Petersen, Iver: Genetik von Karzinomen des Respirationstraktes: Korrelation Genotyp - Phänotyp

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Tumorkollektive

Die Arbeiten basieren auf insgesamt drei Tumorkollektiven. Zum einen wurden Proben von Autopsien, die an der Pathologie der Charité, dem Pathologischen Institut der Christians-Albrecht-Universtät Kiel und dem Departement für Pathologie der Universität Zürich durchgeführt wurden, untersucht. Tumor- und Normalgewebsproben wurden in der Regel tiefgefroren. Dieses Kollektiv wurde insbesondere für die Analyse der hämatogenen Metastasierung von Lungenkarzinomen mit herangezogen, indem synchrone Primär- und Sekundärtumoren untersucht werden konnten.

Bei den weiteren Kollektiven handelt es sich um Resektate von Patienten mit einem Karzinom der Kopf-Hals-Region und der Lunge, die an der Charité operiert wurden. In enger Zusammenarbeit mit den chirurgischen Kollegen, in der HNO-Klinik insbesondere mit Frau Dr. Bockmühl und in der Allgemeinen Chirurgie mit Herrn Prof. Gellert, wurden über einen Zeitraum von drei Jahren, von fast jedem Patienten Gewebe vom Primärtumor, etwaigen Metastasen und konstitutionellem Normalgewebe frisch asserviert. Zudem wurden von den meisten Tumoren Primärkulturen angelegt, die in bisher 8 Fällen zur Etablierung einer Tumorzellinie führten.

3.2. Zusammenstellung tumorbiologischer Methoden

Eine Übersicht über einige Methoden, die in der Tumorgenetik und -biologie Anwendung finden, ist in Abb. 2 dargestellt. Generell lassen sich dabei Techniken, die DNA- bzw. RNA untersuchen von Protein-analytischen Verfahren abgrenzen. Die auf den Nukleinsäuren basierenden Methoden werden in der Tumorgenetik angewandt. Die phänotypische Charakterisierung findet dagegen vornehmlich auf der Proteinebene statt.


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Auf alle Verfahren, die in siehe aufgeführt sind, soll in diesem Zusammenhang nicht näher eingegangen werden. Wichtig ist jedoch, daß man sich bei der Anwendung einer bestimmten Methode über deren Vor- und Nachteile und insbesondere das jeweilige Auflösungsvermögen im Klaren ist. Um einen Überblick über Veränderungen auf chromosomaler Ebene zu erlangen, sind klassische zytogenetische Verfahren, wie die G-und R-Bänderung anwendbar. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist ebenfalls dafür einsetzbar, gehört allerdings mit verbesserter Auflösung bereits zu den molekularzytogenetischen Verfahren. Dabei ist zu beachten, daß einzelne Techniken, wie z.B. die CGH, insbesondere zur Detektion von DNA-Über- und Unterrepräsentierungen sowie Amplifikationen dient. Zur Erkennung von Translokationen und Rearrangements müssen weitere Methoden, z.B. die M-FISH


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(multiplex-FISH, 24-Farben-FISH), eingesetzt werden (Speicher et al. 1996). Mit zunehmender Sensitivität des Verfahrens lassen sich Veränderungen auf Gen- und auf Nukleotid-Ebene erfassen, insbesondere mittels SSCP-Analysen und DNA-Sequenzierung. Dabei sollte man jedoch immer die untergeordnete Funktion eines Gens im Gesamtsystem beachten, was insbesondere bei der Erarbeitung von Vorstellungen über die Entstehung multigener Erkrankungen von Bedeutung ist.

Insgesamt läßt sich bemerken, daß es sinnvoll ist, sich von Übersichtsverfahren zu Methoden mit erhöhter Sensitivität vorzuarbeiten. Nur durch die Kombination von mehreren Techniken läßt sich die Frage von komplexen Veränderungen, wie sie in Tumoren zu finden sind, klären.

Zu einzelnen Techniken wurden eigene methodische Beiträge geleistet. Auf diese soll im folgenden genauer eingegangen werden.

3.3. Comparative Genomische Hybridisierung (CGH)

Die CGH ist eine molekularzytogenetische Methode, die 1992 erstmalig von Anne & Olli Kallioniemi aus der Arbeitsgruppe von Dan Pinkel an der Universität San Francisco publiziert wurde (Kallioniemi et al. 1992) und fast zeitgleich in den Arbeitsgruppen von Thomas Cremer und Peter Lichter in Heidelberg entwickelt wurde (Du Manoir et al. 1993). Die Methode ist schematisch in siehe dargestellt.

Sie beruht auf der Hybridisierung von Tumor- und Normal-DNA auf normale Chromosomenmetaphasen, die aus Blutlymphozyten präpariert werden. Dabei werden beide Genome zunächst mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert gefällt und in gleichen Mengenanteilen zusammen mit einem Überschuß an humaner Cot1-DNA auf die Chromosomen hybridisiert.

Die Cot1 DNA dient dabei der Absättigung hochrepetitiver DNA Sequenzen im Bereich des Heterochromatins. Repetitive DNA-Abschnitte, wie sie z.B. im Bereich der


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Chromosomenzentromeren vorkommen, haben eine unterschiedliche Hybridisierungs-kinetik im Vergleich zu einmalig vorkommenden Sequenzen und verursachen ohne Zugabe von Cot1 DNA ein sehr starkes Fluoreszenzsignal, welches die digitale Bildauswertung beeinträchtigen würde.

Die Genome binden quantitativ an ihre entsprechenden Bindungsstellen auf den Chromosomen. Im Tumor relativ weniger vorkommende Sequenzen führen zur stärkeren Hybridisierung von Normal-DNA in diesem Bereich, das Fluoreszenzsignal des Normalgenoms überwiegt. Im umgekehrten Fall einer DNA-Überrepräsentierung oder Amplifikation bindet entsprechend mehr Tumor-DNA und die Fluoreszenz des Tumorgenoms überwiegt. Durch die Aufnahme unterschiedlicher Bilder am Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Farbfiltern und einer anschließenden quantitativen Auswertung der Fluoreszenzsignale entlang der Chromosomen, können die DNA-Imbalanzen eines Tumor berechnet werden. Das Ergebnis kann dann in Form eines Ratio-Profiles dargestellt werden, wobei Ausschläge nach links einer Deletion und Ausschläge nach rechts einer DNA-Überrepräsentierung entsprechen.

Mit Hilfe des von unserer Arbeitsgruppe entwickelten Programms kann die Darstellung zusätzlich in Form eines CGH-Summenkaryogramms erfolgen, bei dem die Veränderungen durch Falschfarben kodierte, gemittelte Chromosomen dargestellt werden. Die rote Farbe entspricht dabei einer Deletion, grün einer DNA-Überrepräsentierung und blau einer Gleichverteilung beider Genome, d.h. mittels CGH ist keine Imbalanz detektierbar.

Das genaue Prinzip der Methode der Comparativen Genomischen Hybridisierung ist detailliert in dem beiliegenden Übersichtsartikel “Die komparative genomische Hybridisierung - eine Screeningmethode in der genetischen Tumordiagnostik“ dargestellt. Erklärungen zur Bildverarbeitung im Rahmen der CGH können dem Artikel


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“Analyseprogramm zur quantitativen Erfassung chromosomaler Aberrationen mittels komparativer genomischer Hybridisierung (CGH)“ entnommen werden. Die Algorithmen, die bei unserem CGH-Programm angewandt werden, sind dem Artikel “Image analysis for Comparative Genomic Hybridization based on a karyotyping program for Windows“ aufgeführt.

Die Protokolle für die präparativen Schritte können insbesondere der Publikation “Small cell lung cancer is characterized by a high incidence of deletions on chromosomes 3p, 4q, 5q, 10q, 13q and 17p“ entnommen werden und sind auch über die Internet-Seite unserer Arbeitsgruppe (http://amba.charite.de/cgh) abrufbar.


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3.4. Molekulargenetische Methoden

3.4.1.1. SSCP-Analyse

Die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism Analysis, SSCP) dient der Detektion von DNA-Mutationen auf Nukleotid-Ebene. Dabei wird ein maximal 500 bp langes DNA-Fragment mittels PCR amplifiziert. Die Fragmente werden anschließend denaturiert und auf einem hochauflösenden Poylacrylamid-Gel unter nicht-denaturiernden Bedingungen aufgetrennt.

Das Laufverhalten des Fragmentes resultiert aus der Konformation des DNA


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Stranges, die wiederum durch die Basenabfolge bestimmt ist. Eine Mutation im DNA-Fragment führt zu einer Konformationsänderung und resultiert in einem etwas abgeänderten Migrationsverhalten innerhalb des Gel, was in einem veränderten Bandenmuster gegenüber den nicht-mutierten Fragmenten zum Ausdruck kommt (siehe mit * markierte Probe in siehe ).

Die SSCP wird als Screeningmethode für eine schnelle Untersuchung möglichst vieler Tumorproben eingesetzt. Diejenigen Proben, die in der SSCP Analyse ein suspektes Bandenmuster aufweisen, werden dann sequenziert zur Bestätigung und genauen Bestimmung der Mutation.

Die klassische Form der radioaktiven SSCP-Analyse wurde in zwei eigenen Arbeiten angewandt (Petersen et al. 1993, Reichel et al. 1994). Es wurde zudem ein nicht-radioaktives Verfahren (Petersen et al. 1996) entwickelt, das neben der SSCP- auch für die LOH-Analyse und die direkte DNA Sequenzierung eingesetzt werden kann (“Use of non-radioactive detection in SSCP, direct DNA sequencing and LOH analysis“). Es beruht darauf, daß einerseits bei den drei Verfahren mittels Amplifikation DNA Fragmente generiert werden, die über die Markierung des PCR Primers einheitlich gekennzeichnet werden können, und andererseits diese Fragmente über Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Dies ist für die SSCP-Analyse und das direkte Sequenzieren schematisch in siehe wiedergegeben.

Durch die Verwendung des Haptens Biotin bei der Primermarkierung und den Einsatz eines Kapillarblotverfahrens zum Transfer der DNA auf eine Nylonmembran, konnte der Detektionsschritt bei den drei Verfahren vereinheitlicht werden. Die Visualisierung der DNA erfolgte über einen Avidin-Alkalische Phospatase-Enzymassay, der über einen Substratumsatz entweder zur Bildung eines Farbniederschlags oder zur Chemilumineszenz führt.


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3.4.1.2. Direkte DNA Sequenzierung

Die DNA Sequenzierung dient der Entschlüsselung des genetischen Codes, also der Nukleotidabfolge in der DNA. Diese Methode kann zum einen angewandt werden zur Erkennung noch unbekannter Gensequenzen, zum anderen lassen sich Mutationen in bereits bekannten Genen nachweisen. Als DNA Matrize werden häufig PCR Produkte eingesetzt. Entsprechende Sequenzierungsprotokolle bezeichnet man als direkte DNA Sequenzierung. Sie werden bevorzugt zur Detektion von Mutationen in bereits bekannten Sequenzen eingesetzt.

Problematisch bei der DNA Sequenzierung ist der Leserahmen, d.h. der Bereich in dem die Basenabfolge erfaßt werden kann. Dabei gibt es einerseits Limitationen bezüglich sehr langer Sequenzen, andererseits kann aber auch die Lesbarkeit in der Nähe des Sequenzierprimers erschwert sein. Letzteres Problem konnte durch die Entwicklung eines besonderen Protokolls umgangen werden (siehe Artikel “Direct DNA sequencing following SSCP analysis“). Es beruht im Prinzip auf der Einführung eines separaten Reaktionsschrittes, bei dem ein radioaktives Nukleotid eingebaut wird, das in der Sequenz gerade auf den Primer folgt (Petersen et al. 1993, Reichel et al. 1994, Petersen et al. 1994).

Von der direkten Sequenzierung sind Verfahren zu unterscheiden, bei denen das DNA Fragment vorher in einen Plasmidvektor kloniert und in Bakterien zur Vermehrung eingeschleust wurde. Als Primer wird hierbei eine Sequenz im Randbereich der Klonierungsstelle benutzt. Diese Methode eignet sich insbesondere zur Bestimmung von unbekannten Sequenzen und findet beispielsweise Anwendung bei der automatischen DNA Sequenzierung im Rahmen von Genomforschungsprojekten.

Unabhängig von der Generierung der DNA-Matrize erfolgt häufig auch im Rahmen der


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Sequenzierungsreaktion eine Amplifikation mittels PCR. Entsprechende Protokolle werden als “Cycle Sequencing“ bezeichnet.

Detaillierte Reaktionsschritte sind in den oben aufgeführten Publikationen nachlesbar.

3.4.1.3. LOH-Analyse

Die “loss of heterozygostiy“ (LOH)-Analyse basiert auf der Untersuchung von polymorphen genetischen Markern des menschlichen Genoms. Es werden heutzutage vor allem sogenannte Mikrosatelliten-Polymorphismen, bei dem sich die Allele durch die Anzahl kurzer repetitiver Sequenzen unterscheiden, verwandt. Hat ein Patient verschiedene Allele von seiner Mutter und seinem Vater vererbt, d.h. im Falle der Heterozygotie, kann durch den Vergleich beider Allele in Tumor- und Normal DNA eines Individuums eine Deletion entsprechend dem sogenannte Heterozygotie-Verlust (LOH) festgestellt werden. Dies ist schematisch in siehe dargestellt.

Mikrosatelliten-Polymorphismen finden sich über das gesamte Genom verteilt und ihre relative Anordnung entlang der Chromosomen ist über Kopplungsanalysen geklärt. Der Nachweis von Allelverlusten kann damit zur Lokalisation von Tumorsuppressorgenen benutzt werden. Dies geschieht durch die Untersuchung möglichst vieler Marker an möglichst vielen Tumoren im Rahmen sogenannter Allelotypisierungsstudien. Dabei ist es möglich, kleine DNA Verluste aufzuspüren und eine Karte (“deletion mapping“) aufzustellen mit minimalen Regionen interstitieller Deletionen (Petersen et al. 1998a).

Ein ähnliches Prozedere wird auch eingesetzt, um andere Krankheitsgene - zum Beispiel solche, die eine bestimmte Erbkrankheit hervorrufen - zu lokalisieren. Dabei wird über Kopplungsanalysen untersucht, ob innerhalb der betroffenen Familien ein Marker oder Allel mit dem Krankheitsphänotyp segregiert.


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3.5. Telepathologie

Tumorbiologische Untersuchungen sind wesentlich abhängig von einer korrekten pathologisch-anatomischen Diagnose. Zudem ist es in vielen Fällen unabdingbar, daß das untersuchte Gewebe von einem Pathologen auf seine Reinheit, d.h. bei Tumorproben beispielsweise die Kontamination mit Normalgewebe (Stroma, Entzündungsinfiltrate), begutachtet wird. Allzu häufig wird dies jedoch nicht genügend berücksichtigt. So basiert sicherlich das Urteil einiger CGH-Studien, die über einen hohen Anteil an Tumoren ohne Veränderungen berichten, darauf, daß ein Teil der Fälle zuviel Normalgewebe aufwies.

Andererseits muß angemerkt werden, daß es für Wissenschaftler in Grundlagenfächern, die nicht einem Krankenhaus angeschlossen sind, häufig schwierig sein kann, einen entsprechenden pathologischen Service zu erlangen. Für diese Kollegen kann unsere Neuentwicklung auf dem Gebiet der Telemikroskopie hilfreich sein (“Telemicroscopy via the Internet“). Es beschreibt erstmalig die Fernsteuerung eines automatischen Mikroskops über einen konventionellen Internet-Browser (Wolf et al. 1998a, Wolf et al. 1998b). Der Vorteil im Vergleich zu früheren Telemikroskopiesystemen liegt darin, daß jeder Internetteilnehmer ein möglicher Konsultationspartner für eine mikroskopische Beurteilung werden kann. Die früheren Systeme stellten nur 2-Punkt-Lösungen dar, d.h. es konnten in der Regel nur 2 kompatible Systeme miteinander kommunizieren. Mittlerweile haben wir auch eine Version entwickelt, die ohne ein automatisches Mikroskop funktioniert und daher sehr viel preisgünstiger ist.

Die Web-Seite unseres Telemikroskops ist in siehe dargestellt.


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