Matthias, Christoph: Molekularbiologische Untersuchungen zum Einfluß genetischer Wirtsfaktoren auf das Erkrankungsrisiko und den Krankheitsverlauf von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich

Kapitel 3. Literaturübersicht

Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich erkranken meist zwischen dem 50. und 70. Lebensjahr. Innerhalb dieser Gruppe kann häufig ein altersabhängiger Zusammenhang mit dem Alkohol- und Zigarettenkonsum festgestellt werden. Patienten, die in jüngerem Lebensalter erkranken, weisen meist einen höheren Genußmittelkonsum auf und entwickeln vermehrt Hypopharynxkarzinome (Elwood u. Mitarb. 1984; Brugere u. Mitarb. 1986; Blot u. Mitarb. 1988). Patienten, die bereits um das 40. Lebensjahr an einem Kopf-Hals-Karzinom erkranken, sind mit einer Häufigkeit von 2-5% in größeren Studien sehr selten (Clark u. Mitarb. 1982; Webber u. Mitarb. 1984; Shvero u. Mitarb. 1987). In dieser Altersgruppe ist ein exzessiver Alkohol- und Zigarettenkonsum meist nicht nachweisbar. Auch entwickeln diese Patienten im weiteren Verlauf vermehrt Zweittumoren (Shvero u. Mitarb. 1987). Ein etwas höherer Anteil an weiblichen Patienten wird in dieser Altersgruppe


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ebenfalls beobachtet (Clark u. Mitarb. 1982; Webber u. Mitarb. 1984). Diese Umstände weisen auf eine besondere Prädisposition dieser Subpopulation hin.

Der Einfluß von Alkoholkonsum und Zigarettenrauchen auf die Entstehung der Kopf-Hals-Karzionme gilt heute als erwiesen. Die Alkoholmenge, ab welcher das Erkrankungsrisiko stark ansteigt wird in der Literatur mit etwa 60-80 g/d angegeben (Brugere u. Mitarb. 1986). Bei Rauchern steigt ab einem Konsum von 10 Packungsjahren (1 Packungsjahr ist definiert als Konsum einer Schachtel von 20 Zigaretten täglich über 1 Jahr) das Risiko stark an, ein Karzinom zu entwickeln (Elwood u. Mitarb. 1984; Brugere u. Mitarb. 1986; Blot u. Mitarb. 1988). Alkoholkonsum und Zigarettenrauchen haben aber nicht nur einen Einfluß auf die Entstehung von Kopf-Hals-Tumoren, sondern spielen auch im Krankheitsverlauf eine entscheidende Rolle. Von mehreren Autoren konnte beobachtet werden, daß mit zunehmendem Alkohol- und Zigarettenkonsum die Effektivität der Behandlung abnahm, das Risiko von Tumorrezidiven und die Mortalitätsrate aber anstieg (Brugere u. Mitarb. 1986; Vander Ark u. Mitarb. 1997; Dhooge u. Mitarb. 1998).

Als weitere ätiologische Faktoren werden berufsbedingte Umweltgifte wie Asbest, Holzstaub, Zement- und Teerprodukte, Metalldämpfe, Lösungsmittel sowie sozioökonomische Faktoren in der Pathogenese der Kopf-Hals-Karzinome vermutet (Maier u. Mitarb. 1992, 1993, 1997; Tisch u. Mitarb. 1996). Darüber hinaus wird bei Larynxkarzinomen ein Zusammenhang mit der Larynxpapillomatose sowie humanen Papillomaviren (HPV) der Typen 6 und 11

(Koufman u. Mitarb. 1997) und bei Tonsillenkarzinomen mit HPV Typen 16 und 33 vermutet (Snijders u. Mitarb. 1992). Einige der Risikofaktoren beeinflussen sich gegenseitig. Beispielsweise erhöhen Rauchen und Alkoholkonsum die Empfänglichkeit gegenüber HPV-Infektionen (Koufman u. Mitarb. 1997).

Die Entstehung von Plattenepithelkarzinomen ist aber auch bei Personen, welche die Hauptrisikofaktoren aufweisen, ein seltenes Ereignis. Andererseits wird in der Literatur auch von einem relativ konstanten Anteil von 5-10% der Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren berichtet, die alle diese exogenen Risikofaktoren nicht aufweisen (Elwood u. Mitarb. 1984; Brugere u. Mitarb. 1986; Blot u. Mitarb. 1988; Talami u. Mitarb. 1990; Schwartz u. Mitarb. 1994). Diese Umstände machen das Vorliegen genetisch determinierter Risikofaktoren


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wahrscheinlich (Bongers u. Mitarb. 1996; Chouaib u. Mitarb. 1997). Patienten, bei denen diese Tumorentstehung mehrfach unabhängig voneinander auftritt, scheinen eine besondere Risikogruppe darzustellen (De Vries u. Mitarb. 1986, 1987; Copper u. Mitarb. 1995). Die Definition von Mehrfachkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich wurde erstmals von Warren und Gates (1932) aufgestellt und später modifiziert (Hong u. Mitarb. 1990; Schwartz u. Mitarb. 1994). Danach soll der Zweittumor durch mindestens 2 cm nicht neoplastisch veränderte Mukosa von dem Primärtumor oder dem Resektionsrand nach Entfernung des Ersttumors entfernt sein. Die Definition wurde von Schwartz um die Tumoren erweitert, die nach mehr als drei Jahren (Jones u. Mitarb. 1995 definierten 5 Jahre) in geringerem Abstand zum Ersttumor entstanden. Treten die Zweittumoren gleichzeitig oder innerhalb von 6 Monaten auf, so bezeichnet man sie als synchron. Werden sie mehr als 6 Monate zeitlich versetzt diagnostiziert, so bezeichnet man sie als metachron. Die Mehrzahl der Zweittumoren (über 90%) sind metachron. In einem Kollektiv von Kopf-Hals-Karzinom-Patienten wird die jährliche Rate an neu aufgetretenen Zweitkarzinomen auf ca. 3% geschätzt (Jovanovic u. Mitarb. 1994). Die Inzidenz von Zweitkarzinomen variiert zwischen 10% und 40 % in verschiedenen Studien, abhängig von der Lokalisation und Prognose des Primärtumors (De Vries u. Snow 1986; Schwartz u. Mitarb. 1994). Patienten, die ein Zweitkarzinom entwickeln, haben eine deutlich höhere Morbidität und Mortalität. Das 5-Jahresüberleben liegt, abhängig von der Tumorlokalisation und den Rauch- und Trinkgewohnheiten, meist unter 10% (Schwartz u. Mitarb. 1994).

Epidemiologische Untersuchungen an Verwandten ersten Grades von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich haben ergeben, daß diese ein 3,5-fach höheres Risiko tragen, ebenfalls an einem solchen Tumor zu erkranken, verglichen mit Personen, die bei ähnlichem Alkohol- und Zigarettenkonsum diese familiäre Belastung nicht aufwiesen (Copper u. Mitarb. 1995). Eine familiäre Häufung von Mehrfachtumoren konnte ebenfalls beobachtet werden, was dazu führte einen "intrinsic factor" zu postulieren, der das relative Risiko eines Individuums beeinflußt, einen Tumor im Kopf- Hals-Bereich zu entwickeln (Bongers u. Mitarb. 1996). Eine Beeinflussung des individuellen Erkrankungsrisikos, insbesondere bei Zgarettenrauch-abhängigen Malignomen, wird seit


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einigen Jahren mit Genvariationen in Enzymen des Entgiftungsstoffwechsels in Zusammenhang gebracht (Ketterer u. Mitarb. 1990; Harris u. Mitarb. 1991; Ingelman-Sundberg u. Mitarb. 1992; Roots u. Mitarb. 1992a; Gonzales u. Mitarb 1993a, b; Wolf u. Mitarb. 1994; Hayes u. Mitarb. 1995). Die Cytochrom P450 (CYP) Enzyme sind bekannt als Phase 1- Enzyme, welche beim Abbau von vielen Chemikalien bedeutsam sind (Guengerich 1995). Gene dieser Familie, von denen es etwa 150 gibt, kodieren membrangebundene Haem-enthaltende Enzyme (LaBella 1991), die Oxidationsreaktionen ausführen. In der Cytochrom P450 Supergen-Familie sind derzeit etwa zwei Dutzend Genfamilien bekannt, wobei etwa 10 bei Säugern vorkommen. Während die anfängliche Klassifizierung der Enzyme auf ihre Substrateigenschaften zurückgeht, richtet sich die neuere Nomenklatur nach der Übereinstimmung in ihrer Struktur. CYP bezeichnet die Supergenfamilie, gefolgt von einer Zahl, welche die Familie charakterisiert. Ein Buchstabe bestimmt dann die Subfamilie, sowie eine weitere Zahl, die das genaue Gen benennt, beispielsweise CYP 1A1 (Nebert u. Mitarb. 1991). In der Phase 2-Reaktion sind die Glutathion S-Transferasen (GST) von besonderem Interesse in Bezug auf die Entstehung von Krankheiten, insbesondere Malignomerkrankungen, da sie die Konjugation von elekrophilen Substanzen (häufig Karzinogene) mit reduziertem Glutathion katalysieren (Jacoby u. Mitarb. 1978; Chasseaud u. Mitarb. 1979; Mannervik u. Mitarb. 1985). Die GST sind ubiquitär vorkommende Enzyme, die in den meisten menschlichen Zellen in hoher Konzentration vorliegen. Beispielsweise sind die GST eingebunden in die Körperabwehr gegen oxidativen Streß, wie er bei der Entstehung vieler Erkrankungen eine Rolle spielt (Ketterer u. Mitarb. 1990; Hayes u. Strange 1995). Es ist bekannt, daß sie unzählige hydrophobe Liganden an sich binden. Vier Klassen wurden bisher unter den zytosolischen GST identifiziert: alpha, µ, pi und tau. Nach der von Mannervik u. Mitarb. (1992) vorgeschlagenen Nomenklatur bezeichnet GST wieder die Supergenfamilie, gefolgt von einem (ursprünglich griechischen) Buchstaben, der die Familie benennt. Eine Zahl kennzeichnet wiederum das genaue Gen, z.B. GSTµ1 oder auch oft GSTM1 geschrieben.

Interindividuelle Unterschiede in der Aktivität der CYP und GST wurden zunächst auf der Ebene der Proteine nachgewiesen. Mit der Entwicklung molekulargenetischer Untersuchungstechniken verlagerte sich das Interesse zunehmend auf die Ebene der Gene.


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Diese Techniken sind sehr spezifisch, so daß bereits Allele, die sich in einer Base unterscheiden, identifiziert werden können, selbst wenn sie die Proteinstruktur nicht beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden die Polymerasekettenreaktion (PCR), Restriktionenzym-Verdauungen und Elektrophorese-Techniken benutzt, um Allelvarianten zu identifizieren.

Die PCR stellt die in-vitro Vervielfältigung (Amplifikation) einer bekannten DNA-Sequenz dar. Sie wurde Mitte der 80er Jahre (Saiki 1985; Mullis und Falloona 1987) entwickelt, obwohl ihre Prinzipien bereits ein Jahrzehnt früher beschrieben wurden (Panet und Khorana 1974). Die PCR wird benutzt, um Gene zu charakterisieren, zu klonen und zu exprimieren (Newton u. Mitarb. 1989). Ferner konnten mit ihr Mutationen vererbter Erkrankungen identifiziert werden, wie beispielsweise bei der Mukoviszidose (Friedman u. Mitarb. 1991), oder Erreger nachgewiesen werden (z.B. Borrelien). Die Ausgangssubstanzen für die PCR sind die zu vervielfältigende DNA-Vorlage, die DNA-abhängige Polymerase, die vier verschiedenen Desoxyribonucleotidtriphosphate (dNTP´s) und sog. Primer, kurze Oligonucleotide mit komplementärer Struktur zu den die DNA-Vorlage begrenzenden Sequenzen. Die Primer binden an die komplementäre Einzelstrang-DNA, nachdem diese thermisch bei 94-95°C denaturiert wurde. Die Verlängerung der Primer wird durch die DNA-Polymerase bei entsprechender Temperatur unter Verwendung der Desoxyribonucleinsäuren ausgeführt. Es resultiert ein neuer, der Vorlagen-DNA entsprechender Strang, der in weiteren Zyklen wiederum als DNA-Vorlage benutzt werden kann. Die PCR besteht aus einer Abfolge von Zyklen, welche eine Hitzedenaturierung der DNA, Abkühlung der Mixtur um die Primer an die Einzelstrang-DNA zu binden und die folgende Primerverlängerung beinhalten. Die Temperatur, bei der die Primer an die DNA-Vorlage binden, variiert, abhängig von der Länge und der Basenzusammensetzung der Primer. Nach dem Ende des ersten Zyklus verdoppeln sich die DNA-Stränge. Im weiteren Verlauf steigt die Anzahl der DNA-Stränge exponentiell an. Nach 25-30 Zyklen liegt in der Regel genug DNA vor, um weitere Experimente durchführen zu können, beispielsweise Enzymverdauungen und anschließende gelelektrophoretische Auftrennungen (White u. Mitarb. 1989).


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Die Verwendung von Restriktionsenzymen ist der meist benutzte Ansatz, um in der Molekulargenetik Allelvarianten zu erkennen. Die Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismen (RFLP) werden identifiziert, indem die DNA, die aus der PCR resultiert, mit Enzymen verdaut wird, die bestimmte Basensequenzen erkennen und daraufhin die Doppelstrang-DNA durchtrennen. Diese Enzyme werden Restriktionsenzyme genannt und kommen natürlich in vielen Bakterien vor, wahrscheinlich um vor Bakteriophagen zu schützen. Die Sequenzen, die sie erkennen und nach denen sie schneiden, werden Restriktionsstellen genannt. Im Rahmen der PCR-Technik wurde es möglich, kurze DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die solche Restriktionsstellen enthalten, um sie dann mit dem entsprechenden Restriktionsenzym zu verdauen. Da die meisten Mutationen entweder die Bildung einer Restriktionssequenz oder den Verlust einer solchen zur Folge haben, unterscheiden sich die Fragmente verschiedener Allele (Knippers 1997). Sie werden nach der PCR und Restriktionsenzymverdauung durch eine Elektrophorese in Agarosegelen unterschieden. Diese Technik trennt Moleküle entweder nach ihrer Größe und/oder Ladung. Da DNA negativ geladen ist und ein festes Ladungs/Größen-Verhältnis aufweist, besteht die Trennung der DNA-Fragmente mittels Elektrophorese generell auf Größenunterschieden der entsprechenden Fragmente. Dabei ist die Laufstrecke im Gel proportional zu dem Logarithmus des Molekulargewichts. Je nach zu erwartender Größe der DNA-Fragmente kann die Konzentration des Agarosegels verändert werden. Die DNA-Banden werden durch Ethidiumbromidfärbungen dargestellt. Diese Substanz lagert sich zwischen den Basen der DNA an, was wiederum zu einer Fluoreszenz unter UV- Licht führt.

Beispielsweise können mit den genannten Techniken von der menschlichen Glutathion S-Transferase P1 zwei Isoformen identifiziert werden, die sich nur durch eine Aminosäure unterscheiden (Ile/Val an Position 104). Dieser Veränderung der Aminosäuren liegt ein Austausch von Adenin gegen Guanin (A/G Transition) am Nukleotid 313 des GSTP1-Gens zugrunde. Die enzymatischen Eigenschaften der beiden Proteine zeigen deutliche Unterschiede in der Hitzestabilität sowie Affinität beispielsweise für 1-Chlor-2,4,-Nitrobenzen, einem im Zigarettenrauch enthaltenen Karzinogen (Ali-Osman u. Mitarb. 1997; Harries u. Mitarb. 1997).


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Andere Enzyme zeichnen sich durch ausgedehntere Veränderungen in ihren Genen aus. So gibt es beispielsweise bei der GSTT1 nur den Nachweis des intakten Gens, der mit einem funktionsfähigen Enzym korreliert ist oder den kompletten Verlust des Gens mit entsprechendem Verlust des funktionsfähigen Enzyms (Pemble u. Mitarb. 1992).

Von den CYP-Polymorphismen wurde das Gen CYP2D6 besonders ausführlich untersucht, sowohl phänotypisch, wie auch genotypisch, mit einer guten Korrelation zwischen phänotypischen und genotypischen Ergebnissen (Roots u. Mitarb. 1992a; Warwick u. Mitarb. 1994; Rannung u. Mitarb. 1995; Raunio u. Mitarb. 1995). Die zwei bisher identifizierten Mutationen führen zu Phänotypen mit unterschiedlicher katalytischer Aktivität, wobei das homozygot mutierte Gen ein Protein mit einer geringeren Affinität zum Substrat kodiert (poor metabolizer, PM) im Vergleich zum nicht mutierter Genotyp, dessen Enzym eine deutlich höhere Aktivität aufweist (extensive metabolizer, EM). Die Phänotypen können mittels Gelelektrophorese (Board u. Mitarb. 1981) oder chromatographischen Methoden (Hayes u. Mitarb. 1989) getrennt werden. In letzter Zeit werden auch hier zunehmend die o.g. molekulargenetische Verfahren eingesetzt, um direkt die zugrundeliegenden Allele zu identifizieren.

Andere im Rahmen der vorliegenden Studie untersuchte Genvariationen sind die Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) Mikrosatelliten-Polymorphismen. Bereits 1893 wurde von W. B. Coley beobachtet, daß schwere Infektionen zu einer Reduktion von malignen Tumoren führen können. Eine erhöhte Produktion von TNFalpha durch Monozyten konnte bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich nachgewiesen werden (Parks u. Mitarb. 1994; Knerer u. Mitarb. 1996). Viele Tumorwachstum-hemmende Effekte konnten auf die zytotoxischen Eigenschaften von TNFalpha zurückgeführt werden. TNFalpha kann beispielsweise bei Tumorzellen die Apoptose, den programmierten Zelltod, induzieren (Chouaib u. Mitarb. 1997). Diese Funktion hat dazu geführt, TNFalpha als mögliche therapeutische Substanz bei Tumorpatienten einzusetzen. Bisher ist dieser Einsatz aufgrund schwerer Nebenwirkungen limitiert. Neuere Methoden zur topischen und intraperitonealen Applikation oder der Gentransfer von TNFalpha in isolierte Zellen könnten Fortschritte erbringen (Eigler u. Mitarb. 1997). Neuere Studien zeigten, daß einige Tumoren, darunter Ovarialkarzinome, maligne


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Melanome und auch Kopf-Hals-Tumoren in der Lage sind, in-vivo TNFalpha zu produzieren (Parks u. Mitarb. 1994; Knerer u. Mitarb. 1996). TNFalpha dient in diesem Falle nicht mehr der Tumorabwehr, da die Zellen, die dieses Zytokin produzieren, gegen seine antikarzinogenen Eigenschaften immun sind, sondern weist dann prokarzinogene Eigenschaften wie beispielsweise eine Stimulation der Tumorangiogenese oder die Destruktion von Knochen- und Bindegewebe auf (Parks u. Mitarb. 1994; Knerer u. Mitarb. 1996; Eigler u. Mitarb. 1997).

Die physiologische Regulation der TNFalpha-Bildung erfolgt über ein Netzwerk mit anderen proinflammatorischen Zytokinen wie Interleukin IL 1 und IL 6 mit teilweise überlappender Funktion und antagonisierenden Zytokinen wie beispielsweise IL 10. Weitere TNFalpha hemmende Substanzen sind beispielsweise Kortikosteroide und Adenosin. Ferner kann die Halbwertzeit der TNFalpha-mRNA durch Medikamente, beispielsweise Thalidomid, beeinflußt werden (Parks u. Mitarb. 1994; Chouaib u. Mitarb. 1997; Eigler u. Mitarb. 1997).

Eine enge Verbindung der TNFalpha-Produktion zu Polymorphismen im HLA-System konnte nachgewiesen werden (Webb u. Mitarb. 1990; Pocoit u. Mitarb. 1993; Monos u. Mitarb. 1995). So zeigten HLA-DR2 Zellen, die mit Lektinen stimuliert wurden, eine geringere TNFalpha-Produktion als beispielsweise HLA-DR3 oder DR4-Zellen (Webb u. Mitarb. 1990). Mittlerweile sind mehrere Mikrosatelliten-Polymorphismen in und nahe den TNFalpha- und TNFbeta-Genen identifiziert worden (Udalova u. Mitarb. 1993). Dies sind Dinukleotid-Wiederholungen, deren Anzahl auf unterschiedlichen Allelen schwankt. Zwei dieser Mikrosatelliten-Sequenzen, TNFA und B genannt, sind eng miteinander verbunden und liegen 3,5 kb oberhalb des TNFbeta-Gens. Andere Regionen, die polymorphe Mikrosatelliten-Sequenzen enthalten, liegen 8-10 kb unterhalb des TNFalpha-Gens (TNFD) und ein weiterer Marker im ersten Intron von TNFbeta (TNFC). Der Mikrosatelliten-Polymorphismus TNFA weist 13 verschiedene Allele auf, der Marker TNFB 7, TNFC 2 und TNFD erneut 7 Allele (Udalova u. Mitarb. 1993). Obwohl diese Polymorphismen nicht in den transkribierten Gensequenzen von TNFalpha und TNFbeta liegen, konnten Zusammenhänge zwischen bestimmten Haplotypen (gemeinsame Vererbung von Allel-Kombinationen) und verschiedenen Erkrankungen nachgewiesen werden, bei denen immunologische Faktoren eine Rolle spielen. Hierzu gehören der Typ 1-Diabetes mellitus, der systemische Lupus erythematodes (SLE), das


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Sjögren-Syndrom und die primär chronische Polyarthritis PCP (Pocoit u. Mitarb. 1994; Monos u. Mitarb. 1995; Hajeer u. Mitarb. 1996). Darüber hinaus konnten Unterschiede in der Expression von TNFalpha und TNFbeta mit einigen Allelen und Haplotypen der Mikrosatelliten-Polymorphismen in Zusammenhang gebracht werden (Pocoit u. Mitarb. 1994). Die daraus hergeleitete Vermutung, daß die Mikrosatelliten-Polymorphismen in den TNF-Genen die individuelle Immunregulation und die Körperabwehr gegen Krebszellen beeinflussen könnten, macht diese Genvariationen zu möglichen Einflußfaktoren für die Empfänglichkeit gegenüber Karzinomerkrankungen. Tatsächlich konnten bereits einige Tumorerkrankungen, wie Kolonkarzinome und multiple Hautbasaliome mit bestimmten TNF-Mikrosatelliten-Allelen in Verbindung gebracht werden (Campbell u. Mitarb. 1994; Hajeer u. Mitarb. 1997).


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Mon Sep 30 17:18:40 2002