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5  Ergebnisse

5.1 Ermittlung des cut-off-Wertes für s-HER-2/neu

Die Ermittlung des cut-off-Wertes für s-HER-2/neu mußte dreimal mit drei verschiedenen Meßmethoden erfolgen: zunächst mit dem Chiron-Assay, der bis 1999 kommerziell verfügbar war und dann durch den Oncogene Science-Assay ersetzt wurde. Die Antikörper dieses zuletzt genannten Assays werden auch für die vollautomatisierte s-HER-2/neu-Messung auf dem klinisch-chemischen Analysenapparat Immuno 1 verwendet.

5.1.1 Chiron®-Assay

Um einen Eindruck zu gewinnen, in welchem Bereich der obere cut-off-Wert für s-HER-2/neu liegen dürfte, evaluierten wir zunächst ein gesundes Kontrollkollektiv von 54 Frauen aller Altersstufen, welche die Kriterien gesunder Blutspender erfüllten. Dabei zeigte sich für den Chiron-Assay, daß die Serumspiegel eine Konzentration von 10 U/ml nicht überschritten. Es ist zu beachten, daß das Testergebnis bei vielen Frauen bei 0 U/ml lag, was für die ungenügende Detektion des kits im niedrigen Konzentrationsbereich spricht (siehe Abbildung 9).

Die ROC-Kurve sprach eher für einen oberen cut-off von 10 U/ml als für den später gewählten oberen cut-off-Wert von 15 U/ml (siehe Tabelle 2 und Abbildung 10). Der Grund für diese Wahl ist vor allem in der genannten schlechten Detektion im niedrigen Konzentrationsbereich zu sehen. Auch andere Studiengruppen gingen ähnlich vor und legten den oberen cut-off-Wert von s-HER-2/neu mit diesem Assay bei 15 U/ml fest (38). Die später durchgeführte lineare Regression zwischen den Ergebnissen des Chiron-Assays und des Oncogene-Assays bestätigte diese Vorgehensweise.


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Abbildung 9: Verteilung der s-HER-2/neu-Werte, gemessen mit dem Chiron-Assay, bei gesunden Frauen

Tabelle 2: Statistische Grundlagen zur cut-off-Ermittlung für s-HER-2/neu mit dem Chiron-Assay

Chiron cut-off (U/ml)

2

4

6

8

10

12

20

Sensitivität (%)

81,2

74,6

56,8

43,2

34,5

29,9

17,8

Spezifität (%)

64,8

87,0

92,6

98,2

98,2

100

100

Positive Prädiktivität (%)

89,3

95,5

96,6

98,8

98,6

100

100

Negative Prädiktivität (%)

48,6

48,5

37,0

32,1

29,1

27,5

25,0

Accuracy (%)

77,7

77,3

64,5

55,0

48,2

43,4

35,5

Youden-Index (%)

46,0

61,6

49,5

41,3

32,7

30,0

17,8


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Abbildung 10: ROC-Kurve zur cut-off-Ermittlung für den Chiron-Assay

5.1.2 Oncogene®-Assay

Der Oncogene-Assay ist im Vergleich zum Chiron-Assay wesentlich präziser, was die Abbildung 11 zeigt. Ein Messergebnis von 0 kommt nicht vor, bei allen gesunden Kontrollfrauen konnte ein Serumspiegel für HER-2/neu nachgewiesen werden. Auch für Männer kann ein Nachweis von HER-2/neu im Serum geführt werden (Daten nicht dargestellt). In der ROC-Analyse ergab sich für den Oncogene-Assay ein oberer Grenzwert für s-HER-2/neu von 15 ng/ml (siehe auch Tabelle 3 und Abbildung 12). Dieses monozentrisch evaluierte Ergebnis wurde später in der multizentrischen Evaluierung mit dem Immuno 1 exakt bestätigt.


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Abbildung 11: Verteilung der s-HER-2/neu-Werte, gemessen mit dem Oncogene-Assay, bei gesunden Frauen

Tabelle 3: Statistische Grundlagen zur cut-off-Ermittlung für s-HER-2/neu mit dem Oncogene-Assay

Oncogene cut-off (ng/ml)

4

6

8

10

12

16

20

Sensitivität (%)

100

99,5

97,5

87,3

69,0

36,6

21,8

Spezifität (%)

5,6

20,8

47,2

71,7

94,3

100

100

Positive Prädiktivität (%)

79,7

82,4

87,3

92,0

97,8

100

100

Negative Prädiktivität (%)

100

91,7

83,3

60,3

45,0

29,8

25,6

Accuracy (%)

80,0

82,8

86,8

84,0

74,4

50,0

38,4

Youden-Index (%)

5,7

20,3

44,6

59,0

63,4

36,5

21,8


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Abbildung 12: ROC-Kurve zur Grenzwertermittlung für den Oncogene-s-HER-2/neu-Assay

5.1.3 Immuno 1®-Plattform

In der multizentrisch eingebrachten Population von 242 gesunden Frauen lagen 95% der s-HER-2/neu-Ergebnisse unter 13 ng/ml. Gemäß den Vorgaben lag der obere cut-off-Wert bei 14,7 ng/ml. In einer ähnlich konzipierten Studie war ebenfalls das gleiche Resultat erzielt worden (39). Die Verteilung der s-HER-2/neu-Spiegel für das gesamte Kontrollkollektiv ist in Abbildung 13 dargestellt.


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Abbildung 13: Verteilung der s-HER-2/neu-Konzentrationen bei gesunden Frauen (25;40)

Im nächsten Schritt wurde die Verteilung der s-HER-2/neu-Ergebnisse von Patientinnen mit benignen Brusterkrankungen und von Frauen mit chronischen Erkrankungen evaluiert und mit dem gesunden Kontrollkollektiv verglichen. Die Spezifität des Immuno 1-Assays lag bei dem ermittelten s-HER-2/neu-cut-off-Wert von 15 ng/ml für das Kontrollkollektiv bei 97,5% und für die Frauen mit benignen Brusterkrankungen bei 98,0% (siehe Tabelle 4). Für alle chronischen Erkrankungen lag die Spezifität bei 94,6%.


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Tabelle 4: Spezifität des Immuno 1-s-HER-2/neu-Assays für den cut-off-Wert von 15 ng/ml (25;40)

 

Normale Kontrollen

Benigne Brust-erkrankungen

Andere benigne Erkrankungen

Gesamt

Spezifität

97,5%

RN = 273

FP = 7

98,0%

RN = 98

FP = 2

94,6%

RN = 104

FP = 6

96,9%

RN = 475

FP = 15

95% CI

94,9-98,9

93,0-99,8

88,5-98,0

95,0-98,3

RN= Richtig Negative; FP= Falsch Positive; Spezifität = RN / (RN + FP); CI = Konfidenzintervall

Die Sensitivität des Immuno 1-s-HER-2/neu-Assays für die unterschiedlichen Stadien des Mammakarzinoms wurde an 204 Patientinnen (53 Frauen im Stadium I, 52 Frauen im Stadium II, 49 Patientinnen im Stadium III und 50 Frauen im Stadium IV) untersucht. Die medianen und mittleren s-HER-2/neu-Spiegel waren für die Untergruppen wie folgt verteilt: gesunde Frauen: 9,0 und 9,2 ng/ml; benigne Brusterkrankungen: 9,3 und 9,6 ng/ml; Mammakarzinom in den Stadien I/II: 9,8 und 10,7 ng/ml; Mammakarzinom im Stadium III: 10,3 und 10,7 ng/ml. Damit lag die Sensitivität des Immuno 1-s-HER-2/neu-Assays für das Mammakarzinom unabhängig vom Stadium bei 16% (95% CI: 11,4–22,0). Die Sensitivität stieg mit dem Stadium von 0% für das Stadium I bis auf 40% für das Stadium der Fernmetastasierung an. Dabei lag im Stadium IV der Median immer noch niedrig bei 12,5 ng/ml, der Mittwelwert war allerdings auf 75,2 ng/ml angestiegen (siehe Abbildung 14). Diese Sensitivität des Immuno 1-Assays für das Mammakarzinom im Stadium IV von 40% (95% CI: 26,4–54,8) weist auf den klinischen Nutzen der s-HER-2/neu-Bestimmung für die Verlaufsbeobachtung von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom hin.


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Abbildung 14: Sensitivität von s-HER-2/neu für den cut-off-Wert von 15 ng/ml in bezug auf das Stadium des Mammakarzinoms (25;40)

5.2 Korrelation der verschiedenen Methoden der s-HER-2/neu-Bestimmung

Wie im Vorfeld dargestellt, kamen insgesamt 2 manuelle ELISA-Assays zur Bestimmung von s-HER-2/neu zum Einsatz. Zu Beginn der Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel war der Chiron-Assay kommerziell verfügbar und auch in anderen klinischen Studien mit wichtigen Ergebnissen zum Einsatz gekommen (41;42). Im Studienverlauf wurde der Chiron-Assay vom Markt genommen, was uns dazu veranlaßte, auf den Oncogene-Assay zu wechseln und generell die Serumergebnisse der beiden Assays als Qualitätskontrolle zueinander zu korrelieren (siehe Abbildung 15). Obwohl sich beide kits in einigen technischen Aspekten (Wellenlänge zur photometrischen Messung, Antikörper, Einheit des Endergebnisses) unterscheiden, ist die Korrelation doch sehr gut. In dieser linearen Regression verglichen wir 260 longitudinale Oncogene- und Chiron-s-[Seite 71↓]HER-2/neu-Meßergebnisse von 73 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom, inklusive aller Patientinnen unter wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel. Der Korrelationsfaktor von r=0,96 (CI: 0,94-0,97; p<0,0001) spiegelt die generell sehr hohe Qualität der standardisierten s-HER-2/neu-Messung wieder, was für die spätere Diskussion der Reliabilität der verschiedenen Methoden der HER-2/neu-Bestimmung wichtig ist. Schon in der nachfolgenden Darstellung zeigt sich, daß wenige Mammakarzinompatientinnen erhöhte s-HER-2/neu-Spiegel >500 ng/ml aufweisen und wahrscheinlich eine biologische Subgruppe darstellen, hier aber in der Statistik der cut-off-Ermittlung nicht separat betrachtet werden sollen.

Abbildung 15: Korrelation der s-HER-2/neu-Bestimmungen mit dem Oncogene- und dem Chiron-Assay

Aus den Serumproben der Table-Studie (siehe unten) wurde zudem eine Korrelationsanalyse zwischen den s-HER-2/neu-Ergebnissen mittels Immuno 1-Assay und Oncogene-Assay durchgeführt. Die Seren aus der Table-Studie wurden alle mit dem [Seite 72↓]Immuno 1-Assay gemessen. Gleichzeitig wurde jede 10. Probe mit dem manuellen Oncogene-Assay verarbeitet. Da alle Seren aus der Table-Studie Konzentrationen im niedrigen Bereich aufwiesen, wurden sie durch weitere Seren ergänzt, um die Regressionsanalyse bis zum Konzentrationsbereich von 250 ng/ml führen zu können. Die Abbildung 16 zeigt die lineare Regression zwischen diesen aktuell verfügbaren Methoden zur Bestimmung von HER-2/neu im Serum, die statistisch hochsignifikant miteinander korrelieren (p<0,0001). Auch diese ausgezeichnete Korrelation spricht für die hohe Objektivität der Serummessung von HER-2/neu an sich und erlaubt nicht nur, die in der Literatur mit standardisierten Assays publizierten Ergebnisse zu s-HER-2/neu weiterhin zu berücksichtigen, sondern direkt miteinander zu vergleichen.

Abbildung 16: Korrelation der s-HER-2/neu-Bestimmungen mit dem Oncogene- und dem Immuno 1-Assay


[Seite 73↓]

5.3  Einfluß von Herceptin auf die Messung von s-HER-2/neu

In vivo ist eine Komplexbildung von Herceptin und der extrazellulären Domaine von HER-2/neu im Serum beschrieben worden (23;43). Diese Reaktion dürfte aber nur bei sehr hohen Konzentrationen von s-HER-2/neu pharmakologisch relevant sein. In vitro konnte kein Absinken der s-HER-2/neu-Konzentration durch Zugabe unterschiedlicher Mengen von Herceptin festgestellt werden (27). Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse einer Verdünnungsreihe von 3 Seren (1 gesunde Kontrollperson mit normalem s-HER-2/neu-Spiegel, 2 Mammakarzinompatientinnen mit erhöhtem s-HER-2/neu-Spiegel) unter steigender Herceptin-Exposition. Es konnte kein Einfluß durch Zugabe von Herceptin auf das Meßergebnis festgestellt werden. Ähnliche Ergebnisse konnten wir auch in vivo in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Schaller, ehemals Frauenklinik im Klinikum Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin, erheben. Hier wurde aus Blutentnahmen jeweils vor und nach der Herceptin-Erstgabe der s-HER-2/neu-Spiegel bestimmt. Bei allen Messungen ergab sich unabhängig von der Höhe des baseline-Spiegels ein identisches Ergebnis. Diese Resultate werden demnächst in Vollversion dargestellt werden.

Tabelle 5: Messung von s-HER-2/neu in einer Verdünnungsreihe mit steigender Herceptin-Konzentration (27)

Herceptin

(µg/l)

Kontrollperson

Patientin 1

Patientin 2

s-HER-2/neu

%

s-HER-2/neu

%

s-HER-2/neu

%

0

8,5

100

37,7

100

54,1

100

53

8,6

101

38,2

101

54,2

100

105

8,6

101

38,3

102

54,3

101

200

8,6

101

38,3

102

54,6

101

420

8,5

100

38,1

101

54,2

100


[Seite 74↓]

5.4  Ermittlung des cut-off-Bereiches für s-EGFR

Die Verteilung der s-EGFR-Konzentrationen erbrachte unerwartete Ergebnisse: Im Gegensatz zu s-HER-2/neu als Onkoprotein aus der gleichen Rezeptorfamilie zeigten viele Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom erniedrigte Werte im Vergleich zu dem Normalkollektiv (siehe Abbildung 17). Dies ist insofern bemerkenswert, als dies auf eine Downregulation von EGFR bei einer Subgruppe der Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom hinweisen könnte. Während die s-EGFR-Spiegel bei Normalpersonen im allgemeinen zwischen 50-80 ng/ml lagen, streuten die s-EGFR-Spiegel bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom zwischen 30-80 ng/ml.

Abbildung 17: Verteilung von s-EGFR bei Kontrollpersonen (A) sowie Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom (B)

Die statistischen Berechnungen erbrachten einen cut-off-Bereich für s-EGFR von 52-76 ng/ml. EGFR-Spiegel im Serum unter diesem cut-off müssen als pathologisch niedrig interpretiert werden. Dieser cut-off-Bereich wurde anhand der 95%-Perzentilen für die Sensitivität und die Spezifität ermittelt (siehe Tabelle 6).

[Seite 75↓]

Tabelle 6: Statistische Grundlagen zur cut-off-Ermittlung für s-EGFR

s-EGFR (ng/ml)

48,6

52,0

58,0

64,0

70,2

76,0

80,2

Sensitivität (%)

27,6

39,1

54,3

71,4

86,7

95,2

99,1

Spezifität (%)

97,4

94,8

84,2

65,8

40,8

19,7

7,9

Positive Prädiktivität (%)

93,6

91,1

82,6

74,3

66,9

62,1

59,8

Negative Prädiktivität (%)

49,3

52,9

57,1

62,5

68,9

75,0

85,7

Accuracy (%)

57,0

62,4

66,9

69,1

67,4

63,5

60,8

Youden-Index (%)

25,0

33,8

38,5

37,2

27,5

15,0

6,9

Abbildung 18 zeigt die ROC-Kurve zur Grenzwertermittlung für s-EGFR. Wie bereits die statistischen Angaben in Tabelle 6 anzeigen, ist die Unterscheidung von Normalpersonen und Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom nur bedingt gut möglich.

Abbildung 18: ROC-Kurve zur cut-off-Bestimmung für s-EGFR


[Seite 76↓]

5.5  Ermittlung des cut-off-Bereiches für s-uPA

Der Serumspiegel von uPA wurde für diese biochemische Analyse als weiterer Marker gewählt. Dieses Protein gilt als mitverantwortlich für die Destruktion von Interzellularsubstanz und damit für das allgemeine Metastasierungspotential eines Tumors. Es ergänzt somit die Palette aus dem klassischem Tumormarker CA 27.29 und den Wachstumsfaktoren EGFR und HER-2/neu. Die statistischen Angaben, die zur Ermittlung des cut-off-Bereiches von s-uPA herangezogen wurden, sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7: Statistische Grundlagen zur cut-off-Ermittlung für s-uPA

s-uPA (pg/ml)

702

857

1132

1324

1530

1830

2202

Sensitivität (%)

99,0

93,1

82,4

63,7

43,14

23,5

16,7

Spezifität (%)

3,0

13,4

52,3

82,1

89,6

95,5

97,0

Positive Prädiktivität (%)

60,8

62,1

72,4

84,4

86,3

88,9

89,5

Negative Prädiktivität (%)

66,7

56,3

66,1

59,8

50,9

45,1

43,3

Accuracy (%)

61,0

61,5

70,4

71,0

61,5

52,1

48,5

Youden-Index (%)

2,0

6,6

34,6

45,8

32,7

19,1

13,7

Auch s-uPA eigent sich nur bedingt zur Unterscheidung von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und einem Kontrollkollektiv. Wie der nächste Unterpunkt zeigen wird, zeigt CA 27.29 als bereits etablierter Tumormarker den besten Verlauf der ROC-Kurve mit größerer Fläche unter der Kurve. Dies ist nicht verwunderlich, da es sich bei HER-2/neu, EGFR und uPA um tumorassoziierte Proteine handelt, die dem Einfluß einer Vielzahl von Regulationsmechanismen unterliegen dürften, während für CA 27.29 relevante regulative Prozesse nicht nachgewiesen werden konnten. Abbildung 19 zeigt die ROC-Kurve für die Qualität der Trennung von Normalpersonen und Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom anhand der s-uPA-Werte. Ermittelt wurde anhand dieser Daten ein cut-off-Bereich von 857-1830 pg/ml.


[Seite 77↓]

Abbildung 19: ROC-Kurve zur cut-off-Ermittlung für s-uPA

Abschließend zu diesem Punkt soll erwähnt werden, daß für die Bestimmung von PAI-1 als Gegenspieler von uPA das Serummaterial nicht ausreichte, da jedes aliquot nur einmal aufgetaut werden durfte, um keine freeze-and-thaw-Effekte zu produzieren. Grundsätzlich liegt ein kit für den Komplex beider Proteine vor, mit dem wir zumindest eine der im Anhang beschriebenen prospektiven Studien („1-3-LK-Studie“ der Nordostdeutschen Gesellschaft für Gynäkologische Onkologie, Projekt 5) aufarbeiten werden.


[Seite 78↓]

5.6  Ermittlung des cut-off-Wertes für CA 27.29

Die Serumwerte von CA 27.29 wurden im Gegensatz zu allen anderen Markern mit Hilfe eines klinisch-chemischen Analysenapparates auf Chemilumineszenzbasis gemessen. CA 27.29 gilt als „amerikanisches Pendant“ zu CA 15-3, da in den USA CA 27.29 als Standard etabliert ist, während in Europa CA 15-3 bevorzugt wird. In einer kürzlich publizierten Multicenterstudie, an der auch die eigene Studiengruppe beteiligt war, konnte die Gleichwertigkeit der beiden Marker bestätigt werden (44). In niedrigen Konzentrationsbereichen war CA 27.29 dem CA 15-3 sogar überlegen.

Tabelle 8 zeigt die statistischen Berechnungen für die Ermittlung des oberen cut-off-Wertes für CA 27.29, welcher bei 30 U/ml definiert werden konnte.

Tabelle 8: Statistische Grundlagen zur cut-off-Ermittlung für CA 27.29

CA 27.29 cut-off (U/ml)

15

18

21

24

30

36

60

Sensitivität (%)

89,2

86,8

80,2

77,3

66,5

60,5

43,1

Spezifität (%)

57,4

72,2

83,3

92,6

94,4

100

100

Positive Prädiktivität (%)

86,6

90,6

93,7

97,0

97,4

100

100

Negative Prädiktivität (%)

63,3

63,9

57,7

56,8

47,7

45,0

36,2

Accuracy (%)

81,5

83,3

81,0

81,0

73,3

70,1

57,0

Youden-Index (%)

46,6

59,0

63,6

69,8

60,9

60,5

43,1

Die ROC-Kurve zur Grenzwertermittlung von CA 27.29 zeigt im Vergleich zu den zuvor abgebildeten ROC-Kurven für s-HER-2/neu, s-EGFR und s-uPA den besten Verlauf (siehe Abbildung 20). Dies steht im Einklang mit den später dargestellten Ergebnissen zum Vergleich der Monitoringqualität all der benutzten Serummarker (siehe Kapitel 5.8.2.).


[Seite 79↓]

Abbildung 20: ROC-Kurve zur cut-off-Ermittlung für CA 27.29

5.7 s-HER-2/neu im Rahmen der Table-Studie

In verschiedenen Untersuchungen an Mammakarzinomzellinien konnte gezeigt werden, daß die Überexpressionen von HER-2/neu und des Östrogenrezeptors (ER) invers korreliert sind (45;46). Das klinische Äquivalent dieser reziproken Regulation ist der kleine Anteil (10-15%) ER-positiver undgleichzeitig HER-2/neu-positiver Mammakarzinome (47-50). Ursache für dieses Phänomen ist eine Östrogen-sensitive Bindungsstelle am Promotor des HER-2/neu-Gens, welche für die Transkriptionsrate von HER-2/neu mitverantwortlich ist und die Expression des HER-2/neu-Proteins bei hohen Östrogenspiegeln supprimiert (51;52). Umgekehrt steigt die Expression von HER-2/neu sowohl unter Östrogenentzug als auch unter Tamoxifenexposition an (53-55). Die für die klinische Praxis und Therapieentscheidung allerdings wichtigste Information kommt aus in [Seite 80↓] vivo-Untersuchungen an primären Mammakarzinomen, bei denen sich eine vergleichbare Variation der HER-2/neu-Expression während des Menstruationszyklus gezeigt hat (56). Damit könnte der Zeitpunkt der Operation während des Menstruationszyklus das HER-2/neu-Gewebeergebnis in der Imunhistochemie (IHC) mitbestimmen. Wenn man bedenkt, daß Patientinnen mit HER-2/neu-positivem Mammakarzinom im Falle der Fernmetastasierung für eine Herceptin-Therapie qualifizieren, könnte insbesondere bei prämenopausalen Patientinnen das IHC-HER-2/neu-Gewebeergebnis ggf. irreführend sein.

Die folgenden Daten stammen aus einer Begleituntersuchung zur Table-Studie und hinterfragen, ob eine ovarielle Ablation als adjuvante Therapie des primären Mammakarzinoms zu einer Hochregulation von (s-)HER-2/neu führt. Diese Hochregulation käme in diesem Ansatz nicht notwendigerweise von residuellen Mammakarzinomzellen, sondern generell aus den übrigen HER-2/neu-exprimierenden Organen epithelialen Ursprungs. Der Vorteil der HER-2/neu-Messung im Serum liegt dabei in der Möglichkeit der longitudinalen Untersuchung, während gewebebasierte Testmethoden wie IHC oder FISH von der Verfügbarkeit von Tumorgewebe abhängen und damit im allgemeinen auf einen einzigen Zeitpunkt beschränkt bleiben (57). Insofern ist die s-HER-2/neu-Messung auch die einzige Methode, die risikofrei die Beurteilung von Veränderungen des HER-2/neu-Status erlaubt.

Im Rahmen der Table-Studie wurden die Wirksamkeit und Verträglichkeit des GnRH-Analogons Leuprorelin im Vergleich zu einer CMF-Chemotherapie als adjuvante Therapie des nodalpositiven Mammakarzinoms untersucht. Im Studienverlauf wurden für endokrinologische und pharmakologische Untersuchungen zu den Zeitpunkten 0 und nach jeweils 3, 6, 12, 18 und 24 Monaten Seren gesammelt, die wir retrospektiv auf s-HER-2/neu und CA 27.29 aufmaßen. Zusätzlich stand nach einem follow-up von 6 Monaten eine zusätzliche Probe von Patientinnen nach Leuprorelintherapie zur Verfügung. Wir stellten die folgenden Fragen an unser Begleitprojekt: Wird s-HER-2/neu während einer hormonellen Ablation durch CMF oder Leuprorelin relevant hochreguliert? Gibt es ggf. Unterschiede in der Regulation zwischen den beiden Therapiearmen? Wann findet diese Hochregulation in Bezug zum Abfall des Östrodiolspiegels statt? Ist die Regulation [Seite 81↓]reversibel nach Absetzen von Leuprorelin? Hat der Serumspiegel von HER-2/neu eine prognostische bzw. prädiktive Wertigkeit für den Erfolg der adjuvanten Therapie?

5.7.1 Regulation von s-HER-2/neu während ovarieller Ablation

Aus der Table-Studie standen von 80 Patientinnen aus dem Leuprorelin-Arm und von 53 Patientinnen aus dem CMF-Arm Seren zur Verfügung. Beide Gruppen waren in bezug auf ihre demographischen Daten ausgeglichen (siehe Tabelle 9). Für die Statistik zu den Serumergebnissen teilten wir die Leuprorelin-Patientinnen aus Sicherheitgründen nochmals in 2 Untergruppen auf: Im Leuprorelin-Arm waren gehäuft Patientinnen aus der Ukraine enthalten, da laut Protokoll bevorzugt von diesen Frauen eine Pharmakokinetik abgenommen werden sollte. Sie könnten eine besonders ungünstige Untergruppe darstellen, worauf auch die Ergebnisse zum Tumormarker CA 27.29 hinwiesen. Insofern wird im folgenden mehrfach in die Gruppen A (Leuprorelinpatientinnen ohne Berücksichtigung der Ukraine), Gruppe B (CMF-Patientinnen) und Patientinnen unter Leuprorelin-Therapie aus der Ukraine unterschieden.

Die s-HER-2/neu-baseline-Spiegel waren bei den Leuprorelin-Patietinnen (8,1 ng/ml) und bei den CMF-Patientinnen (8,2 ng/ml) gleich. Während der Gesamtdauer der Table-Studie stieg der mittlere s-HER-2/neu-Spiegel in beiden Gruppen statistisch signifikant an (p<0,0001; siehe Tabelle 10 und Abbildung 21). Es ist zu beachten, daß dieser Anstieg absolut ca. ein Drittel des Eingangswertes ausmachte, was für s-HER-2/neu in diesen niedrigen Konzentrationen als sehr viel zu betrachten ist. Eine Patientin aus der Ukraine-Leuprorelin-Gruppe mit einem für die Primärsituation ungewöhnlich hohen baseline-s-HER-2/neu-Spiegel von 139 ng/ml wurde aus dieser Analyse herausgenommen, da sie insbesondere die Statistik der Mittelwerte verfälscht hätte.


[Seite 82↓]

Tabelle 9: Demographische Angaben zu den Patientinnen im s-HER-2/neu-Projekt zur Table-Studie

 

Gesamt

Leuprorelin

CMF

 

n=133

%

n=80

%

n=53

%

Alter in Jahren

      

Median

44

 

44

 

44

 

Range

29-55

 

29-55

 

30-54

 

Tumorgröße

      

pT1

49

36,8

27

33,8

22

41,5

pT2

75

56,4

48

60

27

50,9

pT3

9

6,8

5

6,2

4

7,6

Positive Lymphknoten

      

1-3

105

79,5

61

77,2

44

83,0

4-9

27

20,5

18

22,8

9

17,0

Östrogenrezeptor

      

Positiv

129

97

78

97,4

51

96,2

Negativ

3

2,3

1

1,3

2

3,8

Unbekannt

1

0,7

1

1,3

  

Progesteronrezeptor

      

Positiv

109

82

62

77,5

47

88,7

Negativ

13

9,8

7

8,8

6

11,3

Unbekannt

11

8,2

11

13,7

  

ER & PgR positiv

115

78,9

60

57,1

45

84,9

Operation

      

Mastektomie

59

44,4

38

47,5

21

39,6

Brusterhaltend

74

55,6

42

52,5

32

60,4

Adjuvante Bestrahlung

34

26,2

28

35,9

6

11,5


[Seite 83↓]

Tabelle 10: Modulation von s-HER-2/neu (ng/ml) unter hormoneller Ablation

Gruppe A: Leuprorelin

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

 

Mittelwert

7,8

9,9

10,3

10,3

10,4

10,5

SD

1,94

2,12

2,16

2,17

2,24

2,40

Gruppe B: CMF

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

Mittelwert

8,2

9,4

10,3

10,1

10,6

11,0

SD

1,55

1,93

1,96

1,90

2,25

1,52

Ukraine*: Leuprorelin

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

Follow-up

Mittelwert

8,8*

11,4

10,7

11,6

10,1

12,2

10,1

SD

1,90*

2,30

3,51

1,44

2,12

4,23

0,64

Leuprorelin gesamt

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

Follow-up

Mittelwert

8,1*

10,0

10,4

10,4

10,4

11,0

10,1

SD

1,97*

2,16

2,54

2,14

2,20

3,1

0,64

*Eine Patientin mit deutlich erhöhtem s-HER-2/neu-Basiswert wurde aus dieser Analyse herausgenommen. Der Anstieg von s-HER-2/neu für die kleine Ukraine-Gruppe allein betrachtet war wegen der kleinen Fallzahl nicht signifikant.

Parallel zum Anstieg von s-HER-2/neu fiel der Östradiolspiegel sowohl im Leuprorelinarm (p<0,0001) als auch im CMF-Arm (p=0,028) statisch signifkant ab. Abbildung 22 zeigt diesen Zusammenhang, wobei die mittleren Konzentrationen für alle Parameter unter der x-Achse angegeben sind. Die Boxplots zeigen sowohl die Ranges wie auch die 25-, 50- und 75%-Perzentilen. Dieser Abfall der Serumöstradiolwerte war zwischen den beiden Therapiearmen unterschiedlich (p=0,01), wobei der Abfall im CMF-Arm deutlich geringer ausgeprägt war. Es ist zu beachten, daß sich CA 27.29, über den gesamten Zeitverlauf betrachtet, nicht signifikant veränderte, was darauf hinweist, daß sich s-HER-2/neu aus normalen, epithelialen Zellen der drüsigen Organe rekrutiert und nicht von residuellen Tumorzellen oder einer Rezidiverkrankung stammt.


[Seite 84↓]

Abbildung 21: Anstieg von s-HER-2/neu während hormoneller Ablation

Der größte, relative Anstieg von s-HER-2/neu ereignete sich zwischen baseline und Monat 3 (p<0,001 für beide Arme; siehe Abbildung 22). Dieser ausgeprägte, relative Anstieg verlief parallel zum stärksten absoluten und relativen Abfall der Östradiolspiegel in beiden Behandlungsarmen. Interessanterweise blieb das Östradiolniveau der CMF-Patientinnen nach Beendigung der Chemotherapie als Korrelat der irreversiblen ovariellen Kastration niedrig. Gleichzeitig blieben die s-HER-2/neu-Spiegel über dem Ausgangsniveau erhöht und stiegen bis zum Monat 24 auf 11,0 ng/ml an. Follow-up-Seren über den Monat 24 hinaus standen nur für die Patientinnen im Leuprorelin-Arm zum Zeitpunkt Monat 30 zur Verfügung. Diese Seren zeigten einen erneuten Abfall der s-HER-2/neu-Konzentrationen auf 10,1 ng/ml, was wir als Zeichen der reversiblen ovariellen Ablation werten.


[Seite 85↓]

Abbildung 22: s-HER-2/neu (A), Östradiol (B, Darstellung ohne Ausreißer) und CA 27.29 (C) von Leuprorelin-Patientinnen im Vergleich zu CMF-Patientinnen. Während der Östradiol-Mittelwert (MW) in beiden Gruppen signifikant abfällt, steigt der s-HER-2/neu-Spiegel statistisch signifikant an (p<0,0001).


[Seite 86↓]

In nur 2,7% (16/587) aller s-HER-2/neu-Bestimmungen lag das Ergebnis höher als der obere Grenzwert von 15 ng/ml, was diesen cut-off für Mammakarzinompatientinnen unabhängig von Behandlungsmodalität und vor allem Menopausenstatus bestätigt. Die im Kapitel 5.1.3. beschriebenen Ergebnisse zur Verteilung der s-HER-2/neu-Konzentrationen bei gesunden prä- und postmenopausalen Frauen hatten das gleiche Resultat erbracht.

Die mittleren baseline-Konzentrationen von Östradiol und LH waren in der Leuprorelin- und der CMF-Gruppe vergleichbar. Von Monat 3 bis Monat 24 verursachte die Leuprorelintherapie einen erheblichen Abfall der Östradiolspiegel (baseline: 90,1 pg/ml; Monat 3: 40,8 pg/ml; Monat 6: 18,3 pg/ml) wie auch der LH-Spiegel (baseline: 9,1 mU/ml; Monat 3: 2,7 mU/ml; Monat 6: 3,3 mU/ml). Die Suppression von Östradiol war insgesamt in der CMF-Gruppe deutlich geringer. Während nach 3 Behandlungsmonaten der Abfall des Serumöstradiolspiegels in beiden Gruppen noch vergleichbar war, war im Monat 6 der CMF-bedingte Östradiolabfall schon geringer als im Leuprorelinarm. Im Gegensatz zum Leuprorelin-Arm stiegen die LH-Konzentrationen in der CMF-Gruppe als Gegenregulation des hypothalamisch-hypophysären Regelkreises an (baseline: 6,8 mU/ml; Monat 3: 21,7 mU/ml; Monat 6: 22,4 mU/ml). Das Ausbleiben der Menstruation war als Zeitraum von mindestens 60 Tagen ohne Monatsblutung definiert. Gemäß dieser Festlegung wurden alle Patientinnen im Leuprorelin-Arm und 45/53 (84,9%) Patientinnen in der CMF-Gruppe postmenopausal.

5.7.2 Konstanz von CA 27.29 während ovarieller Ablation

Während die s-HER-2/neu-Spiegel im Zeitverlauf signifikant und anhaltend anstiegen, blieben die mittleren Konzentrationen von CA 27.29 über den Beobachtungsraum von 24 Monaten konstant und fluktuierten unterhalb des oberen cut-off-Wertes von 30 U/ml meistens um einen Wert von 20 U/ml (siehe Tabelle 11 und Abbildung 23).

[Seite 87↓]

Tabelle 11: Konstanz von CA 27.29 (U/ml) unter hormoneller Ablation

Gruppe A: Leuprorelin

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

 

Mittelwert

16,73

14,05

17,30

15,75

16,67

17,85

 

SD

8,14

7,45

8,47

8,24

9,28

9,98

 

Gruppe B: CMF

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

 

Mittelwert

18,41

15,60

20,25

15,16

23,41

12,92

 

SD

8,10

6,91

8,10

7,70

32,44

4,88

 

Ukraine: Leuprorelin

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

Follow-up

Mittelwert

49,65

24,19

35,64

23,90

19,16

36,29

19,19

SD

83,78

10,74

57,70

7,47

10,30

41,12

9,56

Leuprorelin gesamt

Baseline

Monat 3

Monat 6

Monat 12

Monat 18

Monat 24

Follow-up

Mittelwert

25,1

14,97

21,8

16,32

17,13

22,18

19,19

SD

44,3

11,46

29,87

8,37

9,42

23,60

9,56

Es ist zu beachten, daß es auch für CA 27.29 im Zeitverlauf statistisch signifikante Veränderungen der Serumkonzentrationen gab (z. B. den oben beschriebenen Abfall von baseline zum Monat 3 in der Leuprorelingesamtgruppe bei einem p<0,0001). Allerdings wird dieser Abfall zwischen Monat 3 und Monat 6 wieder komplett nivelliert, so daß sich über den gesamten Beobachtungszeitraum keine signifikante Änderung ergibt.


[Seite 88↓]

Abbildung 23: Konstante CA 27.29-Spiegel unter adjuvanter Therapie. Die Patientinnen aus der Ukraine zeigten deutlich erhöhte Eingangswerte und wurden daher separat ausgewertet.

Dieses konstante Niveau von CA 27.29 spricht gegen die ggf. zu stellende Frage, ob sich der ansteigende s-HER-2/neu-Spiegel aus einer zunehmenden Anzahl von noch okkulten, residuellen Tumorzellen ergeben könnte. Auch die bislang sehr geringe Anzahl an Rezidiven von nur n=20 der Patientinnen in diesem biochemischen Begleitprojekt widerspricht einer solchen Hypothese.

Abbildung 24 zeigt die gemäß der nichtparametrischen Varianzanalyse für Meßwiederholungen nach Brunner berechneten relativen Randeffekte von s-HER-2/neu (A), Östradiol (B) und CA 27.29 (C). Die ausgeprägteste und gegenläufige Veränderung von s-HER-2/neu und Östradiol findet zwischen baseline und Monat 3 statt (p<0,001 für beide Arme und Serumparameter). CA 27.29 zeigte keine signifikanten Veränderungen über den gesamten Zeitverlauf.


[Seite 89↓]

Abbildung 24: Relative Randeffekte für s-HER-2/neu (A), Östradiol (B) und CA 27.29 (C) in der nichtparametrischen Varianzanalyse für Meßwiederholungen.


[Seite 90↓]

5.7.3  Prognostische Bedeutung von s-HER-2/neu in der adjuvanten Situation

Wie bereits erwähnt, war die Zahl der Rezidive unter den Patientinnen im s-HER-2/neu-Begleitprojekt zum Untersuchungszeitpunkt noch zu gering (n=20), um angesichts der Aufteilung in 2 Arme zu einem Ergebnis mit hinreichend großer statistischer power zu führen. Damit muß die Beantwortung der Frage nach der prognostischen und prädiktiven Bedeutung von s-HER-2/neu in der adjuvanten Situation für diese Studie zurückgestellt werden. Da das Gesamtergebnis der Studie unabhängig von der Begleitforschung jedoch von allgemeinem Interesse ist, sei dieses kurz zusammengefasst (58). Das mediane und maximale follow-up lag bei 24 und 31 Monaten in der Leuprorelin-Gruppe und bei 22 und 31 Monaten im CMF-Arm, wobei das mediane progressionsfreie Überleben bislang noch nicht erreicht wurde. Bislang konnte kein Unterschied im rezidivfreien oder Gesamtüberleben zwischen den beiden Behandlungsarmen festgestellt werden. Das mittlere rezidivfreie Überleben lag bei 750 Tagen (95% CI: 694-806) im Leuprorelin-Arm und bei 771 Tagen (95% CI: 717-824) im CMF-Arm (p=0.94).

5.8 Prädiktivität und Monitoring durch s-HER-2/neu im Stadium IV

Die prädiktive Bedeutung von s-HER2/neu in der Behandlung des metastasierten Mammakarzinoms wurde im Rahmen einer Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel untersucht. Dieses setting erschien besonders interessant, da die Sensitivität von HER-2/neu-überexprimierenden Tumoren gegenüber Paclitaxel kontrovers diskutiert wird (59;60). Die präklinischen und klinischen Ergebnisse zu diesem Thema sind aufgrund unklarer Einflußgrößen wie heterogener Kollektive (lokal fortgeschrittenes Mamma-karzinom versus Fernmetastasierung), unterschiedlicher Therapieformen (Patientinnen unter begleitender Strahlentherapie; kombinierte Analysen über die beiden Taxane Paclitaxel und Docetaxel) und insgesamt kleiner Fallzahlen schwer interpretierbar. Ein weiteres bias könnte durch die unterschiedlichen Nachweismethoden für HER-2/neu (IHC, FISH oder Serumtest) entstehen. Allein die Wahl der Nachweismethode kann ein Studienergebnis entscheiden: In der Untersuchung zur Bedeutung von HER-2/neu als [Seite 91↓]prädiktiven Faktor für die Hochdosischemotherapie des metastasierten Mammakarzinoms durch Harris et al. konnte gezeigt werden, daß das Therapieergebnis nicht vom immunhistochemischen Nachweis von HER-2/neu im Primärtumor abhing, die Patientinnen mit erhöhtem s-HER-2/neu-Spiegel in der metastasierten Situation aber ein schlechteres outcome hatten (61).

5.8.1 Chemotherapie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel

Ein komplettes Serumset zusammen mit dem klinischen follow-up stand von 35 Patientinnen unter wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel zur Verfügung. Die demographischen Angaben zu diesen 35 Patientinnen sind in Tabelle 12 dargestelt. Die Mehrzahl der Patientinnen (91%) war beim Studienbeginn postmenopausal. Im allgemeinen hatten die Frauen eine weit fortgeschrittene Erkrankung mit dominanter, viszeraler Beteiligung. Tumorcharakteristika und Vorbehandlung waren bei der s-HER-2/neu-positiven und der s-HER-2/neu-negativen Untergruppe vergleichbar. Der einzige Unterschied in den demographischen Angaben zwischen den s-HER-2/neu-positiven und den s-HER-2/neu-negativen Patientinnen fand sich beim Steroidhormonrezeptorstatus. In der Gruppe der s-HER-2/neu-positiven Patientinnen finden sich vermehrt Frauen mit fehlender Expression sowohl des Östrogen- wie auch des Progesteronrezeptors. Dies entspricht dem bekannten Phänomen, daß HER-2/neu-positive Tumore zumeist steroidhormonrezeptornegativ sind (47;62). Zudem muß erwähnt werden, daß bei fast der Hälfte der Patientinnen der Steroidhormonrezeptorstatus unbekannt war, was den Pathologiestandards für die Tumoraufarbeitung zum Zeitpunkt der Diagnosestellung dieser Patientinnen entsprach.

Fast alle Patientinnen (97%) waren mit Anthrazyklinen entweder als adjuvante oder als palliative Therapie vorbehandelt. Bei 60% der Patientinnen war Paclitaxel die Zweitlinienchemotherapie für die metastasierte Erkrankung. Insgesamt 34% der Patientinnen standen mit Paclitaxel bereits unter Drittlinienchemotherapie. Zusätzlich [Seite 92↓]hatten mehr als die Hälfte der Patientinnen auch bereits eine palliative Hormontherapie erhalten.

Tabelle 12: Demographische Angaben der Patientinnen unter wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel

Parameter

  

Gesamt

HER-2/neu

HER-2/neu

 

  

 

 

positiv

negativ

 

  

n=35

%

n=22

%

n=13

%

 

       

Alter bei Ersterkrankung

Range

31-63

 

34-63

 

31-56

 

 

 

Mittelwert

48

 

49

 

48

 

Alter bei Fernmetastasierung

Range

35-66

 

35-66

 

35-62

 

 

Mittelwert

51

 

51

 

52

 

Alter bei Therapiebeginn mit

Range

36-67

 

36-67

 

36-65

 

wöchentlichem Paclitaxel

Mittelwert

54

 

53

 

54

 

Operation

modifiziert rad. Mastektomie

24

68%

15

68%

9

9%

 

brusterhaltend

 

10

29%

7

32%

3

23%

 

keine

 

1

3%

0

0%

1

8%

Histologie

invasiv duktal

 

20

57%

13

59%

7

54%

 

inflammatorisch

 

2

6%

1

5%

1

8%

 

andere

 

13

37%

8

36%

5

38%

Pathologisches

T

1-2

25

72%

16

72%

9

70%

staging

 

3-4

5

14%

3

14%

2

15%

 

 

x

5

14%

3

14%

2

15%

 

N

0

8

23%

5

22%

3

23%

 

 

1-2

20

57%

14

64%

6

46%

 

 

x

7

20%

3

14%

4

31%

 

M

0

31

89%

19

86%

12

92%

 

 

1

4

11%

3

14%

1

8%

Grading

G

1

2

6%

2

9%

0

0%

 

 

>1

21

60%

13

59%

8

62%

 

 

x

12

34%

7

32%

5

38%

Rezeptorstatus

ER oder PR positiv

 

12

34%

8

36%

4

31%

 

ER und PR negativ

 

6

17%

5

23%

1

7%

 

unbekannt

 

17

49%

9

41%

8

62%

Menopausen-

prämenopausal

 

3

9%

2

9%

1

8%

status

postmenopausal

 

32

91%

20

91%

12

92%

Metastasen

Anzahl beteiligter

1

9

26%

5

23%

4

31%

zu Studienbeginn

Organsysteme

2

11

31%

8

36%

3

23%

 

 

>2

15

43%

9

41%

6

47%

 

Dominanz

Viscera

29

83%

19

86%

10

77%

 

Weichteile

6

17%

3

14%

3

23%

 

 

Knochen

0

0%

0

0%

0

0%

Chemotherapie

Paclitaxel als 1st-line

2

6%

0

0%

2

15%

 

Paclitaxel als 2nd-line

21

60%

15

68%

6

46%

  

Paclitaxel als 3rd-line

12

34%

7

32%

5

38%

 

adjuvante Chemotherapie

18

51%

13

59%

5

38%

 

Anthrazyklin-Vorbehandlung

34

97%

22

100%

12

92%

Hormontherapie

adjuvant

 

8

23%

3

14%

5

38%

 

palliativ

 

21

60%

11

50%

10

77%

Radiatio

adjuvant

 

19

54%

12

55%

7

54%

 

palliativ

 

15

43%

11

50%

4

31%


[Seite 93↓]

Wir korrelierten s-HER-2/neu mit dem Behandlungserfolg und untersuchten die Möglichkeit des Monitorings. Die baseline-s-HER-2/neu-Spiegel reichten von 5-2373 ng/ml (Mittelwert: 142 ng/ml; Median 18 ng/ml). 22 Patientinnen (62,9%) zeigten einen erhöhten baseline-s-HER-2/neu-Spiegel >15 ng/ml. Insgesamt 14/35 Frauen (40%) boten eine objektive Remission (siehe Tabelle 13). Unter Berücksichtigung eines Anteils von 34,3% an Patientinnen mit stabiler Erkrankung muß fraktioniertes, dosisintensiviertes Paclitaxel angesichts des mehrfach vorbehandelten Patientinnenguts damit als sehr effektive Therapie angesehen werden. Die Ansprechrate zwischen den s-HER-2/neu-positiven- und den s-HER-2/neu-negativen Patientinnen zeigte keinen Unterschied (p=0,4).

Tabelle 13: Überblicksdarstellung des Bezugs von s-HER-2/neu mit dem Therapieansprechen (CD, PR, SD versus PD), dem progressionsfreien Überleben und der Dauer der response

       
  

Best response (n=35)

 
       
 

s-HER-2/neu

Anzahl an Patienten

Ergebnis

Anzahl an Patienten

%

 
       
 

Gesamt

35

CR oder PR oder SD:

26

74,3%

 
   

CR oder PR:

14

40,0%

 
   

PD:

9

25,7%

 
       
       
 

Positiv

22

{

CR oder PR oder SD:

17*

77,3%

 
   

CR oder PR:

9

40,9%

 
   

PD:

5*

22,7%

 
       
       
 

Negativ

13

{

CR oder PR oder SD:

9*

69,2%

 
   

CR oder PR:

5

38,5%

 
   

PD:

4*

30,8%

 
       
    

*p=0,4

  
      
      
        
  

Progressionsfreies Überleben (n=26)

 

Dauer der response (n=14)

 
        
 

s-HER-2/neu

Anzahl an

Patienten

Progressionsfreies

Überleben (Wochen)

 

Anzahl an Patienten

Dauer der response

(Wochen)

 
        
 

Gesamt

26

38,8

 

14

39,8

 
        
 

Positiv

17

31,2**

 

9

25,7***

 
        
 

Negativ

9

53,1**

 

5

65,2***

 
        
        
   

**p=0,098

  

***p=0,042

 
        


[Seite 94↓]

Es bestand ein Trend zugunsten eines besseren progressionsfreien Überlebens für die s-HER-2/neu-negativen Patientinnen (im Mittel 53,1 Wochen) im Vergleich zu den s-HER-2/neu-positiven Patientinnen (im Mittel 31,2 Wochen; p=0,098). Die entsprechenden Kaplan-Meier-Kurven sind in Abbildung 25 dargestellt. Die Korrelation des baseline-s-HER-2/neu-Spiegels mit der Responsedauer erbrachte einen statistisch signifikanten Unterschied (p=0,042) zugunsten der s-HER-2/neu-negativen Patientinnen, für welche die Responsedauer mit 65,2 Wochen mehr als zweieinhalbfach länger war als für die s-HER-2/neu-positive Subgruppe mit 25,7 Wochen (siehe Abbildung 26).

Abbildung 25: Kaplan-Meier-Kurve über das progressionsfreie Überleben für alle Patientinnen unabhängig vom s-HER-2/neu-Spiegel (n=35) und für die s-HER-2/neu-positive Untergruppe (n=22) im Vergleich zu den Patientinnen mit normalem s-HER-2/neu-Spiegel (n=13)


[Seite 95↓]

Abbildung 26: Kaplan-Meier-Kurve für die Dauer der response für alle Patientinnen unabhängig vom s-HER-2/neu-Spiegel (n=14) und für die s-HER-2/neu-positive Untergruppe (n=9) im Vergleich zu den Patientinnen mit normalem s-HER-2/neu-Spiegel (n=5)

Als nächsten Schritt untersuchten wir rein rechnerisch, ob es innerhalb der s-HER-2/neu-positiven Patientinnen noch biologische Untergruppen gibt. Wir testeten die Patientinnen mit s-HER-2/neu-Konzentrationen ≥20 ng/ml, ≥22 ng/ml, ≥25 ng/ml und ≥30 ng/ml jeweils im Vergleich zu jenen mit s-HER-2/neu-Konzentrationen <20 ng/ml, <22 ng/ml, <25 ng/ml und <30 ng/ml. Dabei fanden wir ein statistisch signifkant kürzeres (p=0,022) progressionsfreies Überleben jenseits einer Grenze von 22 ng/ml mit einem von da an fallenden p-Wert (siehe Tabelle 14). Somit konnten wir einen quantitativen, umgekehrten Bezug zwischen dem Therapieergebnis und dem s-HER2/neu-Spiegel darstellen. Die s-HER-2/neu-positive Patientinnengruppe ist in sich heterogen und läßt sich mit Hilfe des rein metrischen s-HER-2/neu-Spiegels in biologische Untergruppen einteilen.


[Seite 96↓]

Tabelle 14: Verschlechterung des progressionsfreien Überlebens bei Wahl eines höheren s-HER-2/neu-cut-offs >15 ng/ml im Sinne eines Hinweises auf biologische Subgruppen der s-HER-2/neu-Positivität

Variation des cut-off-Wertes von

s-HER-2/neu

(ng/ml)

s-HER-2/neu- Status

Anzahl an Patienten

Progressionsfreies

Überleben

p

 

 

(Wochen)

 

gesamt:

26

38,8

 

15

positiv:

17

31,2

0,098

 

negativ:

9

53,1

 

20

positiv:

12

21,1

0,065

 

negativ:

14

72,1

 

22

positiv:

11

16,8

0,022

 

negativ:

15

80,3

 

25

positiv:

10

13,9

0,0089

 

negativ:

16

85,7

 

30

positiv:

9

11,6

0,0039

 

negativ:

17

90,1

 

Zur Beurteilung der Möglichkeit des Monitorings mit s-HER-2/neu korrelierten wir schließlich den klinischen Therapieerfolg mit dem longitudinalen Verlauf der s-HER-2/neu-Spiegel. In Abbildung 27A und B ist der Verlauf der s-HER-2/neu-Konzentrationen von 2 Patientinnen, gemessen mit dem Oncogene-Assay und dem Chiron-Assay, dargestellt. Abbildung 27A zeigt die s-HER-2/neu-Kurve einer Patientin, die im Therapieverlauf eine partielle Remission entwickelte. Während der Behandlung fiel ihr s-HER-2/neu-Spiegel unter den oberen Grenzwert von 15 ng/ml ab. Zum Zeitpunkt der erneuten Progression stieg s-HER-2/neu erneut an. In Abbildung 27B sind dagegen die Veränderungen von s-HER-2/neu bei einer Patientin mit primärem Therapieversagen unter wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel dargestellt. Ihre s-HER-2/neu-Spiegel stiegen im gesamten Behandlungsverlauf bis auf eine einmalige biologische Schwankung an. Die Messungen mit beiden ELISA-Assays brachten vergleichbare Ergebnisse, ähnlich wie auch in der linearen Regression unter Punkt 5.2. dargestellt.


[Seite 97↓]

Abbildung 27: Kasuistiken zum longitudinalen Verlauf von s-HER-2/neu. A: Patientin mit partieller Remission und späterer Progression. B: Patientin mit primärer Progression.

In der Gesamtanalyse zum Monitoring durch s-HER-2/neu bestimmten wir die mittlere Veränderung der s-HER-2/neu-Konzentration für Patientinnen mit partieller oder kompletter Remission im Vergleich zu Patientinnen mit stabiler Erkrankung und im [Seite 98↓]Vergleich zu Patientinnen mit primärer Progression. In der s-HER-2/neu-positiven Subgruppe lag der mittlere Abfall der s-HER-2/neu-Spiegel bei 19,6 ng/ml für Patientinnen mit objektivem Ansprechen, während der s-HER-2/neu-Spiegel um 17,3 ng/ml bei Patientinnen mit primärer Progression anstieg (siehe Tabelle 15). Dieser unterschiedliche Verlauf zwischen den beiden Gruppen war statistisch nicht signifikant (p=0,15), was auch im Hinblick auf die moderate Gruppengröße gewertet werden muß. Interessanterweise stieg der s-HER-2/neu-Spiegel bei Patientinnen mit stabiler Erkrankung im Mittel um mehr als 200 ng/ml an. Dies ist am ehesten als früher, biochemischer Hinweis auf die Progression der Erkrankung zu werten, während die morphologisch sichtbare Progression gemäß den Restaginguntersuchungen diesem Phänomen hinterherhinkt.

Tabelle 15: Veränderung des s-HER-2/neu-Spiegels unter Therapie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel (Referenzzeitpunkte: baseline und Zeitpunkt der best response-Evaluierung)

 

Longitudinaler Verlauf des s-HER-2/neu-Spiegels (n=33)

 
  
  

Anzahl an Patienten

Mittlere Veränderung der

 
    

s-HER-2/neu-Konzentration

 
  

s-HER-2/neu-

s-HER-2/neu-

s-HER-2/neu-

s-HER-2/neu-

 
  

positiv

negativ

positiv

negativ

 
       
 

CR+PR

9

4

-19,6

-0,8

 
       
 

SD

8

3

+213,5

+1,0

 
       
 

PD - reduziert*

4

4

+17,0

+0,5

 
       
 

*Eine Patientin wurde wegen eines extrem hohen s-HER-2/neu-Spiegels nicht berücksichtigt.

 

Zudem konnte bei 66,6% aller Patientinnen mit erhöhtem s-HER-2/neu-Baselinespiegel und objektiver Remission ein Abfall von s-HER-2/neu unter den oberen cut-off-Wert von 15 ng/ml nachgewiesen werden (siehe Abbildung 28A). Bei Patientinnen mit primärer Progression konnte, wenn auch nur sehr selten, ein vergleichbarer Abfall demonstriert werden (siehe Abbildung 28B). Dieser Umstand und die niedrige Fallzahl sind am ehesten dafür verantwortlich, daß sich insgesamt zum Monitoring keine statistische Signifikanz ergab. s-HER-2/neu-negative Patientinnen zeigten unter Therapie keine relevanten Veränderungen der s-HER-2/neu-Konzentration.


[Seite 99↓]

Abbildung 28: Graphische Darstellung der s-HER-2/neu-Verläufe. A: Patientinnen mit Remission auf wöchentliches Paclitaxel. B: Patientinnen mit primärer Progression.
(Eine Patientin wurde wegen ihres extrem hohen s-HER-2/neu-baseline-Wertes mit >2000 ng/ml aus der graphischen Darstellung herausgenommen.)

Von 19 Patientinnen waren zusätzlich zu den Serumergebnissen unter wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel auch s-HER-2/neu-Resultate aus früheren Chemotherapien vorhanden. Im Median waren diese Serumproben 31 Wochen vor Einleitung der Therapie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel abgenommen worden, d.h. zu einer Zeit mit sicherlich deutlich niedrigerer Tumorlast. Während der mittlere s-HER-2/neu-Spiegel dieser Patientinnen zum Zeitpunkt dieser früheren Chemotherapie bei 22,2 ng/ml lag, stieg die mittlere Konzentration um das ca. Zehnfache bis zum Zeitpunkt der Therapieeinleitung mit fraktioniertem Paclitaxel an.


[Seite 100↓]

5.8.2  Multivariate Analyse unterschiedlicher Serumparameter unter Mehrlinien-Chemotherapie

Die Zahl an Patientinnen zur Untersuchung der Bedeutung von s-HER-2/neu aus der Phase II-Studie mit wöchentlich fraktioniertem Paclitaxel war für eine multivariate Analyse nicht ausreichend und enthielt zudem ein selektioniertes Patientinnengut. Wir erweiterten daher unser Untersuchungskollektiv auf 111 sequentielle Chemotherapiepatientinnen aus der Mamma-Ambulanz der Medizinischen Klinik II, welche ihr Einverständnis für longitudinale Blutentnahmen zur Analyse von prognostischen und prädiktiven Faktoren beim Mammakarzinom gegeben hatten. Für diese Blutentnahmen lag von der Ethikkommission der Charité am Campus Mitte ein positives Votum vor. Zudem entschlossen wir uns, die differentielle Wertigkeit anderer Serumfaktoren im Vergleich zu s-HER-2/neu zu untersuchen. Wir wählten s-EGFR als weiteres Mitglied der EGF-Rezeptorfamilie, uPA als Indikator für die Zerstörung der Interzellularsubstanz sowie CA 27.29 als konventionellen Tumormarker.

Tabelle 16 faßt die demographischen Angaben dieser 111 Patientinnen zusammen. Etwa 70% der Frauen hatten sich wegen eines invasiv duktalen, ER-positiven, nodalpositiven T1-2-Tumors einer modifiziert radikalen Mastektomie unterziehen müssen. Die Mehrzahl der Patientinnen hatte im Erkrankungsverlauf ein Lokalrezidiv durchgemacht. Rund die Hälfte der Patientinnen hatte eine adjuvante Chemotherapie gehabt, während ein Drittel eine adjuvante Hormontherapie erhalten hatte. Auch für die metastasierte Erkrankung hatten bereits ca. 50% der Frauen vor Einleitung der in dieser Analyse untersuchten Chemotherapie eine Hormonbehandlung durchgeführt. Die Patientinnen waren in den Gruppen mit Erst-, Zweit- sowie Dritt- und Mehrlinienchemotherapie gleichmäßig zu je einem Drittel verteilt. Die Chemotherapieregimes basierten in der überwiegenden Mehrzahl entweder auf Taxanen oder Anthrazyklinen oder der Kombination von Substanzen aus beiden Zytostatikagruppen (siehe Tabelle 17), selten genutzte Kombinationen werden nicht separat aufgeführt.


[Seite 101↓]

Tabelle 16: Demographische Angaben zu den Patientinnen unter Mehrlinienchemotherapie

Parameter

Gesamt (%)

Operation

modifiziert radikale Mastektomie

72

 

brusterhaltend

 

25

Lokalrezidiv

Ja

 

69

Histologie

invasiv duktal

 

72

 

inflammatorisch

 

3

 

lobulär

 

6

 

andere

 

19

Pathologisches

T

1

32

staging

 

2

38

  

3

12

  

4

18

 

N

0

26

  

1

65

  

2

8

  

3

1

 

M

0

84

  

1

16

Grading

G

1

56

  

2

45

  

3

49

Rezeptorstatus

ER positiv

 

72

 

PR positiv

 

55

HER-2/neu-Status (FISH oder DAKO)

positiv

 

33

Menopausenstatus

prämenopausal

 

88

 

postmenopausal

 

12

Metastasen zu

Anzahl

1

30

Studienbeginn

beteiligter

2

36

 

Organsysteme

>2

34

 

Dominanz

Viszera

79

  

Weichteile

16

  

Knochen

5

Adjuvante Chemotherapie

Ja

47

Hormontherapie

adjuvant

 

29

 

palliativ

 

55

Radiatio

adjuvant

 

50

 

palliativ

 

36


[Seite 102↓]

Tabelle 17: Art, Linie und Erfolg der Chemotherapie im Beobachtungszeitraum

Chemotherapie

Gesamt (%)

Chemotherapie-Linie (%)

1

2

3

4

      

Taxane

 

50,5

10,9

54,6

32,7

1,8

Anthrazykline

 

6,3

71,4

28,6

0

0

Gemcitabine

 

17,1

52,6

26,3

15,8

5,3

Anthracykline + Taxane

 

9,0

70,0

10,0

10,0

10,0

Anthrazykline + Gemcitabine

 

4,5

60,0

40,0

0

0

 

   

Chemotherapie

 

Gesamt (%)

Best response (%)

CR

PR

SD

PD

 

     

Taxane

 

50,5

4,5

31,1

31,1

33,3

Anthrazykline

 

6,3

0

42,9

42,9

14,3

Gemcitabine

 

17,1

0

22,2

38,9

38,9

Anthrazykline + Taxane

 

9,0

40,0

10,0

10,0

40,0

Anthrazykline + Gemcitabine

 

4,5

0

25,0

50,0

25,0

 

     

Chemotherapie-Linie

 

Gesamt (%)

Best response (%)

CR

PR

SD

PD

 

     

Erstlinientherapie

 

35,5

16,2

21,6

29,7

32,5

Zweilinientherapie

 

38,2

2,7

29,7

35,1

32,5

Drittlinientherapie

 

21,8

5,0

30,0

25,0

40,0

Viertlinientherapie

 

3,6

0

0

66,7

33,3

Für die multivariate Analyse wählten wir aus einer seriellen Probensammlung im Abstand von 2-3 Wochen als repräsentative Seren die Proben zu den Zeitpunkten baseline und best response aus.


[Seite 103↓]

Die s-HER-2/neu-Spiegel reichten von 5-2373,1 ng/ml (baseline-Median und -Mittelwert: 17,4 ng/ml und 87 ng/ml; siehe Tabelle 18). Der HER-2/neu-Status im Gewebe war von 30/111 Patientinnen sowohl mittels IHC (DAKO) wie auch mittels FISH bekannt. Von diesen 30 bekannten Ergebnissen waren 10 HER-2/neu-gewebepositiv. Die s-EGFR-Konzentrationen reichten von 32-135 ng/ml mit einem baseline-Median von 56,4 ng/ml und einem Mittelwert von 57,4 ng/ml. Während also bei s-EGFR der Mittelwert und der Median übereinstimmen (entsprechend der gleichmäßigen Verteilung der EGFR-Expression beim Mammakarzinom im allgemeinen) und keine Korrelation zur Tumormasse besteht, sind für s-HER-2/neu der Median und Mittelwert sehr unterschiedlich (siehe nächste Seite). Dies spiegelt die HER-2/neu-Überexpression bei nur einem Drittel aller Mammakarzinompatientinnen sowie die Korrelation zur Tumorlast wieder. Die s-uPA-Konzentrationen reichten von 524-5086 pg/ml (Median: 1433,2 pg/ml, Mittelwert 1606,2 pg/ml). Wie schon bei s-HER-2/neu waren auch bei CA 27.29 der Median (103 U/ml) und der Mittelwert (484 U/ml) unterschiedlich, was auf die unterschiedliche Tumorlast in dieser heterogenen Population hinweist.

Tabelle 18: Überblick über die biochemischen Serumergebnisse (der Range bezieht sich auf alle gemessenen Proben, im übrigen werden Mittelwert, Median und Perzentilen der baseline-Probe angegeben)

BiochemischerParameter

Range

von - bis

Mittelwert

baseline

Perzentilen

25

50/Median

75

s-HER-2/neu (ng/ml)

4,97

2373,1

87,0

12,5

17,4

40,0

s-EGFR (ng/ml)

30,0

136,2

57,7

49,2

57,1

65,4

s-uPA

(pg/ml)

524,0

5086,0

1606,2

1236,6

1433,2

1735,0

CA 27.29 (U/ml)

7,8

12612,8

484,5

34,6

103,2

360,8


[Seite 104↓]

Für CA 27.29 konnte der Bezug zur Tumormasse als statistisch hochsignifikant dargestellt werden. Die Beziehungen der baseline-Spiegel der verschiedenen Serumparameter zu der Anzahl betroffener Organe sowie zur dominanten Lokalisation der Metastasen ist in Tabelle 19 dargestellt.

Tabelle 19: Mittlere baseline-Spiegel der biochemischen Marker und ihre Assoziation zu Tumorlast und Tumorlokalisation

Tumorlast

Anzahl beteiligter Organe

1

2

3

p-Wert

 

    

s-HER-2/neu (ng/ml)

48,9

111,1

139,9

ns

s-EGFR (ng/ml)

58,8

57,6

56,8

ns

s-uPA (pg/ml)

1559,5

1769,8

1484,9

ns

CA 27.29 (U/ml)

102,3

371,5

1201,5

<0,001

 

  

Tumorlokalisation

 

Dominanz der Erkrankung

Viszera

Weichteile

Knochen

p-Wert

 

    

s-HER-2/neu (ng/ml)

107,2

15,5

16,6

0,010

s-EGFR (ng/ml)

57,6

56,9

61,7

ns

s-uPA (pg/ml)

1672,0

1320,8

1548,8

ns

CA 27.29 (U/ml)

596

79,4

114,8

0,009

ns = nicht signifikant

Die Angaben zu s-HER-2/neu und der Tumorlokalisation spiegeln die high risk-Konstellation der HER-2/neu-Positivität wieder. Niedrigrisikomanifestationen wie Weichteil- oder Knochenmetastasen gehen mit einem nahezu normalen s-HER-2/neu-Spiegel einher, während bei vorwiegend viszeralem Befall der mittlere s-HER-2/neu-Spiegel auf ein Vielfaches der oberen Norm erhöht ist.


[Seite 105↓]

Für s-EGFR stellten wir eine geringfügige Korrelation zum Alter der Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom fest, zum anderen zur HER-2/neu-Amplifikation im Gewebe. Abbildung 29 zeigt den Bezug von s-EGFR zum Menopausenstatus (p=0,009) und zum Alter (p=0,014; Korrelationskoeffizient –0,239). Der mittlere s-EGFR-Spiegel für postmenopausale Frauen lag bei 56,5 ng/ml, während prämenopausale Mammakarzinompatientinnen eine mittlere s-EGFR-Konzentration von 64,7 ng/ml aufwiesen.

Abbildung 29: s-EGFR und seine schwache Korrelation zum Menopausenstatus (p=0,009) und zum Alter im allgemeinen (p=0,014)

HER-2/neu-negative Patientinnen im FISH-Test boten einen mittleren s-EGFR-Spiegel von 57,7 ng/ml, während die FISH-positiven Patientinnen im Mittel eine s-EGFR-Konzentration von 51,2 ng/ml zeigten (p=0,063). Stellte man nicht die Frage nach einer rein metrischen Verteilung, sondern untersuchte die Gruppenbildung von Patientinnen mit s-EGFR-Spiegeln <50 ng/ml versus >50 ng/ml, fand man eine statistisch signifikante Häufung der Patientinnen mit niedrigem s-EGFR-Spiegel in der Gruppe der FISH-positiven Patientinnen (p=0,044).


[Seite 106↓]

Das Ergebnis der palliativen Chemotherapie war wie folgt: CR 8,2%, PR 25,5%, SD 32,7%, PD 33,7% (Aufteilung in Linie und Art der Chemotherapie siehe Tabelle 17). Die mittlere Zeit bis zur Progression in Relation zum Remissionsstatus lag bei 55,8 Wochen für Patientinnen mit CR, bei 41,2 Wochen für Patientinnen mit PR sowie bei 26,9 Wochen für Patientinnen mit SD (siehe Abbildung 30). Diese Unterschiede in der Zeit bis zur Progression waren statistisch signifikant (p<0,001). Die gute Auftrennung der progressionsfreien Intervalle zwischen den Remissionsgruppen beweist ex post die korrektive Gruppenbildung für unsere biochemischen Analysen.

Abbildung 30: Kaplan-Meier-Kurven für das progressionsfreie Intervall in Abhängigkeit vom Remissions-status

In der univariaten Analyse hing das objektive Ansprechen auf die Chemotherapie nicht von den folgenden Faktoren ab: Alter bei Erstdiagnose oder Fernmetastasierung; Art der Primäroperation (Mastektomie oder brusterhaltende Operation); Auftreten eines [Seite 107↓]Lokalrezidivs; Tumorstadium, Grading, Histologie, Steroidhormonrezeptorstatus; Status von HER-2/neu im Gewebe; adjuvante Behandlung (Chemotherapie, Hormonbehandlung, Radiatio); Dominanz der Erkrankung (Viszera, Weichteile, Knochen); Art und Linie der Chemotherapie; vorangegangene Hormontherapie für die metastasierte Erkrankung; response auf die Erstlinienchemotherape; baseline-Serumspiegel von HER-2/neu, EGFR oder uPA. Tabelle 20 faßt die statistisch signifikanten Ergebnisse der univariaten Analyse zur Assoziation von Ansprechen und progressionsfreiem Intervall zu verschiedenen klinischen und biologischen Parametern zusammen.

Tabelle 20: Ergebnisse der univariaten Analyse zu Ansprechen und progressionsfreiem Intervall. Angegeben werden nur die Parameter, die auf mindestens einen der Endpunkte einen statistisch signifikanten Einfluß erbrachten.

 

Best response

Progressionsfreies Überleben

Parameter

χ2 Test (Fisher’s exact) p-Wert

Kaplan-Meier (Log-Rank) p-Wert

Remissionsstatus

---

p<0,0001

HER-2/neu-Gewebestatus (FISH)

ns

0,021

Menopausenstatus

0,005

ns

Vorangegangene adjuvante Chx

ns

0,029

Lokalrezidiv

ns

0,065

Best response auf Erstlinien-Chx

ns

ns

Best response auf Zweitlinien-Chx

0,015

0,003

Palliative Radiatio

0,031

ns

Anzahl beteiligter Organe (1, >1)

0,020

0,002

s-EGFR

Cut-off 50 ng/ml

ns

ns

s-uPA

Cut-off 1800 pg/ml

ns

ns

CA 27.29

Cut-off 30 U/ml

0,014

ns

s-HER-2/neu

Cut-off 15 ng/ml

ns

ns

Cut-off 18 ng/ml

ns

0,001

Cut-off 20 ng/ml

ns

0,004

ns = nicht signifikant; Chx = Chemotherapie


[Seite 108↓]

Der Nachweis der HER-2/neu-Überamplifikation durch FISH (p=0,021) und ein s-HER-2/neu-baseline-Spiegel >17 ng/ml, aber nicht die immunhistochemische HER-2/neu-Expression im Gewebe (p=0,2178), korrelierten statistisch signifikant mit dem progressionsfreien Intervall. Die statistische Signifikanz für die prädiktive Bedeutung von s-HER-2/neu stieg mit einem p-Wert von p=0,1561 für den oberen cut-off-Wert von 15 ng/ml über einen p-Wert von p=0,0845 für den Grenzwert von 16 ng/ml auf den ersten signifikanten p-Wert von p=0,021 bei 17 ng/ml und schließlich sogar von p=0,0011 bei 18 ng/ml an. Patientinnen mit einem s-HER-2/neu-Spiegel <18 ng/ml hatten ein mittleres progressionsfreies Intervall von 34 Wochen, während die Subgruppe mit einem s-HER-2/neu-Spiegel >18 ng/ml ein mittleres progressionsfreies Überleben von nur 19 Wochen aufwies. Die Kaplan-Meier-Kurven für s-EGFR (<50 ng/ml versus >50 ng/ml), s-uPA (<1800 pg/ml versus >1800 pg/ml) sowie CA 27.29 (<30 U/ml versus >30 U/ml) erbrachten keinen Einfluß auf das progressionsfreie Überleben.

Abbildung 31: Kaplan-Meier-Kurven für das progressionsfreie Intervall in Relation zum HER-2/neu-Ergebnis mit unterschiedlichen Nachweismethoden


[Seite 109↓]

In die multivariate Cox-Regression gingen alle Parameter ein, die in der univariaten Analyse einen p-Wert ≤0,1 erbracht hatten, und die bei einer ausreichenden Anzahl an Patientinnen bekannt waren. Dies galt für folgende Parameter: Remissionsstatus (CR+PR, SD, PD), adjuvante Chemotherapie (ja/nein), Anzahl beteiligter Organe (1 versus >2), Lokalrezidiv (ja/nein) und den s-HER-2/neu-Spiegel (<18 versus >18 ng/ml). Die Cox-Analyse identifizierte die in Tabelle 21 dargestellten Einflussfaktoren als statistisch signifikant für das progressionsfreie Intervall.

Tabelle 21: Ergebnisse der Cox-Regression zum Einfluß auf das progressionsfreie Intervall

Parameter

p-Wert

Relatives

Risiko

95%

Konfidenzintervall

Remissions-status

SD versus CR+PR

p<0,001

1,857

1,065-3,237

PD versus CR+PR

49,285

20,152-120,537

Anzahl betroffener Organsysteme

( 2 versus 1)

p=0,025

1, 79

1,077-2,973

s-HER-2/neu-Spiegel

( 18 ng/ml versus <18 ng/ml)

p=0,01

2,344

1,450-3,788

Als letzter wichtiger Aspekt soll noch die Qualität des Monitorings durch die gewählten 4 Serumparameter beschrieben werden. Statistisch wurde hierfür die nichtparametrische Varianzanalyse für Meßwiederholungen nach Brunner angewandt und nachfolgende 3 Fragestellungen untersucht: Gruppeneffekt (Einfluß der best response BR), Zeiteffekt sowie Wechselwirkungen (WW) zwischen Gruppe und Zeit. Es gelten die üblichen Bedingungen für die statistische Signifikanz mit α=0,05, wobei bei paarweisen Vergleichen nach Bonferroni-Holm adjustiert wurde. In Tabelle 22 sind diese Ergebnisse zusammengefaßt (fett gedruckte p-Werte sind statistisch signifikant) und werden danach an einigen Beispielen illustriert. Es kann festgestellt werden, daß s-EGFR zur Verlaufsbeurteilung ungeeignet ist. s-uPA und s-HER-2/neu sind in der zeitlichen Verlaufsbeurteilung nützlich, können aber kaum zwischen den einzelnen Responsegruppen unterscheiden. Der beste Monitoringparameter ist CA 27.29, welches zwischen den einzelnen Responsegruppen unterschiedliche longitudinale Verläufe detektieren läßt.


[Seite 110↓]


[Seite 111↓]

Tabelle 22: Ergebnisse der Varianzanalyse für Meßwiederholungen von baseline zum Zeitpunkt der best response (paarweise Vergleiche wurden nach Bonferroni-Holm adjustiert: 0,05/6=0,0083, 0,05/5=0,01, 0,05/4=0,0125, 0,05/3=0,0167, 0,05/2=0,025)

Verlauf über baseline bis Zeitpunkt der best response

Best response-Gruppen

Einfluß-faktor

p-Werte

s-EGFR

CR, PR, SD, PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,119

0,459

0,491

s-uPA

CR, PR, SD, PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,653

0,038

0,004

paarweise

CR – PR

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,808

0,003

0,087

 

CR – SD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,637

0,004

0,023

CR – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,372

0,100

0,001

PR – SD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,442

0,207

0,623

PR – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,212

0,806

0,055

SD – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,677

0,380

0,075

s-HER-2/neu

CR, PR, SD, PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,076

0,003

0,105

paarweise

CR – PR

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,172

0,002

0,818

 

CR – SD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,032

0,032

0,362

 

CR – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,033

0,188

0,069

 

PR – SD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,268

0,002

0,142

 

PR – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,272

0,043

0,007

 

SD – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,984

0,553

0,169

CA 27.29

CR, PR, SD, PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

<0,001

<0,001

0,002

paarweise

CR – PR

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

<0,001

<0,001

0,013

 

CR – SD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

<0,001

0,112

0,554

CR – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

<0,001

0,137

0,540

PR – SD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,051

<0,001

<0,001

PR – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,031

<0,001

<0,001

SD – PD

Best response

Zeitverlauf

Wechselwirkung

0,779

0,296

0,961

Die Abbildung 32 stellt die gerade numerisch beschriebenen Verläufe mit Hilfe der relativen Randeffekte für alle untersuchten Serummarker graphisch dar. Wie bereits in der Table-Studie beschrieben, bedeuten Werte um 0,5, daß sich die Meßwerte zum Untersuchungszeitpunkt im Vergleich zu allen gepoolten Ergebnissen nicht unterscheiden. Man sieht für s-EGFR, daß sich für keine Responsegruppe im Zeitverlauf ein relevanter Unterschied ergibt. Wie auch schon aus Tabelle 22 ersichtlich, heben sich in bezug auf s-uPA insbesondere die Patientinnen mit CR von allen anderen Untergruppen ab; ihre Kurve kreuzt alle drei anderen Kurven. Für s-HER-2/neu ergibt sich eine ähnlich Konstellation: Hier fallen die Serumwerte von Patientinnen mit objektiver Remission (PR/CR) deutlich ab, während die PD-Kurve anstieg. Interessant ist auch, daß alle Kurven bis auf die Gruppe mit CR von einem nahezu identischen Ausgangspunkt starten. Ähnliches gilt auch für CA 27.29, allerdings mit noch akzentuierterer Steilheit der Kurven, insbesondere für die Patientinnen mit PR. Es ist bemerkenswert, daß sich die Gruppe SD nicht von der Gruppe PD unterscheiden läßt. Dies war mit keinem der untersuchten Serumparameter möglich.


[Seite 112↓]

Abbildung 32: Relative Randeffekte der longitudinalen Verläufe von baseline bis zum Zeitpunkt der best response für alle Serumparameter


[Seite 113↓]

5.8.3  Herceptin®-Therapie

Da sich in der gerade beschriebenen Untersuchung zum Monitoring unter verschiedenen Chemotherapien ohne Herceptin herausgestellt hatte, daß s-HER-2/neu sich zur zeitlichen Verlaufsbeurteilung eignet, aber keine gute Unterscheidung in die verschiedenen Remissionsgruppen erlaubt, wurden für die Betrachtung der Herceptin-Patientinnen die Remissionsbeurteilungen SD, PR und CR im Sinne eines Ausbleibens einer Progression bzw. im Sinne eines klinischen Nutzens zusammengefaßt und im folgenden dichotom unterschieden in Patientinnen mit PD oder CB (clinical benefit).

Insgesamt standen die Daten und Seren von 54 Patientinnen unter einer Herceptin-Monotherapie oder einer Kombination von Herceptin plus Chemotherapie zur Verfügung (siehe Tabelle 23). In kleineren, vorläufigen Analysen sollten 2 Fragen angegangen werden: Korrelieren die Ereignisse einer Progression bzw. des Fehlens der Progression der Erkrankung mit einem mehr als 15%-igem Anstieg oder weniger als 15%-igem Anstieg von s-HER-2/neu im Vergleich zur letzten Voruntersuchung (31-33)? Entscheidend für diesen Ansatz war die visit-per-visit-Analyse über einen langfristigen Verlauf. Als zweiter Aspekt wurde hinterfragt, ob ein früher, relativer Abfall der s-HER-2/neu-Konzentration einen Ausblick auf das Ansprechen auf die Herceptin-basierte Therapie gibt.

Für die visit-per-visit-Analyse wurden 17 Charité-Patientinnen ausgewählt, da sie die längsten Serumverläufe aufwiesen. Die s-HER-2/neu-baseline-Konzentrationen reichten von 11,1-2329,6 ng/ml (Median: 53,5 ng/ml; Mittelwert: 351 ng/ml). Insgesamt konnte von 55 Zeitpunkten eine biochemische und klinische Konkordanzanalyse durchgeführt werden. Ausgehend von einem Anstieg bzw. fehlendem Anstieg von s-HER-2/neu um 15% im Vergleich zur letzten Untersuchung fanden wir eine Übereinstimmung des restagings mit dem Serumverlauf von 78,2%. Die positive Prädiktivität lag bei 81,8%und die negative Prädiktivität bei 63,6% (für weitere statistische Angaben siehe Tabelle 24 und Tabelle 25). Ein Beispiel für den s-HER-2/neu-Verlauf einer der Herceptin-Patientinnen ist in Abbildung 33 dargestellt.


[Seite 114↓]

Tabelle 23: Demographische Angaben zu den Herceptin-Patientinnen

Parameter

Gesamt (%)

Operation

modifiziert radikale Mastektomie

54

 

brusterhaltend

 

15

Histologie

invasiv duktal

 

67

 

inflammatorisch

 

0

 

medullär

 

3

 

andere

 

30

Pathologisches

T

Tis

6

staging

 

1-2

52

  

3-4

26

  

x

16

 

N

0

11

  

>1

69

  

x

19

 

M

0

61

  

1

21

  

x

18

Grading

G

1

5

  

>1

70

  

x

25

Rezeptorstatus

ER oder PR positiv

 

50

 

ER und PR negativ

 

26

 

Unbekannt

 

24

HER-2/neu-Status

IHC +1

 

2

 

IHC +2

 

19

 

IHC +3

 

65

 

FISH +

 

4

 

unbekannt

 

10

Menopausenstatus

prämenopausal

 

22

 

perimenopausal

 

31

 

postmenopausal

 

43

 

unbekannt

 

2

Metastasen zu

Anzahl

1

15

Studienbeginn

beteiligter

2

26

 

Organsysteme

>2

59

 

Dominanz

Viszera

72

  

Weichteile

15

  

Knochen

13

Adjuvante Chemotherapie

ja

72

Hormontherapie

adjuvant

 

33

 

palliativ

 

82

Radiatio

adjuvant

 

50

 

palliativ

 

30


[Seite 115↓]

Tabelle 24: Therapieansprechen und s-HER-2/neu-Verlauf (p<0,005)

Veränderung von s-HER-2/neu

zu 55 Zeitpunkten

PD

CB

Gesamt

15% Anstieg

7

4

11

<15% Anstieg

8

36

44

Gesamt

15

40

55

Die Daten aus dieser Vierfeldertafel lassen sich in folgende statistische Angaben zum Langzeitmonitoring durch s-HER-2/neu zusammenfassen.

Tabelle 25: Qualität des Monitorings unter Herceptin-Therapie

 

Prozentsatz

Konfidenzintervall

Konkordanz

78,2%

65,7%

87,1%

Prädiktivität für CB

81,8%

69,7%

89,8%

Prädiktivität für PD

63,3%

50,4%

75,0%

Sensitivität für CB

90,0%

79,3%

95,5%

Spezifität für CB

46,7%

34,2%

59,7%

Die Kasuistik in Abbildung 33 zeigt, daß der gewählte relative Unterschied für die visit-per-visit-Analyse von 15% über einen sehr großen Bereich der s-HER-2/neu-Konzentrationen sinnvoll ist und auch noch um den oberen cut-off-Wert funktionieren kann, wenn im Laufe einer Response die relativen Unterschiede von visit zu visit immer geringer werden.


[Seite 116↓]

Abbildung 33: Kasuistik zum Monitoring mit s-HER-2/neu unter Herceptin-Therapie

Ganz ähnlich wie auch schon bei der Monitoringanalyse unter Chemotherapie allein kann man also für das Monitoring unter Herceptin-Therapie feststellen, daß die Verläßlichkeit der s-HER-2/neu-Messung gut, aber sicherlich nicht sehr gut ist. Es muß betont werden, daß es sich hier aufgrund der moderaten Fallzahlen nur um eine vorläufige Untersuchung handeln kann, die insbesondere den Vergleich mit CA 27.29 noch nicht erlaubt. Dieser wird jedoch aktuell in der im Anhang unter Projekt 2 beschriebenen, prospektiven Multicenter-Studie in einem sehr robusten Ansatz untersucht. Die Ergebnisse werden im 4. Quartal 2003 erwartet. Besonders interessant dürften die Serumverläufe von s-HER-2/neu bei den sogenannten „tumormarkernegativen“ Patientinnen sein, die kein CA 27.29 exprimieren. Hier wurden mehrfach Patientinnen beobachtet, die hohe s-HER-2/neu-Spiegel zeigen, bei denen aber kein erhöhtes CA 27.29 im Serum nachweisbar ist.


[Seite 117↓]

Von 45 Herceptin-Patientinnen standen sowohl die klinischen Daten wie auch enge Probenabnahmeintervalle innerhalb der ersten 5 Wochen nach Therapiebeginn zur Verfügung. Insgesamt zeigten 16/45 (35,6%) Frauen ein objektives Ansprechen (PR oder CR) auf die Herceptin-basierte Therapie, 14/45 (31,1%) erreichten eine Stabilisierung der Erkrankung und 15/45 (33,3%) waren primär progredient. Dies entspricht einem Anteil an Patientinnen mit klinischem Benefit (CB=CR+PR+SD) von 66,7%.

Die mittlere s-HER-2/neu-Konzentration bei Therapiebeginn lag bei 284,4 ng/ml bei einem Median von 22,4 ng/ml. Wir konnten keinen Bezug zwischen dem Ansprechen und der Höhe des s-HER-2/neu-baseline-Spiegels feststellen (p>0,05; siehe Tabelle 26). Es fand sich auch kein Zusammenhang zwischen dem Ansprechen auf die Herceptin-Therapie und den absoluten oder relativen s-HER-2/neu-Konzentrationen in der 2. Woche nach Therapiebeginn.

Tabelle 26: Darstellung der Verteilung von Ansprechen auf Herceptin-Therapie und Höhe des baseline-s-HER-2/neu-Spiegels (p>0,05)

 

Baseline

s-HER-2/neu

Best response

Gesamt

 

CD/PR

SD

PD

<15ng/ml

n

3

6

4

13

(%)

(23,1%)

(46,2%)

(30,8%)

15-50 ng/ml

n

6

5

6

17

(%)

(35,3%)

(29,4%)

(35,3%)

>50 ng/ml

n

7

3

5

15

(%)

(46,7%)

(20,0%)

(33,3%)

Gesamt

n

16

14

15

45

(%)

(35,6%)

(31,1%)

(33,3%)

Für die s-HER-2/neu-Konzentrationen zum Zeitpunkt Woche 4 nach Therapiebeginn ergab sich allerdings eine Assoziation zwischen Ansprechen und dem relativen Abfall des s-HER-2/neu-Spiegels. Je mehr die s-HER-2/neu-Konzentrationen in der Woche 4 im Vergleich zu Therapiebeginn angestiegen waren bzw. je weniger sie abfielen, desto wahrscheinlicher war eine primäre Progression. Die ROC-Kurve (area under the curve [Seite 118↓]AUC=0,78, CI: 0,6-0,94) für die Unterscheidung von Patientinnen mit PD versus Patientinnen mit CB zeigte, daß die relative s-HER-2/neu-Konzentration zum Zeitpunkt Woche 4 statistisch signifikant zwischen diesen beiden Responsegruppen unterscheiden kann (siehe Abbildung 34). Der Verlauf der ROC-Kurve zeigt, daß bei einer relativen s-HER-2/neu-Konzentration von 65% im Vergleich zu Therapiebeginn (entsprechend einem Abfall von 35%) die Sensitivität für das Erkennen einer Progression bei 90% liegt bei einer Spezifität von 48%. Berücksichtigten wir nur Patientinnen mit objektivem Ansprechen und primärer Progression, stieg die AUC auf 0,82 (CI: 0,66-0,99) an, die Sensitivität lag bei 92%, die Spezifität stieg auf 64% (ROC-Kurve nicht abgebildet).

Abbildung 34: ROC-Kurve zur Unterscheidung von Progression und klinischem Benefit durch den relativen s-HER-2/neu-Abfall zur Woche


[Seite 119↓]

Aus all diesen Daten zum Monitoring einer Herceptin-basierten Therapie kann man folgern, daß ein Anstieg der s-HER-2/neu-Konzentration unter Therapie mit sehr hoher Sicherheit auf eine Progression hinweist. Auch wenn s-HER-2/neu innerhalb von 4 Wochen nicht auf mindestens 65% der Eingangskonzentration abfällt, ist an dem therapeutischen Nutzen zu zweifeln und ein frühes restaging einzuleiten.

5.9 Konkordanzanalysen verschiedener Methoden der HER-2/neu-Bestimmung im Hinblick auf die Patientinnenselektion für eine Herceptin-Therapie

Insbesondere für das metastasierte Mammakarzinom treten individualisierte Therapieformen immer mehr in den Vordergrund. Gegenwärtig stehen 2 spezifische Therapiemodalitäten mit nachgewiesenem Überlebensvorteil zur Verfügung. Dabei handelt es sich zum einen um die Wachstumshemmung durch direkte oder indirekte Blockade der Steroidhormonrezeptoren, zum anderen um den monoklonalen anti-HER-2/neu-Antikörper Herceptin (22;63-66). Für jede Form der spezifischen Therapie muß der Nachweis des Zielproteins reliabel, valide und reproduzierbar sein. Falsch positive oder falsch negative Ergebnisse führen unweigerlich zu einer inadäquaten Patientenselektion. Vor der Therapie mit Herceptin muß sichergestellt sein, daß die Tumorerkrankung bei der individuellen Patientin tatsächlich HER-2/neu überexprimiert. Der Nachweis erfolgt im allgemeinen durch den Nachweis der HER-2/neu-Überamplifikation und/oder den Nachweis der HER-2/neu-Proteinüberexpression. Die Serummessung von HER-2/neu ist bislang in größeren klinischen Studien relativ unbeachtet geblieben. Wir stellten in den folgenden Untersuchungen die Frage, ob die s-HER-2/neu-Messung die Gewebetestung ggf. ersetzen oder zumindest sinnvoll ergänzen kann.


[Seite 120↓]

5.9.1  IHC des Primärtumors und s-HER-2/neu im Stadium IV

Zunächst einmal war es notwendig, den Bezug zwischen der HER-2/neu-Positivität im Gewebe und im Serum zu überprüfen. Hierfür wurden 101 Seren zum Zeitpunkt der gesicherten Progression von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom und bekanntem HER-2/neu-Gewebestatus aufgemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 27 dargestellt. Es handelt sich um ein selektiertes Patientinnengut, von dem ein Großteil aufgrund der bekannten HER-2/neu-Positivität an die universitäre Einrichtung zur Einleitung einer Herceptin-Therapie verwiesen wurde. Insofern läßt sich der hohe Anteil von HER-2/neu-positiven Patientinnen mit mehr als 60% erklären.

Tabelle 27: Übersicht über HER-2/neu-Proteinüberexpression und s-HER-2/neu-Spiegel bei 101 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom (die Prozentangaben beziehen sich jeweils auf die Spalten).

Gewebe

Serum

HER-2/neu

IHC +2

HER-2/neu

IHC +3

HER-2/neu

IHC negativ

Gesamt

s-HER-2/neu positiv

28 (68%)

14 (74%)

17 (41,5%)

59 (58,4%)

s-HER-2/neu negativ

13 (32%)

5 (26%)

24 (58,5%)

42 (41,6%)

Gesamt

41

19

41

101

Es zeigte sich, daß rund 70% der Patientinnen mit HER-2/neu-Überexpression im Gewebe unabhängig vom IHC-Score +2 oder +3 zum Zeitpunkt der Progression einer Fernmetastasierung tatsächlich auch einen erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel aufweisen. Wäre das Gewebeergebnis also nicht bekannt, würde man bei einer Patientinnenselektion anhand des s-HER-2/neu-Status viele Patientinnen für eine adäquate Therapie verlieren. Dieses Phänomen wird als „non-shedding“ bezeichnet. Die Ursachen hierfür sind weitgehend unbekannt. Andererseits findet sich ein erhöhter s-HER-2/neu-Spiegel auch bei einer relativ hohen Anzahl (41,5%) an HER-2/neu-gewebenegativen Frauen. Inwieweit es hierfür Erklärungen geben könnte, soll in der nachfolgenden Konkordanzanalyse von IHC, FISH und s-HER-2/neu an Primärtumoren und ihren Metastasen diskutiert werden.


[Seite 121↓]

5.9.2  Subgruppenanalyse mit IHC, computerisierter IHC-Befundung, FISH und s-HER-2/neu im Stadium IV

Bislang beruhen die spezifischen Therapien des Mammakarzinoms auf dem pathophysiologischen Dogma der Klonalität. Für den Einsatz von Hormontherapien oder Herceptin beim metastasierten Mammakarzinom verläßt man sich fast ausschließlich auf den Proteinnachweis am Primärtumor, da meist kein Gewebe einer Fernmetastase vorliegt, allenfalls eine zusätzliche Biopsie aus einem Lokalrezidiv. Der Grundsatz der Klonalität wird aber zunehmend durch die Erkenntnis eingeschränkt, daß sich Tumore während ihrer Entstehung und auch noch während der Metastasierung verändern, was die Patientenselektion und damit auch die Wirksamkeit und Sicherheit spezifischer Therapieformen kompromittieren könnte.

In der nachfolgenden Analyse nutzten wir alle 3 standardisierten Nachweismethoden von HER-2/neu (IHC, FISH, ELISA), um das gesamte verfügbare Gewebematerial und Serum von 30 Mammakarzinompatientinnen auf den HER-2/neu-Status zu untersuchen. Wir hatten folgende Fragen: Gibt es diskordante Gewebeergebnisse zwischen IHC und FISH? Kann eine automatisierte IHC-Befundung die Testergebnisse verbessern? Wie korreliert der s-HER-2/neu-Spiegel mit IHC and FISH? Gibt die s-HER-2/neu-Messung als “real time”-Analyse im Stadium IV zusätzliche Information zur HER-2/neu-Gewebetestung und ggf. eine höhere Therapiesicherheit?

Die demographischen Angaben der 30 Patientinnen sind in Tabelle 28 aufgeführt. Ungefähr die Hälfte aller Frauen waren entweder ER- oder PR-positiv. Die Mehrzahl war postmenopausal und bot eine weitgehend viszerale Erkrankung. Das FISH-Ergebnis wurde für alle anderen HER-2/neu-Ergebnisse als Referenzmethode gewählt. Tabelle 29 zeigt die Übereinstimmung der FISH-Ergebnisse und der konventionell befundeten IHC-Schnitte (83,6%) sowie die Konkordanz der FISH-Ergebnisse und der computerisiert befundeten IHC-Schnitte (88,5%). Die Korrelation zwischen den unstandardisierten IHC-Techniken und den anderen Nachweismethoden war relativ schlecht mit einer Konkordanz von 73,8% zur FISH-Methodik und 80,3% zum HercepTest. Die beste Übereinstimmung von 95,1% ergab sich für den HercepTest in der konventionellen und der computerisierten Befundung.


[Seite 122↓]

Tabelle 28: Demographische Daten zu den Patientinnen in der HER-2/neu-Konkordanzanalyse

Parameter

Gesamt

 

 

 

n=30

(%)

Alter bei Erstdiagnose

 

Range

31-69

 

 

 

Mittelwert

50

 

Operation

modifiziert radikale Mastektomie

20

67%

 

brusterhaltend

9

30%

 

keine

 

1

3%

Histologie

invasiv duktal

 

25

83%

 

inflammatorisch

 

0

0

 

medullar

 

0

0

 

andere

 

5

17%

Tumorstadium

T

1-2

22

74%

 

 

3-4

7

23%

 

 

x

1

3%

 

N

0

5

17%

 

 

>1

24

80%

 

 

x

1

3%

 

M

0

25

83%

 

 

1

5

17%

Grading

G

1

1

3%

 

 

>2

25

84%

 

 

x

4

13%

Rezeptorstatus

ER oder PR positiv

 

14

47%

 

ER und PR negativ

 

9

30%

 

unbekannt

 

7

23%

Menopausenstatus

prämenopausal

 

6

20%

 

postmenopausal

 

24

80%

Alter bei s-HER-2/neu-

 

Range

35-71

 

Messung

 

Mittelwert

54

 

Metastasen zu

Anzahl beteiligter

1

11

37%

Studienbeginn

Organe

2

8

28%

 

 

>2

11

37%

 

Dominanz

Viszera

21

70%

 

 

Weichteile

8

27%

 

 

Knochen

1

3%

Vorangegangene

Adjuvante Chx

 

18

60%

 Chemotherapie

vor Erstlinientherapie

10

33%

 

vor Zweitlinientherapie

12

40%

 

vor Drittlinientherapie

8

27%

Vorangegangene

adjuvant

 

10

33%

Hormontherapie

palliativ

 

11

37%

Radiatio

adjuvant

 

7

23%

 

palliativ

 

11

37%


[Seite 123↓]

Tabelle 29: Konkordanz der FISH-Ergebnisse in Relation zu A: der manuellen Befundung des DAKO HercepTests (Konkordanz 83,6%); B: der computerisierten Befundung auf dem ACIS-System (Konkordanz 88,5%). Die beste Konkordanz ergibt sich zwischen der manuellen und der automatisierten Befundung in C (Konkordanz 95,1%).

A

FISH

DAKO

Positiv

(>4 Genkopien)

Negativ

Gesamt

Positiv (+2 oder +3)

8

4

12

Negativ

6

43

49

Gesamt

14

47

61

B

FISH

ACIS

Positiv

(>4 Genkopien)

Negativ

Gesamt

Positiv (>2,0)

12

3

15

Negativ

3

43

46

Gesamt

14

47

61

C

DAKO

ACIS

Positiv

(+2 oder +3)

Negativ

Gesamt

Positiv (>2,0)

12

3

15

Negativ

0

46

46

Gesamt

12

49

61

Die Ergebnisse der statistischen Berechnungen zu dieser Konkordanzanalyse mit Hilfe des Konkordanzkoeffizienten κ sind in Tabelle 30 zusammengefaßt. Die unstandardisierten IHC-Methoden stimmen nur moderat mit der standardisierten IHC oder der FISH überein, [Seite 124↓]was den gegenwärtigen klinischen Standard bestätigt. Der Konkordanzkoeffizienz κ wird für die automatisierte IHC im Vergleich zur FISH besser als beim Vergleich der konventionellen IHC-Befundung in Relation zur FISH, wobei die Konfidenzintervalle allerdings überlappen. Generell kann aber festgestellt werden, daß die manuelle Befundung durch den Pathologen und die automatisierte Evaluation auf dem ACIS-System sehr gut übereinstimmen.

Tabelle 30: Konkordanzkoeffizienten zu allen Vergleichen der HER-2/neu-Gewebeergebnisse mit unterschiedlichen Methoden und Befundungsansätzen (manuell versus computerisiert)

Methodenvergleich

Konkordanz (%)

Inter-pretation

Koeffizient κ

Konfidenz-intervall

p-Wert

DAKO versus un-standardisierte IHC

73,8

deutlich

0,42

0,21–0,63

0,00013

FISH versus un-standardisierte IHC

80,3

deutlich

0,57

0,37–0,76

<0,0001

FISH versus DAKO

83,6

deutlich

0,51

0,24–0,77

<0,0001

FISH versus ACIS

88,5

stark

0,68

0,46–0,90

<0,0001

ACIS versus DAKO

95,1

fast vollständig

0,85

0,70–1,00

<0,0001

Nach dieser Konkordanzanalyse zu den verschiedenen Gewebeergebnissen und Befundungsoptionen schlossen wir nun die s-HER-2/neu-Spiegel zum Zeitpunkt der Fernmetastasierung in die Betrachtung mit ein. Als Referenzbefund für den HER-2/neu-Gewebestatus wählten wir hierbei für jede Patientin das Ergebnis mit dem höchsten Score aus. Das zugehörige Material durfte sowohl vom Primärtumor als auch aus Lokalrezidiven oder Fernmetastasen stammen.

Serumergebnisse standen von 28 Frauen zur Verfügung. Der mediane s-HER-2/neu-Spiegel von FISH-positiven Patientinnen lag bei 67 ng/ml und war damit statistisch [Seite 125↓]signifikant höher als der mediane s-HER-2/neu-Spiegel von FISH-negativen Patientinnen mit 17 ng/ml (p=0,018; siehe Abbildung 35).

Abbildung 35: s-HER-2/neu-Spiegel von FISH-positiven Patientinnen im Vergleich zu FISH-negativen Patientinnen

Fast alle Patientinnen mit einem HER-2/neu-gewebepositiven Tumor zeigten auch einen erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel zum Zeitpunkt der Fernmetastasierung (siehe Tabelle 31). Ähnlich wie bei der Korrelation von HER-2/neu-Gewebestatus und s-HER-2/neu-Spiegel an den unter 5.9.1. beschriebenen Patientinnen fanden wir auch hier einen Anteil an non-sheddern von rund 20%.


[Seite 126↓]

Tabelle 31: Korrelation von HER-2/neu-Gewebestatus mit unterschiedlichen Nachweismethoden und s-HER-2/neu-Spiegel zum Zeitpunkt der Fernmetastasierung

A

FISH

Serum

Positiv

(>4 Genkopien)

Negativ

Gesamt

Positiv (>15 ng/ml)

7

14

21

Negativ

1

6

7

Gesamt

8

20

28

B

DAKO

Serum

Positiv

(+2 oder +3)

Negativ

Gesamt

Positiv (>15 ng/ml)

8

13

21

Negativ

2

5

7

Gesamt

10

18

28

C

ACIS

Serum

Positiv

(>2,0)

Negativ

Gesamt

Positiv (>15 ng/ml)

9

12

21

Negativ

2

5

7

Gesamt

11

17

28

Ungefähr zwei Drittel (14/20) der Patientinnen mit einem HER-2/neu-negativen Tumor zeigten einen erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel im Stadium der Fernmetastasierung. Dieser “Wechsel” des HER-2/neu-Status von einem negativen Primärtumor zur Serumpositivität [Seite 127↓]im Stadium IV war für alle Nachweismethoden im Gewebe im Vergleich zum Serum statistisch signifikant (FISH/Serum: p=0,001; DAKO/Serum: p=0,013; ACIS/Serum: p=0,007). Dies bedeutet, daß es für jede Gewebemethodik (FISH, HercepTest, ACIS) häufiger Wechsel von einem HER-2/neu-negativen Gewebeergebnis zu einem positiven s-HER-2/neu-Spiegel gab als umgekehrt. Es muß betont werden, daß die Daten in den Tabellen 29 und 31 nicht direkt vergleichbar sind. In Tabelle 29 wurde das gleiche Gewebe einzeitig mit 2 verschiedenen Methoden untersucht, während in Tabelle 31 zwei unterschiedliche Materialen zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen und auch anders bearbeitet wurden. Diskrepante Ergebnisse können hier also auf die Unterschiede bezüglich des Gewebes, der Bestimmungsmethode und der Abnahmezeitpunkte zurückzuführen sein. Dies schließt eine biologische Änderung des HER-2/neu-Status während des Fortschritts der Erkrankung ein.

In der Konkordanzanalyse kamen 2 quantitative Methoden zum Einsatz: die IHC-Befundung auf dem ACIS-System und die s-HER-2/neu-Messung. Wir setzten diese Ergebnisse für die FISH-positiven und die FISH-negativen Patientinnen zueinander in Bezug (siehe Abbildung 36). Es fielen 3 distinkte Gruppen auf: Die erste Gruppe clustert um die ACIS-Werte 0-1, entsprechend einem negativen HER-2/neu-Gewebestatus; die entsprechenden s-HER-2/neu-Konzentrationen reichen von 7-40 ng/ml. All diese Patientinnen sind FISH-negativ. Die gering erhöhten s-HER-2/neu-Konzentrationen könnten dabei eine Funktion der Tumorlast sein oder von einer HER-2/neu-Proteinexpression (z. B. +1) stammen, die noch nicht die Einstufung als HER-2/neu-positiv zuläßt. Andererseits kann eine Veränderung des HER-2/neu-Status im Erkrankungsverlauf nicht ausgeschlossen werden. Es ist fragwürdig, ob die Patientin mit dem ACIS-Score von 0 im Primärtumor und einem s-HER-2/neu-Spiegel von 127 ng/ml (8,5-fach über dem cut-off) eine HER-2/neu-negative, metastasierte Erkrankung hat.

Die zweite Untergruppe der Patientinnen gruppiert sich um den s-HER-2/neu-Grenzwert von 15 ng/ml. Es handelt sich um „non“- und „low-shedders“, also HER-2/neu-positive Patientinnen laut ACIS-Score und FISH, die nur wenig extrazelluläre Domaine von HER-2/neu in das Serum abgeben. Die Verteilung der dritten Subgruppe ähnelt einer Streuung um eine lineare Regressionsgerade, wobei die Anzahl an Patientinnen leider zu gering [Seite 128↓]war, eine separate Analyse der ACIS-positiven Patientinnen durchzuführen. Bei der linearen Regression über alle metrischen Ergebnisse ergab sich ein Korrelationkoeffizient von r=0,50 (CI: 0,1-0,9; p=0,007).

Abbildung 36: Explorative Analyse der metrischen ACIS-IHC-Scores und der s-HER-2/neu-Spiegel (Gruppen 1-3 sind im Text beschrieben)

Abschließend betrachteten wir die Patientinnen im einzelnen auf diskordante Ergebnisse. Bei 64,3% (18/28) der Patientinnen waren alle Gewebeergebnisse stimmig. Bei den übrigen 10/28 Frauen gab es diskrepante Resultate. Wäre das Gewebeergebnis mit dem höchsten HER-2/neu-Score repräsentativ, würde ein erhöhter s-HER-2/neu-Spiegel bei 8/10 dieser Patientinnen die Diagnose der HER-2/neu-Positivität stützen. Tabelle 32 zeigt 15 Beispiele mit allen Geweben und Untersuchungsmethoden, die meistens klar für


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Tabelle 32: Beispiele für Patientinnen aus der HER-2/neu-Konkordanzanalyse mit allen untersuchten Materialien in allen Methoden. Die Farben sollen graphisch darstellen, daß HER-2/neu semiquantitativ befundet wird, obwohl eine nicht-dichotome Expression zugrunde liegt.


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eine HER-2/neu-Negativität (Patientin 40SD) oder Positivität (Patientin 44KH; siehe auch Abbildung 37) sprechen. Bei manchen Patientinnen mit ausschließlich negativen Gewebeergebnissen und einem gering erhöhten s-HER-2/neu-Spiegel bei Fernmetastasierung (Patientin 08BK) ist dieser am ehesten eine Funktion der Tumorlast. Es gibt aber auch Übergangssituationen (Patientinnen 49SI und 34RB), bei denen der gering erhöhte s-HER-2/neu-Spiegel auf eine geringe HER-2/neu-Expression hinweist, welche die Diagnose der HER-2/neu-Positivität nicht erlaubt.

Abbildung 37: FISH und IHC von Primärtumor (A) und regionärer LK-Metastase (B) der Patientin 44KH. Alle Ergebnisse sind eindeutig HER-2/neu-positiv. Der Serumspiegel bei Fernmetastasierung lag bei 142 ng/ml.


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Einige Patientinnen zeigten zwischen unterschiedlichen Paraffinblöcken des gleichen Organs bzw. Gewebes bei gleicher Untersuchungsmethode unterschiedliche Ergebnisse (Patientinnen 15HE und 26LR; siehe auch Abbildung 38). Diese Metastasen waren zueinander heterogen; der DAKO-Score wurde einmal als negativ, bei der benachbarten Metastase als positiv befundet. In beiden Fällen war der Serumspiegel von HER-2/neu erhöht.

Abbildung 38: Weichteilmetastasen (FISH und IHC) der Patientin 15HE. Die IHC in A ist mit dem HercepTest mit 0 befundet, die danebenliegende Metastase in B mit einem Score von +2. Der s-HER-2/neu-Spiegel lag bei 16 ng/ml.


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Ein ähnlicher Befund wurde auch bei der Patientin 13GI erhoben (siehe Abbildung 39). Der Unterschied bestand nur darin, daß beide abgebildeten Schnitte aus dem gleichen Tumorblock stammten. Interessanterweise war auch das gesunde Gewebe HER-2/neu-positiv, was die Befundung beeinträchtigt haben könnte. Wieder andere Patientinnen zeigten diskrepante Ergebnisse in der HER-2/neu-Expression zwischen dem Primärtumor und seinen regionären Lymphknotenmetastasen (Patientinnen 33PG und 38TH), wobei die computerisierte IHC-Befundung die Ergebnisse des Pathologen nach konventioneller Befundung nicht immer bestätigt hatte.

Abbildung 39: Primärtumor der Patientin 13GI: Während der Paraffinschnitt in A als IHC-negativ eingestuft wurde, lag der Score in B bei +2. Grundsätzlich wurden beide Ergebnisse auf dem ACIS-System bestätigt. Die FISH-Untersuchung war für beide Schnitte negativ. Das präexistierende gesunde Drüsengewebe in C zeigt ebenfalls eine HER-2/neu-Expression.


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Es muß berücksichtigt werden, daß oft kein Tumorblock mehr verfügbar ist, aus dem sich die HER-2/neu-Überexpression bestimmen lassen könnte. Oft muß man auf ungenügendes Tumormaterial zurückgreifen. Betrachtet man die Ergebnisse aus Tabelle 32 ex post und nimmt hypothetisch nur ein Gewebeergebnis als Kriterium für die Entscheidung für oder gegen eine Herceptin-Therapie in der metastasierten Situation, so sieht man, daß dies klinisch relevant häufig zu einer falschen Entscheidung geführt hätte. Eine Berücksichtigung des s-HER-2/neu-Spiegels kann also insbesondere bei erschwerter Diagnostik am Primärtumor eine gute Ergänzung zur Bestimmung des HER-2/neu-Status sein. Es bleibt aber abschließend festzustellen, daß in rund 70% der Fälle alle HER-2/neu-Ergebnisse übereinstimmten. Die Gewebediagnostik für HER-2/neu muß also für die Mehrheit der Patientinnen als sicher angesehen werden.


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06.02.2004