Matthias, Christoph: Molekularbiologische Untersuchungen zum Einfluß genetischer Wirtsfaktoren auf das Erkrankungsrisiko und den Krankheitsverlauf von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich

Kapitel 6. Diskussion

6.1 Patienten- und Tumorcharakteristika

Sowohl die Alters- wie auch Geschlechterverteilung in der Patientengruppe und den nach der Tumorlokalisation aufgestellten Untergruppen entsprachen denen vergleichbarer epidemiologischer Studien (Elwood u. Mitarb. 1984; Brugere u. Mitarb. 1986; Blot u. Mitarb. 1988). Auch die ausgeprägten Rauch- und Trinkgewohnheiten sind typisch für dieses Patientenkollektiv. Der Anteil von Alkoholabstinenzlern und Nichtrauchern war mit 2,6% in der vorliegenden Studie relativ niedrig. Er liegt meist bei 5-7%. Ferner bestätigte sich im vorliegenden Kollektiv, daß Alkoholkonsum für die Tumorentstehung in der sogenannten oberen Schluckstraße (Mundhöhle, Oro-Hypopharynx) von besonderer Bedeutung ist, während bei Larynxkarzinomen starkes Rauchen im Vordergrund steht (Elwood u. Mitarb. 1984; Brugere u. Mitarb. 1986; Blot u. Mitarb. 1988).

Die Auswahl der Kontrollpersonen war schwierig, da Personen im Alter von 50-70 Jahren, die mehr als 50g Alkohol täglich zu sich nehmen und mindestens 10-20 Packungsjahre an Zigarettenkonsum aufweisen, dabei aber gesund sind, schwer rekrutiert werden konnten. Folglich unterschied sich die Kontrollgruppe in ihrem Genußmittelkonsum signifikant von der Patientengruppe. Mit der heute verfügbaren statistischen Software lassen sich die Unterschiede im Genußmittelkonsum oder Alter zwischen Patienten- und Kontrollgruppe berücksichtigen, so daß eine in ihren Eigenschaften nicht völlig übereinstimmende Kontrollgruppe jedem Kollektiv, das möglicherweise ein selektioniertes Personenspektrum


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enthält, vorzuziehen ist. In der vorliegenden Studie wurden Personen mit verschiedenen nicht entzündlichen Erkrankungen (Septumdeviationen, Hörsturzpatienten, Mittelgesichtstraumen), die nicht an einer Malignomerkrankung litten, in die Kontrollgruppe aufgenommen. Alle Genotyp-Frequenzen wurden mit einer in North Staffordshire, England von 1986-1996 rekrutierten Kontrollgruppe von 1200 Personen verglichen und wiesen in keinem der untersuchten Polymorphismen signifikante Unterschiede auf. Obwohl gerade in den hier bestimmten Polymorphismen regionale und ethnische Unterschiede bekannt sind (Kato u. Mitarb. 1992; Crouau-Roy u. Mitarb. 1993; Zhao u. Mitarb. 1994; Masimirembwa u. Mitarb. 1995), kann dies als Indiz dafür genommen werden, daß die Kontrollgruppe die bei gesunden Nordeuropäern anzutreffenden Genotyp-Frequenzen repräsentiert.

Männer rauchten und tranken signifikant mehr Alkohol und wiesen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung häufiger fortgeschrittene Tumorstadien auf als Frauen. Geschlechtsunabhängig wurde durch starken Alkoholkonsum die Tumorlokalisation (Mundhöhlen / Pharynxtumoren), die Größe (T3-T4 Tumoren) sowie der Lymphknotenbefall signifikant beeinflußt. Die Primärtumor-Lokalisation hingegen beeinflußte signifikant das Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnose sowie den histologischen Differenzierungsgrad des Tumors. Der histologische Differenzierungsgrad beeinflußte wiederum die Tumorgröße und das Auftreten von Halslymphknoten-Metastasen. Diese Zusammenhänge sind vielfach von anderen Autoren beschrieben worden (Elwood u. Mitarb. 1984; Brugere u. Mitarb. 1986; Blot u. Mitarb. 1988; Jahnke 1995a; Evans 1997; Robin 1997). Durch die hier nachgewiesene Verflechtung der einzelnen Patientencharakteristika mit Tumoreigenschaften konnte gezeigt werden, daß es sich bei den untersuchten Studiengruppen um ein repräsentatives Kollektiv von Kopf-Hals-Tumor-Patienten handelt.

In der vorliegenden Arbeit sollte nicht auf Einzelheiten der Tumorbehandlung eingegangen werden. Details zur chirurgischen Tumorbehandlung wurden nur soweit in die Datenbank der Studie aufgenommen, sofern sie erforderlich waren, Informationen über den weiteren Krankheitsverlauf zu liefern. Da die Gruppe der Kopf-Hals-Tumoren ein sehr inhomogenes Krankheitsbild darstellt, mußten verschiedene Patienten- und Tumoreigenschaften berücksichtigt werden. Der Zeitpunkt der Diagnose unterscheidet sich sehr stark, von häufigen


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Frühdiagnosen bei glottischen Larynxkarzinomen aufgrund frühzeitig aufgetretener Heiserkeit bis zur Spätdiagnose bei Oro- und Hypopharynxkarzinomen, die meist erst in fortgeschrittenem Tumorstadium Schluckbeschwerden verursachen. Auch variiert die Häufigkeit des Lymphknotenbefalls bei Diagnosestellung zwischen benachbarten anatomischen Lokalisationen erheblich (Jahnke 1995a; Muir u. Weiland 1995; Evans 1997; Robin 1997). Einige Autoren konnten allein in Mundhöhle und Oropharynx 10 anatomische Untergruppen herausstellen, die sich in der Metastasierunghäufigkeit und dem Tumorverhalten signifikant unterschieden (Evans 1997). Lokalisation und Stadium der Tumoren sind für die Prognose dieser Erkrankung sicherlich von größerer Bedeutung als das histologische Grading oder genetische Wirtsfaktoren (Muir u. Mitarb. 1995, Evans 1997). Eine getrennte Analyse der hier untersuchten Genvariationen in einer so großen Anzahl von anatomischen Regionen würde eine Studiengruppe von mehreren tausend Patienten erforderlich machen und ist daher kaum zu realisieren. Um dennoch Aussagen über den Einfluß genetischer Wirtsfaktoren auf die Empfänglichkeit und den Krankheitsverlauf der Kopf-Hals-Karzinom-Patienten treffen zu können, wurden zunächst alle Patienten zusammengefaßt. In der weiteren Analyse wurden Patienten mit Tumoren in unterschiedlichen anatomischen Regionen, verschiedenen Tumoreigenschaften (histologischer Differenzierungsgrad, regionaler Lymphknotenbefall) sowie verschiedene Altersgruppen, Patienten mit unterschiedlichem Genußmittelkonsum und Patienten mit Tumorrezidiven und Mehrfachtumoren gesondert betrachtet.

Neben Parametern wie dem zervikalen Lymphknotenbefall, dem Tumorstadium und dem histologischen Differenzierungsgrad als Prognose-beeinflussende Faktoren (Muir u. Mitarb. 1995; Evans 1997; Robin 1997) werden in der Literatur eine Vielzahl weiterer Tumoreigenschaften, wie Tumorvaskularisation, Mitoseindex, Keratinisierung, verschiedene Wachstumsformen, Entzündungsparameter, Expression von Keratin 6, 13, 19, Expression von p53, EGFR (epithelial growth factor receptor) und Cyclin D1, Chromosomenverluste bestimmter Lokalisationen (LOH) sowie Onkogene der ras Familie, c-myc, int-2, hst-1 und bcl-1 beschrieben, die einen Einfluß auf den Krankheitsverlauf zu haben scheinen (Issing u. Mitarb. 1992; Janot u. Mitarb. 1996). Es ist jedoch kaum möglich, in einer umfangreichen


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epidemiologischen Studie all diese Parameter auf die Beeinflussung durch genetische Wirtsfaktoren zu untersuchen, so daß sich die vorliegende Studie auf die Parameter Tumorlokalisation und Ausdehnung zum Zeitpunkt der Diagnose, histologisches Grading, Halslymphknoten-Metastasierung, Tumorrezidive und Mehrfachtumoren beschränkte. Diese Faktoren sind nach wie vor die Parameter, welche die Prognose der Erkrankung am nachhaltigsten beeinflussen (Janot u. Mitarb. 1996; Evans 1997; Robin 1997). Beispielsweise sinkt mit der Diagnose von befallenen Halslymphknoten das 5-Jahresüberleben von Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren um 50%. Der prognostische Einfluß von einem Tumorrezidiv oder Zweittumor ist noch deutlich ausgeprägter (Evans 1997; Robin 1997).

6.2 Einfluß der Genvariationen in den Glutathion S-Transferasen und Cytochrom P450 auf die Entwicklung von Kopf-Hals-Tumoren

In der vorliegenden Arbeit hatte der GSTM1AB-Genotyp einen protektiven Einfluß auf die Entwicklung eines Kopf-Hals-Karzinoms, der für die Genotypen GSTM1A und GSTM1B nicht nachgewiesen werden konnte. Der hier durchgeführte PCR-Ansatz erlaubte es jedoch nicht, zwischen Individuen, die den Genotyp GSTM1BB tragen und dem Genotyp GSTM1B0 zu unterscheiden. Aus der Verteilung der einzelnen Allele kann davon ausgegangen werden, daß die Mehrzahl der GSTM1B-Individuen GSTM1B0-Genotypen trägt (der GSTM10 Genotyp liegt homozygot in 55-60 % der Population vor). Dasselbe gilt für GSTM1A. Nur der Nachweis von 2 GSTM1-Genkopien hatte einen protektiven Einfluß auf die Karzinomentwicklung, was auch als Gen-Dosis-Effekt bezeichnet wird (Brockmöller u. Mitarb. 1994; Strange u. Mitarb. 1998). Von anderen Autoren wurde bereits eine ähnliche Risikobeeinflussung des GSTM1-Polymorphismus auf Lungenkarzinome (Seidegard u. Mitarb. 1986; Kihara u. Mitarb. 1995) multiple Hautbasaliome (Haegerty u. Mitarb. 1996) und Blasenkarzinome (Brockmöller u. Mitarb. 1994) nachgewiesen. Die vorliegenden Ergebnisse an Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren unterstützen die Rolle des GSTM1-Polymorphismus bei Zigarettenrauch-abhängigen Karzinomerkrankungen.

Der GSTM3-Polymorphismus war hingegen nur bei Larynxkarzinom-Patienten mit einer Risikovermittlung verbunden. Bisher liegen epidemiologische Untersuchungen über diesen


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erst kürzlich identifizierten Polymorphismus nur bei Hautbasaliomen vor. Bei dieser Erkrankung konnte ein Einfluß der Genotyp-Kombination GSTM3AA und GSTM1 0 mit einem erhöhten Erkrankungsrisiko und dem Auftreten von multiplen Basaliomen in Verbindung gebracht werden (Yengi u. Mitarb. 1996). Eine Verbindung des GSTM3B-Allels mit dem GSTM1A-Allel, wie in dieser Studie beobachtet, ließ sich im vorliegenden Kollektiv bestätigen (Inskip u. Mitarb. 1995).

Interessanterweise wurde die Expression des GSTM3-Enzyms ausschließlich in den Zilien der respiratorischen Larynxschleimhaut nachgewiesen (Abb. 3a). Dies steht in Übereinstimmung mit ihrem protektiven Effekt überwiegend bei Larynxkarzinomen und weniger bei den Mundhöhlen / Pharynxkarzinomen. Die Zilien treten direkt mit den Partikeln des Zigarettenrauchs in Kontakt und stellen damit neben ihrer mechanischen Reinigungsfunktion bereits einen Teil der biochemischen Entgiftungsfunktion der Schleimhaut dar. An der großen Kontaktfläche der Zilien können demnach bereits polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe aus dem Zigarettenrauch zu nichttoxischen Substanzen entgiftet werden. Der Mechanismus, durch den der GSTM3-Polymorphismus das Erkrankungsrisiko beeinflußt, ist nicht eindeutig geklärt. Die Aktivität der durch die verschiedenen Allele kodierten Enzyme unterscheidet sich nach bisherigen Erkenntnissen nicht (Inskip u. Mitarb. 1995). Das GSTM3B-Allel enthält jedoch eine Erkennungssequenz für den Transkriptionsfaktor YY1, den das A-Allel nicht aufweist. Das Anbinden dieses Faktors kann zu einer stärkeren Expression des Enzyms führen, da er die Gentranskription von intragenen Orten aus reguliert (Flanagan 1995). Eine weitere Möglichkeit der Risikobeeinflussung ohne direkte Veränderung der Enzymaktivität wäre eine Verbindung zu anderen µ-Klasse-Genen, die auf benachbarten Chromosomenorten auf Chromosom 1p13 angeordnet sind. Solch ein Zusammenhang konnte zwischen dem GSTM1- und GSTM3-Polymorphismus gezeigt werden (Inskip u. Mitarb. 1995). Diese Hypothese wird durch Beobachtungen an Lungenkarzinom-Patienten gestützt, bei denen eine geringere Expression von GSTM3 bei gleichzeitigem Vorliegen des GSTM1 0-Genotyps festgestellt werden konnte (Anttila u. Mitarb. 1995).

Der GSTP1-Polymorphismus zeigte im Gegensatz dazu einen stärkeren Einfluß bei den Mundhöhlen / Pharynxkarzinom-Patienten. GSTP1 war immunhistochemisch insbesondere in


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den äußeren Schichten des pharyngealen Plattenepithels nachweisbar, zeigte jedoch auch eine Anfärbung der Zilien des respiratorischen Epithels (Abb. 4a, b). Der Polymorphismus im GSTP1-Gen hat einen Austausch von Valin gegen Isoleucin am Codon 105 des Enzyms zur Folge. Dieser Aminosäureaustausch nahe der hydrophoben Bindungsstelle bedingt eine Veränderung der spezifischen Aktivität und Affinität für elektrophile Substrate wie beispielsweise Benzpyren (Ali-Osman u. Mitarb. 1997; Harries u. Mitarb. 1997). Der hier ermittelte Einfluß des mutierten GSTP1-Genotyps legt nahe, daß diese Genveränderung für die Entgiftung von Zigarettenrauch-assoziierten Karzinogenen in der Pharynxschleimhaut bedeutsam ist. In geringerem Ausmaß ließ sich dieser Einfluß auch bei den Larynxkarzinom-Patienten feststellen. GSTP1 scheint im respiratorischen Epithel aber nicht so bedeutsam zu sein wie im Plattenepithel des Pharynx, das kein GSTM3 enthält. Von anderen Arbeitsgruppen wurde bereits ein Einfluß der GSTP1-Genotypen auf weitere Zigarettenrauch-assoziierte Karzinomerkrankungen wie Lungen- und Blasenkarzinome nachgewiesen (Harries u. Mitarb. 1997). Ferner konnte kürzlich in einer japanischen Studie ein Einfluß des GSTP1-Polymorphismus auf die Entwicklung von Ösophaguskarzinomen festgestellt werden, was die Bedeutung dieses Polymorphismus in der vorliegenden Studie unterstützt (Morita u. Mitarb. 1998). Es muß hier angemerkt werden, daß ein weiterer Polymorphismus im GSTP1-Gen am Nukleotid 341 beschrieben wurde (Ali-Osman u. Mitarb. 1997). Diese Mutation kommt meist zusammen mit der Mutation am Nukleotid 313 vor und wird als C-Allel bezeichnet. Ein Einfluß dieses C-Allels auf die Entwicklung von Glioblastomen wurde von dem Erstbeschreiber beobachtet (Ali-Osman u. Mitarb. 1997). In der vorliegenden Studie wurden GSTP1C-Allele nicht bestimmt.

Im Gegensatz zu den Glutathion S-Transferasen konnte ein Einfluß von den untersuchten Polymorphismen der Cytochrom P450 auf das Erkrankungsrisiko nicht nachgewiesen werden. Die Bedeutung der verschiedenen Allele in den Cytochrom P450 1- und 2-Familien als Einflußfaktoren auf Zigarettenrauch-assoziierte Tumorerkrankungen hat in den letzten Jahren viel Interesse hervorgerufen. Die Rolle von CYP2D6, CYP1A1 und CYP2E1 in der Beeinflussung des Krebsrisikos ist in der Literatur jedoch nicht einheitlich. Epidemiologische Studien konnten einen Einfluß von CYP2D6EM (extensive metabolizer) bei Raucherinnen auf


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die Entwicklung von Zervixkarzinomen nachweisen (Warwick u. Mitarb. 1994). Mittels phänotypisierender wie auch genotypisierender Methoden konnte weiterhin gezeigt werden, daß CYP2D6PM (PM =poor metabolizer) Enzyme seltener bei Lungenkarzinom-, Blasenkarzinom- und Magenkarzinom-Patienten vorkommen (Roots u. Mitarb. 1992b). Mit den hier untersuchten zwei Mutationen können ca. 90% der aktivitätsbeeinflussenden Genveränderungen bei Europäern erfaßt werden. Geringere Enzymaktivität (PM) wird bei etwa 7% der europäischen Bevölkerung nachgewiesen. Darüber hinaus ist jedoch bekannt, daß einige Personen über eine außergewöhnlich hohe Enzymaktivität verfügen, die eventuell auf einer Genduplikatur oder dem Vorhandensein besonderer Allele beruht (Guengerich 1995). Solche Individuen konnten bei den hier durchgeführten Untersuchungen aus methodischen Gründen nicht identifiziert werden.

Die CYP1A1 m2-Mutation zeigte als Einzelfaktor in der Fall-Kontroll-Studie den Trend, daß die homozygote Mutation einen prognostisch günstigen Faktor darstellen könnte. Aufgrund der Seltenheit dieses Genotyps wurde keine Signifikanz erreicht (p=0,10, OR=0,2). CYP1A1 hat als Einflußfaktor von Zigarettenrauch-assoziierten Tumorerkrankungen Interesse erregt, da CYP1A1 durch Benzpyren aus dem Zigarettenrauch induziert werden kann (Gonzales u. Mitarb. 1993b; Guengerich 1995) und in einer japanischen Studie gezeigt werden konnte, daß sowohl das mutierte Allel der 3´End Region (m1-Mutation) als auch das mutierte Allel im Exon 7 (m2-Mutation) alleine und in Kombination mit GSTM1 0-Homozygotie das Lungenkrebsrisiko beeinflußten (Nakaski u. Mitarb. 1993). Weitere japanische Studien legen ferner einen Einfluß der CYP1A1-Polymorphismen auf die Entstehung von Ösophaguskarzinomen nahe (Nimura u. Mitarb. 1997). Studien an europäischen Populationen konnten diesen Einfluß, zumindest was die m1-Mutation betrifft, bei Lungenkarzinom-Patienten nicht bestätigen (Hirvonen u. Mitarb. 1992; Drakoulis u. Mitarb. 1994). Die in der letzteren Studie berichtete Verbindung der Exon 7-Mutation mit der 3`End-Mutation konnte in der vorliegenden Studie ebenfalls nachgewiesen werden. Das seltenere Auftreten der Exon 7-Mutation im Vergleich zur 3´End-Mutation wurde hingegen nur bei den Mundhöhlen / Pharynxkarzinom-Patienten beobachtet. Diese Prozentzahlen sind jedoch aufgrund der Seltenheit der beiden Mutationen durch wenige Individuen stark beeinflußbar. Die Bedeutung


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der CYP1A1-Mutationen auf Zigarettenrauch-assoziierte Karzinomerkrankungen ist schwer bei nordeuropäischen Populationen nachzuweisen, da die 3´End-Mutation sehr viel seltener zu finden ist (7,3%, Drakaulis u. Mitarb. 1994) als in der japanischen Bevölkerung (33,2%, Nakashi u. Mitarb. 1993). Die Risikobeeinflussung durch den CYP1A1 m2-Polymorphismus in Kombination mit dem TNF-Allel B3 weist aber auf einen möglichen Einfluß auch im vorliegenden Kollektiv hin (siehe unten). Im CYP1A1-Gen wurden kürzlich noch weitere Mutationen identifiziert. Der als m3-Mutation beschriebene Polymorphismus tritt nach bisherigen Erkenntnissen nur in der schwarz-afrikanischen Bevölkerung auf. Eine weitere, im Exon 7 beschriebene Mutation (m4) tritt bei Europäern mit einer Häufigkeit von etwa 3% auf (Cascorbi u. Mitarb. 1996). Sie wurde in der vorliegenden Studie nicht bestimmt.

Dem CYP2E1-Polymorphismus konnte im untersuchten Patientenkollektiv weder bei der Determinierung des Erkrankungsrisikos noch bei der Beeinflussung von Tumor- oder Prognosekriterien ein Einfluß zugeordnet werden. In japanischen Studien wurde der CYP2E1-Polymorphismus mit dem Lungenkrebsrisiko in Verbindung gebracht (Kato u. Mitarb. 1992; Uematsu u. Mitarb. 1994). Die Ergebnisse ließen sich in einer finnischen Population jedoch nicht nachweisen (Hirvonen u. Mitarb. 1993). Ferner konnte ein ausgeprägter Einfluß auf die Entstehung von Ösophaguskarzinomen in einer chinesischen Studie aufgezeigt werden während ein Einfluß von GSTM1-, GSTT1- und GSTP1-Polymorphismen dort nicht nachweisbar war (Lin u. Mitarb. 1998). Diese Ergebnisse sowie deutlich unterschiedliche Genotyp-Frequenzen in den Kontrollgruppen weisen auf ausgeprägte ethnische Unterschiede an diesen Genorten hin und lassen einen Vergleich asiatischer Kollektive mit europäischen Patientengruppen wenig sinnvoll erscheinen. Nach den vorliegenden Ergebnissen scheinen die hier untersuchten CYP-Polymorphismen aber eine untergeordnete Rolle in der Beeinflussung des Erkrankungsrisikos von Kopf-Hals-Karzinomen zu spielen.

Einen Einfluß von GSTM1-Genvariationen und in geringerem Maße auch vom GSTT1-Polymorphismus konnte bereits von einer amerikanischen Arbeitsgruppe aufgezeigt werden (Trizna u. Mitarb. 1995). Andere Autoren konnten allerdings keinen Einfluß der Polymorphismen an den GSTM1, GSTT1 und CYP1A1-Genorten auf das Erkrankungsrisiko von 185 Kopf-Hals-Karzinom-Patienten nachweisen (Oude-Ophuis u. Mitarb. 1998).


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Erst kürzlich erschien eine Reihe weiterer Fall-Kontroll-Studien über Tumoren im oberen Aerodigestivtrakt. Von einigen Autoren konnten Risiko-vermittelnde Einflüsse der GST in diesem Patientenkollektiv bestätigt werden (bei Kopf-Hals-Karzinomen (phänotypisch): Lafuente u. Mitarb. 1998; bei Larynxkarzinomen: Jourenkova u. Mitarb. 1998; bei Mundhöhlenkarzinomen: Hung u. Mitarb. 1997; Park u. Mitarb. 1997), andere konnten signifikante Unterschiede in den Genotyp-Frequenzen nicht bestätigen (Gonzalez u. Mitarb. 1998). Die Patientenzahl dieser Studien lag jedoch teilweise unter 100 Patienten. Insbesondere die regionalen Unterschiede der GSTM3- und GSTP1-Genpolymorphismen weisen aber auf einen differenzierten Einfluß der GST- und CYP-Genvariationen in den einzelnen anatomischen Regionen des Kopf-Hals-Bereichs hin. Dies könnte eine Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse verschiedener Gruppen sein.

Die bislang untersuchten Mutationen stellen wahrscheinlich nur einen kleinen Teil aus dem gesamten Spektrum der Allelvariationen in den GST- und CYP-Genen dar (Rannung u. Mitarb. 1995). Die fortlaufende Identifizierung weiterer Genpolymorphismen in den detoxifizierenden Enzymen zeigt der Nachweis des C-Allels im GSTP1-Gen (Ali-Osman u. Mitarb. 1997), der Nachweis der polymorphen GSTT2 (Coggan u. Mitarb. 1998) sowie der m4-Polymorphismus im Exon 7 des CYP1A1-Gens (Cascorbi u. Mitarb. 1996). Auch wurden kürzlich Polymorphismen in den Genen der N-Azetyltransferase, einem weiteren Phase-2-Enzym, mit einem veränderten Larynxkarzinom-Risiko in Verbindung gebracht (Henning u. Mitarb. 1999). Weiterhin wurde ein Genpolymorphismus in der Alkoholdehydrogenase-3 identifiziert und mit einem erhöhten Mundhöhlenkarzinom-Risiko in Verbindung gebracht (Coutelle u. Mitarb. 1997; Harty u. Mitarb. 1997).

Das Ausmaß der Risikobeeinflussung durch Polymorphismen in den entgiftenden Enzymen war in der vorliegenden Studie ähnlich dem für die GST- und CYP-Polymorphismen ermittelten Risikofaktoren bei anderen Karzinomerkrankungen (Magenkarzinome, Smith u. Mitarb. 1995; Astrozytome und Meningeome, Elexpuru-Camiruaga u. Mitarb. 1995; Zervixkarzinome, Ambrosone u. Mitarb. 1995; Hautbasaliome, Yengi u. Mitarb. 1996). Da die Anzahl der risikovermittelnden Gene bisher weder bekannt noch in ihrer Größenordnung abzuschätzen ist, bleibt auch die vorhandene Studie nur ein erster Schritt auf dem Weg, die


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genetischen Risikofaktoren für die Entwicklung von Kopf-Hals-Karzinomen zu identifizieren. Mit der zunehmenden Kenntnis über risikovermittelnde Genvariationen liegt das Potential dieser Untersuchungen in der Konstruktion von Genotyp-Kombinationen, die deutlich höhere Risikobeeinflussungen implizieren und eventuell in der klinischen Routine eingesetzt werden können. Die bisher nachgewiesenen Genotypen sind aber entweder zu selten oder mit einer zu geringen Risikobeeinflussung verbunden, um ihre Anwendung in der Klinikroutine zu empfehlen.

6.3 Einfluß der TNF-Mikrosatelliten-Polymorphismen auf die Entwicklung von Kopf-Hals-Tumoren

Das TNFB3-Allel war bei Patienten mit Larynxkarzinomen sowohl heterozygot als auch homozygot (B3/B3-Genotyp) signifikant vermehrt nachweisbar, was eine Bestätigung für dessen Risikovermittlung ist. Die Interaktion zwischen dem TNFB3-Allel und dem Wildtyp am m2-Genort von CYP1A1 führte zum Anstieg des Erkrankungsrisikos bei dem Vorliegen einer Kopie des B3-Allels auf 3,9 sowie auf 8,8 für Homozygotie an B3. Der CYP1A1 m2-Polymorphismus bewirkte nur in Zusammenhang mit dem TNFB3-Allel eine Risikobeeinflussung auf die Larynxkarzinom-Entstehung. Es ist bekannt, daß TNFalpha die Expression von CYP-Genen beeinflussen kann (Stern u. Mitarb. 1996), was eine mögliche Erklärung für diese Interaktion sein könnte. Ein Zusammenhang zwischen CYP-Polymorphismen mit den hier untersuchten TNF-Genvariationen ist bisher in der Literatur nicht beschrieben worden. Bei Vorliegen dieser Genotyp-Kombination wurden Risikofaktoren erreicht, wie sie für einen geringen bis mittleren Alkohol- und Zigarettenkonsum in epidemiologischen Untersuchungen ermittelt wurden (Elwood u. Mitarb. 1984; Blot u. Mitarb. 1988). Ein Einfluß dieser Größenordnung konnte in der vorliegenden Arbeit bei Kopf-Hals-Tumoren erstmalig genetischen Konstellationen zugeordnet werden.

Das TNFB3-Allel wurde als Teil eines Risiko-beeinflussenden Haplotypen (miteinander zusammen vererbte Allele) erstmals bei Patienten mit primär chronischer Polyarthritis und Zöliakie nachgewiesen (Hajeer u. Mitarb. 1996; McManus u. Mitarb. 1996). Bei diesen Patienten war eine Verbindung zu bestimmten HLA-Genotypen feststellbar, in deren


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Nachbarschaft die Gene für TNFalpha und TNFbeta im MHC auf Chromosom 6p21 liegen. Ein weiterer Haplotyp, der ebenfalls das TNFB3-Allel enthält, trat gehäuft bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes auf (Hajeer u. Mitarb. 1997). Darüber hinaus ließ sich ein Einfluß des B3-Allels auf das Erkrankungsrisiko von Kolonkarzinomen nachweisen (Honchel u. Mitarb. 1996). In weiteren Untersuchungen konnte das TNFB3-Allel mit einer verstärkten Fähigkeit TNFalpha zu produzieren in Verbindung gebracht werden (Pocoit u. Mitarb. 1993). Ob diese Beeinflussung der TNFalpha-Produktion durch einen direkten Einfluß des TNFB3-Allels auf die Expression von TNFalpha bedingt ist oder ob das TNFB3-Allel mit anderen Genvariationen dieser Region in Verbindung steht, ist bisher nicht bekannt. Bei Kolonkarzinom-Patienten wurde ein hoher Anteil von Instabilitäten an den TNF-Mikrosatelliten-Markern bei dem Vergleich von Blut- und Tumor-DNA festgestellt (Honchel u. Mitarb. 1996). Erste Untersuchungen unserer Gruppe konnten diese Beobachtung bei Kopf-Hals-Tumoren bestätigen (unveröffentlichte Ergebnisse). Bei Lungenkarzinomen, Ovarialkarzinomen, Mammakarzinomen und Kopf-Hals-Karzinomen kommen DNA-Verluste auf Chromosom 6p häufig vor, was ein Hinweis dafür sein kann, daß auf dem verlorengegangenen Chromosomenabschnitt ein Tumorsuppressorgen lokalisiert ist (Wooster u. Mitarb. 1994; Field u. Mitarb. 1995a, b). Die Beeinflussung eines solchen Tumorsuppressorgens durch die TNF-Mikrosatelliten-Polymorphismen wäre möglich (McManus u. Mitarb. 1996). Weitere potentielle Zielorte stellen der polymorphe TNF2-Promoter (Wilson u. Mitarb. 1993), der mit der p53-Regulation in Verbindung gebrachte waf1-Polymorphismus und die Allelvariationen im Gen des Zellzyklus-regulierenden Proteins Cyclin D3 dar.

Die genaue Funktion der identifizierten TNF-Mikrosatelliten-Polymorphismen ist bisher nicht bekannt. Obwohl sie nicht in Genabschnitten liegen, die in Proteinstrukturen überschrieben werden und teilweise weit von den Strukturgenen TNFalpha und TNFbeta entfernt sind, haben sie wahrscheinlich regulierende Einflüsse auf TNFalpha und TNFbeta. (Pocoit u. Mitarb. 1993; Udalova u. Mitarb. 1993).


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Die Rolle von TNFalpha als Immunmodulator bei Infektions-, Autoimmun- und einigen Malignomerkrankungen wurde in zahlreichen Studien untersucht (Carroll u. Mitarb. 1990; Larrick u. Mitarb. 1990; Parks u. Mitarb. 1994; Knerer u. Mitarb. 1996).

TNFalpha ist verantwortlich für einige lokale und systemische Effekte des Tumors wie Zerstörung von Tumorgewebe und Kachexie (Carroll u. Mitarb. 1990; Larrick u. Mitarb. 1990).

Heute wird TNFalpha eine komplexe Rolle in der Steuerung von zellproliferativen Prozessen, dem Zellzyklus und der Apoptose zugeschrieben. TNFalpha kann Phagozyten und Endothelzellen aktivieren, die Expression von MHC-Antigenen sowie Onkogenen, Transkriptionfaktoren, Entzündungsmediatoren und Akutphase-Proteinen steuern (Old 1985; Vilcek und Lee 1991).

Ein Einfluß von Variationen im MHC, in dem auch die TNF-Gene liegen, auf das Erkrankungsrisiko von Larynxkarzinomen konnte bereits gezeigt werden (De Vries u. Mitarb. 1987). Diese Untersuchungen beruhen jedoch nicht auf dem Nachweis genetischer Veränderungen, sondern auf der immunhistochemischen Identifizierung verschiedener HLA-Typen bei Larynxkarzinom-Patienten und Patienten mit Mehrfachkarzinomen im oberen Aerodigestivtrakt. Diese Beobachtungen führten dazu, genetisch determinierte Veränderungen zu postulieren, die bei einigen Karzinom-Patienten zu einer veränderten Immunabwehr gegenüber Tumoren führen, welche durch von außen einwirkende Giftstoffe hervorgerufen werden (De Vries u. Mitarb. 1987). Mit der Identifizierung Risiko-beeinflussender Mikrosatelliten-Polymorphismen in den TNF-Genen konnte diese Vermutung durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt werden.

6.4 Patienten unterschiedlicher Altersgruppen und mit unterschiedlichem Alkohol- und Zigarettenkonsum

Patienten unter dem 50. Lebensjahr teilten nicht den protektiven Einfluß des GSTM1AB Genotyps. Das TNFD3-Allel war hingegen nur in dieser Altersgruppe signifikant häufiger nachweisbar. Patienten, die in fortgeschrittenem Alter an einem Kopf-Hals-Karzinom erkrankten, teilten nicht den in der Gesamtgruppe nachgewiesenen Risikofaktor des TNFB3-Allels. Im CYP2D6-Gen waren die Mutationen, die mit einer verminderten Enzymaktivität


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einhergehen und nach der 2-phasigen Entgiftungstheorie (siehe Abb.1) als protektiv eingeschätzt werden, signifikant häufiger unter den >80-jährigen Karzinompatienten vertreten.

Es wird seit einiger Zeit vermutet, daß insbesondere Larynxkarzinom-Patienten altersabhängig eine unterschiedliche Pathogenese der Erkrankung aufweisen (Shervo u. Mitarb. 1987). Das Fehlen des protektiven Einflusses der GST-Polymorphismen, insbesondere GSTM1AB, bei Patienten unter dem 50. Lebensjahr sowie der Nachweis besonderer TNF-Allele legen den Schluß nahe, daß bei jungen Patienten besondere Genkonstellationen eine Rolle spielen, die Immunreaktionen gegen Tumorzellen beeinflussen, während Unterschiede im Karzinogenstoffwechsel weniger bedeutsam scheinen. Untersuchungen an dieser Patientengruppe sind in der Literatur aber bisher nicht mit statistischen Berechnungen belegt, sondern nur als Beobachtungen dargestellt (bei Kopf-Hals-Karzinomen: Clark u. Mitarb. 1982; bei Larynxkarzinomen: Webber u. Mitarb. 1984 sowie Shervo u. Mitarb. 1987). Idealerweise sollte für diese Patientengruppe eine noch niedrigere Altersgrenze als die in der vorliegenden Studie definiert werden. Eine Altersgrenze von 40 oder 45 Lebensjahren ließ aufgrund geringer Fallzahlen in der vorliegenden Studie jedoch keine statistischen Berechnungen zu. In den o.g. Kollektiven von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich (bzw. Larynx) waren nur etwa 2-3% jünger als 40 Jahre alt (Clark u. Mitarb. 1982; Webber u. Mitarb. 1984; Shvero u. Mitarb. 1987).

Systematische Untersuchungen über Besonderheiten bei Kopf-Hals-Karzinom-Patienten in fortgeschrittenem Alter liegen in der Literatur ebenfalls nicht vor. Die verfügbaren Studien beinhalten teilweise konträre Aussagen. So wurde bei Patienten fortgeschrittenen Alters teilweise ein geringeres Rezidivrisiko nach Tumorbehandlung beobachtet (Magnano u. Mitarb. 1995) andererseits aber auch eine erhöhte Anzahl von Tumorrezidiven und zervikalen Lymphknotenmetastasen (Janot u. Mitarb. 1996). Ergebnisse der vorliegenden Studie legen den Schluß nahe, daß die Entstehung eines Kopf-Hals-Karzinoms im fortgeschrittenen Alter zunehmend unabhängig von genetischen Risikofaktoren als zufälliges Ereignis auftritt.

In der Literatur wird ferner ein relativ konstanter Prozentsatz von etwa 5% der Kopf-Hals-Karzinom-Patienten berichtet, welche die Hauptrisikofaktoren, Rauchen und Alkoholkonsum, nicht teilen (Elwood u. Mitarb. 1984; Blot u. Mitarb. 1988; Brugere u. Mitarb. 1986).


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Untersuchungen über die Ursache der besonderen Empfänglichkeit dieser Patientengruppe für die Karzinomentstehung liegen ebenfalls nicht vor. Der Einfluß der bestimmten Genvariationen bei diesen Patienten zeigte einige Parallelen zu den altersabhängigen Einflüssen. Erneut waren die als protektiv in der Gesamtgruppe identifizierten GST-Genotypen (GSTM1AB, GSTM3BB) sowie die CYP1A1 homozygoten Wildtypen in der Gruppe der Patienten mit geringer Toxinaufnahme nicht nachweisbar. Statistische Signifikanz wurde, da diese Genotypen bereits in der Gesamtpatientengruppe reduziert waren, nicht erreicht. Das TNFA6-Allel, welches im Rahmen anderer Studien bereits mit einer verminderten Bildung von TNFalpha in Verbindung gebracht werden konnte (Pocoit u. Mitarb. 1993) war bei Patienten mit geringem Genußmittelkonsum signifikant häufiger nachweisbar. Variationen am TNFA-Marker, wenn auch nicht das Vorliegen des A6-Allels, wurden bereits mit Kolonkarzinomen in Zusammenhang gebracht (Campbell u. Mitarb. 1994). Aus diesen Beobachtungen läßt sich vermuten, daß bei dieser Patientengruppe, ähnlich wie bei den jungen Patienten besondere immunologische Konstellationen bedeutsam sind.

In der Gruppe der Patienten mit hohem Alkohol- und Zigarettenkonsum konnten im Vergleich zur Gesamtgruppe keine signifikanten Unterschiede in den hier bestimmten Genotyp-Frequenzen festgestellt werden. Alle identifizierten Risikofaktoren waren in diesem Patientenkollektiv seltener vorhanden, so daß sich keine Unterschiede zur Kontrollgruppe ergaben, was den Schluß zuläßt, daß in dieser Untergruppe die Karzinomerkrankung durch ein übermäßiges Einwirken von Karzinogenen unabhängig von einem Risiko-Genotyp oder protektiven Genotyp entsteht.

6.5 Patienten mit Mehrfachtumoren

Nach der von Slaughter u. Mitarb. (1953) ursprünglich für Mundhöhlenkarzinome aufgestellten Feldkanzerisierungstheorie, die heute aber für den gesamten oberen Aerodigestivtrakt als bedeutsam angesehen wird (Dhooge u. Mitarb. 1998), erwirbt die gesamte Mukosa durch Karzinogeneinwirkung ein malignes Potential. Patienten, bei denen das seltene Ereignis der Tumorentstehung zwei- oder mehrmals unabhängig voneinander auftritt, lassen eine genetisch bedingte Disposition vermuten. So stellte im vorliegenden


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Kollektiv die Gruppe der Patienten mit Mehrfachtumoren bei den Genotypisierungen die Subpopulation innerhalb der Kopf-Hals-Tumor-Patienten dar, die sich in ihren Genotyp-Frequenzen am deutlichsten sowohl von der Kontrollgruppe als auch von den Patienten mit Einfachtumoren unterschied. Dies betraf das häufige Auftreten des GSTM3AA-Genotyps, der bereits in der Gesamtpopulation als Risikofaktor identifiziert werden konnte. Ähnliches gilt für den Genotyp GSTT1 0. Der Verlust des funktionsfähigen GSTT1-Gens war unter den Patienten mit Mehrfachtumoren doppelt so häufig nachweisbar wie in der Kontrollgruppe oder bei den Patienten mit Einfachtumoren. Am CYP1A1 m2-Genort waren die protektiven Genotypen, die mit der m2-Mutation auf einem oder beiden Allelen einhergehen, signifikant seltener nachweisbar. Unter den TNF-Mikrosatelliten-Markern trat das bereits im Gesamtkollektiv ermittelte Risiko-Allel TNFB3, wie auch der homozygote Genotyp, bei den Patienten mit Mehrfachtumoren in weiter zunehmender Frequenz auf. Eine signifikante Interaktion zwischen dem TNFB3-Allel und dem CYP1A1 m2-Polymorphismus konnte aufgrund der geringen Anzahl von Patienten mit Mehrfachtumoren nicht nachgewiesen werden.

Die Entwicklung eines Zweittumors im oberen Aerodigestivtrakt ist einer der Hauptgründe für Therapieversagen und Mortalität nach einer kurativen Behandlung eines Kopf-Hals-Karzinoms. Ein Tumorrezidiv des Indextumors tritt in dieser wie in anderen Studien meist innerhalb der ersten zwei Jahre nach der Behandlung auf. Da Zweitkarzinome aber in einer relativ konstanten Rate von 3% jährlich auftreten, konzentriert sich die klinische Nachbetreuung von Kopf-Hals- Tumor-Patienten 24-36 Monate nach Behandlung des Indextumors zunehmend auf die Diagnose von Zweittumoren (Jovanovic u. Mitarb. 1994; Copper u. Mitarb. 1995; Dhooge u. Mitarb. 1998). Diese ist aufgrund unübersichtlicher anatomischer Verhältnisse nach ausgedehnten Resektionen und in oftmals bestrahltem Gebiet deutlich erschwert, was wiederholt zu dem Versuch geführt hat, Hochrisiko-Patienten für die Entwicklung von Zweitkarzinomen zu identifizieren und diese einer intensiveren Nachbetreuung zuzuführen (De Vries u. Mitarb. 1986, 1987; Bongers u. Mitarb. 1995; Dhooge u. Mitarb. 1998). Als erwiesen gilt bisher lediglich, daß Patienten, die zum Zeitpunkt des Indextumors nicht rauchten oder Alkohol tranken, ein geringes Risiko für das Auftreten


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eines Zweitkarzinoms aufweisen; eine für die Nachbetreuung wenig hilfreiche Erkenntnis, da dies höchstens 5-10% der Patienten eines Kollektivs sind (Dhooge u. Mitarb. 1998). Die Identifizierung der o.g. Risiko-Genotypen für die Entstehung von Mehrfachtumoren könnte dazu beitragen, die Gruppe der Kopf-Hals-Tumor-Patienten entsprechend ihrer Genotyp-Konstellation unterschiedlich intensiv nachzubetreuen. Da die berechneten odds ratios für alle 4 Genotypen bei 2,5-5 lagen und die Risikoallele unter Patienten mit Mehrfachtumoren relativ häufig waren (CYP1A1 m2-Wildtyp: ca. 85%; GSTT10: ca. 40%; GSTM3AA: ca. 70%; TNFB3-Allel: ca. 30%) scheint eine

Anwendung dieser Risikomarker in der Tumornachsorge nicht mehr ganz abwegig zu sein.

6.6 Beeinflussung des Tumorverhaltens durch die bestimmten Genvariationen

Im Rahmen durchgeführten Studie ließ sich bestätigen, daß Tumorrezidive meist im Zeitraum von 6 Monaten bis zu 2 Jahren nach der Diagnose des Primärtumors auftreten (hier 32 der 43 Tumorrezidive) (Schwartz u. Mitarb. 1994; Jones u. Mitarb. 1995; Magnano u. Mitarb. 1995; Muir u. Weiland 1995). Nach 3-5 Jahren sind Tumorrezidive sehr selten, was dazu geführt hat, daß einige Autoren jedes nach 3 Jahren auftretende Malignom als Zweittumor werten (Schwartz u. Mitarb. 1994; Jones u. Mitarb. 1995). Im Zeitraum unter 6 Monaten nach der Primärtumor-Behandlung ist erneutes Tumorwachstum meist auf nachgewachsene Residualtumorzellen zurückzuführen (Bedi u. Mitarb. 1996), weshalb in der hier vorliegenden Studie jegliches Tumorwachstum bis zu 6 Monaten nach der Behandlung nicht als Rezidiv sondern als Residualtumor gewertet wurde. Die stärkste Beeinflussung der Rezidivhäufigkeit zeigten klinische Parameter wie die Tumorausdehnung und der histologische Differenzierungsgrad des Malignoms. Die Beeinflussung der Rezidivhäufigkeit durch den initialen Halslymphknotenbefall war geringer als erwartet. Hier sei jedoch darauf verwiesen, daß bei der vorliegenden Berechnung nur lokoregionäre Rezidive nach histologisch überprüfter R0-Resektion gewertet wurden, um bei der Untersuchung genetischer Variationen keine Beeinflussung durch Therapiefehler zu erhalten. Therapieunabhängig wäre sicherlich ein wesentlich stärkerer Einfluß des initialen Halslymphknotenbefalls auf die Tumorrezidivrate zu erwarten gewesen. Der Alkoholkonsum hatte lediglich einen


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signifikanten Einfluß auf die Rezidivhäufigkeit von Pharynxkarzinomen. Geschlechtsabhängige Unterschiede waren nur sehr diskret auszumachen. Die Beeinflussung der Tumorrezidivrate durch die genannten Faktoren entspricht den Beobachtungen anderer Autoren und wurde aufgeführt um nachzuweisen, daß es sich bei dem vorliegenden Patientenkollektiv um ein für dieses Krankheitsbild repräsentatives Kollektiv handelte (Field u. Mitarb. 1995b; Magnano u. Mitarb. 1995; Evans 1997; Robin 1997).

Während bisher wenig über den Einfluß genetisch bedingter Wirtsfaktoren auf den Verlauf der Kopf-Hals-Tumor-Erkrankung bekannt ist, wird der Einfluß genetischer Veränderungen im Tumorgewebe auf die Beeinflussung des Tumorverhaltens seit einigen Jahren sehr intensiv untersucht. Genetische Veränderungen im H-ras-Protoonkogen sind im Tumorgenom mit einer schlechten Prognose verbunden (Issing u. Mitarb. 1992). Ähnliches wurde für die Expression von p53 oder Cyclin D1 gezeigt (Michalides u. Mitarb. 1995). Die Expression von Onkogenen und deren Proteinen, Metalloproteinasen, Zellzyklus- und Proliferation-steuernden Proteinen (Cyclin D1, D3) wurde bei Kopf-Hals-Tumoren nachgewiesen (Issing u. Mitarb. 1992; Califano u. Mitarb. 1996). Einige Marker wurden mit einem aggressiven Tumorverhalten in Verbindung gebracht, konnten sich bisher jedoch nicht in der Klinikroutine durchsetzen. Chromosomenverluste an diversen Orten wie beispielsweise 3p, 6p, 8p, 8q, 9p21, 11q13, 13q21, 14q24, 17p13 und 22q13 (Field u. Mitarb. 1995 a, b; Bockmühl u. Mitarb. 1996) konnten mit einem veränderten Tumorverhalten in Verbindung gebracht werden.

Der Verlauf der Tumorerkrankung ist jedoch nicht nur durch die Tumoreigenschaften bestimmt, sondern reflektiert vielmehr die Bilanz zwischen Tumoraggressivität und Gegenwehr des Wirtsorganismus. So ist seit langem bekannt, daß Faktoren, welche die Abwehrsituation des Wirtsorganismus schwächen, wie beispielsweise immunsuppressive Therapien, Kachexie und schlechte Ernährung, einen negativen Einfluß auf den Krankheitsverlauf von Tumorpatienten haben (Chouaib u. Mitarb. 1997).

Unter den hier untersuchten Genpolymorphismen waren Mutationen im CYP2D6-Gen, die mit einem PM (poor metabolizer)-Enzymstatus einhergehen, gehäuft mit dem Auftreten von Halslymphknoten-Metastasen verbunden. Statistische Signifikanz wurde in Kombination mit


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anderen Genotypen wie dem Wildtyp am CYP1A1 m2-Genort, GSTM3AA und dem TNFC1-Allel erreicht. Der GSTM1B-Genotyp war signifikant mit einem gehäuften Lymphknotenbefall assoziiert, während GSTM10 als Einzelfaktor protektiv war. Dieser Zusammenhang eines bei den bisherigen Untersuchungen als negativ identifizierten Genotyps mit einem für den weiteren Krankheitsverlauf positiven Einfluß zeigt die Problematik bei der Identifizierung von Risikoallelen. Kürzlich konnte eine andere Studie zeigen, daß bei Patienten mit Mundhöhlenkarzinomen, welche die CYP1A1 m1-Mutation trugen und mindestens ein GSTM1-Allel aufwiesen, häufiger Mutationen im p53 Tumorsuppressorgen nachweisbar waren, verglichen mit GSTM1 0-Patienten (Lazarus u. Mitarb. 1998). Diese p53-Mutationen gelten nach bisherigem Wissensstand als ein prognostisch negativer Indikator.

Der positive Einfluß des GSTM1 0-Genotypen war bei der Betrachtung von Genotyp-Kombinationen nicht mehr nachweisbar, was die biologische Relevanz wie auch den Mechanismus dieser Beeinflussung des Tumorverhaltens fraglich erscheinen läßt. Auf eine mögliche Erklärung weisen Genotyp-Frequenzen einer Blasenkarzinom-Studie hin, in der das Fehlen des GSTM1A-Allels einen besseren Risikomarker darstellte als der GSTM10-Genotyp (Brockmöller u. Mitarb. 1996b), was wiederum auf der genetischen Verbindung des GSTM1A-Allels mit dem GSTM3B-Allel beruhen könnte (Inskip u. Mitarb. 1995).

Die TNF-Allele D6 und A2 konnten mit einer gut differenzierten Tumorhistologie in Zusammenhang gebracht werden. Das TNFA2-Allel wurde als Teil eines Haplotypen identifiziert, der gehäuft bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes auftritt (Hajeer u. Mitarb. 1997). Ein Einfluß auf das Verhalten von Tumoren ist bei beiden hier identifizierten Allelen in der Literatur bisher nicht beschrieben worden.

Viele Fall-Kontroll-Studien, die vorliegende eingeschlossen, konnten den meisten Risiko-beeinflussenden Genotypen bei der statistischen Auswertung nur eine geringe Risikovermittlung mit odds ratios zwischen 2 und 3 zuordnen. Deshalb werden zunehmend Kombinationen von Risiko-Allelen untersucht, in der Hoffnung, beeinflussende Faktoren mit odds ratios um 15 identifizieren zu können, die eine Anwendung in der Klinikroutine sinnvoll erscheinen lassen. Die Untersuchung von Interaktionen sollte auf biologischen Überlegungen beruhen. So sollten Polymorphismen, welche Enzyme der Phase 1- und Phase 2- Reaktion des


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klassischen Entgiftungsstoffwechsels beeinflussen oder ein überlappendes Substratspektrum aufweisen, auf eine Interaktion untersucht werden. Ferner könnten Genpolymorphismen, deren Enzyme Moleküle entgiften, die aus der gleichen pathologischen Noxe entstanden (z.B. Entgiftung von Nitrosaminen und PAH aus dem Zigarettenrauch) synergistisch wirken. Auch könnten Genotyp-Interaktionen eine Verbindung in der Regulation der Expression der kodierten Genprodukte aufweisen (Strange u. Mitarb. 1998). Der signifikante Nachweis von Interaktionen ist äußerst schwierig, da aus statistischen Gesichtspunkten der Studienumfang mit zunehmender Komplexität der untersuchten Kombinationen exponentiell zunehmen muß. In der Mehrzahl der bisher veröffentlichten Studien, wie beispielsweise in einer der umfangreichsten dieser Art (Brockmöller u. Mitarb. 1996b), konnten zwischen 8 Genvariationen und 7 Patientencharakteristika bei Blasenkarzinom-Patienten keine Interaktionen nachgewiesen werden. Die vorliegende Studie ergab neben einer Vielzahl additiver Effekte synergistische Einflüsse nur für GSTT1 0 / GSTM3AA und CYP1A1 m2-Wildtyp / TNFB4 in der Beeinflussung des histologischen Differenzierungsgrads sowie für GSTM3AA / CYP2D6PM für die Prädisposition eines von der Tumorlokalisation unabhängigen Halslymphknotenbefalls. Unter den Interaktionen zwischen verschiedenen GST-Polymorphismen hat insbesondere die Kombination GSTM1 0 / GSTT1 0 Interesse hervorgerufen, da beide Genprodukte am Abbau von Sauerstoffradikalen beteiligt sind und eine Häufung dieser Genotyp-Kombination bei Ovarialkarzinom-Patienten nachgewiesen wurde (Warwick u. Mitarb. 1994). Im vorliegenden Kollektiv ließen sich lediglich additive Effekte zwischen diesen beiden Genotypen aufzeigen, der Synergismus zwischen GSTT1 0 und GSTM3AA könnte aber auf der genetischen Verbindung zwischen dem GSTM1A-Allel und dem GSTM3B-Allel beruhen (Inskip u. Mitarb. 1995). Bisher wurden synergistische Einflüsse zwischen dem GSTT1- und GSTM3-Polymorphismus in der Literatur nicht beschrieben. Der hier nachgewiesene Synergismus von Phase 1-/ Phase 2-Polymorphismen (GSTM3AA / CYP2D6PM auf die Entwicklung eines Halslymphknotenbefalls) ist nach der Hypothese des Entgiftungsstoffwechsels von besonderem Interesse. Nachdem gezeigt werden konnte, daß der CYP2D6-Metabolismus von Debrisoquin bei Lungenkarzinom-Patienten mit geringer GSTµ-Aktivität gegen trans-Stilbenoxid im Vergleich zu Patienten mit hoher GSTµ-

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Aktivität verringert war (Roots u. Mitarb. 1992b), kann ferner eine direkte Beeinflussung beider Polymorphismen vermutet werden. Da über eine Verbindung der CYP2D6-Polymorphismen mit GSTM3-Genotypen bisher keine weiteren Arbeiten vorliegen, bleibt die Ursache dieses Synergismus spekulativ.

Wie bereits in der Fall-Kontroll-Studie, wurde eine Interaktion zwischen dem CYP1A1 m2-Polymorphismus und TNFB-Allelen im Zusammenhang mit dem histologischen Differenzierungsgrad nachgewiesen. Eine mögliche Erklärung ist die bereits erwähnte Beeinflussung der Expression verschiedener CYP-Enzyme durch ausgeschüttete Zytokine (u.a. TNFalpha) nach Entzündungsreizen (Shedlofsky u. Mitarb. 1994; Muntanerelat u. Mitarb. 1995).

Eine Häufung von Tumorrezidiven, insbesondere Mundhöhlen / Pharynxkarzinomen bei Patienten mit Vorliegen des TNFB1D5-Haplotypen, konnte gezeigt werden. Weder einzelne Genotypen noch Kombinationen von Polymorphismen in den entgiftenden Enzymen wiesen hingegen einen signifikanten Einfluß auf. Der B1D5-Haplotyp wurde bereits mit einem erhöhten Risiko an primär chronischer Polyarthritis (PCP) zu erkranken und mit Störungen bei der Initiierung und Regulation von Immunantworten in Verbindung gebracht (Hajeer u. Mitarb. 1996). Inwieweit diese auch bei der Entwicklung von Rezidivtumoren im Kopf-Hals-Bereich bedeutsam sind, läßt sich nach den bisher vorliegenden Ergebnissen nur vermuten. Trends konnten für den GSTP1- und CYP1A1 m2-Polymorphismus berechnet werden, die statistischen Berechnungen lagen jedoch deutlich vom Signifikanzniveau entfernt (p=0,1-0,2).Der überraschend geringe Einfluß der GST- und CYP-Polymorphismen auf das Auftreten von Rezidiven liegt wahrscheinlich an der abnehmenden Patientenzahl bei zunehmendem Zeitintervall der Nachbeobachtung. Entsprechend der Beeinflussung prognoserelevanter Tumorcharakteristika wäre ein ähnlicher Zusammenhang zwischen der Rezidivhäufigkeit und einzelnen GST- und CYP-Genotypen zu erwarten gewesen.

Aus der Vielzahl der einflußreichen Polymorphismen ließen sich 4 identifizieren, die in verschiedenen Untergruppen der Studie immer wieder als Risiko-Genotypen auftauchten: GSTT1 0, GSTM3AA, CYP1A1 m2-Wildtyp und das TNF-Allel B3.


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Auffällig war, daß am CYP1A1 m2-Genort der Wildtyp einen Risikofaktor darstellte, der Einfluß an CYP2D6-Genorten aber genau umgekehrt war. Hier waren Mutationen im Gen mit einem schlechter differenzierten Tumor und gehäuften Halslymphknoten-Metastasen verbunden. Ähnliche Beobachtungen an CYP2D6-Genorten konnten bereits von unserer Arbeitsgruppe an einem anderen Kollektiv von Mundhöhlenkarzinomen gemacht werden (Worrall u. Mitarb. 1998). Diese stehen im Widerspruch mit dem 2-phasigen Entgiftungsstoffwechsel. Die Funktion der CYP-Polymorphismen ist jedoch nicht so eindeutig, wie aus der Phase 1-/ Phase 2-Hypothese hervorgeht (Abb.1). Es ist bekannt, daß die CYP-Enzyme für einige Substanzen toxifizierende Reaktionen unterstützen, bei anderen Substanzen aber detoxifizierende Funktionen haben können (Roots u. Mitarb. 1992a). Auch ist die Rolle der CYP-Enzyme im Entgiftungsstoffwechsel generell nicht unumstritten (Ingelman-Sundberg u. Mitarb. 1992). Obwohl heute davon ausgegangen wird, daß sich die CYP- und GST-Enzyme als Reaktion auf chemische Substanzen aus der Umgebung entwickelt haben, gibt es neuere Untersuchungen, die diesen Enzymen einen Einfluß in dem Stoffwechsel endogener Liganden zuordnen. Den CYP-Polymorphismen wird ferner ein Einfluß auf die Zellproliferation und Apoptose zugeschrieben (Nebert 1994; Rannung u. Mitarb. 1995). CYP1A1 und CYP2D6 sind in der Embryonalphase und Fetalentwicklung stark erhöht und scheinen einen Einfluß auf die Zelldifferenzierung zu haben. Das in-vivo Substrat für CYP2D6 ist bisher jedoch nicht bekannt und von einigen Autoren wird bezweifelt, daß das CYP2D6-Protein überhaupt eine physiologische Funktion hat (Rannung u. Mitarb. 1995).

Anhand der hier gewonnenen Ergebnisse stellt sich die Frage, warum Polymorphismen, die in der Fall-Kontroll-Studie nur einen geringen oder gar keinen Einfluß auf die Entstehung der Kopf-Hals-Tumoren zeigten (z.B. CYP1A1-1, GSTT1 0), Tumorcharakteristika, wie den histologischen Differenzierungsgrad oder die Halslymphknoten-Metastasierung, signifikant beeinflußten. Dies impliziert, daß andere Mechanismen als sie der Entgiftungsstoffwechsel erklären kann für die Beeinflussung dieser Tumorcharakteristika verantwortlich sind. Unterstützt wird diese Vermutung durch epidemiologische Studien, die einen Einfluß der CYP2D6-Polymorphismen auf die Entwicklung von multiplen Hautbasaliomen nachwiesen,


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einer Erkrankung, die nach derzeitigem Wissensstand nicht von Zigarettenrauch-abhängigen Karzinogenen beeinflußt wird (Yengi u. Mitarb. 1996).

Die Karzinomentstehung ist durch einen zunehmenden Verlust bedingt, die normale Zellhomöostase zu kontrollieren (Hart 1997). So sind die histologischen Veränderungen, die im Rahmen der Karzinomentstehung in unterschiedlichen Stadien beobachtet werden, Ausdruck einer fortschreitenden Anhäufung von genetischen Schäden. Die Entstehung eines Tumors wird heute auf einen Mehrschritt-Mechanismus zurückgeführt, bei dem es durch die Abfolge von bestimmten Mutationen zur zunehmenden Entdifferenzierung und somit zur Bildung von Zellhyperplasien, Dysplasien und vom Carcinoma in situ bis zum invasiven Plattenepithelkarzinom kommt (Harris u. Mitarb. 1991; Bockmühl u. Mitarb. 1996; Califano u. Mitarb. 1996). Die in der Zelle verursachten genetischen Schäden beinhalten Veränderungen des gesamten DNA-Gehalts, Deletionen (Verlust von DNA-Fragmenten), Additionen, Translokationen von Chromosomen-Fragmenten, Genamplifikationen (vermehrtes Kopieren von einem Allel), DNA-Mutationen und chemische Veränderungen der DNA (Hart 1997). Bei Kopf-Hals-Karzinomen gilt als erwiesen, daß sowohl spontane als auch Karzinogen-induzierte genetische Veränderungen zur Tumorentstehung beitragen (Hart 1997).

Für einige vererbte Tumorerkrankungen konnten spezifische genetische Veränderungen, z.B. die Inaktivierung bestimmter Tumorsuppressorgene, im Prozeß der Karzinomentstehung nachgewiesen werden. Die Mutationen sind bei den meisten Tumorerkrankungen jedoch heterogen (Califano u. Mitarb. 1996; Hart 1997). Bei Kopf-Hals-Karzinomen und einer Vielzahl anderer Tumorerkrankungen konnten häufige Veränderungen im p53-Tumorsuppressorgen auf Chromosom 17p als frühes Ereignis in der Karzinogenese festgestellt werden. p53 kann bei genotoxisch gestreßten Zellen den Zellzyklus stoppen und damit die DNA-Reparatur ermöglichen oder, falls dies nicht mehr möglich ist, die Apoptose (den programmierten Zelltod) einleiten.

Mit fortschreitenden Entdifferenzierung weisen die Zellen einen Selektionsvorteil gegenüber benachbarten Zellen auf und setzen sich im Tumorgewebe gegen weniger entdifferenzierte Zellen durch. So kommt es zu einer fortschreitenden Malignisierung der Tumoren, denen der Wirtsorganismus keine effektive Abwehr mehr entgegensetzen kann (Califano u. Mitarb.


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1996; Hart 1997). Es gibt bereits Hinweise, daß die hier untersuchten Polymorphismen dieses biologische Verhalten von Tumoren beeinflussen. Kürzlich konnte gezeigt werden, daß PAH-Anlagerungen (polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, wie sie im Zigarettenrauch enthalten sind) an die DNA gehäuft im Lungengewebe bei Individuen mit GSTM1 0-Genotypen auftreten (Perera 1996). Von anderen Autoren wurde eine bis zu 9-fache Zunahme von Mutationen im p53-Gen des Tumorgenoms bei homozygotem Vorliegen der m1-Mutation im CYP1A1-Gen und gleichzeitigem Vorliegen des GSTM1 0-Genotyps bei Patienten mit Lungenkarzinomen nachgewiesen (Goto u. Mitarb. 1996; Kawajiri u. Mitarb. 1996). Ähnliche Zusammenhänge zwischen CYP1A1-Genotypen und p53-Mutationen ließen sich auch bei Mundhöhlenkarzinomen bestätigen (Lazarus u. Mitarb. 1998). Ferner konnten p53-Mutationen in Ovarialkarzinomen (Sarhanis u. Mitarb. 1996), Blasenkarzinomen (Brockmöller u. Mitarb. 1996a) sowie p53- und H-ras-1-Mutationen in Lungenkarzinomen (Ryberg u. Mitarb. 1994) mit dem GSTM1 0-Genotyp der Patienten in Verbindung gebracht werden, was den Schluß zuläßt, daß GSTM1 p53 vor Mutationen schützt. p53 ist eines der am häufigsten von Veränderungen betroffenen Gene in dysplastischen Läsionen des oberen Aerodigestivtrakts. Es folgen weitere Mutationen in der Tumorzelle, die Tumorprogression und Metastasierungs-Wahrscheinlichkeit beeinflussen und damit insgesamt die Prognose des Krankeitsverlaufs bestimmen (Watling u. Mitarb. 1992; Magnano u. Mitarb. 1995; Bedi u. Mitarb. 1996; Goto u. Mitarb. 1996).

Eine weitere Möglichkeit, wie die hier untersuchten Polymorphismen das Tumorverhalten beeinflussen könnten, ist völlig unabhängig von ihrer Eigenschaft als detoxifizierende Enzyme oder Immunregulatoren. So könnten die Polymorphismen über eine Verbindung mit benachbarten Genen, die für die Tumorinitiierung oder Suppression bedeutsam sind, in Wechselwirkung stehen (genetische Linkage). Der untersuchte Polymorphismus wäre nur ein Marker für eine Veränderung in einem solchen Gen, welches das Tumorverhalten beeinflußt. Dieser Zusammenhang wird insbesondere an dem Genort von CYP2D6 vermutet (Roots u. Mitarb. 1992a, b), der auf Chromosom 22q13 in unmittelbarer Nähe des Interleukin 2 b-Rezeptors, des platelet-derived-growth-factor-beta und des Tumorsuppressorgens Neurofibromatosis Typ 2 auf einem Chromosomenabschnitt liegt, der häufig von


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Allelverlusten im Tumorgewebe betroffen ist (Field u. Mitarb. 1995a, b). Interessanterweise konnte in der vorliegenden Arbeit ein Einfluß des GSTT1-Polymorphismus auf den histologischen Differenzierungsgrad nachgewiesen werden. GSTT1 und GSTT2 liegen nahe CYP2D6 auf Chromosom 22. Eine genetische Verbindung zwischen dem GSTT1- und CYP2D6- Polymorphismus, die jedoch nicht sehr ausgeprägt ist, konnte ebenfalls in der vorliegenden Studie festgestellt werden. Kürzlich wurde auch im GSTT2-Gen ein Polymorphismus identifiziert. Ob die Allelvarianten funktionell relevant sind und ob die Veränderungen in beiden Genen miteinander in Verbindung stehen, ist noch nicht bekannt (Coggan u. Mitarb.1998).

Erstaunlich war bei den hier gewonnenen Ergebnissen, daß der GSTP1-Polymorphismus bei der Beeinflussung der Tumorcharakteristika keine Rolle spielte. Neben den bereits nachgewiesenen Unterschieden in der Proteinaktivität der durch die einzelnen Allele kodierten Enzyme wird diese Genvariation mit der Zellproliferation in Zusammenhang gebracht (Harries u. Mitarb. 1996). GSTP1 liegt auf Chromosom 11q13 in einem größeren Amplikon (Chromosomenfragment mit mehreren gemeinsam kopierten Genen; Islam u. Mitarb. 1989; Ali-Osman u. Mitarb. 1996). Chromosomenverluste und Genamplifikationen (vermehrtes Kopieren von Genen) an diesem Genort sind häufig im Tumorgewebe bei Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich nachweisbar und konnten mit einer veränderten Prognose in Verbindung gebracht werden (Müller u. Mitarb. 1994; Parise u. Mitarb. 1994; Magnano u. Mitarb. 1995). Auf diesem Amplikon liegt auch der Genort für das Zellzyklus-regulierende Protein Cyclin D1, welcher ebenfalls polymorph ist. Ein Einfluß dieser Genvariation auf den Differenzierungsgrad von Kopf-Hals-Tumoren konnte kürzlich von unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden (Matthias u. Mitarb. 1998c). Der Cyclin D1-Polymorphismus scheint Verbindungen zu Zellzyklus-steuernden Eigenschaften von TNFalpha zu haben und in Verbindung mit bestimmten TNF-Allelen Auswirkungen auf den Verlauf von Kopf-Hals-Karzinomen zu haben (eigene, unveröffentlichte Ergebnisse). Eine gegenseitige Beeinflussung der GSTP1- und Cyclin D1-Polymorphismen wie auch eine Verbindung zu einem benachbarten Tumorsuppressorgen wird ebenfalls von einigen Autoren vermutet (Müller u. Mitarb. 1994; Parise u. Mitarb. 1994).


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Diese Zusammenhänge legen nahe, daß der Einfluß der untersuchten Genvariationen zumindest teilweise auf Gen-Gen-Interaktionen beruhen könnte und der in der Einleitung beschriebene Entgiftungsstoffwechsel, dessen einzelne Enzymaktivitäten durch Genpolymorphismen beeinflußt werden, als Erklärung allein nicht ausreicht.

Ähnliche Überlegungen müssen auch für den Einfluß der TNF-Mikrosatelliten-Marker angestellt werden. Sie liegen nicht in transkribierten Genabschnitten und bewirken somit keine direkte Veränderung von Proteinstrukturen. Für einige Allele wurde eine Beeinflussung der Expression von TNFalpha nachgewiesen (Pocoit u. Mitarb. 1993), dessen Rolle bei der Abwehr des Organismus gegen Tumorzellen seit seiner Entdeckung unumstritten ist (Carswell u. Mitarb. 1975; Larrick u. Mitarb. 1990). Ein Einfluß der TNF-Mikrosatelliten-Polymorphismen auf das Entstehungsrisiko einiger Malignomerkrankungen wurde ebenfalls nachgewiesen (Kolonkarzinome: Campbell u. Mitarb. 1994; Hautbasaliome: Hajeer u. Mitarb. 1997). In der vorliegenden Arbeit zeigten TNF-Allele, die mit einer verstärkten TNFalpha-Bildung in Verbindung gebracht werden, generell positive Einflüsse.

Nicht alle der identifizierten TNF-Mikrosatelliten-Allele oder Haplotypen konnten aber bisher mit Veränderungen in der Expression von TNFalpha in Verbindung gebracht werden. Auch ist unklar, ob die verschiedenen Mikrosatelliten-Allele direkt die Expression von TNFalpha steuern oder mit anderen Genvariationen dieser Region in Verbindung stehen, wie beispielsweise dem TNF2-Promoter-Polymorphismus (McManus u. Mitarb. 1996). In diesem Fall könnten auch sie lediglich einen Marker für eine benachbarte Genvariation darstellen, die das Tumorverhalten beeinflußt.

Kürzlich konnte eine hohe Frequenz von Instabilitäten an den TNF-Mikrosatelliten-Markern beim Vergleich der Stammzell- und Tumorzell-DNA von Kolonkarzinom-Patienten nachgewiesen werden (Honchel u. Mitarb. 1996). Diese Resultate konnten von unserer Arbeitsgruppe in ersten Versuchen bei Kopf-Hals-Karzinomen bestätigt werden. Der Genort der TNF-Mikrosatelliten-Marker auf Chromosom 6p21.3 ist ein im Tumorgewebe häufig von Chromosomenverlusten betroffenes Areal (Field u. Mitarb. 1995a; Honchel u. Mitarb. 1996).


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Diese Beobachtungen, sowie das häufige Auftreten von Allelimbalancen (verstärktes Kopieren eines Allels) an diesen Genorten im Tumorgewebe führte zur Postulierung von Tumorsuppressorgenen auf Chromosom 6p (Honchel u. Mitarb. 1996).

Die Mechanismen, die den Zusammenhang von genetischen Konstellationen in der Stammzell-DNA des Wirtsorganismus mit dem Tumorverhalten zu erklären versuchen, bleiben jedoch spekulativ. Alle bisher bekannten Untersuchungen, die vorliegende eingeschlossen, beschreiben dieses Phänomen lediglich, ohne die genauen Mechanismen zu klären. Erstmalig gelang hier jedoch die Identifizierung von Genvariationen im Wirtsorganismus, die das Risiko beeinflussen, einen undifferenzierten Tumor, einen Halslymphknotenbefall oder ein Tumorrezidiv im Kopf-Hals-Bereich zu entwickeln.


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