3 Methodische Grundlagen und Studiengruppen

In einer Querschnittsstudie wurde die Prävalenz der unterschiedlichen Parasitenspezies bei asymptomatischen Probanden aus einer hochendemischen Region in Afrika untersucht werden. Im Rahmen dieser Studie wurden malariologische und hämatologische Parameter sowie polymorphe genetische Faktoren von Erwachsenen und Kindern aus einer ländlichen und einer städtischen Region im Südwesten Nigerias verglichen. Die Studie wurde zwischen Oktober 1996 und September 1997 in Ibadan, einer Stadt mit etwa 4 Millionen Einwohnern, und in Abanla, einem Dorf in einer etwa 20 km von Ibadan entfernten ländlichen Region, durchgeführt. In diesem Gebiet ist die Transmission von P. falciparum hoch und über das Jahr stabil (holoendemisch). Die Proben wurden während der Trockenzeit zwischen Dezember 1996 und Mai 1997 gesammelt. Von den 593 in die Studie aufgenommenen Probanden wurden 230 Kinder aus Abanla (Grundschule und Kindergarten), 59 Kinder aus Ibadan (Grundschule und Kindergarten), 144 Kinder aus Gesundheitsposten in Ibadan und 160 Erwachsene aus Ibadan rekrutiert (May, et al., 1999a). Das

Studiendesign wurde vom Ethikkommittee des Joint Ethical Committee University Ibadan, University College Hospital begutachtet und genehmigt.

Die Region um Lambaréné ist ein typisches hyperendemisches Malariagebiet mit einer geschätzten entomologischen Inokulationsrate von 10 - 100 Stichen infizierter Moskitos pro Jahr (Wildling, et al., 1995). Es lassen sich klinisch und immunologisch drei Patientengruppen unterscheiden: Nichtimmune Patienten im Kleinkindalter, die lebensbedrohlich an Malaria erkranken können und als häufige Komplikationen schwere Anämie mit Hyperparasitämie, Hypoglykämie oder zerebrale Manifestationsformen aufweisen; Patienten im Schulalter mit einer begrenzten Anti-Krankheitsimmunität, die gewöhnlich an einer unkomplizierten Malaria ohne Organkomplikationen erkranken; und semiimmune Erwachsene mit einer meist milden Verlaufsform (Kremsner, et al., 1995).

In den Jahren 1995 und 1996 wurden für eine Longitudinalstudie 200 Kinder (Alter 6 Monate bis 11 Jahre) im Albert-Schweitzer-Hospital Lambaréné, Gabun rekrutiert. 100 Kinder mit einer schweren Malaria wurden stationär aufgenommen und behandelt (4 Tage Chinin und Clindamycin) (Kremsner, et al., 1995). Zu jedem in die Studie aufgenommenen Kind mit schwerer Malaria wurde, im Sinne einer matched-pair-Studie, ein Kind ähnlichen Alters, gleichen Geschlechts und gleicher Herkunft zugeordnet, bei dem eine milde Malaria diagnostiziert wurde. Diese Kinder wurden ambulant mit Pyrimethamin und Sulfadoxin behandelt (Schmidt-Ott, et al., 1997). Die Kinder mit schwerer Malaria wurden permanent stationär, die Kinder mit milder Malaria im Abstand von 12 Stunden untersucht. Longitudinal wurden Reinfektionen und klinische Malariaattacken durch zweiwöchentliches klinisches und parasitologisches Follow-up über 52 Monate verfolgt.

Die Aufnahmekriterien in die Gruppe mit schwerer Malaria waren definiert als Hyperparasitämie (> 250000 Parasiten/µl entsprechend > 10% Parasitämie), schwere Anämie (< 50 g/l Hb), zerebrale Malaria, Hypoglykämie (< 50 mg/dl Glucose) oder andere Zeichen einer schweren Malaria bei Ausschluß einer anderen Erkrankung (Kun, et al., 1998;Luty, et al., 1999).

Kinder mit milder Malaria hatten eine Parasitämie zwischen 1000 und 50000 Para­siten/µl Blut, keine Schizontämie, einen Anteil von pigmentierten Schizonten < 50/µl, Hämoglobin > 80 g/l, Thrombozyten > 50/nl, Leukozyten < 12/nl, Laktat < 3 mM und einen Blutglukosewert > 50 mg/dl. Ausschlußkriterien für die Aufnahme in die Studie waren eine Sichelzellanämie (HbSS), eine durchgemachte schwere Malaria oder ein Krankenhausaufenthalt vor dem Studienbeginn, andere akute Infektionen sowie die Einnahme von antiparasitären Medikamenten in den Wochen vor Beginn der Studie. Kinder mit Mangelernährung oder chronischen Erkrankungen wurden ebenfalls ausgeschlossen. Die Eltern der Kinder wurden über die Studie informiert und gaben ihr Einverständnis. Die Studie wurde vom Ethikkommitteé der Albert-Schweitzer-Stiftung begutachtet und genehmigt.

Die im einzelnen angewendeten Methoden sind in der im Anhang zusammengestellten Literatur beschrieben und hier nur kurz zusammengefaßt.

Die Antigene der HLA-Klasse II wurden zu Beginn der HLA-Forschung durch die gemischte Lymphozytenkultur (mixed lymphocyte reaction, MLR) definiert. Diese Methode mißt die zelluläre Immunantwort durch Aktivierung von T-Lymphozyten. In der Folge wurden zur HLA-Bestimmung serologische Methoden angewandt, bei der verschiedene immunogene Epitope durch Bindung von Antikörpern nachgewiesen wurden (Dyer and Martin, 1991). Später folgten weitere molekulare, biochemische und zelluläre Methoden, die sich aber nicht zur vollständigen Aufdeckung aller MHC-Klasse-II-Allele eigneten. Seit einigen Jahren wird der HLA-Polymorphismus auf genetischer Ebene untersucht, indem die variablen DNA-Sequenzen des 2. Exons, die für die Antigenbindungsstelle kodieren, durch eine PCR (Mullis and Faloona, 1987;Saiki, et al., 1985) amplifiziert und die Bruchstücke mit Restrik­tionsendonukleasen (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) (Bodmer, et al., 1987), mit

Oligonukleotidsonden (Saiki, et al., 1985) oder durch Klonierung und Sequenzierung (Sanger, et al., 1977) analysiert werden. Allelspezifische Oligonukleotide (ASO) (Saiki, et al., 1986) und sequenzspezifische Oligonukleotidsonden (sequence-specific oligonucleotide probes, SSOP) (Bugawan, et al., 1990;Bugawan, et al., 1988;Saiki, et al., 1989) ermöglichen inzwischen eine rasche und effiziente Typisierung von Loci der MHC-II-Klasse.

Die Typisierung mit sequenzspezifischen Oligonukleotid-Sonden (SSOP) basierte bei HLA-Genen auf dem Protokoll des XI. internationalen HLA-Workshops [1991] und wurde teilweise modifiziert nach (Schmitz, et al., 1991). Zur Vernetzung der PCR-Amplifikate mit Nylonmembranen wurde das Protokoll nach Church & Gilbert modifiziert (Church and Gilbert, 1985). Die Markierung der Oligonukleotide erfolgte durch Digoxigenin-11-2´-3´-didesoxy-Uridintriphosphat und wurde mit dem „DIG Oligonucleotide 3´-End Labeling Kit“ (Boehringer-Mannheim) durchgeführt (Nevinny-Stickel, et al., 1991). Für die Hybridisierung und den Allelnachweis durch Digoxigenin-markierte SSOP wurden die Protokolle von (Horwitz, et al., 1966;Michal, 1983;Wood, et al., 1985) in leicht modifizierter Form verwendet. Modifikationen von diesen Protokoll wurden in den jeweiligen Arbeiten beschrieben (May, et al., 1998b;May, et al., 1998a;Meyer, et al., 1994;Meyer, et al., 1996;Meyer, et al., 1994;Schnittger, et al., 1997).

Die Methoden wurden direkt oder modifiziert aus der im einzelnen angegebenen Literatur oder molekularbiologischen Handbüchern entnommen (Ausubel, et al., 1992;Erlich, 1989;Innis, et al., 1990;Sambrook, et al., 1989).

Die DNA wurde aus peripheren mononukleären Blutzellen nach dem modifizierten Protokoll von Miller et al. [1988] oder aus Vollblut nach Standardprotokollen oder mit Hilfe von kommerziellen Kits (Quiagen, Invitrogen) durchgeführt. Die synthetischen Oligonukleotide wurden im Labor (Gene Assembler .r. Plus; Pharmacia LKB) hergestellt und gereinigt oder bei kommerziellen Anbietern erworben.

Die DNA-Amplifikation wurde mit Hilfe der PCR nach dem für die einzelnen Anwendungen modifizierten Grundprotokoll von Saiki et al. (Saiki, et al., 1985) durchgeführt. Nach der Amplifikation wurde die Größe der amplifizierten DNA-Fragmente mittels Agarose-Gelelektrophorese überprüft.

Die Typisierung der Genvarianten, die in den hier zusammengefaßten Arbeiten untersucht wurden, ist in den einzelnen Publikationen beschrieben: G6PD (May, et al., 2000b), α-Thalassämie (Mockenhaupt, et al., 1999), TNFα (May, et al., 2000c), ICAM-1 (Kun, et al., 1999), iNOS (Kun, et al., 1998), MSA (merozoite surface antigen) (Kun, et al., 1998).

Zur DNA-Sequenzierung wurden DNA-Fragmente durch Klonierung in Plasmidvektoren nach Standardmethoden separiert(Sambrook, et al., 1989), in kompetente E.-coli-Zellen eingebracht, vermehrt und anschließend eine Minipräparation der Plasmid-DNA durch alkalische Lyse (Birnboim and Doly, 1979) oder mit Hilfe eines kommerziellen Kits durchgeführt (Quiagen). Nach positivem analytischem Restriktionsverdau mit dem Enzym EcoRI wurde eine manuelle (BaseRunner, Sigma) oder automatische (entweder ABI, Becton Dickinson oder LiCor, MWG) DNA-Sequenzanalyse nach (Sanger, et al., 1977) durchgeführt.

Die Bestimmung des Hb-Genotyps wurde mittels Hb-Elektrophorese auf Zellulose-Acetat-Membranen durchgeführt (Lell, et al., 1999;May, et al., 2000b).

Die mikroskopische Parasitenzählung wurde standardmäßig mit einer Giemsa-Färbung nach Ausstrich und Dickem Tropfen mit Auszählung der Parasiten in 100 Ölimmersionsfeldern durchgeführt (May, et al., 2000a;May, et al., 1999a;Mockenhaupt, et al., 2000).

Hämoglobinkonzentration, Hämatokrit, Erythrozytenanzahl und Granulozytenanzahl wurde mit einem Coulter Counter (HC555; Clinicon, Mannheim) gemessen und gegebenenfalls für das Alter korrigiert (Bienzle, et al., 1980;May, et al., 2000b;May, et al., 2000a;May, et al., 1999a).

G6PD-Aktvität und Pyruvatkinase-Aktivität im Erythrozyten wurde spektrophotometrisch gemessen (Beutler, 1975;May, et al., 2000b;WHO, 1967).

3.3  Auswertung der Ergebnisse und statistische Berechnungen

Statistische Berechnungen wurden in der Regel mit dem Programm StatView oder Jmp (beide SAS Institute Inc., North Carolina) nach allgemeinen Standards durchgeführt. Kopplungsungleichgewichte wurden mit den in der entsprechenden Arbeiten angegebenen Formeln berechnet (May, et al., 1998a).

Zur Bewertung der Typisierungssignale und Berechnung von Genfrequenzen, Amino­säuremotiv-Frequenzen und Haplotypfrequenzen der Genvarianten in den beiden Stu­diengruppen wurden Computerprogramme entwickelt, die eine schnelle und zuverlässige Auswertung ermöglichen. Der ausführliche Quelltext der Programme ist in den Anhangskapiteln 4.6 und 4.6 angegeben. Die Programme sind in der Programmiersprache Visual Basic geschrieben und basieren auf der kommerziellen Software Excel (Microsoft, Office 97 für MacIntosh).

Genvarianten, die innerhalb einer Bevölkerungsgruppe in hohen Frequenzen vorkommen, sind an diesem Genort häufig heterozygot. Wenn bei Heterozygoten die Genvarianten beider Chromosomen an mehreren Positionen variabel sind, ergibt die PCR-basierte Typisierung häufig ein Signalmuster, bei dem für mehrere variable Positionen des Gens ein heterozygotes Signal gefunden wird. Daraus ergibt sich bei der PCR-basierten Typisierung die Schwierigkeit, daß die Typisierungssignale beider Varianten in ihrer Gesamtheit nicht den entsprechenden Haplotypen eindeutig zuzuordnen sind. Ergibt z. B. die Typisierung eines Gens mit den beiden variablen Positionen X (Variante G oder A) und Y (Variante T oder C) das heterozygote Signalmuster G/A an Position X und T/C an Position Y, so ist uneindeutig, ob die Haplotypen GT und AT oder GC und AT sind. Methodisch sind diese Signalmuster nur mit unverhältnismäßig großem Aufwand zu trennen (Klonierung). Das Programm "BLOT" wurde geschrieben, um bei solchen uneindeutigen Signalen eine rechnerische Bestimmung beider Genvarianten zu ermöglichen (Programmcode Kap. 4.6). Die Software enthält Algorithmen, mit denen ein Schlüssel aller bisher bekannten Varianten

eines bestimmten Gens und ihrer Signalmuster mit dem tatsächlich aktuell gefundenen Signalmuster verglichen wird. Der Anwender erhält als Ergebnis diejenigen Genotypen, bei denen es die beste Übereinstimmung zwischen den ermittelten Signalen und den theoretischen Signalen der bisher bekannten möglichen Genotypen gibt. Außerdem werden die Anzahl der nicht übereinstimmenden Signale und deren Position ausgegeben.

Für die Berechnung werden vom Benutzer die Signale, die bei den molekularbiologischen Untersuchungen ermittelt werden, eingegeben. Dabei ist grundsätzlich die Methodik, die zur Typisierung angewendet wird, beliebig (z. B. direkte Sequenzierung, Sondenhybridisierung, Restriktionsverdau­muster). Ein Auflösungsschlüssel, der für den jeweiligen Genort, die Genvarianten, die untersuchten Genbereiche und die angewandte Methodik spezifisch ist, liegt als einzelne Tabelle vor und kann nach den entsprechenden Bedürfnissen variiert und aktualisiert werden. Die Algorithmen lesen die Daten ein, und bilden aus den Informationen des Auflösungsschlüssels für jede Genvariante einen binären Code. Die molekularbiologisch ermittelten Signale werden ebenfalls eingelesen und daraus ein binärer Code gebildet. Beide Binärcodes werden mit Hilfe von Boolean'schen Operationen verglichen, ein Ergebniscode berechnet und ausgewertet. Hierdurch ist ein schneller und zuverlässiger Vergleich der eigenen Signale und des Auflösungsschlüssels möglich. Aus der Rückberechnung des Ergebniscodes in ein Ergebnissignalmuster kann die Anzahl der Nicht-Übereinstimmungen bei dem Vergleich mit den bekannten Genotypmustern ermittelt werden. Die Genotypen mit der niedrigsten Anzahl an Nicht-Übereinstimmungen werden als wahrscheinlichstes Muster in eine neue Tabelle ausgegeben. Eine Anzahl von Nicht-Übereinstimmungen von 0 bedeutet somit die 100%ige Übereinstimmung mit einem Genotyp des Auflösungsschlüssels. Zusätzlich wird für jeden Fehler die entsprechende Position innerhalb des Genorts festgelegt und angezeigt, ob das Signal im Vergleich zum Auflösungsschlüssel positiv oder negativ war. Proben, bei denen sich mehrfach Unterschiede zwischen ermitteltem Genotypmuster und Auflösungsschlüssel zeigten, wurden kloniert und sequenziert.

Bei der Auswertung von Typisierungsergebnissen hoch polymorpher Gene wie z. B. bei HLA-Genen stellen die Ermittlung von Allelfrequenzen, Aminosäuremotiv-Frequenzen und Haplotypfrequenzen die ersten Analyseschritte dar. Je nach Fragestellung werden die Frequenzen von Gruppen mit unterschiedlichen Phänotypen verglichen oder popula­tionsgenetische Vergleiche durchgeführt. Während die einfache Auszählung der Allele aus den Genotypen jedes Individuums aufwendig, aber prinzipiell unproblematisch ist, gestaltet sich die Auszählung von Aminosäuremotiv-Gruppen für jeden zu untersuchenden Phänotyp als äußerst aufwendig. Bei dieser Analyse werden die Allele in Gruppen zusammengefaßt, die die gleiche Sequenz einer bestimmten variablen Region aufweisen und die Frequenzen dieser Gruppen ermittelt (z. B. alle Allele mit einem Methionin an Position 11 des HLA-DPA1-Exons 2 werden als Gruppe "Met-11" [DPA1*02021, DPA1*02022, DPA1*0301] und alle Allele mit einem Alanin an Position 11 werden als Gruppe "Ala-11" [DPA1*0103, DPA1*0104, DPA1*0105, DPA1*02011, DPA1*02012, DPA1*0203, DPA1*0401] zusammengefaßt). Die Gruppen haben also ein bestimmtes Codon an einer Position des Genlocus gemeinsam. Bei HLA-Molekülen kann die durch dieses Codon kodierte Aminosäure das Bindungsverhalten mit dem antigenen Peptid beeinflußen und sollte daher entsprechend analysiert werden. Je nach HLA-Locus kommen bis zu 18 verschiedene variable Positionen mit mehreren Aminosäure-Motivgruppen vor. Zusätzlich sollten bei Assoziationsberechungen Motivgruppen und Allele für verschieden Phänotypen untersucht werden, wobei jeder einzelne Phänotyp eine eigene Auszählung erfordert. In dem Programm können jeweils zwei Phänotypen miteinander verglichen werden.

Mit Hilfe des Programms "FAST" wird sowohl die automatische Zählung der Allele und Motivgruppen als auch die Weiterverarbeitung der Frequenzen für populationsgenetische und assoziationsanalytische Untersuchungen durchgeführt. Für die Berechnungen sind drei Dateien notwendig: 1. Das Hauptprogramm, das auf einem Tabellenblatt auch die Grundparameter für die Algorithmen speichert und den Dialog für den Benutzer zur

Verfügung stellt ("FASTAnalyse"); 2. Eine Aufschlüsselungsdatei, die für jedes Allel der untersuchten Locus die Liste der Motivgruppen enthält ("FASTKey"); 3. Das Datenblatt, das in tabellarischer Form die ermittelten Allele für jeden Locus und die phänotypischen Einteilungen jedes Probanden enthält ("Datenblatt").

Das Programm liest in einem ersten Schritt die wählbaren Parameter, die Patientendaten, und den Auflösungsschlüssel in den Speicher. In diesem Schritt werden unklare und falsche Eingaben, wie z. B. unbekannte Allele, überprüft. In einem nächsten Schritt werden für jeden Probanden und Locus die beiden Allele gelesen und jede variable Region einer Aminosäuremotiv-Gruppe zugeordnet. Bei einer Assoziationsuntersuchung wird dies für jeden von zwei Phänotypen getrennt vorgenommen. Dann wird für beide Phänotypen die Anzahl der Allele und Aminosäuremotiv-Gruppe pro Probanden (n) und pro Chromosomen (2n) berechnet.

Die so ermittelten Daten werden für die weiteren Berechnungen verwendet. Es stehen 4 Analysemodi zur Verfügung: 1. einfache Berechung von genotypischen und phäno­typischen Allelfrequenzen für einen Locus und einen Phänotyp; 2. Berechung von genotypischen und phänotypischen Allelfrequenzen für einen Locus und zwei Phänotypen mit Analyse der χ²-Werte und bei heterogener Verteilung der Phänotypen (P < 0,05) unter Angabe der odds ratio (OR) und des P-Wertes; 3. Berechung von genotypischen und phänotypischen Allelfrequenzen für zwei Loci und einem Phänotyp und Angabe von populationsgenetischen Parametern wie Haplotypfrequenz und Deltawerten; 4. Berechung von genotypischen und phänotypischen Allelfrequenzen für zwei Loci und zwei Phänotypen mit Vergleich von Haplotypfrequenzen und Analyse des χ²-Wertes und bei signifikanter Ungleichverteilung der Haplotypen unter Angabe des Signifikanzwertes. Die Ergebnisse werden in tabellarischer Form ausgegeben und gespeichert.