4  Einordnung der Ergebnisse in die gegenwärtige Malariaforschung

Die Ergebnisse der Untersuchungen über asymptomatisch mit P. falciparum infizierten Kindern aus Nigeria und Kindern mit milder und schwerer Malaria aus Gabun unterstützen die Hypothese, daß genetische Faktoren des Wirtes den Verlauf einer Infektion mit Malariaparasiten beeinflußen. Varianten von Genen, die in angeborene und erworbene Immunität involviert sind, waren in diesen Studien mit bestimmten Manifestationen der Infektion und der Reinfektionsrate nach einer klinischen Malariaepisode assoziiert.

In den folgenden Kapiteln werden die Ergebnisse aus den Studien in Nigeria und Gabun kurz zusammengefaßt und in den Kontext der aktuellen Kenntnisse eingeordnet. Auf die ausführlichen Resultate und Diskussionen in den einzelnen Originalarbeiten (Anhang ) wird in den jeweiligen Kapiteln verwiesen.

In der in Nigeria durchgeführten Studie konnte gezeigt werden, daß die Rate an submikroskopischen und gemischten Infektionen mit Plasmodien bei Personen ohne manifeste Malaria in dem untersuchten Gebiet sehr hoch ist (May, et al., 1999a). 20% der Probanden hatten eine Parasitämie, die bei normaler mikroskopischer Untersuchung nicht erkennbar war, aber mittels PCR detektiert werden konnte. Das Vorkommen der P.-falciparum-Infektion stieg mit dem Alter an und erreichte bei Kindern ab 12 Jahren nahezu 100%. Die Prävalenz der beiden anderen in dieser Region vorkommenden Parasitenspezies, P. malariae und P. ovale, stieg ab dem fünften Lebensjahr steil an, so daß nahezu alle Kinder mit 12 Jahren min­destens mit einer der Parasitenspezies infiziert waren. Erwartungsgemäß war die Infektionsrate bei Kindern höher als bei Erwachsenen. Überaschenderweise war in dieser Studie kein Unterschied in der Prävalenz von P. falciparum zwischen Kindern aus der urbanen und der ländlichen Region zu erkennen, wobei letztere häufiger

Mischinfektionen mit mehreren unterschiedlichen Parasiten­spezies hatten. Probanden mit Mischinfektionen mit P. falciparum und P. malariae hatten häufiger eine vergrößerte Milz als solche mit Einzelinfektionen. Das Vorkommen von Dreifachinfektionen war größer als nach der Prävalenz der einzelnen Spezies statistisch zu erwarten gewesen wäre (May, et al., 1999a).

In einer älteren Studie aus Nigeria wurde ebenfalls eine Häufung von Mischinfektionen (P. falciparum und P. malariae), hier unter Erwachsenen, gefunden (Bruce-Chwatt, 1963a;Bruce-Chwatt, 1963b). Im Gegensatz dazu wurden in anderen Untersuchungen multiple Infektionen seltener gesehen als statistisch zu erwarten (Cohen, 1973;Maitland, et al., 1996). Bei Cohen wurde bei jüngeren Kindern eine niedrigere Prävalenz von Mischinfektionen und eine Korrelation mit einer Milzvergrößerung beobachtet. Für das seltenere Vorkommen von Mischinfektionen wurde ein immunabhängiger Mechanismus vermutet. Allerdings berichtete Cohen auch von mehreren Studien, in denen multiple Infektionen häufiger als zufällig vorkamen. Auch in Longitudinalstudien gibt es widersprüchliche Berichte über Häufung und Verminderung von Mehrfachinfektionen (Richie, 1988). Die Tatsache, daß Milzgröße und Anti-Schizonten-Antikörpertiter mit der Parasiten­dichte auch bei den hier untersuchten niedrigen Parasitämien korrelierte, legt die Vermutung nahe, daß bei vielen Kindern langdauernde submikroskopische Infektionen vorkommen.

Die Bedeutung von asymptomatischen Infektionen für den Patienten wird seit langem diskutiert (Greenwood, 1987).Bei 228 klinisch gesunden Schulkindern aus Abanla zeigte sich, daß ein großer Teil nach den von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) formulierten Kriterien als anämisch einzustufen war (May, et al., 2000a). Bestimmungen der G6PD- und Pyruvatkinase-Aktivität deuteten darauf hin, daß bei vielen der Kinder die hämatologischen Parameter chronisch verschlechtert waren und mit einem erhöhten Erythrozytenumsatz einher gingen (May, et al., 2000b). Die Erhöhung der Serumspiegel des Transferrinrezeptors bei Kindern mit asymptomatischer oder milder P.-falciparum-Infektion spricht gegen eine Knochenmarks­suppression als Ursache der chronischen subklinischen Anämie (Mockenhaupt, et al., 1999). Das Auftreten einer Anämie war vor allem abhängig

vom Vorkommen einer P.-falciparum-Parasitämie - auch in einer sehr geringen Höhe -, dem Vorkommen einer Infektion mit verschieden Parasitenspezies, der Komplexität der P.-falciparum-Infektion (Infektion mit unterschiedlichen P. falciparum-Stämmen) und dem Auftreten einer Splenomegalie. Diese kann, wie eine andere Untersuchung mit der selben Studiengruppe gezeigt hat, wiederum durch eine Mehrfachinfektion begünstigt werden (May, et al., 1999a). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, daß die Bedeutung von sehr niedrigen Parasitämien auch mit anderen Parasitenspezies als P. falciparum für die Entwicklung einer chronischen Anämie größer ist als bislang vermutet wurde.

Weiterhin zeigte sich, daß in Nigeria die Einnahme von Chloroquin bei Kindern auch ohne manifeste Malariasymptomatik sehr verbreitet ist. Die Prävalenz an Kindern mit subkurativen Chloroquinspiegeln bei einer hohen Rate von Chloroquin-resistenten P.-falciparum-Stämmen ist sehr hoch (Mockenhaupt, et al., 2000). Dieser Umstand leistet der Verbreitung von Resistenzen weiteren Vorschub.

Im longitudinalen Vergleich wurde gezeigt, daß in der Gruppe mit schwerer Malaria im Ver­gleich zur der Gruppe mit milder Malaria häufiger und rascher Reinfektionen auftreten (Lell, et al., 1999) und sich beide Gruppen in ihrem Zytokinmuster unterscheiden (Luty, et al., 1999). Sozioökonomische Faktoren spielten keine nachweisbare Rolle für die Unterschiede bezüg­lich des Auftretens einer Anämie, Hyperparasitämie oder Reinfektionsrate (Luckner, et al., 1998). Ebenso gab es keinen Anhalt für eine unterschiedliche Stichfrequenz bei Kindern mit milder oder schwerer Malaria [el Sylla, unveröffentlicht]. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, daß die beiden Gruppen sich in ihrer, wahrscheinlich genetisch determinierten, Empfänglichkeit für schwere Malaria unterscheiden.

Weitere detaillierte Daten im Zusammenhang mit der Studiengruppe aus Gabun sind aus folgenden Publikationen zu entnehmen: (Kun, et al., 1998;Kun, et al., 1999;Kun, et al., 1998;Lell, et al., 1999;Luty, et al., 1998;May, et al., 1999b;Schmidt-Ott, et al., 1997;Wildling, et al., 1995).

Die Präsentation von antigenen Peptiden ist HLA-restringiert. Der Polymorphismus der HLA-Moleküle erlaubt einer Population, eine große Zahl verschiedener Antigene zu präsentieren. Die individuelle HLA-Ausstattung definiert wiederum, welche Antigene bei einem einzelnen Menschen präsentiert werden und zu welchen TCR-Interaktionen es kommen kann. Dieser Zusammenhang ist Grundlage für die Hypothese, daß in einer Population natürliche Selektion in Richtung eines ausgeprägten HLA-Polymorphismus wirkt. Tatsächlich hat eine eigene Studie gezeigt, daß die Anzahl der HLA-Varianten und -Haplotypen in Gabun weitaus größer ist als bei Europäern (Schnittger, et al., 1997). Die HLA-Variabilität schien vor allem durch die hohe Zahl der haplotypischen Kombinationen der Loci DRB1, DQA1 und DQB1 hervorgerufen zu sein. Ein Vergleich von Populationen aus Nigeria, Gabun und Liberia zeigte, daß es auch in geographisch relativ nah zusammenliegenden Regionen große Unterschiede in der Verteilung von HLA-Varianten gibt (May, et al., 1998a). Trotz dieser Unterschiede wurden Kopplungsungleichgewichte bestimmter Allelkombinationen in allen drei Populationen gefunden. Diese Beobachtung spricht dafür, daß Haplotypen - eher als bestimmte Allele - einem selektiven Druck ausgesetzt sind.

Im Zusammenhang mit einer genetisch bedingten Resistenz gegenüber Malaria tropica wurde früher gezeigt, daß das HLA-Klasse-I-Molekül HLA-B*53 mit einem Schutz vor schwerer Anämie und der zerebralen Verlaufsform der Malaria assoziiert ist (Hill, et al., 1991). Die protektive Wirkung entsprach etwa der Größenordnung der Schutzwirkung des Sichelzellgens HbS. Die Autoren vermuteten, daß die Protektion von HLA-B*53-positiven Individuen durch eine zytotoxische T-Zellreaktion gegen infizierte Hepatozyten vermittelt werden müßte. Allerdings sollte ein Organismus von der Größe von P. falciparum Tausende

potentieller T-Zellepitope haben, die eine Vielzahl von HLA-Restriktionsmustern haben können. Daher wurde gefolgert, daß die meisten Antworten gegen diese Antigene von geringem protektiven Wert sind, bzw. daß die Anzahl protektionsvermittelnder Epitope sehr gering ist. Dies wäre auch im Zusammenhang mit der Entwicklung einer Vakzine von Bedeutung. Die Autoren postulierten, daß der außerordentlich große Genpolymorphismus des HLA-Komplexes als Folge des Selektionsdruckes durch Infektionskrankheiten entstanden ist.

Später durchgeführte vergleichbare HLA-Assoziationsstudien in Ostafrika konnten die in Westafrika erhobenen Befunde nicht bestätigen (Dieye, et al., 1997;Riley, et al., 1992). In einer folgenden, auf den ursprünglichen HLA-Befunden basierenden Studie wurde jedoch gezeigt, daß konservierte Regionen des Leberstadium-spezifischen Antigens LSA-1, das von HLA-B*53 präsentiert werden kann, von zytotoxischen T-Zellen der gegen die schwere Verlaufsform geschützten Individuen erkannt wird (Hill, et al., 1992). Allerdings war die CTL-Stimulation durch dieses Peptid nicht bei allen untersuchten HLAB*53-positiven Personen möglich. Weitere Arbeiten haben T-Zellepitope definiert, die eine protektive zytotoxische T-Zellantwort auslösen (Aidoo, et al., 1995;Lalvani and Hill, 1998;Lalvani, et al., 1996;Udhayakumar, et al., 1997). Es gibt weiterhin Hinweise darauf, daß Sporozoitenanti­gene im Rahmen der HLA-Klasse-I-Präsentation prozessiert werden und damit einen alternativen Weg für das Priming von CD8-positiven T-Zellen darstellen können (Plebanski and Hill, 2000).

In der oben erwähnten Studie von Hill et al. wurde auch der Klasse-II-Haplotyp HLA-DRB1*1302-DQB1*0501 mit Schutz vor schwerer Anämie beschrieben (Hill, et al., 1991). Obwohl in einer weiteren Studie bei einer anderen Population Hinweise auf einen Einfluß von HLA-Klasse-II-Haplotypen für die individuelle Manifestation der Malaria gefunden wurde, konnten die Befunde von Hill et al. hier nicht bestätigt werden (Bennett, et al., 1993).

In der Studiengruppe aus Gabun wurde für das Allel DQB1*0501 eine Assoziation mit einer Protektion vor Anämie bei milder und schwerer Malaria sowie vor weiteren Reinfektionen nachgewiesen (May, et al., 2001). Sowohl bei den Kindern mit milder Malaria als auch bei den Kindern mit schwerer Malaria lag der niedrigste Hämatokrit aller Reinfektionen bei

DQB1*0501-Trägern signifikant höher als bei DQB1*0501-negativen Individuen. In beiden Gruppen lag der Hämatokrit bei homozygoten im Vergleich zu heterozygoten DQB1*0501-Trägern höher. Bei der Kaplan-Meier-Analyse des Profils aller Reinfektionen im Zeitraum von über 4 Jahren nach Beginn der Studie zeigte sich in der Gruppe mit schwerer Malaria bei DQB1*0501-positiven Kindern eine signifikante Verlängerung der Intervalle bis zur nächsten Reinfektion. In der Gruppe mit initial milder Malaria war der selbe, wenn auch nicht signifikante, Trend zu erkennen. Entsprechend diesen Ergebnissen hatten in der Gruppe mit schwerer Malaria DQB1*0501-Träger häufiger unter einer Infektion pro Jahr als DQB1*0501-Negative. Ein indirekter Parameter für die Infektionsstärke vor dem Zeitpunkt der Untersuchung ist der Anteil der mit Malariapigment beladenen Monozyten im Blut (Metzger, et al., 1995). DQB1*0501-Träger hatten signifikant häufiger einen Anteil pigmentierter Monozyten im oberen Bereich (> 75te Perzentile) als Nicht-Träger.

Um zu untersuchen, inwieweit das Allel DQB1*0501 einen Einfluß auf die Immunantwort gegen erythrozytäre oder präerythrozytäre Antigene hat, wurden PBMC der Patienten mit Peptiden verschiedener Entwicklungsstadien stimuliert und der Plasmaspiegel von IFN-γ gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß DQB1*0501-Träger signifikant häufiger eine starke IFN-γ-Antwort gegen LSA-1-Antigene generierten als DQB1*0501-Negative; dies war bei der Stimulation mit MSA-1-Antigenen nicht der Fall. Diese In-vitro-Ergebnisse deuteten darauf hin, daß ein möglicher Mechanismus der beobachteten Assoziation eine verstärkte IFN-γ-Antwort bei Trägern von DQB1*0501 sein könnte (May, et al., 2001).

In der Studie aus Gabun wurden die HLA-Klasse-II-Allelgruppe DRB1*04 und das Allel DPB1*1701 häufiger bei Patienten mit schwerer als bei solchen mit milder Malaria nachgewiesen (May, et al., 1999b). Zusätzlich wurden Assoziationen bestimmter HLA-Klasse-II-Allele mit einzelnen Varianten des P.-falciparum-Oberflächenproteins MSA gefunden (May, et al., 1999b). MSA-1 und MSA-2 werden von P. falciparum während des Merozoitenstadiums und auf der Oberfläche von infizierten Erythrozyten exprimiert. Die MSA-Gene sind polymorph und werden in Familien eingeteilt. Entsprechend der Homologie im zweiten von 17 vorhandenen Blöcken kommen bei MSA-1 die Familien MAD20, K1 und RO33 vor

(Tanabe, et al., 1987). Das MSA-2-Gen ist in zwei hochkonservierte flankierende und eine variable zentrale Region organisiert, dessen repetitive Sequenzen die Familien FC27 und 2D7 definieren (Smythe, et al., 1990). Mehrere Assoziationen bestimmter MSA-Familien mit dem Malariaverlauf wurden bisher beschrieben (Kimura, et al., 1990;Kun, et al., 1998;Scherf, et al., 1991). In früheren eigenen Arbeiten wurden Assoziationen zwischen dem Vorkommen der Aminosäure Methionin an Position 11 (Met-11) des DPA1-Gens (Exon 2) und dem Verlauf einer Infektion mit O. volvulus (Meyer, et al., 1996) und S. haematobium (May, et al., 1998b) beschrieben. In Gabun waren Met-11-positive Kinder mit milder und solche mit schwerer Malaria seltener mit RO33-positiven P.-falciparum-Klonen infiziert als Met-11-negative Kinder. Umgekehrt waren K1-positive Klone mit dem Vorkommen von Met-11 assoziiert. Die Ergebnisse betonen zum Teil auf die besondere Rolle von HLA-DP-Allelen, deren Bedeutung für die Immunantwort noch relativ unvollständig definiert ist (Meyer, et al., 1997). Weitere Assoziationen zwischen HLA-Klasse-II-Allelen und MSA-Familien deuten darauf hin, daß MHC-Klasse-II-Allele in die Selektion von parasitären Antigenen, wie MSA, involviert sind (May, et al., 1999b).

In beiden MSA-Genen kommen Längenpolymorphismen vor, so daß mit molekulargenetischen Methoden eine Infektion mit mehreren genetisch unterschiedlichen P.-falciparum-Stämmen nachgewiesen werden kann. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Komplexität der Infektion bezüglich der Anzahl der P.-falciparum-Stämme. P.-falciparum-Infektionen mit mehreren Parasitenstämmen waren in Gabun mit dem Vorkommen bestimmter HLA-Klasse-II-Allele assoziiert (May, et al., 1999b).

Bisher wurden nur wenige Assoziationen von HLA-Klasse-II-Allelen mit Manifestationen der P.-falciparum-Infektion oder bestimmten Immunantworten bei Malaria beschrieben. In einer Untersuchung war eine starke Antikörperantwort gegen das Epitop EENV des P.-falciparum-Antigens Pf155/ RESA mit DQw2 assoziiert (Riley, et al., 1992). Andere Autoren konnten diese Assoziation der Antikörperantwort mit der genannten DQ-Spezifität jedoch nicht bestätigen. Eine weitere Studie beschreibt eine Assoziation der humoralen Immunantwort gegen das synthetische Peptid SPf66 mit HLA-Klasse-II-Faktoren (Beck, et al., 1995).

In dieser Studie korrelierte DRB1*11 und DQB1*0301 positiv und DRB1*15 negativ mit der Antikörperantwort gegen SPf66. Gleichfalls sind HLA-A2- und -B8-restringierte zytotoxische T-Zellantworten gegen das Sporozoiten-Oberflächenprotein 2 von P. falciparum (Pf SSP2) beschrieben worden.

Die in den eigenen Untersuchungen beobachteten Assoziationen von HLA-Klasse-II-Varianten mit Manifestationen der Malaria und der Reinfektionsrate über einen mehrjährigen Zeitraum lassen auf eine Beteiligung von Antigen-präsentierenden Zellen und CD4-positiven T-Zellen bei der Entwicklung einer Immunität gegen Malaria schließen. Die HLA-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentation durch APC ist der erste Schritt einer Aktivierung von CD4-positiven T-Zellen und damit der Induktion einer Antikörperantwort. Die Bedeutung von Antikörpern bei der Abwehr von Blutstadien ist in mehreren Studien gezeigt worden (Bouharoun-Tayoun, et al., 1990;Playfair, 1982). Die gefundenen Assoziationen zwischen HLA-Klasse II und Infektionsparametern lassen daher zunächst auf eine Kontrolle von erythrozytären Stadien durch Antikörper-induzierte Immunantworten schließen. Da Erythrozyten selbst keine HLA-Klasse-II-Moleküle exprimieren, muß der Ansatzpunkt dieses Mechanismus im präerythrozytären Stadium liegen oder aber im Zusammenhang mit der Phagozytose von Merozoiten oder Erythrozytenbestandteilen infizierter Zellen durch Makrophagen stehen. Es ist unklar, ob durch die Präsentation von Parasitenantigenen aus erythrozytären Stadien ein Priming von Immunzellen hervorgerufen werden kann, das letztlich zu einer Reduktion der Parasitämie und Verminderung der Komplikationsrate oder dem Aufbau einer protektiven Immunität führen kann.

Da Erythrozyten keine HLA-Klasse-Moleküle exprimieren, kann es zu keiner direkten Zytotoxizität gegen infizierte Erythrozyten kommen. Zur Zeit ist nicht bekannt, ob CD8-positive T-Zellen eine protektive Bedeutung gegenüber Blutstadien haben. In vitro können Parasitenantigen-induzierte T-Zellproliferation und Zytokinsekretion durch CD8-positive T-Zellen inhibiert werden (Mshana, et al., 1990). In dieser Arbeit wurde mit Anti-HLA-Klasse-II-Antikörpern demonstriert, daß P.-falciparum-Schizonten spezifische, HLA-DQ-restringierte CD8-positive T-Zellen CD4-positive T-Zellen supprimieren können.

Es ist möglich, daß durch die HLA-Klasse-II-restringierte Präsentation die Zerstörung von infizierten Hepatozyten vermittelt wird. Dies hätte zur Folge, daß alle Nachkommen aus einem Sporozoiten und damit ein gesamter Parasitenklon vernichtet würde. Dadurch könnte in einer frühen Phase die Komplexität der Infektion, also die Anzahl der unterschiedlichen Parasitenstämme, mit denen ein Individuum infiziert ist, reduziert werden. In der Folge würde das Risiko gesenkt, mit einem besonders virulenten Stamm infiziert zu sein.

Mögliche Bedeutung von Nicht-HLA-Genen des MHC.Wenn nachgewiesene Assoziationen von MHC-Markern mit Erkrankungen, bzw. Krankheitsmanifestationen, interpretiert werden sollen, muß die häufige Kopplung von Genen innerhalb der MHC-Region berücksichtigt werden. Dabei können auch Gene gekoppelt, die keine HLA-Moleküle kodieren. Bei vielen solcher in der MHC-Klasse-II-Region gelegenen Nicht-HLA-Gene, aber auch bei Genen innerhalb des Klasse-III-Komplexes, ist bereits eine funktionelle Relevanz für das Immunsystem nachgewiesen worden. Auch gekoppelte Pseudogene oder Promotorsequenzen in diesem Bereich könnten trotz fehlenden Genproduktes von funktionellem Interesse sein, da sie eine Rolle in der Genregulation spielen können. Bei vielen MHC- Genen ist die funktionelle Bedeutung unklar und es wird angenommen, daß ein Großteil der Gene in dieser Region bisher noch nicht identifiziert wurde. Daher ist es möglich, daß die hier berechneten Assoziationen von Manifestationen der P.-falciparum-Infektion mit bestimmten Allelen der MHC-Loci auf einer Kopplung mit einem anderen polymorphen und funktionell relevanten Gen innerhalb des MHC-Komplexes beruht.

Die Gene und Genprodukte der Loci DMA und DMB haben eine MHC-Klasse-II-verwandte Sequenz, aber auch große Ähnlichkeit zu Strukturen des Klasse-I-Komplexes (Kelly, et al., 1991). Zellmutationsuntersuchungen haben gezeigt, daß DMA und -DMB eine Bedeutung für die Bindung der HLA-Klasse-II-Moleküle mit dem antigenen Petid und die gemeinsame Bindung an der Zelloberfläche haben (Fling, et al., 1994;Morris, et al., 1994).

Einige Gene der Region zwischen den DPA1- und DQB1-Loci besitzen Sequenzähnlichkeiten zu HLA-Genen und haben eine Bedeutung für die Prozessierung und Antigenpräsentation im Zusammenhang mit HLA-Klasse-I-Molekülen. Die Proteasomgene LMP2 und

LMP7 (low molecular mass proteasome) (Beck, et al., 1992) und die Gene der Transporter-Superfamilie ABC (ATP-binding cassette) TAP1 und TAP2 (transporter associated with antigen presentation) (Trowsdale, et al., 1990) sind mit MHC-D-Allelen gekoppelt (Rønningen, et al., 1993).

Bei der Verarbeitung antigener Peptide im Zytosol spielt der Proteasomkomplex eine besondere Rolle. Der katalytische 20S-Kern des Proteasoms besteht aus 28 Untereinheiten, die in vier heptamerischen Ringen angeordnet sind (Tanaka, et al., 1997). Die inneren Ringe des Komplexes bestehen aus Untereinheiten, die nach Stimulation mit INF-γ durch LMP2, LMP7 und MECL-1 (multicatalytic endopeptidase complex-like) ersetzt werden. Durch diesen Vorgang wird das 20S-Protasom strukturell umorganisiert und gelangt in einen „Immunproteasom“ genannten Zustand, in dem die Substratspezifität verändert und das Peptidrepertoir erweitert wird (Griffin, et al., 1998). In diesem Zustand wird der Verdau Ubiquitin-markierter Proteine zu Peptiden katalysiert. Das Proteasom kann potentiell antigene Epitope generieren, aber auch zerstören (Vinitsky, et al., 1997). Bisher wurden von LMP2 und LMP7 nur jeweils zwei Varianten beschrieben. Über die Verteilung in afrikanischen Populationen ist bisher nichts bekannt.LMP2 und LMP7 werden von Genen innerhalb der MHC-Klasse-II-Region kodiert. Sie liegen dort etwa 200 kD telomer des DQB1-Locus.

Für die effiziente Antigenpräsentation durch HLA-Klasse-I-Moleküle ist die aktive Translokation der Peptide in das Endoplasmatische Retikulum erforderlich. Dieser Transport ist beim Menschen mit TAP1 und TAP2, typischen Vertretern der ABC-Familie (ABC, ATP-binding cassette), assoziiert. Ohne funktionell aktive TAP-Moleküle ist der Zusammenbau und der intrazelluläre Transport von HLA-Klasse-I-Molekülen behindert (Esquivel, et al., 1992;Hermel, et al., 1991). Die Selektion der Peptidsequenzen, die durch TAP-Moleküle transportiert werden, ist an die Präferenzen der HLA-Klasse-I-Moleküle angepasst (Gubler, et al., 1998;Uebel and Tampe, 1999); allerdings tragen TAP-Varianten selbst ebenfalls zur Epitopselektion bei (Daniel, et al., 1998).

Ob diese Gene, die zwischen DPA1 und DQB1 liegen, an den beschriebenen Assoziationen beteiligt sind, ist bisher unklar. Da bei einer erythrozytären Infektion mit P. falciparum

eher von einer Präsentation durch HLA-Klasse-II-Molekülen ausgegangen werden muß, sollten bei der Entwicklung einer Immunität gegen erythrozytäre Stadien in erster Linie Gene involviert sein, die eine Bedeutung für Regulation und Expression dieser Proteine haben. Mögliche Kandidaten wären insbesondere die oligomorphen Loci DMA und DMB, bei denen vor kurzem eine entscheidende Bedeutung für die Prozessierung exogener Peptide aufgezeigt wurde (Ceman, et al., 1995).

In der Studiengruppe aus Gabun wurde bestätigt, daß der Quotient aus IL-10 und TNFα im Plasma ein Risikomarker für zerebrale Malaria und schwere Anämie ist. Bei Kindern mit schwerer Malaria waren diese beiden Komplikationen mit einem IL-10/TNFα-Quotient < 1 assoziiert (May, et al., 2000c). Umgekehrt hatten Patienten mit einem IL-10/TNFα-Quotient > 1 häufiger eine Hyperparasitämie. Diese Personen mit einem IL-10/TNFα-Quotient > 1 hatten häufiger die TNFα-Wildtyp-Variante, während solche mit einer Mutation an Position 238 des TNFα-Promotors (TNF^-238A) immer einen niedrigeren IL-10 als TNFα-Plasmaspiegel hatten. Allerdings war weder der TNFα-Plasmaspiegel noch der IL-10-Spiegel direkt mit den TNFα-Promotorvarianten assoziiert. Da TNFα und IL-10 von den gleichen Zelltypen - Monozyten/Makrophagen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten - sezerniert werden, ist es vorstellbar, daß eine leichte Hochregulierung von TNFα und eine relative Herunterregulierung von IL-10 zu einem signifikanten Unterschied des IL-10/TNF-Quotienten führen.

Die Ergebnisse in Gabun bestätigten die früher gemachte Beobachtung, daß das Allel TNF^-238A immer gemeinsam mit dem Allel TNF^-376A vorkommt. Die Bedeutung der Mutation TNF^-376A auf die Bindung eines Transkriptionsfaktors und die basale Genexpression wurde in vitro gezeigt (Knight, et al., 1999). In vivo konnte eine Erhöhung des TNFα-Plasmaspiegels

durch TNFα-Promotorvarianten bisher nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse aus Gabun legen nahe, daß TNFα-Promotorvarianten einen Einfluß auf die Balance von IL-10 und TNFα bei Malariaerkrankten haben und dadurch den Verlauf der schweren Malaria beeinflussen können (May, et al., 2000c).

In der Studiengruppe aus Nigeria wurde nur die Verteilung der TNFα-Promotorvarianten, nicht aber die TNFα- und IL-10-Plasmaspiegel untersucht. Es war bei den untersuchten asymptomatischen Kindern keine Assoziation zwischen TNFα-Promotorvarianten und Prävalenz oder Höhe der Parasitämien, dem Vorkommen von multiplen Infektionen oder anderen malariologischen Parametern zu erkennen.

Eine direkte Assoziation zwischen dem homozygoten Auftreten einer TNFα-Promotormutation an Position -308 und dem erhöhten Risiko einer schweren Komplikation bei Malaria wurde in einer großen Querschnittstudie in Gambia nachgewiesen (McGuire, et al., 1994). In derselben Studienpopulation wurde später die TNF^-238A-Variante als Risikofaktor für eine Anämie bei Malaria beschrieben (McGuire, et al., 1999). In einer neueren Arbeit der selben Arbeitsgruppe wurde die Variante TNF^-376A als ein zusätzlicher Risikofaktor einer zerebralen Malaria und TNF^-238A als ein relativer Schutzfaktor für diese Komplikation angesehen (Knight, et al., 1999). In Sri Lanka war die Variante TNF^-308A mit schweren Infektionen assoziiert, unabhängig davon, ob es sich um eine Malaria oder eine andere Infektion handelte (Wattavidanage, et al., 1999). Interessanterweise war die TNF^-308A -Variante in der Gabuner Studiengruppe signifikant mit einer erhöhten Reinfektionsrate und kürzeren Zeitperioden bis zur jeweils nächsten Reinfektion assoziiert.

Die in den Untersuchungen von Fernandez-Reyes (Fernandez-Reyes, et al., 1997) beobachtete hohe Genfrequenz von ICAM-1^Kilifi in Kenia wurde in der eigenen Untersuchung in Gabun (27,0%) und Nigeria bestätigt (31,6%) (Kun, et al., 1999). In Kenia wurde beobachtet, daß Kinder mit der Kilifi-Variante häufiger eine schwere Malaria hatten als Kinder mit dem ICAM-1-Wildtyp. In dieser Studie hatten Individuen mit dem homozygoten ICAM-1^Kilifi-Genotyp ein relatives Risiko von

2,2 und heterozygote Genträger ein Risiko von 1,4, an einer schweren Malaria zu erkranken (Fernandez-Reyes, et al., 1997). Im Gegensatz dazu zeigte der Vergleich in Gabun, daß ICAM-1^Kilifi-Träger einen relativen Schutz vor schwerer Malaria hatten (Kun, et al., 1999). Dieses Ergebnis entspricht der Erwartung der Malaria­hypothese, nach der Genvarianten sich in polymorphen Frequenzen in einem Malaria-endemischen Gebiet verbreiten konnten, wenn sie einen relativen Schutz vor Malaria vermitteln. In einer Studie in Gambia wurde keine Assoziation der ICAM-1-Variante mit der Schwere der Malaria gefunden (Bellamy, et al., 1998). Ein verändertes Bindungsverhalten der Variante ICAM-1^Kilifi an Erythrozytenrezeptoren konnte bisher nicht als Erklärungsmodell für die beobachteten Assoziationen bewiesen werden.

In der Studiengruppe aus Nigeria wurden bei Trägern von ICAM-1^Kilifi keine veränderten malariologischen Parameter im Vergleich zu homozygoten Trägern des ICAM-1-Wildtyps nachgewiesen. Entsprechend der Funktion dieses Adhäsionsmoleküls sprechen die Ergebnisse dafür, daß die Variante einen Einfluß auf den Verlauf einer manifesten Malaria, nicht aber auf das Infektionsrisiko hat.

Im Rahmen der Studien in Gabun wurde kürzlich eine Punktmutation an Position -969 im Promotor der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase iNOS^Lambaréné beschrieben. Diese Mutation war bei heterozygoten Genträgern mit einer Protektion vor schwerer Malaria assoziiert (Kun, et al., 1998). Um den pathophysiologischen Mechanismus der Protektion zu untersuchen, wurden epidemiologische, klinische, proteinbiochemische und molekularbiologische Studien durchgeführt (Kun, et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Die Variante iNOS^Lambaréné ist mit einer Frequenz von etwa 10% am häufigsten in Afrika (Gabun, Nigeria, Senegal) und mit 2,5 bis 3,6% seltener in Asien (Thailand, Papua Neuguinea) verbreitet. In Deutschland wurde das Allel bisher nicht nachgewiesen. Diese Befunde deuten auf eine Selektion der iNOS^Lambaréné-Variante in Gegenden mit hoher Malariaendemizität hin.

Klinisch zeigte sich bei Trägern dieser Variante eine signifikant geringere Rate an symptomatischen Reinfektionen als bei Homozygoten mit der Wildtypvariante (P < 0,002). Ex vivo war die konstitutive NOS-Enzymaktivität von Zellen mit dem iNOS^Lambaréné-Allel sieben mal höher als von Zellen, die homozygot für die Wildtypvariante waren (P < 0,003). In DNA-Protein-Bindungsassays (EMSA, electrophoretic mobility shift assay) wurde gezeigt, daß die Bindung von Kernproteinen bei der Mutante im Vergleich zum Wildtyp verbessert ist (Kun, et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß durch die Mutation bei der iNOS^Lambaréné-Variante Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren verändert werden und in der Folge die Aktivität des Enzyms erhöht wird. Eine hierdurch gesteigerte Produktion von NOS verbessert wahrscheinlich die Kontrolle einer Parasitämie mit P. falciparum und könnte eine Protektion vor schwerer Malaria bei Trägern der Mutante vermitteln. Durch diesen Selektionvorteil könnte sich die Mutante in Gegenden mit Malariaprävalenz durchgesetzt haben.

Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurden in einer Studie aus Tansania keine Assozia­tion zwischen der iNOS^Lambaréné-Variante und einem Schutz vor schwerer Malaria beobachtet (Levesque, et al., 1999). Dieser Unterschied läßt sich dadurch erklären, daß es sich hier um eine Querschnittstudie handelte und andere Parameter untersucht wurden. In einer neueren Studie wurde eine Assoziation von stromabwärts der iNOS^Lambaréné-Mutation gelegenen Pentanukleotid-Repeats des iNOS-Promotors mit einer erhöhten Empfänglichkeit für zerebrale Malaria beschrieben (Burgner, et al., 1998). In der Gabuner Studiengruppe konnte ein solcher Zusammenhang nicht beobachtet werden.

Der in der Studiengruppe in Gabun gefundene Beziehung zwischen einem erhöhten NO-Spiegel bei Kindern mit der iNOS^Lambaréné-Variante und einer Protektion vor schwerer Malaria könnte hypothetisch durch verschiedene Mechanismen erklärt werden. Zum einen könnte bei Trägern der iNOS^Lambaréné-Allels die Invasion von Leberzellen durch Sporozoiten nach IFN-γ-Induktion zu einer verstärkten Stimulation der iNOS mit einer schnelleren und wirkungsvolleren Abwehr der Parasiten führen. Zum anderen könnte durch eine bessere Induzierbarkeit der iNOS^Lambaréné-Variante die Reduktion von infizierten Erythrozyten durch

eine Antikörper-abhängige zelluläre Inhibition beschleunigt werden. Der ADCI-Mechanismus führt nach Opsonierung von Merozoiten zur Sekretion von toxischen Produkten durch aktivierte Monozyten. Die lokale Sekretion von NO nach Ingestion von Merozoiten könnte zytoadhärente infizierte Erythrozyten effizient reduzieren.

Faktoren der angeborenen Immunität - vor allem Varianten von Erythrozytenantigenen wie das Sichelzellmerkmal, α-Thalassämie, G6PD-Mangel und Blutgruppenantigenen - haben einen Effekt auf den erythrozytären Zyklus des Parasiten. Sie können in unterschiedlichem Maße die Höhe der Parasitämie beeinflußen. Wird die Entwicklung einer Hyperparasitämie verzögert, so bleibt dem Immunsystem mehr Zeit, eine adäquate Antwort aufzubauen. Allerdings wachsen Parasiten in der Anfangsphase der Infektion oft so stark, daß eine Wachstumshemmung durch Erythrozytenvarianten nur relativ geringe Auswirkungen auf die Höhe der Parasitämie hat.

Der relative Schutz von heterozygoten Trägern des Sichelzellgens (HbAS) gegenüber der Entwicklung einer schweren Malaria wurde in vielen Studien epidemiologisch nachgewiesen (Harrison, 1982;Nagel, 1990;Pasvol and Weatherall, 1980). Auch bei der Gabuner Studiengruppe zeigte sich beim Vergleich der Kinder mit milder und schwerer Malaria ein pro­tektiver Effekt bei Trägern des Sichelzellmerkmals (OR 2,3, P < 0,4) (Lell, et al., 1999). Im longitudinalen Vergleich zeigte sich eine signifikante Verringerung der Parasitämiehöhe und des Hämatokrit bei HbAS-Trägern im Vergleich zu Kindern mit normalen α-Globin; dagegen war kein Unterschied in der Inzidenzrate feststellbar.

Im Gegensatz zu den überzeugenden Ergebnissen zum protektiven Einfluß des Sichelzellmerkmals auf das Risiko einer schweren Malaria lagen bisher nur wenige Untersuchungen zur Assoziation dieser Erythrozytopathie mit asymptomatischer Parasitämie oder mit der

Prävalenz der Parasitämie in hochendemischen Gebieten vor. Bei den klinisch gesunden, asymptomatischen Kindern der Nigerianischen Studiengruppe wurde kein Einfluß des Sichelzellstatus auf die Häufigkeit einer Parasitämie oder dem Vorkommen von subpatenten Infektionen gefunden. Ebenfalls wurde keine Assoziation zur Komplexität der P.-falciparum-Infektion oder zur Anzahl der Parasitenspezies bei Infizierten festgestellt. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu den Ergebnissen einer Studie aus Gabun, in der bei Kindern mit Sichelzellgen eine erhöhte Prävalenz multipler Infektionen gefunden wurde (Ntoumi, et al., 1997). In einer Studiengruppe aus Ghana wurde bei einer Querschnittsuntersuchung an asymptomatischen Probanden unterschiedlicher Altersgruppen keine Assozia­tion des Sichelzellmerkmals mit Infektionsprävalenz, Höhe der Parasitämie, Milzrate oder Milzgröße festgestellt (Burchard, et al., im Druck).

Die Ergebnisse bestätigen, daß Träger der Sichelzellmutation keinen Schutz vor einer Infektion mit P. falciparum oder einer der anderen Parasitenspezies haben. Allerdings haben Infizierte einen relativen Schutz vor einer höheren Parasitämie und dem Auftreten schwerer Komplikationen.

In Gabun zeigte sich kein ausgeprägter protektiver Effekt der α-Thalassämie gegenüber schwerer Malaria. In der Gruppe mit milder und schwerer Malaria gab es ähnlich viele Kinder mit normalem α-Globin, mit heterozygoter α-Thalassämie und mit homozygoter α-Thalassämie (Lell, et al., 1999). Dies steht im Widerspruch zu früheren Ergebnissen aus Melanesien, wo ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Malaria und der α-Thalassämie festgestellt wurde (Flint, et al., 1986). Später wurde gezeigt, daß Kinder aus dieser Region mit homozygoter α-Thalassämie relativ vor Malaria, aber auch vor anderen Infektionserkrankungen, geschützt waren (Allen, et al., 1997).

In Gabun war der Hämatokritwert erwartungsgemäß bei Personen mit homozygoter Thalassämie am niedrigsten und am höchsten bei Probanden mit normalen α-Globin (Lell, et al., 1999). Im longitudinalen Vergleich zeigten sich weder in der Gruppe mit schwerer noch in

der mit milder Malaria signifikante Unterschiede in der Inzidenzrate oder dem Ausmaß der Parasitämie. Im Gegensatz dazu wurde bei einer Studie in Melanesien eine zweifach erhöhte Inzidenz mit P. falciparum oder P. vivax bei Kindern mit homozygoter α-Thalassämie festgestellt (Williams, et al., 1996).

Bei der Studiengruppe aus Nigeria war der α-Thalassämiestatus der Probanden nicht mit der Prävalenz einer P.-falciparum-Infektion oder der Höhe der Parasitämie assoziiert (Mockenhaupt, et al., 1999). Erwartungsgemäß hatten Kinder mit α-Thalassämie geringere Hämoglobinwerte, ein kleineres MCV und ein geringeres MCH als Kinder ohne α-Thalassämie. Die weitere Analyse der Daten zeigte, daß bei infizierten und nicht-infizierten Kinder mit homozygoter α-Thalassämie der Hämoglobinspiegel ähnlich war, während er bei Kindern mit heterozygoter α-Thalassämie oder solchen ohne α-Thalassämie abhängig vom Infektionsstatus war (Mockenhaupt, et al., 1999). Dabei war eine mit α-Thalassämie einhergehende Mikrozytose korreliert mit einem Schutz vor einem durch eine P.-falciparum-assoziierten Hämoglobinabfall. Diese Beobachtungen könnten durch einen reduzierten Effekt von Chloroquin gegen P. falciparum bei α-thalassämischen Kindern erklärbar sein (Mockenhaupt, et al., im Druck).

In der Gabuner Studiengruppe war die Verteilung der G6PD-Genotypen bei Kindern mit schwerer und leichter Malaria nahezu identisch (Lell, et al., 1999). Bei dem Vergleich der longitudinal erhobenen Daten war weder die Inzidenzrate noch die Parasitämiehöhe oder der Hämatokrit mit dem G6PD-Genotyp assoziiert. Frühere Arbeiten über die protektive Rolle des G6PD-Mangels führten zu widersprüchlichen Ergebnissen (Bienzle, et al., 1972;Gilles, et al., 1967;Martin, et al., 1979). Eine große Querschnittstudie bei Kindern aus Gambia zeigte einen protektiven Effekt der Mangelvariante G6PD A^- gegenüber schwerer Malaria (Ruwende, et al., 1995); dieser Effekt wurde in der Gabuner Längsschnittstudie nicht bestätigt.

In Nigeria zeigte sich keine Assoziation zwischen G6PD-Genotypen und der Prävalenz der Plasmodieninfektion, der Höhe der Parasitämie oder der Komplexität der Infektion bezüglich der Anzahl der Plasmodiumspezies oder der detektierbaren P.-falciparum-Klone (May, et al., 2000b). In der Studie konnte gezeigt werden, daß hemi- und homozygote Kinder mit G6PD A^--Mangel eine signifikant erniedrigte Erythrozytenzahl hatten. Die Pyruvatkinase-Aktivität als Indikator für ein niedriges Erythrozytenalter war bei Kindern mit G6PD-Mangel ebenfalls erniedrigt. Aufgrund dieser Ergebnisse kann vermutet werden, daß auch der relativ geringgradige afrikanische G6PD-Mangel zu einer subklinischen Hämolyse und dadurch zu einer jüngeren Erythrozytenpopulation führt. Als praktische Konsequenz hat dies zur Folge, daß die Diagnose eines heterozygoten G6PD-Mangels (G6PD B/A^-) mit biochemischen Methoden häufig zu falsch negativen Ergebnissen führt (May, et al., 2000b). Wenn möglich, sollte bei derartigen Fragestellungen eine Typisierung der G6PD-Varianten auf DNA-Ebene erfolgen. Im Verlauf dieser Studien wurde die bisher unbekannte Variante G6PD¹⁴³¹ beschrieben, die die Erstellung eines partiellen Stammbaums afrikanischer G6PD-Varianten ermöglicht. In einer anderen Studie an klinisch gesunden Personen aus Ghana wurde, ähnlich den Ergebnissen in Nigeria ebenfalls kein Zusammenhang zwischen G6PD-Mangel und Plasmodienprävalenz, Parasitämie oder epidemiologischen Milzrate gefunden (Burchard, et al., im Druck).

Andere klinische Studien haben zu unterschiedlichen Ergebnissen geführt. Eine frühe Studie von 700 Kindern in Nigeria zeigte eine partielle Protektion vor Malaria bei Männern mit G6PD A und vor allem bei Frauen mit dem GdB/GdA^--Genotyp. Patienten mit den Genotypen GdA und GdA^- hatten insgesamt weniger Parasiten als GdB-Träger. Kein Schutz wurde für defiziente Hemizygote und Homozygote nachgewiesen (Bienzle, et al., 1972). Einen Schutz von G6PD-Defizienten gegenüber einer letalen Malaria fanden weitere Arbeitsgruppen, die allerdings eine Differenzierung von heterozygoten und defizienten Frauen nicht vornahmen (Gilles, et al., 1967). Eine neuere Arbeit aus West- und Ostafrika hat einen geschlechtsunabhängigen partiellen Schutz vor schwerer Malaria für G6PD A^--Träger ermittelt (46-58% reduziertes Risiko); eine Protektion für Heterozygote konnte nicht

bestätigt werden (Ruwende, et al., 1995). Andere Untersuchungen fanden keinen Hinweis auf eine Protektion vor Malaria bei G6PD-Defizienten (Martin, et al., 1979), bzw. keine Verringerung der Parasitendichte bei Infizierten (Porter, et al., 1964).

In der Gabuner Studiengruppe waren Patienten mit schwerer Malaria häufiger positiv für die Blutgruppe A als die Patienten mit milder Malaria (Lell, et al., 1999). Diese Befunde entsprechen früheren Ergebnissen aus Zimbabwe (Fischer and Boone, 1998). Ein niedrigerer Hämoglobinspiegel bei Patienten mit Blutgruppe A, so wie er in Zimbabwe beschrieben wurde, konnte aber in Gabun nicht gefunden werden. Als Trend war zu beobachten, daß Patienten aus Gabun mit Blutgruppe A bei Reinfektionen höhere Parasitämien aufwiesen. Bei diesen Patienten wurde auch eine höhere Rate an Rosetten-formierenden Parasitenisolaten gefunden als bei Patienten mit anderen Blutgruppen (Kun, et al., 1998). Diese Ergebnisse haben Untersuchungen nach sich gezogen, in denen experimentell gezeigt wurde, daß das Blutgruppenantigen A ein Korezeptor bei der Rosettenformation von P.-falciparum-infizierten Erythrozyten ist (Barragan, et al., 2000). Dies bestätigt die Beobachtungen vorangegangener Arbeiten, in denen eine höhere Rosettingrate bei Patienten mit Blutgruppe A beschrieben wurde (Udomsangpetch, et al., 1993).

Eine andere Hypothese vermutet die Beteiligung von immunologischen Mechanismen, bei denen es zu einer Kreuzreaktion von Antikörpern gegen Blutgruppe A gegen Antigene von P.-falciparum-infizierten Erythrozyten kommt (Harrison and Ridley, 1975). Unklar war bisher, ob Blutgruppen-Antigene auch die Parasitämie oder hämatologische Parameter bei asymptomatisch infizierten Kindern beeinflußen können. In der Studie in Nigeria konnte ein solcher Einfluß bei keiner Blutgruppenkonstellation nachgewiesen werden.

4.6  Koevolution von Wirt und Parasit

Neuere Untersuchungen zeigen, daß es nicht nur zu einer Anpassung des Wirtes an den Parasiten, sondern umgekehrt auch zu einer Anpassung des Parasiten an den Wirt gekommen ist. In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Untersuchungen zu Assoziationen von Genvarianten von P. falciparum mit dem Verlauf einer Malaria tropica veröffentlicht (Engelbrecht, et al., 1995;Robert, et al., 1996). Zum Teil waren diese Assoziationen von der Transmissionsstärke und anderen Faktoren abhängig (Walliker, et al., 1998). In anderen Untersuchungen wurden geographische Unterschiede von Plasmodiengenvarianten nachgewiesen, die auf einen Selektionsdruck einiger dieser Allele hindeuteten (Conway, et al., 1992;Conway, 1997;Creasey, et al., 1990).

Die hier zusammengefaßten Untersuchungen unterstützen die Hypothese, daß die Aus­einandersetzung von Mensch und Plasmodien zu einer ständigen gegenseitigen Beeinflußung und Anpassung geführt hat. Die koevolutonäre Veränderung der Genome der beiden Organismen ist wahrscheinlich mitverantwortlich für die unterschiedliche geographische Verteilung von polymorphen Genen sowohl des Menschen als auch der Plasmodien und scheint auch heute noch Teil einer komplexen und dynamischen Anpassung von Wirt und Parasit zu sein (May, et al., 1999b;May, et al., 1998a;Schnittger, et al., 1997).