Matthias, Christoph: Molekularbiologische Untersuchungen zum Einfluß genetischer Wirtsfaktoren auf das Erkrankungsrisiko und den Krankheitsverlauf von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich

Kapitel 4. Material und Methoden

4.1 Patienten

Zwischen 1994 und 1997 wurden Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich aus den HNO-Kliniken des Virchow-Klinikums und der Charité der Humboldt-Universität zu Berlin in die Studie aufgenommen. Die Patientengruppe enthielt Männer und Frauen mit Mundhöhlen-, Pharynx- und Larynxkarzinomen, die sich mit erstmals diagnostizierten Tumoren in einer der Kliniken vorstellten oder im Rahmen der Tumorsprechstunde bis zu 5 Jahre nach der Tumorbehandlung betreut wurden. Neben den Patientendaten (Name, Geburtsdatum, Geschlecht, Alter zum Zeitpunkt der Diagnosestellung, Rauch- und Alkoholkonsum-Gewohnheiten bis zur Diagnosestellung) wurden die Tumorlokalisation, die TNM-Klassifikation (Hermanek u. Mitarb. 1987), der histologische Differenzierungsgrad des Tumors, die Art der Behandlung und die histologische Beurteilung der Resektionsränder in die Studie aufgenommen. Die regelmäßige Nachkontrolle in der Tumorsprechstunde sowie Auftreten und Zeitpunkt von Tumorrezidiven oder Zweittumoren wurde ebenfalls erfaßt.

Eine Kontrollgruppe von Personen, bei denen keine Malignomerkrankung vorlag, wurde ebenfalls in die Studie aufgenommen. Sie enthielt Patienten der HNO-Kliniken, die sich in der Alters- und Geschlechterverteilung wie auch im Alkohol- und Zigarettenkonsum möglichst


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wenig von der Tumorgruppe unterschieden, bei denen aber keine malignen oder entzündlichen Erkrankungen vorlagen. Von allen Studienteilnehmern wurde 10 ml Venenblut entnommen, aus dem nach Extraktion der Leukozyten-DNA die Genotypen an den einzelnen Genorten bestimmt wurden.

4.2 Methoden zur Bestimmung der Polymorphismen an Glutathion S-Transferase und Cytochrom P450 Genorten

DNA-Extraktion:

Die Extraktion der DNA aus Blutproben wurde mittels der Phenol/Chloroform-Methode und Alkoholpräzipitation durchgeführt. 3ml EDTA-Blut wurden nach Lagerung bei -20°C bei Raumtemperatur aufgetaut, in 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Fa. Falcon) überführt und 35 ml 4°C kalter Lysepuffer hinzugefügt, um die Blutzellen zu lysieren. Das Röhrchen wurde geschüttelt und anschließend bei 1500 G für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, um die Degradierung der DNA durch Nukleasen zu vermeiden. Der Zellniederschlag wurde in 1,5 ml kaltem (4°C) SE-Puffer und 0,17 ml 5% NaDS resuspendiert und mit 2 mg/ml Proteinase K bei 37°C über Nacht inkubiert, um Proteine zu denaturieren und die Zellkernmembranen zu lysieren. Die Proben wurden dann in 10 ml Glasröhrchen überführt und 1,5 ml Phenol, gesättigt mit Tris-Puffer (pH 8,0) und 8-Hydroxyquinolin, hinzugefügt. Das Gemisch wurde geschüttelt, bis die Proteine ausfielen. Das 8-Hydroxyquinolin schützte vor der Oxidation des Phenols, und seine gelbliche Farbe erlaubte jederzeit die Identifizierung der organischen Phase. Die Proben wurden dann erneut bei 1500 G für 10 Minuten zentrifugiert, um die organische von der wäßrigen Phase zu trennen. Die wäßrige Phase, in der sich die DNA befand, wurde in ein weiteres Röhrchen gegeben, das 1,5 ml Chloroform / Isoamylalkohol (24:1) enthielt, um Phenolreste auszuwaschen. Die Mischung wurde für 5 Minuten bei 1500 G zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde erneut mit einer Pasteurpipette in ein frisches Glasröhrchen überführt, das erneut die Chloroform / Isoamylalkohol-Lösung enthielt. Die Chloroform-Extraktion wurde wiederholt und die wäßrige Phase in ein neues Glasröhrchen überführt. 0,15 ml 3 M Natriumazetat (pH 5,3) und 3,3 ml reiner Alkohol wurden hinzugefügt und das Röhrchen vorsichtig geschwenkt, bis die


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DNA ausfiel. Die DNA wurde mit einem sterilisierten Glashaken aus der Lösung entfernt und in 0,1 ml sterilem, destilliertem Wasser in einem Eppendorfröhrchen resuspendiert. Kurzzeitige Lagerung der DNA erfolgte bei 4°C, Langzeitlagerung bei -20°C.

Polymerasekettenreaktion (PCR):

Alle Zusätze für die PCR wurden bei -20°C gelagert. Während sie vor dem Ansetzen der PCR-Lösung auftauten, befanden sich die zu untersuchenden DNA-Proben ebenfalls bei Raumtemperatur. Mikrozentrifugenröhrchen wurden mit den Patientenkodierungen beschriftet. Die PCR- Stammlösung wurde wie folgt zusammengestellt:

*1U entspricht der Menge an Enzym, das 10 Nanomol dNTP´s in löslichem Medium in 30 min. bei 74°C umsetzen kann.

Die Verdünnung erfolgte jeweils mit sterilem, destilliertem Wasser. Die Stammlösung wurde geschwenkt und jeweils 48 µl in jede der beschrifteten Patientenröhrchen gegeben. 2µl der zu untersuchenden DNA-Lösung wurden der PCR-Lösung hinzugefügt und das Gemisch mit 2 Tropfen flüssigem Paraffinöl abgedeckt, um eine Verdunstung bei den hohen Temperaturen während der PCR zu verhindern. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, um die Ölphase zu trennen. Anschließend wurden die Proben in den Thermozykler gestellt und das für die jeweiligen Primer ermittelte Programm (siehe unten) der PCR eingestellt.

Restriktionsenzymverdauung:

Die Identifizierung der meisten Mutationen erforderte die Verdauung des PCR-Produkts mit einem Restriktionsenzym, welches eine bestimmte Sequenz auf einem der beiden Allele erkennt. Die Restriktion wurde wie folgt durchgeführt:

Eine Stammlösung für 20 Verdauungen (oder entsprechend mehr) wurde angesetzt:


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10µl der Enzym-Stammlösung wurden mit 10µl PCR-Produkt vermischt und über Nacht bei der, für das jeweilige Enzym angegebenen Temperatur inkubiert. Anschließend wurden 8 ml Ladepuffer zu der Lösung hinzugegeben.

Agarose-Gelelektrophorese:

Eine Gelgußform wurde mit den entsprechenden Kämmen vorbereitet. Die Agarose wurde zwischen 2-4% Konzentrationen verwendet (Gelkonzentration abhängig von der DNA-Fragmentgröße) und in 0,5x TBE-Puffer unter gleichmäßigem Erhitzen gelöst. Nach anschließendem Abkühlen auf ca. 50°C wurden 2 ml Ethidiumbromidlösung (10mg/ml) hinzugefügt. Die Agarose wurde in die Gelform gegossen und etwa 30min. zum Aushärten bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurden die Kämme aus dem Gel entfernt, der Träger in die Elektrophoresekammer gesetzt und mit 300ml 0,5 x TBE-Puffer mit 5ml Ethidiumbromid (10mg/ml) übergossen, bis das Gel etwa 5 mm mit Puffer bedeckt war. 5-8µl der zu untersuchenden DNA-Proben wurden in die einzelnen Gelaussparungen geladen und die Elektrophorese bei ca. 100V für 40-60min. durchgeführt.

Reagentien und Puffer:

Borsäure, Tris HCl, EDTA, Chloroform, NaCl, MgCl, Hydrochlorsäure, Natrium- dodezylsulfat, Natriumacetat 8-Hydroxyquinolin, Isoamylalkohol und Sukrose von BDH Chemicals Ltd. Poole, Dorset, UK. Phenol von Rathburn Chemicals Ltd., Walkerburn, Schottland, Agarose von Promega, Southampton, UK.

dNTPs und Taq-Polymerase von Promega, Primer von Pharmacia Biotech, St Albans, UK.

Restriktionsenzyme von Promega oder New England Biolabs Hitchin, UK, Proteinase K von Sigma chemical, Poole, Dorset, UK.

Puffer:

TE-Puffer: 15,76g Tris-HCL, 18,6g Di-Natrium-EDTA, 100ml Aqua dest.

TBE-Puffer: 21,5g Tris-HCL, 1,9g Di-Natrium-EDTA, 11g Borsäure, 2000ml Aqua dest.


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Ladepuffer: 2,0ml Bromphenolblau (1mg/ml in TE Puffer), 0,35g SDS (Natrium-dodezylsulfat), 0,5g Ficoll 400 in 5ml TE-Puffer

SE-Puffer: 18,6g Di-Natrium-EDTA, 1,0g Sarkosyl, 100ml Aqua dest.

Lysepuffer: 600mg Tris-base, 870mg NaCl, 100ml Aqua dest.

Geräteausstattung:

1. PCR Thermal Cycler; Hybaid OmniGene und Perkin Elmer Thermal Cycler

2. Elektrophoresekammern: Hoefer PS 300 DC Power Supply und Pharmacia EPS 300/400.

3. Gel-Elektrophorese Apparat, Pharmacia GNA-200.

4. Zentrifugen; Sanyo MSE Mistral 1000 und MSE micro-centaur, Fisons, Loughborough, UK.

5. UV- Beleuchter; LKB 2011 Macro Vue, Pharmacia

6. Filmkamera und Filme (Polaroid 665) von Kodak, UK.

Jede Genvariation wurde mit einer spezifischen PCR identifiziert, deren Details im folgenden aufgeführt sind.

GSTM1-Mutationen:

GSTM1A-, B-, AB- und 0- Genotypen wurden mittels multiplex PCR-Reaktionen identifiziert. Jeder Ansatz bestand aus zwei PCR-Amplifikationen. Der eine enthielt einen komplementären Primer zu dem GSTM1A-Allel (5´-TTGGGAAGGCGTCCAAGCGC-3´) und der andere einen B-spezifischen Primer (5´-TTGGGAAGGCGTCCAAGCAG-3´). Die beiden Allele unterscheiden sich durch eine Base in Exon 7. Zusätzlich enthielten die Ansätze einen komplementären Primer zu Intron 6 (5´-GCTTCACGTGTTATGAAGGTTC-3´). Um nachzuweisen, daß das GSTM1-Gen überhaupt vorhanden war (es gibt auch den Verlust des funktionsfähigen Allels, ein sogenanntes Null-Allel) wurden Primer zu Exon 4 und 5 des Gens (5´-CTGCCCTACTTGATTGATGGG-3´ und 5´-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3´), einer Region, die bei Patienten mit dem Verlust des GSTM1-Gens nicht mehr vorhanden ist, hinzugegeben. Als interne Kontrolle wurden beta-Globin spezifische Primer

(5´-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3´ und 5´-CAACTTCATCCACGTTCACC-3´) verwendet. Ein Beispielgel zeigt Abb. A, Bahn 4-11, unten .


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GSTM3-Mutation:

3bp-Deletion in Exon 6 (MnlI- RFLP):

Spezifische Primer: (5´-CCTCAGTACTTGGAAGAGCT-3´und 5´-CACATGAAAGCCTTCAGGTT-3´)

Das PCR-Programm lautete: Denaturierung 94°C, 3min., dann 35 Zyklen, jeweils Denaturierung (94°C, 45sec.), Primeranbindung (58°C, 30sec.), Primerelongation (72°C, 45sec.). Abschließend wurde eine Primerelongation bei 72°C für 8min. durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt (273bp für das Wildtypallel, 270bp für das mutierte Allel) wurde bei 37°C mit MnlI verdaut. Die erhaltenen Fragmente (125bp, 86bp, 51bp und 11bp für das Wildtypallel; 134bp, 125bp und 11 bp für das mutierte Allel) wurden auf einem 4% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.

Die Banden nach der Elektrophorese zeigt Abb. A (Bahn 1-3 oben) .

GSTP1-Mutation:

A/G-Transition in Nukleotid 313 (Alw 261- RFLP):

Spezifische Primer: (5´-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3´und 5´-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3´)

Das PCR-Programm lautete: Denaturierung 95°C, 5min., dann 30 Zyklen, jeweils Denaturierung (94°C, 30sec.), Primeranbindung (55°C, 30sec.), Primerelongation (72°C, 30sec.). Abschließend wurde eine Primerelongation bei 72°C für 5min. durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde bei 37°C mit dem Enzym Alw261 verdaut. Die resultierenden Fragmente (176bp für den Wildtyp, 91bp und 85bp für das mutierte Allel) wurden auf einem 3% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Ein Beispiel-Gel zeigt Abb. F (Bahn: 5-7 oben).

GSTT1-Mutation:

Zum Nachweis bzw. Verlust des GSTT1-Gens wurde ein 480bp-Fragment des GSTT1-Gens, welches bei GSTT1 negativen Personen fehlt, mit folgenden Oligonokleotidprimern nachgewiesen: (5´-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3´ und 5´-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3´). Als interne Kontrolle wurde eine Region des beta-Globin-Gens (5´GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3´ und 5´-


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TGGTCTCCTTAAACCCTGTCTTG-3´) amplifiziert. Das PCR-Programm lautete: Denaturierung 94°C, 150sec, anschließend 39 Zyklen, jeweils Denaturierung (93°C, 60sec.), Primeranbindung (58°C, 60sec.), Primerelongation (72°C, 60sec.). Eine abschließende Elongation bei 72°C für 7 Minuten wurde angeschlossen. Die einzelnen Fragmente, GSTT1 positiv (480bp) und die beta-Globin Bande (325bp), wurden auf einem 2%-Gel aufgetrennt. Ein Beispiel zeigen Bahn 1 und 2 (unten) der Abb. A.

CYP2D6-Mutationen

Die zwei häufig im CYP2D6-Gen vorkommenden Mutationen wurden mit unterschiedlichen PCR-Reaktionen und nachfolgenden Enzymverdauungen nachgewiesen. Die Mutation der Intron 3 / Exon 4-Bindungsstelle (G/A) führt zu einem Verlust der Restriktionsstelle für das Enzym BstNI während die 2-Basenpaardeletion in Exon 5 eine Restriktionsstelle für Hpa II in dem mutierten Allel darstellt. Zusammen charakterisieren diese Genotypen 90% der Phänotypen bei Europäern; es gibt noch einige andere Mutationen im CYP2D6-Gen, die mit einer veränderten Expression des Enzyms einhergehen, in dieser Population aber sehr selten sind.

Intron 3/ Exon 4-G/A-Mutation (BstNI- RFLP):

Spezifische Primer zu Exon 3 / Intron 4: (5´-GCCTTCGCCAACCACTCCG-3´ und 5´-AAATCCTGCTCTTCCGAGGC-3´). Das PCR-Programm lautete: Denaturierung 94°C, 3min., dann 34 Zyklen, jeweils Denaturierung (94°C, 30sec.), Primeranbindung (60°C, 60sec.), Primerelongation (72°C, 60sec.). Ein abschließender Zyklus von Primerbindung und Elongation wurde bei 72°C für 8min. durchgeführt.

Das resultierende 334bp PCR- Produkt wurde bei 60°C mit BstNI, wie oben beschrieben, verdaut. Das Wildtyp-Allel enthält eine Schnittstelle nach 105bp (229bp/105bp), die im mutierten Allel fehlt (334bp). Die resultierenden Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden nach der Elektrophorese sind in einem Beispiel-Gel (siehe Tabellenanhang, Abb. B) dargestellt.

Exon 5-Deletion (HpaII-RFLP):

Spezifische Primer zu Exon 5 / Intron 5: (5´-GATGAGCTGCTAACTGAGCCC-3´ und 5´-CCGAGAGCATACTCGGGAC-3´). Das PCR- Programm entsprach dem der Intron 3/ Exon


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4-Mutation. Das resultierende 268bp PCR-Produkt wurde bei 37°C mit HpaII, wie oben beschrieben, verdaut. Der Wildtyp enthält nur eine Schnittstelle nach 80bp (80bp/188bp), das mutierte Allel eine zweite nach weiteren 168 bp (20bp/80bp/168bp). Die resultierenden Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden nach der Elektrophorese sind in Abb. C dargestellt.

CYP2E1-Mutationen

Die Mutation der 5´Endstelle im CYP2E1-Gen wurde ebenfalls mit einer PCR-Reaktion und nachfolgender Enzymverdauung nachgewiesen.

5´-End-Mutation (RsaI- RFLP):

Spezifische Primer: (5´-CCAGTCGAGTCTATACATTGTCA-3´ und 5´-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3´). Das PCR-Programm lautete: Denaturierung 94°C, 3min., dann 30 Zyklen, jeweils Denaturierung (94°C, 60sec.), Primeranbindung (58°C, 60sec.), Primerelongation (72°C, 60sec.). Ein abschließender Zyklus von Primeranbindung und Elongation wurde bei 72°C für 5min. durchgeführt.

Das resultierende 410bp PCR- Produkt wurde bei 37°C mit RsaI und mit PstI verdaut. Die resultierenden Fragmente (RsaI-Verdauung: 410bp bei dem Wildtyp, 360bp und 50bp bei dem mutierten Allel; PstI-Verdauung: 290bp und 120 bp) wurden in einem 2% Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Ein Beispielgel ist unter Abb. D dargestellt.

CYP1A1-Mutationen

In dem aus 7 Introns und 6 Exons bestehenden CYP1A1-Gen sind 4 Mutationen beschrieben worden (Cascorbi u. Mitarb. 1996), von denen die bei Europäern am häufigsten vorkommenden zwei untersucht wurden. Die m1-Mutation befindet sich in der 3´End-Region und führt zu einer T/C Transition, die im Enzym einen Thymin / Cytosin Austausch bewirkt. Die Transition stellt eine Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym MspI dar. Die 2. Mutation, m2 genannt, beruht auf einer A/G Transition in Exon 7, was in der Haem-Bindungsstelle des Enzyms zu einem Austausch von Isoleucin durch Valin führt. Beide Mutationen im CYP1A1-Gen wurden mittels PCR und Restriktionsenzymverdauungen identifiziert.

3´End-Region-T/C-Mutation, T/C-Mutation (MspI RFLP):


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Spezifische Primer: (5´-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3´und 5´-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3´)

Das PCR-Programm lautete: Denaturierung 94°C, 3min., dann 39 Zyklen, jeweils Denaturierung (95°C, 60sec.), Primeranbindung (66°C, 60sec.), Primerelongation (72°C, 60sec.). Das resultierende 340bp PCR-Produkt wurde bei 37°C mit MspI verdaut. Das Wildtyp-Allel weist keine Schnittstelle auf, das mutierte Allel führt zu einer Spaltung in ein 140bp und ein 200bp-Fragment. Die resultierenden Fragmente wurden auf einem 2% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Ein Beispiel-Gel zeigt Abb. E.

CYP1A1 Exon 7-A/G-Mutation (NcoI- RFLP):

Spezifische Primer: (5´-AAAGGCTGGGTCCACCCTCT-3´und 5´-AAAGACCTCCCAGCGGGCCA-3´)

Das resultierende 322bp PCR-Produkt wurde bei 37°C mit NcoI, wie oben beschrieben, verdaut. Alle Allele weisen eine Schnittstelle nach 70bp auf. Darüber hinaus verfügt das Wildtyp-Allel über eine weitere Schnittstelle nach 20bp, die im mutierten Allel nicht nachweisbar ist. Demnach zeigt das Wildtyp-Allel DNA-Fragmente von 20bp, 70bp und 232bp, das mutierte Allel nur 2 Fragmente von 70bp und 252bp. Diese wurden auf einem 4% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (Abb. F).

4.3 Tumor Nekrose Faktor (TNF)-Mikrosatelliten-Polymorphismen

Die polymorphen Mikrosatelliten-Marker TNFA mit der Wiederholung der Sequenz (AC/GT)n, TNFB (TC/GA)n, TNFC (TC/GA)n, sowie TNFD mit der Sequenz (TC/GA)n wurden ebenfalls mit PCR-Amplifikationen bestimmt. Spezifische Oligonukleotidprimer für die vier untersuchten Mikrosatellitenmarker wurden von der Fa. Pharmacia Biotech, St. Albans, UK bezogen, mit der Phosphoramiditmethode markiert und die Allele nach der Methode von Udalova u. Mitarb. bestimmt (1993). Für TNFA wurden folgende Primer verwendet:

5´-GCACTCCAGCCTAGGCCACAGA-3´und 5´-CCTCTCTCCCCTGCAACACACA-3´. Die Primer für TNFB lauteten: 5´-GCCTCTAGATTTCATCCAGCCACA-3´und 5´-GTGTGTGTTGCAGGGGAGAGAGAG-3´. Die Primersequenzen für TNFC lauteten: 5´-


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GGTTTCTCTGACTGCATCTTGTCC-3´ und 5´TCATGGGGAGAACCTGCAGAGAA-3´sowie für TNFD: 5´-CATAGTGGGACTCTGTCTCCAAAG-3´und 5´-TGAGACAGAGGATAGGAGAGACAG-3´. An der 5´-Endstelle wurden die Vorwärtsprimer mit 6-FAM-(für TNFC und TNFD) sowie HEX-(TNFA) und TAMRA-(TNFB) Fluoreszenslösungen markiert (Applied Biosystems). Die PCR-Stammlösung enthielt: 10mM Tris-HCl (pH 8,3) 50 mM KCl, 10mM MgCl2, 20µM jeder der dNTPs, ca. 200ng DNA der zu untersuchenden Patientenprobe und 0,5 U Taq-DNA-Polymerase. Die PCR wurde modifiziert nach Udalova u. Mitarb. (1993) mit folgendem PCR Programm durchgeführt: Für TNFA, B und C: 30 Zyklen, jeweils 95°C für 60 sec., 65°C für 60 sec. und 72°C für 45 sec., abschließend ein Zyklus von 72°C für 5 min. Bei TNFD wurde die Primeranbindung des 2. Schritts statt bei 65°C bei 60°C durchgeführt. Die anderen PCR-Bedingungen blieben unverändert. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2% Agarosegel in 1x TBE für 60 min. in einer Elektrophoresekammer bei 100V im Gel bewegt, dann je nach ihrer Bandenstärke so gepoolt, daß etwa gleiche Mengen des PCR-Produkts in jedem Teströhrchen vorhanden waren. DNA-Größenstandards (0,5µl Genescan ROX, Applied Biosystems) und 1,5µl formamidhaltige Dextranblau-Färbelösung wurde zu 0,4µl des gepoolten PCR-Produkts gegeben. Es folgte ein Denaturierungsschritt für 2 min. bei 95°C und sofortiges Kühlen auf Eis. Die Elektrophorese wurde auf einem denaturierten Polyacrylamidgel (6% Acrylamid/ bis-Acrylamid 16:1, Severn Biotechnologies) in einem automatisierten DNA-Sequenzierer (373A, Applied Biosystems) durchgeführt. Die Größe der erhaltenen DNA-Fragmente wurde in mobility units (mu) unter Verwendung der Genescan-672-Software (Macintosh) ermittelt. Anschließend konnte die genaue Allelgröße unter Verwendung der Genotyper-Software (Macintosh) ermittelt wurden. Kontroll-DNA-Proben bekannter TNF-Genotypen wurden auf jedem Gel mitgeführt.

4.4 Statistische Analyse

Bei der vorliegenden Untersuchung handelt es sich um einen explorativen Studienansatz. Die untersuchten Genvariationen wurden aufgrund ihres vermuteten biologischen Einflusses ausgewählt. Die gewonnenen Resultate sind daher als Hypothesen zu verstehen, die der Bestätigung unabhängiger Studien bedürfen. Patientendaten und Genotypen wurden in Excel-


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7-Tabellen (Microsoft) verschlüsselt und mit der Stata 5-Software (Stata Corporation) und Kwikstat 4 (TexaSoft) ausgewertet. Mit Chi-Quadrat-Tests wurden die einzelnen Untergruppen der Studie auf Homogenität untersucht. Logistische Regressionsanalysen wurden verwendet um die Bedeutung der Genotypen als Risikomarker zu berechnen. Signifikante Genotyp-Kombinationen wurden unterteilt in additive Effekte und synergistische Effekte, wenn die Interaktion unter Berücksichtigung der Einzeleffekte einen signifikanten Einfluß behielt. Regressionanalysen (Cox `s proportional hazards model) wurden verwendet, um festzustellen, welche Faktoren alleine oder in Kombination das Rezidivintervall beeinflußten. Bei Gegenüberstellungen im Rahmen der Fall-Kontroll-Studie wurden die Daten für Unterschiede in Alter, Geschlecht, Rauch- und Trinkgewohnheiten korrigiert, da Unterschiede für diese Parameter zwischen den Patientengruppen und der Kontrollgruppe bestanden. Bei vielen Analysen war es aufgrund der Fallzahlen notwendig, Patienten mit Tumoren in benachbarten anatomischen Regionen zusammenzufassen (z.B. Mundhöhlen- und Pharynxkarzinome, supraglottische und glottische Larynxkarzinome), obwohl bekannt ist, daß Unterschiede im biologischen Verhalten (z.B. Häufigkeit der Lymphknotenmetastasierung) bestehen. Bei der Auswertung wurde für Gruppenunterschiede in den Einflußfaktoren Alter, Geschlecht, Rauchen, Alkoholkonsum sowie Tumorlokalisation korrigiert und die statistischen Werte für beeinflussende Genotyp-Kombinationen ermittelt.

Generell wurden nur Ergebnisse, die ein Signifikanzniveau ple0,05 aufwiesen berücksichtigt. Bei der Betrachtung eines Effekts in kleineren Untergruppen wurde der Schwerpunkt auf die Entwicklung der odds ratio bzw. hazard ratio gelegt und vereinzelt p-Werte bis 0,1 berücksichtigt. Im Text wurde dann darauf verwiesen, daß keine Signifikanz vorlag.


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Mon Sep 30 17:18:40 2002