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4  In vitro Versuche zur Hemmung der Proliferation von Kaninchenendothelzellen durch Thalidomid

Die Wirkung von Thalidomid auf Endothezellen wird in der Literatur unterschiedlich bewertet. Thalidomid hemmt in vitro die bFGF (basic Fibrolast Growth Factor) und VEGF induzierte Angioneogenese im Kaninchen Korneamodell {130}. Jedoch gelang es im Gegensatz dazu Vesela und Mitarbeitern nicht, eine Hemmung von bFGF induzierter Angioneogenese im Hühnereiallantoismodell nachzuweisen {128}. In einer anderen Studie, die von Gutman und Mitarbeitern an Mäusen, denen B16 F-10 Melanomzellen subkutan implantiert worden waren, durchgeführt wurde, gelang eine Hemmung des Melanomwachstums durch Thalidomid nicht {80}. Bauer et al. konnten nachweisen, daß eine Hemmung von humanem Endothelzellwachstum durch Thalidomid nach oraler Verabreichung nur speziesspezifisch gelingt {129}. Diese Arbeitsgruppe sah nur eine in-vitro Proliferationshemmung von humanen aortalen Endothelzellen durch Thalidomid, wenn die Endothelzellen mit menschlichen oder Kaninchenlebermikrosomen koinkubiert worden waren. Bei Ratten- bzw. Mäusemikrosomen hingegen konnte kein inhibitorischer Effekt nachgewiesen werden. Sie schlußfolgerten, daß eine metabolische Aktivierung durch Thalidomid notwendig sei, um die antiangioneogenetischen Effekte von Thalidomid nachzuweisen.

Aufgrund dieser wiedersprüchlichen Berichte aus der Literatur untersuchten wir deshalb die Wirkung von Thalidomid auf Kaninchenendothelzellen in-vitro. Um die Wirkung von metabolisiertem und nicht metabolisiertem Thalidomid auf Kaninchenendothelzellen zu untersuchen, wurde der folgende in-vitro Proliferationsassay durchgeführt.


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4.1  Material und Methoden

Nach erteilter Genehmigung durch das Landesamt für Gesundheitsschutz und technische Sicherheit des Senats von Berlin wurden 6 weibliche New Zealand White Kaninchen (Charles River Wiga Ansbach, Deutschland) mit einem Gewicht von 2.5 bis 3 kg in der tierexperimentellen Abteilung der Klinik für Allgemein-, Visceral-, Gefäß- und Thoraxchirurgie der Charité, Campus Mitte unter Standardbedingungen bei Futter und Wasser ad libitum gehalten. Nach einer Akkomodationszeit von einer Woche wurde 3 Tieren eine Medikation von 50mg/kg KG Thalidomid einml täglich oral per Knopfkanüle verabreicht. 3 Tiere dienten als Kontrollgruppe. Thalidomid wurde durch die Firma Grünenthal (Grünenthal AG, Aachen Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die Tiere wurden täglich gewogen, die Körpertemperatur gemessen und auf ihren Aktivitätsstatus untersucht. Nach 1 weiteren Woche wurden die Tiere mit einer Ketanest Rompun Narkose betäubt (im. Injektion von Ketaminhydrochlorid (50 mg/kg Hoechst AG, Frankfurt/Main, Deutschland und Xylazin (5 mg/kg Bernburg AG, Bernburg, Deutschland). In Rückenlage erfolgte die Desinfektion mit Betaisodona und die sterile Abdeckung des Abdomens unter OP-Bedingungen. Nach einer 5cm langen Laparotomie erfolgte zunächst die Entnahme von 40 ml Blut aus der Vena cava inferior durch Punktion mit einer sterilen Kanüle. Danach wurde die V. Cava inferior bis zum Diaphragma disseziert und unter Klemmen reseziert. Das entnommene Veneresektat wurde in PBS Pufferlösung plaziert. Danach wurden die Tiere durch Injektion einer hypertonen Kaliumchloridlösung getötet.

Die Weiterverarbeitung des autologen Kaninchenvollbluts erfolgte durch Zentrifugieren bei 3000 U/min, Hitze induzierter Inaktivierung und steriler Filtration des Überstandes. Zur Isolierung der Kaninchenendothelzellen aus dem Venenresektat wurde dies


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zunächst für 15 Minuten mit Collagenase P (1 U/ml, (Boehringer, Mannheim, Deutschland) inkubiert. Sodann wurden die Endothelzellen vorsichtig von der Intima der Venenwand gelöst. Isolierte Zellen einer Vene wurden in vier identische Teile aufgeteilt und auf unbeschichteten Multiwellplatten inkubiert.

Die Testung der Proliferationshemmung der in Kultur befindlichen Kaninchenendothelzellen wurde mit vier verschiedenen Testmedien in Zusammenarbeit mit der Firma Cell Lining ® (Rudower Chaussee 29, 12489 Berlin) durchgeführt. (Darstellung des Versuchsablaufs in Abb. 11)

Abbildung 11: Versuchsablauf zur Überprüfung der Wirkung von Thalidomid auf Kaninchen-Endothelzellen (NZW= New Zealnd White Kaninchen, FCS= Fetales Kälber Serum, Serum= Kaninchenserum ohne Thalidomid, Serum + T= Kaninchenserum mit Thalidomid, PDT= Population Doubling Time, PDL= Population Doubling Level)


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Als Basismedium diente Dulbecco´s modifiziertes Eagle´s medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) supplementiert mit 4 mM L-Glutamin (Biochrom, Berlin, Deutschland), 100 U/100 µg /ml Penicillin/Streptomycin, 0,05 µg/ml Amphotericin B (Biochrom, Berlin, Deutschland), 50 U/ml Heparin (Biochrom, Berlin, Deutschland).

Zusätzlich zu diesem Medium erhielt die erste Testserie

Alle Versuche wurden wiederholt durchgeführt.

In einem zweiten Teil des Experiments wurden zuvor mit metabolisiertem Thalidomid in Kaninchenserum inkubierte Kaninchenendothelzellen mit 10 % igem FCS (Biochrom, Berlin, Deutschland) ohne Thalidomid inkubiert, um die Reversibilität der Proliferationshemmung durch das Medikament zu untersuchen.

Die Zellidentität wurde in situ durch Immunhistochemische Färbung mit von Willebrand/Factor VIII (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) mittels des EnVisionTM AP Detektionssystem (Dako, Hamburg, Deutschland) nachgewiesen. Mikroskopisch wurde die typische kopfsteinpflasterartige Anordnung in konfluenter Monolayerschicht in der Kulturschale überprüft. Die Kulturen wurden regelmäßig auf Kontamination mit Mycoplasmen und anderen Bakterien durch einen Fluoreszenzkit (Biochrom, Berlin, Deutschland) untersucht.

Bevor die Zellen komplett konfluierten, wurden sie trypsinisiert, ausgewaschen, geteilt und erneut ausgesäht. Die Zellzahl und Viabilität wurde mittels eines elektronischen Zellzählsystems (Casy Counter® ,Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) bei


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jeder Zellpassage erfasst und in eine Excel Datenbank (Microsoft Windows 98®) eingegeben. Bei jeder Passage wurden die Zellen mikroskopisch untersucht und Photodokumentationen der Kulturen erstellt. Diese Methoden sind in der Firma Cell Lining® etabliert und anerkannte Methoden zur Untersuchung der Endothelzellproliferation {52}. Um die Proliferationsaktivität der Kaninchenendothelzellen in den unterschiedlichen Kulturmedien vergleichen zu können, wurden der Population doubling level (PDL) und die Population doubling time (PDT) kalkuliert. Für die Berechnung des PDL (population doubling level, Generationszahl) und der PDT (population doubling time, Verdopplungszeit) wurden folgende Annahmen getroffen. Die Primärzellen vermehren sich durch exponentielles Wachstum. Ausgehend von einer einfachen Teilung der Mutterzelle in zwei Tochterzellen ergeben sich aus einer Ausgangszellzahl von N o Zellen nach n Teilungen N Zellen. Mathematisch ergibt sich daraus

N=No 7 2n. Hieraus folgt nach Umformung

lg N = lg No + n 7 lg 2.

Der PDL berechnet sich demnach als

n = PDL = (lg N - lg No) / lg 2

Die für einen Teilungszyklus benötigte Verdopplungszeit berechnet sich demnach

als

PDT [h] = t [h] / PDL

Hierbei ist t die Zeitdauer zwischen den Messungen der Ausgangszellzahl No und der Endzellzahl N.

Die statistische Auswertung wurde mit dem SAS 8.0® System für Windows 98® durchgeführt. Die Werte wurden auf ihre Normalverteilung mit dem Spearman´s log rank Korrelationstest überprüft. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann Whitney U test oder T-test für kontinuierliche Daten erfasst. P Werte kleiner als 0.05 wurden als signifikant angesehen.


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4.2  Ergebnisse

Alle Tiere tolerierten die Versuchsmedikation gut. Es traten bei keinem Tier Fieber oder Gewichtsverlust von mehr als 10 Gramm auf. Die Venenentnahme war unkompliziert. Die Isolation der Kaninchenendothelzellen aus den Venensegmenten führte zu einer vergleichbaren Anzahl von Zellen bei allen 6 Tieren. (zwischen 81.000 bis 129.000 Zellen mit einer Zellvitalität von 70-88 %).

Zellzählung Die Zellen der Gruppe 1 proliferierten in 12 Tagen zu einem Medianwert von 212.000 (Range 190.100-234.100) (Abb 12). Eine deutliche Proliferationshemmung war in Gruppe 3 zu erkennen mit einer medianen Zellzahl von 21.500 (Range 13.000-26.500) am 12. Tag.

Abbildung 12: Kaninchenendothelzellproliferation unter verschiedenen Testseren. Unter Fetalem Kälber Serum (FCS), mit normalem Kaninchenserum (S), sowie mit reinem nicht metabolisiertem Thalidomid (P) kam es zu keiner Proliferationshemmung. Im Gegensatz dazu führte der Zusatz von metabolisiertem Thalidomid (T) zu einer deutlichen Proliferationshemmung (p<0,001).


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Die Zellen, die mit normalem Kaninchenserum ohne Thalidomid (S) inkubiert wurden, wiesen die gleichen Wachstumscharakteristika wie die Kontrollzellen auf. Reines, nicht durch Kaninchen metabolisiertes Thalidomid hatte keinen inhibierenden Effekt auf die Proliferationsrate der Kaninchenendothelzellen.

Population doubling level (PDL). Die Anzahl der Zellgenerationen in einer gegebenen Zeit wies in den 3tägigen Intervallen eine große Variationsbreite auf.. In Gruppe 1 stieg der PDL von 1.5 (Median, Range 1,3 - 1,7) am 3. Tag auf Werte von 4.5 (Range 4,0 - 5,2) am 12. Tag an. Der PDL in Gruppe 3 variierte von -0,7 am dritten Tag auf 0,8 am zwölften Tag. In den Gruppen 2 und 4 zeigten sich wie bei den Proliferationszellzahlen ähnliche Ergebnisse wie in Gruppe 1.


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Population doubling time (PDT).

Die Verdopplungszeiten der kultivierten Zellen stieg in Gruppe drei von 61h am dritten Tag auf 272 h am zwölften Tag an (Abb. 13). Bei den anderen Gruppen war eine Verminderung der PDT zwischen 60 h am dritten Tag bis hin zu 38 h am 12. Tag zu beobachten.

Abbildung 13: Kaninchenendothelzellproliferationzeit unter verschiedenen Testseren. Im Gegensatz zu Fetalem Kälber Serum (FCS), normalem Kaninchenserum (S) und reinem Thalidomid (P) dazu führte der Zusatz von metabolisiertem Thalidomid (T) zu einer deutlichen Verlängerung der Zeit bis zur Verdopplung einer Generation (PDT)(p<0,001, Vergleich FCS vs T).


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Abbildung 14: Normal konfigurierte Kaninchenendothelzellen nach 12 tägiger Kultivierung in FCS (Fetales Kälber Serum). Erkennbar das typische Kopfsteinpflastermuster und die ovaläre Zellform mit normaler Zellarchitektur (200 fache Vergrößerung Lichtmikroskop).

Zellviabilität und mikroskopische Beurteilung der Endothelzellkulturen.

Die morphologischen Veränderungen unter den verschiedenen in-vitro Therapieformen sind in Abbildung 14 und 15 dargestellt. Während die mit FCS unter Standardbedingungen kultivierten Zellen (Abb. 14) nach 12 Tagen ein typisches Konfluenzmuster aufwiesen und ein sogenanntes Kopfsteinpflasterrelief in der Kulturschale bildeten, zeigte sich in der Kultur der mit metabolisiertem Thalidomid behandelten Zellen ein grundlegend anderes Bild (Abb 15). Die Zellen waren deutlich in Ihrer Anzahl vermindert (siehe PDT und PDL). Sie lagerten sich nicht zu konfluierenden Gruppen aneinander und wiesen Atypien in der Zellmorphologie auf. Sie hatten die


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Fähigkeit zur Adherenz teilweise verloren und bildeten nicht die für Endothelzellkulturen typischen Zellverbände. Die Zellen der Grupen 2 und 4 zeigten das Gleiche Konfluenzverhalten wie die Zellen der FCS-Gruppe (nicht abgebildet).

Zusammenfassend führte die Behandlung von Kaninchenendothelzellen in-vitro mit metabolisiertem Thalidomid über 12 Tage zu einer reduzierten Proliferationsrate, einer verlängerten Verdoppelungszeit sowie einer verlängerten Proliferationszeit im

Abbildung 15: Irregulär konfigurierte Kaninchenendothelzellen nach 12 tägiger Kultivierung unter Zusatz von metabolisiertem Thalidomid. Erkennbar die Zellkernatypien, fehlendes Kopfsteinpfasterrelief und irreguläre Zellmorphologie (200 fache Vergrößerung Lichtmikroskop).


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Vergleich zu einer mit FCS behandelten Kaninchenendothelzellkultur. Die Gabe von normalem Kaninchenserum sowie von reinem Thalidomid hatte keinen signifikanten Einfluß auf das Proliferationsverhalten, die Verdopplungsanzahl der Zellgenerationen sowie auf die Verdopplungszeit.

Zellen, die vom 1. bis zum 6. Tag mit metabolisiertem Thalidomid behandelt wurden und dann weiter mit FCS inkubiert wurden, zeigten wieder eine ansteigende Proliferationsrate. Die Zellzahlen stiegen von 16500 (Range 13800-18000) Zellen auf 185000 Zellen (Range 175300-198650). Sie wiesen nach 15 Tagen (also 9 Tage nach dem Umsteigen von metabolisiertem Thalidomid auf FCS wieder ein endothelzelltypisches Konfluenzmuster mit Kopfsteinpflasterrelief auf.


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4.3  Diskussion

Eine Studie der Literatur zeigt unterschiedliche Ergebnisse der einzelnen Arbeitsgruppen zur Aktivität von Thalidomid auf Endothelzellen in-vitro. Während D`Amato et al. keinen Unterschied der Endothelzellproliferation im Chorionallantois-Modell sahen, konnten Moreira und Mitarbeiter sowohl für Thalidomid als auch für ein Strukturanalogon eine in-vitro Hemmung der Endothelzellproliferation beweisen {64,130,132}. Bauer und Mitarbeiter berichteten über die Notwendigkeit der metabolischen Aktivierung von Thalidomid zur Entfaltung antiangiogenetischer Eigenschaften {129}. Nach den überzeugenden Arbeiten dieser Arbeitsgruppe kann als gesichert gelten, daß das Medikament nur in Tierversuchen verläßlich eingesetzt werden kann, wenn diese Tiere den Wirkstoff auch metabolisieren können {129}. Dieses ist lediglich bei Tieren die entwicklungsgeschichtlich höher entwickelt sind als Mäuse oder Ratten der Fall. Obwohl in den letzten 30 Jahren mehr als dreissig Hypothesen über den Wirkungsmechansimus von Thalidomid veröffentlicht wurden, hat sich bisher keine Hypothese als bewiesen durchgesetzt. Es ist ebenso bis heute ungeklärt welcher der Metabolite des Thalidomid für die teratogene Wirkung des Medikaments verantwortlich ist. Nach oraler Aufnahme kann die Hydroxylierung der Substanz an zwei Stellen im Glutaramid und im Phtalimidring erfolgen und so zur Bildung von 5 primären Metaboliten führen. (4-OH-thalidomid, 3-OH-thalidomid, 3`-OH-thalidomid, 4`-OH-thalidomid, 5`-OH-thalidomid). Diese hydroxylierten Metaboliten konnten sämtlich im Kaninchenmodell nach oraler Gabe von Thalidomid im Serum identifiziert werden {131}. Das Kaninchen ist für die teratogene Wirkung von Thalidomid sensibel. Der weitere Abbau von Thalidomid führt zu intermediären Zwischenprodukten wie zB. Arenen und Epoxiden, die von verschiedenen Autoren als ursächlich für die


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teratogene Wirkung der Substanz angesehen wurden {133,134,135}. Jedoch konnten Arene und Epoxidverbindungen im Kaninchenserum nach oraler Administration von Thalidomid bisher nicht nachgewiesen werden {134}.

Neben der antiangiogenetischen Wirkung von Thalidomid wurden Wirkungen des Medikaments auf zelluläre und immunologische Funktionen des Organismus beschrieben. Stephens und Mitarbeiter bewiesen einen inhibitorischen Effekt von Thalidomid auf die Förderung der αυβ3 Integrin Expression durch Insulin-like growth factor I (IGF-I) und Fibroblast growth factor II (FGF-II) {135}.

Endothelzellen sind Zielorgan von Thalidomidmetaboliten. Bereits 1960 berichteten Miller et al. über eine Veränderung der vaskulären Permeabilität durch Thalidomid in einem Kleintiermodell {133}. Nogueira und Mitarbeiter sahen eine Reduktion der Expression von ICAM-1 von mit TNF-α oder IL1-β stimulierten HUVEC-Zellen nach der Inkubation und Thalidomid {134}. Die Formationsanomalien der in-vitro

Endothelzellkulturen sowie die beobachteten Zellatypien mit einer reduzierten Gesamtanzahl an Endothelzellen in-vitro könnten sich klinisch in einer verminderten Angiogenese, sowie Gefäßmalformationen und konsekutiven Organmissbildungen - wie sie unter der Einnahme von Thalidomid durch schwangere Frauen bei der Thalidomidembryopathie beschrieben wurden – widerspiegeln.

Die dargestellten Untersuchungsergebnisse zeigen erstmals eine direkte inhibitorische Wirkung von metabolisiertem Thalidomid auf die Proliferationsrate von Kaninchenendothelzellen in vitro. Diese Wirkung von Thalidomid konnte bisher weder in-vitro bei Endothelzellen anderer Spezies noch in-vivo nachgewiesen werden. Die herabgesetzte α vβ3 Integrinexpression auf Endothelzellen nach der Inkubation mit metabolisiertem Thalidomid könnte eine der Ursachen für das gestörte


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Anlagerungsverhalten der untersuchten Zellen in den eigenen in-vitro Versuchen sein {135}. Eine andere Erklärung für die reduzierte Proliferationsrate könnte in dem von Parman und Mitarbeitern 1999 beschriebenen Effekt begründet sein, daß ein Metabolit des Thalidomid zu einer Oxydierung der Endothelzell-DNA an Position 8 der DNA zu einer erleichterten Intercalation von Thalidomid an dieser Stelle führen könnte {136}.

Die Ergebnisse der Studie zeigen erstmalig einen direkten inhibitorischen Effekt von metabolisisertem Thalidomid auf die Proliferationsrate von Kaninchenendothelzellen. Sollte sich dieser Effekt potentiell auch auf Tumorendothelzellen übertragen lassen, scheint eine Anwendung von Thalidomid als Angiogenesehemmer möglich und auch in-vivo vorstellbar. Die Effekte des Medikaments müssen jedoch nicht nur an Endothelzellen untersucht werden, sondern auch im Hinblick auf etablierte Therapieformen überprüft werden.

So muß zB vor der intraoperativen, intraperitonealen Anwendung von Thalidomid nach chirurgischer Intervention im Gastrointestinaltrakt eine Gefährdung des Operationsergebnisses ausgeschlossen werden. Keinesfalls darf die Morbidität oder Mortalität nach kolorektalen Resektionen durch die additive Gabe von intraperitonealem Thalidomid erhöht werden, da dies auch durch einen eventuellen antiangioneogenetischen Benefit nicht zu rechtfertigen wäre. Somit sollte in den folgenden Untersuchungen der Effekt von intraperitoneal appliziertem Thalidomid unmittelbar nach Anlage einer Dickdarmanastomose im Kaninchentiermodell überprüft werden. Vorher wird auf für die Angioneogenese der Anastomosenheilung wichtige Grundlagen eingegangen.


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05.02.2004