom ist dies ethisch nicht mehr erfüllbar. Auch die Bezugnahme auf historische Kollektive ist aus ähnlichen Gründen nicht angemessen. Man muß daher davon ausgehen, daß die meisten Einflußfaktoren für das Mammakarzinom nicht nur biologisch, sondern auch aufgrund der methodischen Nachweismöglichkeiten, zu einem gewissen Grad prognostische und prädiktive Qualität haben.


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4.12.4  Monitoring

Das Hauptanwendungsgebiet von biochemischen Faktoren im Serum, welche gewöhnlich als „Tumormarker“ bezeichnet und damit inhaltlich nicht differenziert werden, ist die Verlaufsbeurteilung von soliden Tumoren. Hierbei gibt es unterschiedliche Empfehlungen zur Interpretation. In einer kürzlich publizierten Studie der anerkannten Tumormarkerarbeitsgruppe aus Nottingham wurde für einen Score aus drei unterschiedlich spezifischen biochemischen Faktoren (BSG, CEA, CA 15-3) zur Remissionsbeurteilung des metastasierten Mammakarzinoms ein relativer Anstieg bzw. Abfall von 20% von Konsultation zu Konsultation („visit-per-visit“) für die Wertung als Progression bzw. Remission vorgeschlagen (31). Hierbei zeigte sich eine Übereinstimmung des biochemischen Verlaufes und der Beurteilung nach UICC-Kriterien von 87% für progrediente und von 67% für remittierende Patientinnen. Ein identisches Ergebnis war sogar bei dem Unterschied δ von nur 10% von visit-per-visit erzielt worden, die schriftliche Vollversion fokussierte aber auf den erwähnten Unterschied von 20% (Prof. Robertson, Nottingham, persönliche Mitteilung).

Ähnliche Untersuchungen zum direkten Vergleich von CA 15-3 und CEA für das Monitoring des metastasierten Mammakarzinoms setzten einen Wert von 25% Veränderung an, arbeiteten dabei aber nicht auf einer „visit-per-visit“-Basis, sondern bezogen sich stets auf den Eingangswert (32;33). Da dies dem prospektiven Monitoringcharakter in der klinischen Praxis nicht entgegenkommt, haben wir uns für die Beurteilung des Monitoring durch s-HER-2/neu im Rahmen multizentrischer Studien für „visit-per-visit“-Analysen mit 15% Veränderung im Vergleich zum Vorwert entschieden. Dies paßt auch gut zu den Daten, die hinsichtlich der intraindividuellen Variabilität von s-HER-2/neu erhoben wurden (11). Bei einem prozentualen Variationskoeffizienten (%VC) von 6,03% fielen 95% der Wiederholungsuntersuchungen in den Bereich des Zweifachen der Standardabweichung, entsprechend einer Variation von +/- 12% des Mittelwertes. Damit muß jede Abweichung von mehr als 12% im Vergleich zur Voruntersuchung als Indikator für eine Veränderung der Tumorlast angesehen werden.


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Ob tatsächlich eine prozentuale Änderung im Vergleich zur Voruntersuchung als Bewertungsgrundlage ausreicht, oder nur eine Normalisierung eines initial erhöhten Tumormarkerspiegels im Therapieverlauf als verläßlicher Indikator für ein Ansprechen auf die Therapie angesehen werden kann, kann im Augenblick noch nicht entschieden werden (34). Hierzu gibt es bei den nationalen wie internationalen Fachgesellschaften für keine Tumorentität eine eindeutige Festlegung.

4.12.5 Screening

Der Aspekt des Screenings wird aus dieser Arbeit völlig ausgegliedert, obwohl Screening häufig mit biochemischen Faktoren generell und insbesondere mit den konventionellen Tumormarkern in Verbindung gebracht wird. Aufgrund seiner biologischen Eigenschaften (nur ca. 25-30% aller Mammakarzinompatientinnen zeigen eine HER-2/neu-Überexpression im Primärtumor) wäre s-HER-2/neu a priori zum Screening ungeeignet. Zudem zeigen in der Primärsituation nicht etwa, wie vielleicht erwartet, rund 30% aller Mammakarzinome einen erhöhten Serumspiegel für HER-2/neu, sondern nur 5-10%, was sich durch die Abhängigkeit der s-HER-2/neu-Konzentration von der Tumorlast erklären läßt, die beim Primärtumor noch sehr gering ist (35).

4.13 Statistik

Die statistischen Berechnungen dieser Habilitationsschrift wurden fast ausnahmslos von den Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Biometrie der Charité unter der Leitung von Prof. Dr. K.-D. Wernecke durchgeführt. Für die einzelnen Fragestellungen wählte Prof. Wernecke nach Darstellung des medizinischen Hintergrundes die passenden statistischen Methoden aus. Insbesondere für das longitudinale Monitoring mit Meßwiederholungen wurden hierfür moderne Berechnungsansätze angewendet. Die [Seite 58↓]Statistik wurde im allgemeinen mit SPSS für Windows 2000 in der Version 10 und mit SAS in der Version 8.1 erarbeitet.

4.13.1 Bestimmung der cut-off-Werte von s-HER-2/neu, s-EGFR, s-uPA und CA 27.29

Zur Ermittlung der cut-off-Bereiche für die genannten Serumfaktoren nutzten wir ROC (Receiver Operating Characteristics)-Kurven. Hierbei werden in einem Koordinatenkreuz auf der X-Achse 1 minus Spezifität, auf der Y-Achse die Sensitivität in einer Skalierung von 0 bis 1 aufgetragen. Je besser die Trennschärfe, desto rechteckiger wird die ROC-Kurve. Die Entscheidung für einen cut-off-Wert bzw. cut-off-Bereich erfolgte vornehmlich klinisch unter Berücksichtigung der Prävalenz der Erkrankung und mit dem Ziel einer hohen positiven Prädiktivität. Maßgeblich waren weiterhin die Serumkonzentrationen, welche die Eckpunkte einer 95%-igen Sensitivität und Spezifität markierten. Als weitere Orientierungshilfen wurden die Accuracy (Quotient aus allen richtigen Ergebnissen/alle Ergebnisse) und der Youden-Index (Summe aus Sensitivität plus Spezifität minus 1) herangezogen.

4.13.2 Multizentrische Untersuchung zu s-HER-2/neu

Für die multizentrische Untersuchung zur Ermittlung des oberen cut-off-Wertes von s-HER-2/neu auf dem Immuno 1-System wurde ähnlich vorgegangen. Auch hier wurde eine Sensitivität von 95% als Entscheidungskriterium herangezogen. Ausgehend von diesem oberen cut-off konnte dann die Spezifität des s-HER-2/neu-Spiegels von Mamma-karzinompatientinnen gegenüber Frauen mit benignen Brusterkrankungen sowie gegenüber Patientinnen mit anderen chronischen Erkrankungen ermittelt werden. Die Größe der Untersuchungkollektive lag bei 280 gesunden Kontrollen, 100 Patientinnen mit benignen Brusterkrankungen und 110 Patientinnen mit chronischen Nicht-Brusterkrankungen. Nach [Seite 59↓]Festlegung des cut-off-Wertes wurde die Sensitivität der s-HER-2/neu-Konzentration für die unterschiedlichen Stadien des Mammakarzinoms bestimmt.

4.13.3 Analysen im Rahmen der Table-Studie

Deskriptive Standardmethoden wurden zur Bestimmung der Mittelwerte, Mediane, Standardabweichungen, Range und Perzentilen der Serumkonzentrationen aller biochemischen Faktoren (s-HER-2/neu, CA 27.29, LH, FSH, Östradiol, Leuprorelin) angewandt. Nichtparametrische Korrelationsanalysen (Spearmansches rho) und Testprozeduren (Mann-Whitney, Kruskal-Wallis) wurden herangezogen, um Unterschiede zwischen den s-HER-2/neu-Spiegeln und den demographischen Angaben aufzudecken.

In einer ersten orientierenden Untersuchung wurde für die Fragestellung, ob sich der s-HER-2/neu-Wert im zeitlichen Verlauf im Vergleich zur baseline in den beiden Behandlungsarmen verändert, der Sign-Test verwendet. Der Sign-Test fokussiert mehr auf den Median als den Mittelwert als Maß für die allgemeine Tendenz. Er geht als einzige Voraussetzung von einer kontinuierlichen Verteilung der Testvariable aus. Für den direkten Vergleich der baseline-Werte und jeder Folgemessung wurde dann zweiseitig mit dem t-Test für gepaarte Stichproben geprüft. Diese Form der Berechnung erlaubte a priori sowohl einen Abfall wie auch einen Anstieg der s-HER-2/neu-Werte und ging nicht schon von Beginn an von einem Anstieg aus.

Die nichtparametrische Varianzanalyse für Daten mit Meßwiederholungen nach Brunner wurde verwendet, um Unterschiede der s-HER-2/neu-Verläufe zwischen den beiden Behandlungsarmen festzustellen und um Zeiteffekte über den gesamten Beobachtungszeitraum von 24 Monaten (30 Monate für Patientinnen unter Leuprorelintherapie) sowie Wechselwirkungen zu erkennen (36). Zur graphischen Darstellung der Ergebnisse wurden die relativen Randeffekte (nach Brunner) herangezogen. Diese beschreiben zum Beispiel die Wahrscheinlichkeit, daß sich die Meßwerte einer bestimmten Behandlungsgruppe zu einem bestimmten Zeitpunkt von allen [Seite 60↓]Messwerten des Versuchs unterscheiden. Anhand dieser Darstellungsform zeigt sich, wie sich die Verläufe mit der Zeit verändern oder zwischen den Gruppen unterscheiden. Ein relativer Randeffekt >0,5 bedeutet, daß die Meßkonzentrationen (zu diesem Zeitpunkt in dieser Behandlungsgruppe) gegenüber allen gepoolten Ergebnissen zu höheren Werten tendieren, die Tendenz ist umso größer, je größer der relative Randeffekt ist. Analog zeigt ein relativer Randeffekt < 0,5 eine Tendenz zu kleineren Meßwerten auf. Dies bedeutet auch, daß nur unbedeutende Veränderungen vorliegen, wenn die relativen Randeffekte um den Wert 0,5 undulieren. Signifikante Veränderungen der Serumkonzentrationen gegenüber dem Therapiebeginn wurden mit dem Wilcoxon-Test für paarweise Vergleiche ermittelt.

4.13.4 Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel

Für den Vergleich der Remissionsraten zwischen den s-HER-2/neu-positiven und den s-HER-2/neu-negativen Patientinnen wurde der Mantel-Haenszel-Test verwendet. Der Vergleich des progressionsfreien Überlebens und der Ansprechdauer erfolgte mit dem Log-Rank-Test. Als Irrtumswahrscheinlichkeit erster Ordnung wurde für alle Berechnungen ein Signifikanzniveau von α=0,05 gewählt. Eine Cox-Regressionsanalyse unter Berücksichtigung aller Variablen des Primärtumors konnte bei insgesamt 35/50 auswertbaren Patientinnen nicht durchgeführt werden.

4.13.5 Erweiterte Untersuchung zur Prädiktivität unter Mehrlinienchemotherapie

Durch die erhöhte Fallzahl (n=111) in der Untersuchung des Panels an biochemischen Faktoren bei Patientinnen unter Mehrlinientherapie war eine aufwendigere statistische Aufarbeitung möglich. Der Vergleich des progressionsfreien Überlebens zwischen den s-HER-2/neu-positiven und den s-HER-2/neu-negativen Patientinnen erfolgte auch hier mit dem Log-Rank-Test bei α=0,05. Die Parameter, die in den univariaten Analysen einen p-Wert ≤0,1 lieferten, gingen dann in eine multivariate Cox-Regression ein. Der Vergleich [Seite 61↓]der Remissionsraten zwischen den s-HER-2/neu-positiven und den s-HER-2/neu-negativen Patientinnen erfolgte mit Hilfe des χ2-Tests (Fisher’s exact). Um Unterschiede (Gruppeneffekte, Zeiteffekte und Wechselwirkungen) der Monitoring-Verläufe für die Parameter s-HER-2/neu, s-EGFR, s-uPA und CA 27.29 zwischen den Patientinnen mit unterschiedlichem Remissionsstatus aufzuzeigen, wurde ebenso wie in der Table-Studie die nichtparametrische Varianzanalyse für Daten mit Meßwiederholungen nach Brunner eingesetzt (siehe 4.13.3.).

4.13.6 Monitoring durch s-HER-2/neu unter Herceptin-Therapie

Die Berechnung von Unterschieden zwischen dem Serumverlauf von HER-2/neu und dem klinischen Ansprechen auf die Herceptin-Therapie erfolgte mit dem χ2-Test (Fisher’s exact). Es wurden die Ereignisse einer Progression bzw. des Fehlens der Progression in Bezug zu einem mehr als 15%-igem Anstieg oder weniger als 15%-igem Anstieg von s-HER-2/neu im Vergleich zur letzten Voruntersuchung gesetzt. Dieser Ansatz diente zur ersten Analyse, bei welchem Anteil der Patientinnen unter Herceptin-Therapie der s-HER-2/neu-Spiegel relevant abfällt. Für die Analyse nach einem Zusammenhang zwischen response und Höhe des baseline-s-HER-2/neu-Spiegels (Gruppen <15 ng/ml und >15 ng/ml beziehungsweise <15 ng/ml, 15-50 ng/ml und >50 ng/ml) wurde ebenfalls der χ2-Test herangezogen.

Als klinisch relevanteste Frage wurde angesehen, wieviel der s-HER-2/neu-Spiegel in welchem Zeitraum abfallen muß, um frühzeitig den ausbleibenden Nutzen der Therapie anzuzeigen. Zunächst wurde mit Hilfe einer logistischen Regression gefragt, ob ein Bezug zwischen der binären response (Progression versus Nicht-Progression) und dem relativen Abfall der s-HER-2/neu-Konzentration zu den Wochen 2-3 und 3-5 besteht. Für diese beiden Gruppen wurde dann für den Fall des Bestehens einer solchen Abhängigkeit eine ROC-Kurve aufgestellt, an deren Koordinaten sich die Sensitivität und Spezifität für eine bestimmte relative s-HER-2/neu-Konzentration zu diesem Zeitpunkt ablesen ließ.


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4.13.7  Verteilung von IHC des Primärtumors und s-HER-2/neu im Stadium IV

Zur Bestimmung der Verteilung von s-HER-2/neu-positiven Patientinnen in Abhängigkeit vom IHC-Status im Gewebe wurde eine Vierfeldertafel aufgestellt und mit dem χ2-Test die statistische Signifkanz berechnet.

4.13.8 Konkordanz von Immunhistochemie (mit ACIS), FISH und s-HER-2/neu

Die Konkordanz für die HER-2/neu-Gewebetestungen mittels unterschiedlicher Bestimmungsmethoden wurde mit dem Konkordanzindex Kappa (κ) ermittelt, der Ergebnisse von –1 bis 1 liefert. Eine übliche Interpretation für κ ist wie folgt: κ < 0,1: keine Konkordanz; κ = 0,10–0,40: Konkordanz schwach; κ = 0,41–0,6: Konkordanz deutlich; κ = 0,61–0,8: Konkordanz stark; κ = 0,81–1,0: Konkordanz fast vollständig (37). Wir testeten die Nullhypothese H0: κ = 0, d. h. die Annahme, daß es zwischen den verschiedenen HER-2/neu-Gewebeergebnissen keine Übereinstimmungen gibt und wählten hierfür das Signifikanzniveau α = 0,05.

Der McNemar-Test wurde zur Analyse der verschiedenen HER-2/neu-Gewebeergebnisse mit den s-HER-2/neu-Spiegeln im Stadium IV der Erkrankung benutzt. Diese Methode testet auf Änderungen von Wahrscheinlichkeiten (Nullhypothese H0: die Wahrscheinlichkeit für Unterschiede des Gewebeergebnisses im Vergleich zum Serumergebnis ist in beiden Richtungen identisch, d. h. Gewebe-negativ zu Serum-positiv und Gewebe-positiv zu Serum-negativ). Zwischen den metrischen Gewebeergebnissen auf dem ACIS-System und den metrischen s-HER-2/neu-Spiegeln wurde eine lineare Regression durchgeführt, der Pearson’schen Korrelationskoeffizient lieferte die Stärke des linearen Zusammenhangs.


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06.02.2004