In-vitro, in-vivo und klinische Untersuchungen zur Wirksamkeit des Angioneogenesehemmers Thalidomid

Habilitationsschrift

Zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach
Chirurgie

vorgelegt dem Fakultätsrat
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Herrn Dr. med. Julian W. Mall
geboren am 29. August 1967 in Homburg/Saar

Präsident: Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Eingereicht: Januar/2003,

Habilitation am 13.11.03

Gutachter:
1. Professor Dr. med. JM Müller
2. Professor Dr. med. H-D. Saeger
3. Professor Dr. med. H. Ostertag

„Aufgrund meiner klinischen und histologischen Beobachtungen stelle ich fest, daß bösartige Tumore häufig durch eine deutlich erhöhte peritumoröse Gefäßvaskularisierung gekennzeichnet sind. Eine große Bedeutung haben Endothelzellen, die in der Lage sind Tumorzellen und Zellen des Immunsystems miteinander kommunizieren zu lassen.“

E. Metchnikoff (russ. Arzt und Physiologe, Nobelpreisträger 1908) {234}

Kaninchenkorneamodell zur Untersuchung der Angioneogenese:. Zentral eine avaskuläre Zone nach Einbringen des Angiogenesehemmers Thalidomid {D Ámato et al.; 130}.

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Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Angioneogenese
  • 1.2  Prognostische Bedeutung der Angioneogenese bei Karzinomen
  • 1.3  Angioneogeneseinhibitoren
  • 1.4  Thalidomid
  • 1.5  Thalidomid und Karzinomtherapie
  • 1.6  Unerwünschte Wirkungen von Thalidomid
• 2  Ziele der Arbeit
  • 2.1 Rationale für eine antiangioneogenetische Therapie mit Thalidomid
    • 2.1.1  Prospektiv randomisierte Placebo kontrollierte Doppel-blind Studie zur Verlängerung der Überlebenszeit durch die additive Gabe von Thalidomid zur Kombinationschemotherapie beim kleinzelligen Bronchialkarzinom
    • 2.1.2  In vitro Untersuchungen zur Proliferationshemmung von Kaninchenendothelzellen durch Thalidomid
    • 2.1.3  Untersuchungen der Wirkung von intraperitoneal appliziertem Thalidomid nach Kolonresektion im Kaninchentiermodell
    • 2.1.4  Hypothesen der Monographie
• 3  Prospektiv randomisierte Placebo-kontrollierte Studie zur Verlängerung der Überlebenszeit durch die additive Gabe von Thalidomid zur Kombinationschemotherapie beim kleinzelligen Bronchialkarzinom
  • 3.1 Art der Studie
  • 3.2 Zielkriterien
    • 3.2.1 Stadieneinteilung
    • 3.2.2 Therapie
    • 3.2.3  Prognose
  • 3.3  Material und Methoden
    • 3.3.1  Studienablauf
    • 3.3.2  Ein- und Ausschlußkriterien der Studie
    • 3.3.3  Untersuchung von TNF -α, VEGF, NSE, Albumin und LDH
    • 3.3.4  Stichprobenumfang
  • 3.4  Ergebnisse
    • 3.4.1 Krankengut
    • 3.4.2 Vergleichbarkeit der untersuchten Grupen
    • 3.4.3 Analyse des Hauptzielkriteriums Überlebenszeit
    • 3.4.4  Nebenzielkriterien (Tumorstadien, Korrelation der Surrogatparameter Albumin, LDH, NSE, VEGF)
    • 3.4.5  Nebenwirkungen der Chemotherapie mit ACO 1 und additiver Thalidomidgabe
  • 3.5  Diskussion
• 4  In vitro Versuche zur Hemmung der Proliferation von Kaninchenendothelzellen durch Thalidomid
  • 4.1  Material und Methoden
  • 4.2  Ergebnisse
  • 4.3  Diskussion
• 5  Grundlagen der Anastomosenheilung
• 6  Prospektiv randomisierte Studie zur Untersuchung des Einfluß von i.p. appliziertem Thalidomid auf die Heilung von Kolonanastomosen im Kaninchentiermodell
  • 6.1 Material und Methoden
    • 6.1.1 Operationsablauf
    • 6.1.2 Dosierung von Thalidomid
    • 6.1.3 Untersuchung des Berstungsdrucks
    • 6.1.4  Immunhistochemische Aufarbeitung der Anastomosenpräparate
  • 6.2  Ergebnisse
    • 6.2.1 Gewicht
    • 6.2.2 Berstungsdruckmessung
    • 6.2.3 Angioneogenesescore (AS)
    • 6.2.4  Mib-1 (VAS)
    • 6.2.5  Untersuchung der Leukozytenkonzentration im peripheren Blut
    • 6.2.6 Untersuchung der Hämoglobingehalts
    • 6.2.7  Thrombozyten
    • 6.2.8  Adhäsionsscore
    • 6.2.9  TNF- alpha Konzentration im Serum
  • 6.3  Diskussion
• 7  Gesamtdiskussion
• 8  Zusammenfassung
• 9  Schlußfolgerung
• 10  Ausblick
• Danksagung
• Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Versicherung

Tabellen

• Tabelle 1: Mediatoren der Angiogenese
• Tabelle 2: Vorläuferproteine und endogene Inhibitoren der Angiogenese
• Tabelle 3: Einsatz unterschiedlicher Angioneogeneseinhibitoren in klinischen Studien
• Tabelle 4: Immunomodulatorische und anti-inflammatorische Wirkungen von Thalidomid.
• Tabelle 5: Klinische Studien zur Untersuchung der Verlängerung der Überlebenszeit bei unterschiedlichen Karzinomen nach additiver Thalidomidgabe.
• Tabelle 6: Marburger Klassifikation des kleinzelligen Bronchialkarzinom nach Wolf und Havemann.
• Tabelle 7: Ausschlußkriterien für die additive Gabe von Thalidomid bei kleinzelligem BroCa.
• Tabelle 9: Verteilung der Tumormarker VEGF, NSE, LDH und Albumin bei unterschiedlichen Tumorstadien (Marburger Klassifikation).
• Tabelle 10: Nebenwirkungen der additiven Thalidomidtherapie bei 34 Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom.
• Tabelle 11: Nebenwirkungen in der Plazebogruppe bei 36 Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom.
• Tabelle 12: Unterschiedliche Studienergebnisse zur Beziehung zwischen Angiogenesescore und Prognose bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom.
• Tabelle 13: Voraussetzungen einer ungestörten Heilung von Darmanastomosen.
• Tabelle 14: Nachweis disseminierter Tumorzellen im Knochenmark, Blut und Lymphknoten bei gastrointestinalen Karzinomen (GÜ= Gesamtüberlebenszeit vermindert, RFZ= rezidiv freie Zeit vermindert, K. A.= Keine Aussage in der Studie, K. E.= Kein Einfluß auf die Prognose).
• Tabelle 14: Radikalität der chirurgischen Therapie in Abhängigkeit der Tumorzelldissemination zum Zeitpunkt der Operation.

Bilder

• Abbildung 1: Studienablauf der prospektiv randomisierten Doppelblind Studie Thalidomid in der additiven Therapie des kleinzelligen Bronchialkarzinoms.
• Abbildung 3: Überlebenszeit aller Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom ohne Berücksichtigung der Todesursache in der prospektiv-randomisierten Studie zur additiven Wirksamkeit der Thalidomid-Therapie (p=0,13 Kaplan-Meyer Analyse).
• Abbildung 4: Tumorbezogene Überlebenszeit der Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom der prospektiv-randomisierten Studie zur additiven Wirksamkeit der Thalidomid-Therapie (Thalidomid n=34, Plazebo n=36, p=0,03 Kaplan-Meyer Analyse).
• Abbildung 5: Korrelation der VEGF Konzentration im Serum mit den Tumorstadien (Marburger Klassifikation: VLD – ED III)
• Abbildung 6: Signifikanter Unterschied der VEGF Konzentration im Serum zwischen nichtmetastasierten und metastasierten Stadien der Erkrankung (p<0,001).
• Abbildung 10: Korrelationskoeffizient von VEGF und NSE bei 70 Patienten mit kleinzelligem Bronchialkarzinom.
• Abbildung 11: Versuchsablauf zur Überprüfung der Wirkung von Thalidomid auf Kaninchen-Endothelzellen (NZW= New Zealnd White Kaninchen, FCS= Fetales Kälber Serum, Serum= Kaninchenserum ohne Thalidomid, Serum + T= Kaninchenserum mit Thalidomid, PDT= Population Doubling Time, PDL= Population Doubling Level)
• Abbildung 12: Kaninchenendothelzellproliferation unter verschiedenen Testseren. Unter Fetalem Kälber Serum (FCS), mit normalem Kaninchenserum (S), sowie mit reinem nicht metabolisiertem Thalidomid (P) kam es zu keiner Proliferationshemmung. Im Gegensatz dazu führte der Zusatz von metabolisiertem Thalidomid (T) zu einer deutlichen Proliferationshemmung (p<0,001).
• Abbildung 13: Kaninchenendothelzellproliferationzeit unter verschiedenen Testseren. Im Gegensatz zu Fetalem Kälber Serum (FCS), normalem Kaninchenserum (S) und reinem Thalidomid (P) dazu führte der Zusatz von metabolisiertem Thalidomid (T) zu einer deutlichen Verlängerung der Zeit bis zur Verdopplung einer Generation (PDT)(p<0,001, Vergleich FCS vs T).
• Abbildung 14: Normal konfigurierte Kaninchenendothelzellen nach 12 tägiger Kultivierung in FCS (Fetales Kälber Serum). Erkennbar das typische Kopfsteinpflastermuster und die ovaläre Zellform mit normaler Zellarchitektur (200 fache Vergrößerung Lichtmikroskop).
• Abbildung 15: Irregulär konfigurierte Kaninchenendothelzellen nach 12 tägiger Kultivierung unter Zusatz von metabolisiertem Thalidomid. Erkennbar die Zellkernatypien, fehlendes Kopfsteinpfasterrelief und irreguläre Zellmorphologie (200 fache Vergrößerung Lichtmikroskop).
• Abbildung 16: Versuchsaufbau zur Untersuchung der intraperitonealen Wirkung von Thalidomid nach Zökumresektion im Kaninchenmodell.
• Abbildung 17: Kein signifikanter Unterschied in der Gewichtsveränderung am 3. und 7. pop. Tag bei 40 NZW Kaninchen nach Zökumteilresektion und Reanastomosierung.
• Abbildung 18: Kein signifikanter Berstungsdruckunterschied am 3. und 7. postop. Tag bei 40 NZW Kaninchen nach Anastomosenentnahme (p>0,05).
• Abbildung 19: Signifikanter Unterschied des Angiogenesescore in der Anastomosenregion nach Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein am 3. postop Tag (p<0,01). Kein signifikanter Unterschied am 7. postop. Tag.
• Abbildung 20: Immunhistochemische Darstellung der Gefäße in der Anastomosenregion in der Mukosa und Submukosa nach Thalidomidtherapie am 7. postop. Tag bei NZW Kaninchen (200 fache Vergrößerung, Lichtmikroskopie).
• Abbildung 21: Kein signifikanter Unterschied in der Mib-1 Expression (Visueller Analog Score, VAS) in der Anastomosenregion nach Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein am 3. und 7. postop. Tag bei 40 NZW Kaninchen.
• Abbildung 22: Veränderung der Leukozytenkonzentration im Serum nach Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein am 3. und 7. postop. Tag bei 40 NZW Kaninchen
• Abbildung 23: Veränderung der Hämoglobinwerte im Serum nach Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein am 3. und 7. postop. Tag bei 40 NZW Kaninchen. Es fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen am dritten oder siebten Untersuchungstag.
• Abbildung 24: Veränderung der Thrombozytenzahlen im Serum nach Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein am 3. und 7. postop. Tag bei 40 NZW Kaninchen. Die Thrombozyten lagen am 7. Tag in der Thalidomidgruppe signifikant höher im Vergleich zur Kontrollgruppe.
• Abbildung 25: Signifikanter Unterschied in der Ausprägung des Adhäsionsscore intraabdominal nach Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein am 7. postop. Tag zwischen Verum- und Kontrollgruppe (p<0,05) bei 40 NZW Kaninchen
• Abbildung 26: Signifikanter Unterschied TNF-alpha Konzentrationen im Serum zwischen Verum- und Kontrollgruppe nach intraperitonealer Therapie mit Thalidomid/CMZ oder CMZ allein sowohl am 3. (p<0,01) als auch am 7. (p<0,01) postop. Tag bei 40 NZW Kaninchen.
• Abbildung 26: Graphische Darstellung möglicher Wirkungsmechanismen von Thalidomid während der Inhibition der Angioneogenese..7