3 Patienten und Methoden

Zwischen März 1998 und August 2003 erhielten 280 Patienten eine allogene SZT. Davon hatten 85 Patienten eine ALL, 86 Patienten eine AML, 19 Patienten ein MDS und 72 Patienten eine CML. Die übrigen Patienten hatten NHL, MM, aplastische Anämien oder Nierenzellkarzinome. Die Patienten waren von März 1998 bis März 2001 in der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie, Charité, Campus Mitte und ab April 2001 nach der Fusion der Knochenmarktransplantationen und Umzug an den Campus Virchow-Klinikum der Charité, in der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Hämatologie und Onkologie, Campus Virchow-Klinikum transplantiert worden.

Von 155 der 280 Patienten, die zwischen März 1998 und August 2003 wegen einer ALL, AML, MDS oder einer CML allogen stammzelltransplantiert wurden, lagen ausreichende Nachbeobachtungszeiten und Chimärismusdaten vor.

(Die Darstellung der Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen erfolgt in Kapitel 3.6.).

Das mediane Alter der 155 Patienten betrug 37 Jahre (16 - 67 Jahre). Die allogene SZT erfolgte bei 73/155 Patienten (47 %) in kontrollierten Krankheitsstadien (1. CR bei ALL oder AML, 1. chronischer Phase (cP) bei CML oder bei unbehandeltem MDS) und bei 82/155 Patienten (53 %) in fortgeschritteneren Krankheitsstadien. 121/155 Patienten (78 %) erhielten eine allogene SZT nach konventioneller hochdosierter Strahlen- und Chemotherapie (Standardtransplantation); 34/155 Patienten (22 %) hatten eine dosisreduzierte Konditionierung zur nichtmyeloablativen Stammzelltransplantation (NST) erhalten.

88 Patienten (57 %) waren von einem HLA-identischen verwandten Spender transplantiert worden und 67 Patienten (43%) von einem HLA-identischen Fremdspender. Die große Mehrzahl der Patienten (88 %) wurde mit mobilisierten peripheren Stammzellen transplantiert, 12 % wurden knochenmarktransplantiert (Tabelle 1).

Die GvHD-Prophylaxe variierte in Abhängigkeit von Grunderkrankung, Spendertyp und Konditionierung und umfasste in allen Fällen CSA; MTX und/oder Prednisolon wurden zusätzlich bei Standardtransplantation gegeben; MMF wurde bei einigen Patienten nach NST zusätzlich zu CSA gegeben (siehe Kapitel 3.4.3.).

Tabelle 1 . Patientencharakteristika.

ALL = akute lymphatische Leukämie, AML = akute myeloische Leukämie, CML = chronische myeloische Leukämie, MDS = myelodysplastisches Syndrom, CR = komplette Remission. CP = chronische Phase.

Vor Beginn der Konditionierung wurden vom Patienten 3-5 ml mit EDTA durchmischtes Knochenmark und 10 ml EDTA-Blut für die Chimärismusanalyse asserviert. Vom Spender wurden ebenfalls Blutproben vor Stammzellmobilisation bzw. von unverwandten Spendern Blutproben, die mit dem Transplantat mitgeliefert wurden, asserviert.

Die Chimärismusanalysen aus peripherem Blut wurden 2 und 4 Wochen nach Transplantation, danach in zuerst 2 - 4- wöchigen Abständen, dann alle 3 Monate für mindestens ein Jahr durchgeführt. Knochenmark wurde anlässlich von routinemäßig durchgeführten Punktionen 1, 3, 6 und 12 Monate nach Standardtransplantation und nach NST untersucht, nach NST erfolgte eine weitere Knochenmarkuntersuchung am Tag + 14.

Ein gemischter Chimärismus (MC) wurde definiert als ≥ 5% Empfängerzellen in mindestens 1 untersuchten Zellsubpopulation in 2 unabhängigen Untersuchungen [Nagy 2000, Massenkeil 2003]. Die Chimärismusanalysen erfolgten im DNA-Labor (Leiterin: Frau Dr. M. Nagy) des Institutes für Rechtsmedizin der Charité und wurden im Rahmen eines drittmittelfinanzierten Kooperationsprojektes (Dieter-Schlag Stiftung, 10/1999) durchgeführt.

Die Chimärismusanalyse von Leukozytensubpopulationen aus dem Blut und Knochenmark wurde mit Hilfe eines Multiplex-STR Assays durchgeführt [Thiede 1999, Nagy 2000, Massenkeil 2003]. EDTA-Blut oder –Knochenmark wurde mit Antikörper-beschichteten Magnetperlen (Dynabeads) sortiert (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg). Die verwendeten Antikörper waren spezifisch für CD4-, CD8-, CD3-, CD19-, CD14-, CD15- und CD2-positive kernhaltige Zellen. Das Knochenmark wurde mit Antikörpern gegen CD34 untersucht. Residuelle Blut- und Knochenmarkzellen wurden ebenfalls untersucht. Die Reinheit der spezifischen Zellpopulationen wurde mittels flußzytometrischer Analyse nach Ablösung der Magnetperlen (Becton Dickinson, Heidelberg) kontrolliert und war > 93 %.

Genomische DNA wurde aus dem gesorteten Blut mit Hilfe der voll automatischen GenoM^TM-48 Robotic Workstation (GENOVISION, Wien, Österreich) gewonnen [Blin 1976]. Die Extraktion bestand aus Zelllyse mit chaotropen Reagenzien, DNA-Bindung an Silikat-beschichtete Magnetpartikel, gefolgt von Elution der reinen Nukleinsäureproben. STR-Polymorphismen wurden auf dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems, Darmstadt) nach Koamplifikation von neun STR’s und dem Amelogenin Gen mit dem AmpFlSTR Profilerplus Kit (PE Applied Biosystems, Darmstadt) untersucht [Nagy 2000]. Wir bestimmten die Spender:Empfänger-Relation der untersuchten DNA durch Messung der Relation der Flächen der Spender- und Empfängersignale [Thiede 1999]. Die geschätzte Sensitivität des AmpFISTR Profilerplus multiplex Systems für den Nachweis eines geringen Empfänger- bzw. Spenderzellanteils in einer gemischten Probe liegt bei 5 %. Eine Mindestzellzahl von 1000 Zellen ist ausreichend für eine aussagekräftige Analyse [Nagy 2000]. Proben, in denen kein eindeutiges Spender- oder Empfängerprofil nachgewiesen werden konnte, wurden von der Analyse und anschließenden Auswertung ausgeschlossen.

Von den verwandten Spendern wurden für eine spätere adoptive Immuntherapie vor Stammzellmobilisation Lymphozyten durch Leukapherese gewonnen und auf CD3-Expression untersucht. Die Zellen wurden in Portionen zu 5 x 10⁶, 1 x 10⁷, 5 x 10⁷ und, soweit vorhanden, 1 x 10⁸ CD3-positiven Zellen/kg KG des Empfängers geteilt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Von unverwandten Spendern wurden zum Zeitpunkt der Stammzelltransplantation Lymphozyten aus dem G-CSF mobilisierten Blutstammzelltransplantat in Portionen zu 1 x 10⁶, 5 x 10⁶, 1 x 10⁷ und, soweit vorhanden, 5 x 10⁷ CD3-positiven Zellen/kg KG des Empfängers geteilt und in flüssigem Stickstoff gelagert.

61 Patienten erhielten eine oder mehrere DLI in eskalierender Dosierung nach Transplantation. Bei 6 Patienten lagen keine ausreichenden Nachbeobachtungsdaten und Chimärismusuntersuchungen vor, so dass in die folgende Analyse 55 Patienten eingingen.

Indikationen zur Spenderlymphozyteninfusion waren:

1. prophylaktisch bei Hochrisikopatienten mit ALL oder AML nach NST und bei Patienten nach Standardtransplantation mit Ph+ ALL oder ALL > 1. CR bei Transplantation.
2. therapeutisch bei rezidivierter ALL, AML oder CML.

Die vor Transplantation gewonnenen Spenderlymphozyten wurden als prophylaktische DLI ab Tag + 60 verabreicht, wenn sich keine GvHD nach Absetzen der medikamentösen GvHD-Prophylaxe entwickelt hatte und diese Patienten entweder einen MC aufwiesen oder ein sehr hohes Rezidivrisiko durch unkontrollierte Erkrankung vor Transplantation hatten. DLI wurden auch in therapeutischer Indikation bei bestätigtem Frührezidiv verabreicht. Sie wurden meist in vierwöchigen Abständen nach antiallergischer Prämedikation verabreicht. Die erste Dosis enthielt 1 x 10⁷ CD3-positive Zellen/kg KG bei verwandten Spendern und 5 x 10⁶ bei Fremdspendern, die weiteren Gaben erfolgten eskalierend in halblogarithmisch gesteigerten Dosierungsstufen bis maximal 1 x 10⁸ CD3-positive Zellen/kg KG des Patienten. Während des Beobachtungszeitraums wurde wegen der häufig nach DLI zu beobachtenden GvHD eine Reduktion um eine halbe logarithmische Stufe vorgenommen, so dass dann die 1. DLI nach unverwandter Transplantation 1 x 10⁶ und nach verwandter Transplantation 5 x 10⁶ CD3-positive Zellen/kg KG enthielt.

Nichtmyeloablative Stammzelltransplantationen (NST) werden seit August 1998 in unserer Klinik durchgeführt. Das Protokoll zur NST wurde durch die Ethikkommission der Charité genehmigt. Nach Aufklärung gaben alle Patienten ihre schriftliche Einverständniserklärung.

Vierunddreißig konsekutive Patienten wurden wegen einer ALL oder einer AML zwischen August 1998 und August 2003 nichtmyeloablativ stammzelltransplantiert. Dreißig von 34 Patienten hatten eine ausreichende Nachbeobachtungszeit und gingen in die weitere Untersuchung ein, um die Durchführbarkeit und Nebenwirkungsrate der NST bei Patienten mit akuten Leukämien zu analysieren. Die vier ausgeschlossenen Patienten hatten eine Nachbeobachtungszeit von weniger als drei Monaten zum Zeitpunkt der Auswertung und waren in CR. Die Patienten waren zwischen 19 und 67 Jahren alt. 6/9 ALL-Patienten hatten eine Ph+ ALL und 9/21 AML-Patienten eine sekundäre AML. 17/30 Patienten hatten einen mit einer ungünstigen Prognose assoziierten Karyotyp in der Knochenmarkdiagnostik.

Zum Zeitpunkt der NST waren 9 Patienten in 1. CR, 21 Patienten hatten eine fortgeschrittene Erkrankung, 3/21 waren in 2. CR und 18 Patienten hatten eine aktive Erkrankung (Tabelle 2).

Alle Patienten erfüllten Kriterien der Hochrisiko-ALL bzw. –AML aufgrund ihres fortgeschrittenen Alters, hoher Zellzahl bei Erstdiagnose, ungünstiger zytogenetischer Aberrationen oder unkontrollierter Erkrankung [Gökbuget 2000, Visani 2001].

Tabelle 2 . Charakteristika von 30 Patienten mit akuten Leukämien vor NST.

ALL = akute lymphatische Leukämie, AML = akute myeloische Leukämie, CR = komplette Remission, GvHD = graft-versus-host disease, CSA = Cyclosporin A, MTX = Methotrexat.

Alle Patienten waren aufgrund ihrer Grunderkrankung Kandidaten für eine allogene SZT, hatten aber Kontraindikationen gegen eine myeloablative Konditionierung. Die häufigsten Kontraindikationen waren Alter über 50 Jahre, ein Rezidiv nach allogener Standardtransplantation und eine aktive oder residuelle schwere Infektion. 14/30 Patienten hatten mehr als 1 Kontraindikation gegen eine Standardkonditionierung. Insgesamt 17/30 Patienten hatten zum Zeitpunkt der NST eine aktive oder gerade überwundene schwere Infektion (Tabelle 3).

Tabelle 3 . Indikation zur NST bei 30 Patienten mit ALL oder AML.

M = Mann, F = Frau, ALL = akute lymphatische Leukämie, Ph+ = Philadelphia-Chromosom-positive ALL, c-ALL = common-ALL, T-ALL = T-lymphoblastische ALL, AML = akute myeloische Leukämie, sAML = sekundäre AML, Z.n. = Zustand nach, KI = Karnofsky-Index.

Die Zeitdauer von der Erstdiagnose bis zur NST betrug im Median 9,9 Monate (3,3 - 68,3 Monate); bei den 8 retransplantierten Patienten lagen im Median 16 Monate zwischen Erst- und Zweittransplantation (Spannweite 7 - 61 Monate).

Alle Patienten wurden von HLA-identischen Spendern transplantiert. 20 Patienten hatten einen verwandten (66 %), 10 Patienten einen unverwandten Spender (33 %). Eine Spender-Empfänger Geschlechtsdifferenz lag bei 12/30 Patienten vor.

Die Konditionierung bestand aus Fludarabin 30 mg/m² i.v. an den Tagen – 10 bis – 5 (Gesamtdosis 180 mg/m²), Busulfan 4 mg/kg p. os an den Tagen – 6 und – 5 (Gesamtdosis 8 mg/kg) sowie ATG (Fresenius) 10 mg/kg i.v. Tag – 4 bis – 1 (Gesamtdosis 40 mg/kg) [Slavin 1998] (Abbildung 3).

	Abbildung 3 . Dosisreduzierte Konditionierung. SZT = Stammzelltransplantat, ATG = Antithymozytenglobulin, BU = Busulfan, FL = Fludarabin, CSA = Cyclosporin A, MMF = Mycophenolat mofetil.

Die Stammzellmobilisation erfolgte bei 27 Spendern mit G-CSF 2 x 5 g/kg/Tag s.c. über 4 - 5 Tage. Die Stammzellapherese wurde über 1 - 2 Tage durchgeführt. Angestrebt wurde die Gewinnung von mindestens 4 x 10⁶ CD34-positiven Zellen/kg KG des Patienten. Von 3 Spendern wurde wegen Ablehnung der G-CSF-Gabe Knochenmark in Vollnarkose durch Beckenkammaspiration gewonnen. Die Apherese von CD3-positiven Lymphozyten bei verwandten Spendern und die Gewinnung von CD3-positiven Lymphozyten aus dem G-CSF mobilisierten Transplantat bei unverwandten Spendern sowie deren Portionierung wurde in Kapitel 3.3. beschrieben.

Als GvHD-Prophylaxe wurde anfänglich nur CSA mit initial 2 x 2,5 mg/kg/Tag i.v. ab Tag – 1 verwendet. CSA wurde bei Ausbleiben einer akuten GvHD ab Tag + 60 stufenweise abgesetzt. Wegen der im Verlauf der Studie häufig auftretenden GvHD, wurde die GvHD-Prophylaxe ab Patient Nr. 24 um MMF 3 x 1 g/Tag i.v. ab Tag 0 erweitert, das zwischen Tag + 30 und + 45 abgesetzt wurde, wenn keine GvHD aufgetreten war. CSA wurde bei diesen Patienten bis mindestens Tag + 90 gegeben.

Akute and chronische GvHD wurden histologisch gesichert und nach etablierten Kriterien evaluiert und klassifiziert [Glucksberg 1974, Shulman 1980, Przepiorka 1995]. Die akute GvHD wurde mit Hochdosis-Prednisolon von 2 mg/kg bis 1 g Methylprednisolon/Tag behandelt, eine steroidrefraktäre akute GvHD wurde mit 2 x 20 mg des monoklonalen Interleukin-2 Rezeptorantikörpers Basiliximab und/oder ATG 3 x 30 mg/kg behandelt [Massenkeil 2002]. Die chronische GvHD wurde mit CSA und Prednisolon behandelt; refraktäre Patienten erhielten MMF, Cyclophosphamid und extrakorporale Photopherese.

Die selektive Darmdekontamination erfolgte mit Ciprofloxacin 2 x 500 mg/Tag und Amphotericin B 4 x 1 ml/Tag ab Konditionierung bis zur Rekonstitution der neutrophilen Granulozyten und Abheilung einer Stomatitis. Die Prophylaxe der Pneumocystis carinii Pneumonie (PCP) wurde mit Trimethoprim/ Sulfamethoxazol 3 x 960 mg/Woche p. os bis 6 Monate nach NST durchgeführt. Patienten mit chronischer GvHD erhielten eine PCP-Prophylaxe, solange sie immunsuppressiv behandelt wurden. Bei Kontraindikationen gegen Trimethoprim/ Sulfamethoxazol erhielten die Patienten Pentamidin per inhalationem, 3 x 300 mg zum Beginn der Konditionierung und dann alle 4 Wochen.

Die Herpes simplex Virus Prophylaxe erfolgte mit Aciclovir 3 x 5 mg/kg/Tag i.v. von Tag – 1 bis Tag + 30. Immunglobuline 10 g wurden an Tag 0 und dann alle 2 Wochen bis 3 Monate nach NST verabreicht, danach nur bei IgG-Werten < 5 g/l.

Bei Cytomegalovirus (CMV)-negativer Empfänger-Spenderkonstellation erhielten die Patienten CMV-negative Blutprodukte. Alle Patienten wurden mit gefilterten und bestrahlten Blutprodukten versorgt.

Eine Computertomographie (CT) wurde bei allen 17 Patienten mit einer Pneumonie oder systemischen Pilzinfektion vor NST angefertigt. Die CT-Untersuchung zeigte Lungeninfiltrate bei 9/17 und hepatolienale Infiltrate bei 2/17 Patienten (Tabelle 3). Diese 11 Patienten erhielten eine antimykotische Therapie mit verschiedenen Präparaten, die vom Beginn der Konditionierung bis zur Entlassung, zum Teil auch bis 6 Monate nach Entlassung in Abhängigkeit von den Befunden der radiologischen Verlaufsuntersuchungen verabreicht wurden.

Fieber wurde definiert als orale Temperatur > 38.3 °C oder zweimal > 38.0 °C innerhalb von 12 Stunden. Sepsis, Fieber unklarer Genese (fever of unknown origin, FUO) und Katheter-assoziierte Infektionen wurden akzeptierten Leitlinien folgend beurteilt [ACCP / SCCM 1992, Mermel 2001, Hughes 2002].

Patienten, die nicht innerhalb von 72 Stunden entfieberten, bei denen klinisch oder im konventionellen Röntgen-Thorax ein Pneumonieverdacht vorlag oder die eine Pneumonie in der Anamnese hatten, erhielten ein Spiral-CT der Lunge. Die antibiotische Erstlinientherapie bestand aus Breitspektrum-beta-Lactamantibiotika, im Ausnahmefall kombiniert mit Aminoglykosiden; Patienten mit Haut- oder Katheterinfektionen oder Nachweis von Staphylokokken erhielten zusätzlich ein Glykopeptid. Die Zweitlinientherapie bestand aus einem Carbapenem und eventuell einem Glykopeptid. Antimykotika wurden bei persistierendem Fieber oder Lungeninfiltraten zusätzlich verabreicht.

Der CMV-Serostatus von Empfänger und Spender wurde vor NST festgestellt. Wöchentliche Testungen auf CMV-DNA und -Antigen pp65 wurden bis zur Entlassung sowie an Tag + 90, + 180 und + 360 durchgeführt, zusätzliche Untersuchungen erfolgten bei stattgehabter CMV-Infektion unter antiviraler Therapie und bei klinischem Verdacht auf eine CMV-Infektion. Eine präemptive Therapie [Ljungman 2002] mit Ganciclovir wurde bei zwei aufeinander folgenden CMV-DNA-Nachweisen oder einmaligem CMV-Antigennachweis eingeleitet und bis zu zwei negativen Testresultaten fortgeführt.

Nach NST erhielten alle Patienten ab Tag 5 G-CSF 5 g/kg/Tag zur Verkürzung der Neutropeniezeit bis die Leukozytenzahlen stabil > 2,0/nl waren. Das Anwachsen des Transplantates wurde definiert als der Zeitpunkt, an dem die neutrophilen Granulozyten > 0,5/nl und Thrombozyten > 20/nl ohne Thrombozytenkonzentratgabe über 3 Tage lagen. Knochenmarkpunktionen zur Krankheitsbeurteilung wurden vor NST, nach 2 Wochen, 1, 3, 6 und 12 Monaten durchgeführt.

Die Chimärismusanalysen aus peripherem Blut und Knochenmark erfolgten wie in Kapitel 3.2. beschrieben.

Zur Evaluation des Stellenwertes der NST bei Patienten mit Hochrisikoleukämien im Vergleich zur Standardtransplantation führten wir eine kontrollierte Fall-Kontrollstudie durch. Dabei wurde auch die Chimärismuskinetik der Leukozytensubpopulationen soweit vorliegend analysiert.

Fünfundzwanzig konsekutive Patienten mit Hochrisiko-ALL oder AML [Gökbuget 2000, Visani 2001], die zwischen August 1998 und Juni 2002 eine NST erhalten hatten (siehe Kapitel 3.4.) und eine ausreichende Nachbeobachtungszeit hatten, wurden in die retrospektive Analyse als Fallpatienten eingeschlossen. Kontraindikationen gegen eine Standardtransplantation waren: schwere aktive oder residuelle pilzverdächtige Infektionen bei 10/25 Patienten, Alter über 50 Jahre bei 7/25 Patienten, Rezidive nach allogener Standardtransplantation bei 6/25 Patienten, intensive zytostatische Vorbehandlung bei 1/25 Patienten und wiederholte subdurale Hämatome bei 1/25 Patienten. 11/25 Patienten hatten mehr als 1 Kontraindikation gegen eine Standardtransplantation.

Durch 1:2 Zuordnung wurden den 25 Fallpatienten 50 Kontrollpatienten zugeordnet, die ebenfalls eine Hochrisiko-ALL oder –AML hatten und eine myeloablative Stammzelltransplantation erhalten hatten. Matching-Kriterien für die Zuordnung von Fällen und Kontrollen waren: Diagnose (ALL oder AML), Stadium der Erkrankung (1. CR oder keine 1. CR), Spendertyp (HLA-identischer verwandter oder unverwandter Spender) und Alter bei Transplantation. Da fortgeschrittenes Alter eine Indikation für die NST darstellte, waren diese Patienten im Median 6 Jahre älter als die Kontrollpatienten (n.s.).

50 Patienten hatten einen HLA-identischen verwandten und 25 Patienten einen HLA-identischen unverwandten Spender. Eine Spender-Empfänger-Geschlechtsdifferenz lag bei 9/25 NST-Patienten (36 %) und 21/50 Standardtransplantations-Patienten (43 %) vor (n.s.) (Tabelle 4).

Tabelle 4 . Charakteristika von 75 Patienten der retrospektiven Fall-Kontrollstudie.

ALL = akute lymphatische Leukämie, AML = akute myeloische Leukämie, CR = komplette Remission.

Die nichtmyeloablative Konditionierung für die 25 Fallpatienten erfolgte mit Fludarabin, Busulfan und ATG wie in Kapitel 3.4. beschrieben. Kontrollpatienten erhielten eine fraktionierte totale Ganzkörperbestrahlung mit 2 x 2 Gy von Tag – 6 bis Tag – 4 (Gesamtdosis 12 Gy) und Cyclophosphamid 60 mg/kg, Tag – 3 und – 2 (Gesamtdosis 120 mg/kg) (n = 36) oder Etoposid 50 mg/kg, Tag – 3 (n = 2) bzw. Etoposid 50 mg/kg Tag - 3 und Cyclophosphamid 100 mg/kg an Tag – 4 (n = 12).

Leukapherese, Stammzellmobilisation und Stammzellapherese erfolgten wie in Kapitel 3.3. und 3.4. beschrieben. Knochenmark wurde bei 20 Patienten als Stammzellquelle verwendet und mobilisierte periphere Stammzellen bei 55 Patienten. Mobilisierte periphere Blutstammzellen wurden häufiger bei der NST als Stammzellquelle verwendet als bei der Standardtransplantation (p = 0,054), da mehrere standardtransplantierte Patienten ihre Transplantation schon 1997 oder in der ersten Hälfte des Jahres 1998 erhalten hatten, und zu dieser Zeit Knochenmarkentnahmen noch häufiger durchgeführt wurden. Die Patienten wurden ausgewählt, um ein gutes Matching der aufgeführten Kriterien zu erzielen.

Die GvHD-Prophylaxe nach NST erfolgte mit CSA oder CSA und MMF wie in Kapitel 3.4.3. beschrieben. Kontrollpatienten mit verwandtem Spender erhielten nach Standardtransplantation CSA bis Tag + 150 - 180 sowie MTX i.v., Tag + 1, + 3, + 6 und + 11. Nach unverwandter Transplantation erhielten die Patienten CSA, MTX und Prednisolon, letzteres wurde ab Tag + 28 stufenweise abgesetzt. Wenn Etoposid Bestandteil der Konditionierung war, wurde Prednisolon statt MTX gegeben. Die Klassifikation der akuten wie der chronischen GvHD erfolgte nach etablierten Kriterien [Glucksberg 1974, Shulman 1980, Przepiorka 1995]. Die Therapie der akuten und chronischen GvHD war in beiden Gruppen gleich und wurde in Kapitel 3.4.3. beschrieben.

Die Prinzipien der Infektionsprophylaxe, Infektionsüberwachung, Diagnostik und antiinfektiösen Therapie waren in beiden Gruppen gleich und wurden in Kapitel 3.4.4. ausführlich beschrieben.

Aus statistischen Gründen einer ausreichenden Fallzahl wurden Sepsis, invasive Pilzinfektionen und andere Pneumonien in der Fall-Kontrollstudie gemeinsam als schwere Infektionen vor oder nach SZT analysiert.

Ab Tag + 5 nach Transplantation erhielten alle nichtmyeloablativ stammzelltransplantierten Patienten und nach Standardtransplantation alle von einem unverwandten Spender transplantierten Patienten G-CSF in einer Dosis von 5 g/kg/Tag bis zu stabilen Leukozytenwerten > 2,0/nl. Die Beurteilung des Transplantatanwachsens und der Remission wurde in Kapitel 3.4.5. beschrieben. Die Chimärismusanalysen aus peripherem Blut und Knochenmark erfolgten wie in Kapitel 3.2. beschrieben.

NST bei metastasierten Nierenzellkarzinomen werden in einer gemeinsamen Studie mit der Klinik für Urologie der Charité seit Dezember 2000 nach Erteilung der Votums der Ethikkommission der Charité durchgeführt. Nach Aufklärung erteilten alle Patienten ihre schriftliche Einwilligung.

Zwischen Dezember 2000 und Juni 2003 wurden insgesamt 29 Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen als Kandidaten für eine NST interdisziplinär evaluiert. Folgende Ein- und Ausschlusskriterien galten für die Studie:

Einschlusskriterien

• Metastasiertes Nierenzellkarzinom nach Tumornephrektomie
• messbare Metastasen
• kein Ansprechen auf eine Interferon-haltige Immuntherapie
• Lebenserwartung > 6 Monate
• Alter 18 - 65 Jahre (biologisches Alter)
• HLA-identischer Geschwister- (oder Fremd-)spender
• Aufklärung über den experimentellen Charakter der Therapie
• schriftliche Einwilligung in die Studie

Ausschlusskriterien

• ausschließlich ossäre Metastasen
• ZNS-Metastasen
• Zustand nach Organtransplantation
• schwere und chronische virale Infektionen
• schwere internistische Begleiterkrankungen
• manifestes Zweitmalignom
• Schwangerschaft oder Stillzeit
• letzte Therapie des Nierenzellkarzinoms vor weniger als 8 Wochen

Der Primärtumor war bei allen 29 Patienten operativ entfernt worden, unabhängig davon, ob zum Operationszeitpunkt ein lokal begrenztes oder ein metastasiertes Tumorstadium vorlag. Die mediane Zeit von der Primärdiagnose bis zum Auftreten von Fernmetastasen betrug 2 Jahre. Alle Patienten hatten einen oder mehrere Zyklen Chemoimmuntherapie erhalten, die aus hochdosiertem Interleukin-2 s.c. und Interferon alpha s.c. bestand, kombiniert mit 5-Fluorouracil i.v. und/oder 13-cis-Retinolsäure [Roigas 2003]. Die niedrig auflösende HLA-Klasse I- und hochauflösende Klasse II-Typisierung identifizierte einen HLA-kompatiblen Spender bei 13/29 untersuchten Patienten; ein unverwandter Spender wurde bei einem 25-jährigen Patienten gefunden (Tabelle 5). 15/29 Patienten hatten keinen HLA-kompatiblen Spender.

Tabelle 5 . Charakteristika von 29 evaluierten Patienten mit refraktären Nierenzellkarzinomen bei Studieneinschluss.

CR = komplette Remission, PR = partielle Remission, SD = stabile Erkrankung, PD = progrediente Erkrankung.

Sieben der 14 Patienten mit einem HLA-kompatiblen Spender wurden nicht allogen stammzelltransplantiert wegen sehr rascher Tumorprogression (n = 5), medizinischer Kontraindikation des Spenders (n = 1) und sekundärer Therapieablehnung (n = 1).

Eine NST wurde zwischen Juni 2001 und März 2003 bei 7/29 als transplantabel beurteilten Patienten (24 %) durchgeführt. Das mediane Alter der Patienten betrug 58 Jahre (25-64 Jahre). Drei von 7 Patienten hatten ein primär metastasiertes Nierenzellkarzinom, bei den anderen 4 Patienten lagen zwischen Primärdiagnose und Auftreten von Metastasen 1 - 5 Jahre. 5 Patienten hatten ein klarzelliges und 2 ein papilläres bzw. tubulo-papilläres Nierenzellkarzinom. Zusätzlich zur Tumornephrektomie hatten die Patienten Operationen resezierbarer Metastasen, Immuntherapien, Chemotherapien und Lasertherapien bei symptomatischer metastasierter Tumorerkrankung erhalten (Tabelle 6). Zwischen Auftreten der Metastasen und der NST lagen 9 bis 155 Monate (im Median 19 Monate). Alle Patienten hatten ihre schriftliche Einwilligung nach Aufklärung über den experimentellen Charakter der Therapie erteilt.

Tabelle 6 . Charakteristika von 7 Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen vor NST.

M = Mann, F = Frau, Op = Operation, IMT = Immuntherapie, LITT = Laser induzierte Thermotherapie, RT = Bestrahlung.

Alle Patienten wurden von HLA-identischen verwandten (n = 6) oder unverwandten (n = 1) Spendern transplantiert. Die Konditionierung bestand aus Cyclophosphamid 60 mg/kg KG i.v., Tag – 7 und – 6 (Gesamtdosis 120 mg/kg), Fludarabin 25 mg/m² i.v., Tag – 5 bis – 1 (Gesamtdosis 125 mg/m²) und ATG (Fresenius) 10 mg/kg i.v., Tag – 3 bis - 1 (Gesamtdosis 30 mg/kg KG) [Childs 2000]. Vor Beginn der Stammzellmobilisation wurden von den Spendern Lymphozyten für eine spätere adoptive Immuntherapie gewonnen und portioniert wie beschrieben (siehe Kapitel 3.3.). Als Stammzellquelle wurden ausschließlich mobilisierte periphere Blutstammzellen eingesetzt. Die Stammzellmobilisation und –apherese erfolgte wie in Kapitel 3.3. und 3.4.2. beschrieben.

Die GvHD-Prophylaxe bestand aus CSA und wurde stufenweise nach 6 - 8 Wochen reduziert, falls keine GvHD aufgetreten war. Nach Fremdspendertransplantation wurde zusätzlich MMF bis Tag + 28 verabreicht. Die Klassifikation und Therapie der GvHD erfolgte wie beschrieben (Kapitel 3.4.3).

Infektionsprophylaxe, Überwachung, Diagnostik und antimikrobielle Therapie entsprachen den klinikinternen Standards für die allogene SZT bei hämatologischen Systemerkrankungen und wurden ausführlich in Kapitel 3.4.4. dargestellt.

Die Verabreichung von DLI erfolgte wie in 3.3. beschrieben ab Tag + 60, wenn sich keine GvHD nach Absetzen von CSA und MMF entwickelt hatte und ein gemischter Chimärismus vorlag. Die erste Dosis enthielt 5 x 10⁶ CD3-positive Zellen/kg KG. Chimärismusuntersuchungen aus dem peripheren Blut zur Kontrolle des Anwachsen des Transplantates wurden nach 2 Wochen, monatlich bis 6 Monate, zwei- bis dreimonatlich bis 1 Jahr und dann alle 3 Monate nach NST durchgeführt wie in Kapitel 3.2. beschrieben. Die Tumorevaluation erfolgte vor Transplantation klinisch und durch CT von Thorax und/oder Abdomen und wurde in dreimonatlichen Abständen nach NST wiederholt.

Die berechneten Resultate der deskriptiven Statistik werden mit Median und Spannweite (range) angegeben. Wegen der begrenzten Patientenzahl und nicht normal verteilten Variablen (skew distributions) bei den jeweiligen Fragestellungen wurden statistische Vergleiche stets mit nichtparametrischen Tests analysiert (Mann-Whitney-U Test für zwei unabhängige Gruppen). Überlebensdaten bezüglich transplantationsassoziierter Mortalität (TRM), erkrankungsfreiem Überleben (EFS) und Gesamt-Überleben wurden nach Kaplan-Meier [Kaplan 1958] analysiert und univariat mit dem Log-Rang Test [Kalbfleisch 1980] auf Unterschiedlichkeit in Bezug auf wichtige Einflussgrößen geprüft. Mit Hilfe dieser Analysen wurden zusätzlich mediane Überlebenszeiten mit 95%-Konfidenzintervall (C.I.) ermittelt. Voraussetzung für den statistischen Vergleich zweier Überlebenskurven ist eine in beiden Vergleichsarmen gleichverlaufende Zensierung. Das wurde mit Hilfe der Follow-up-Maturity [Parmar 1996] als Maß für statistisch vergleichbare Nachbeobachtungszeiten in zwei unabhängigen Gruppen [Schemper 1996] geprüft. Die statistische Relation zwischen Konditionierungsregimen sowie hämatopoetischer Rekonstitution, Chimärismusanalyse, akuter und chronischer GvHD und Infektionen nach Stammzelltransplantation wurden mit dem exakten Fisher-Test und dem Chi-Quadrat-Test (X²) berechnet. Eine multivariate Cox’ Regressionsanalyse für proportionale Hazards [Cox 1972] wurde durchgeführt, um den prognostischen Einfluss der Konditionierung, der Diagnose, des Krankheitsstadiums, des Patientenalters, der Spenderherkunft, der zytogenetischen Risikogruppe, der akuten und chronischen GvHD, des Chimärismusstatus und schwerer Infektionen auf die TRM, das EFS und das Gesamt-Überleben multivariat zu bestimmen. Die statistische Analyse wurde mit SPSS 11.0 (Statistical Package for the Social Science) durchgeführt. Alle Signifikanzen wurden zweiseitig bezüglich p < 0,05 festgelegt. Die statistische Beratung erfolgte durch Professor Dr. Klaus-Dieter Wernecke, Institut für Medizinische Biometrie der Charité.