Petersen, Iver: Genetik von Karzinomen des Respirationstraktes: Korrelation Genotyp - Phänotyp

22

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Methodische Beiträge - CGH Summen-/Superkaryogramme/Histogramme

Das Ergebnis einer CGH-Untersuchung wird bei allen Auswerteprogrammen durch das sogenannte mittlere Ratio-Profil dargestellt ( siehe a). In dieses mittlere Profil fließen sämtliche Profile der gleichen Chromosomen aus mehreren aufgenommenen Metaphasen eines Falles ein. Die Einzelprofile errechnen sich anhand der Fluoreszenzintensitäten von Tumor- und Normal-DNA, die entlang der Chromosomenachse bestimmt werden. Zusätzlich zum Profil wird das Ergebnis häufig auch in Form einer Strich- oder Graphdarstellung wiedergegeben ( siehe b).

Zusätzlich zur Profil- und Strichdarstellung kann in der von uns entwickelten CGH-Software (“Analyseprogramm zur quantitativen Erfassung chromosomaler Aberrationen mittels Komparativer Genomischer Hybridisierung (CGH)“ und “Image analysis for Comparative Genomic Hybridization (CGH) based on a karyotyping program for Windows“) das Ergebnis in Form gemittelter Ratio-Chromosomen dargestellt werden. Wir bezeichnen es als CGH-Summenkaryogramm ( siehe a).

Um gemeinsame Veränderungen von Tumoren einer bestimmten Gruppe (z.B. einer histologischen Entität) zusammenzufassen, können die Summenkaryogramme der einzelnen Fälle in einem CGH-Superkaryogramm übereinandergelegt werden (ausführlich erklärt in der Arbeit “Small cell lung cancer is characterized by a high incidence of deletions on chromosomes 3p, 4q, 5q, 10q, 13q and 17p“). Es repräsentiert typische chromosomale Imbalanzen einer Tumorgruppe aufgrund der Tatsache, daß durch die Superposition zufällige Veränderungen unterdrückt und nur diejenigen sichtbar bleiben, die in einer größeren Anzahl der Fälle siehe c). Diese Auswertung ist insbesondere von Vorteil, wenn in einer Gruppe nur wenige Fälle vorhanden sind.

Während die Summen- und Superkaryogramme im wesentlichen nur neue


23

Darstellungsformen sind, lassen sich mit den Histogrammen weitergehende statistische Auswertungsmöglichkeiten realisieren ( siehe e). Sie werden vor allem dann sinnvoll, wenn die Fallzahlen groß genug sind, d.h. ab etwa 20 Tumoren. Die Histogrammdarstellung läßt sich von der klassischen Strichdarstellung ( siehe ) ableiten, bei der die Einzelveränderungen anhand von Strichen beiderseits der Chromosomenideogramme zusammengefaßt werden. Diese Darstellung erfolgte manuell und war mit entsprechenden Fehlern behaftet. Zur Erstellung der Histogramme werden die Veränderungen in Form einzelner Striche automatisch an einer bestimmten Stelle aufsummiert und im Verhältnis zu der Gesamtanzahl der Fälle gesetzt. Daraus ergibt sich eine Verteilung der chromosomalen Imbalanzen als Inzidenzkurve links und rechts der Chromosomenideogramme. Ausschläge auf der rechten Seite entsprechen einer Überrepräsentationen, Ausschläge auf der linken Seite DNA-Verlusten. Die Inzidenz läßt sich anhand der Hilfslinien ablesen. Der Maximalwert von 100% wird erreicht, falls alle Tumoren an einer bestimmten chromosomalen Region einen DNA-Gewinn oder -Verlust aufweisen.

Die Histogrammdarstellung hat mehrere Vorteile gegenüber der konventionellen Strichdarstellung. Erstens kann so das Ergebnis einer sehr großen Anzahl von Fällen graphisch dargestellt werden. Dies ist bei der Strichdarstellung schon allein aufgrund des Platzmangels nicht möglich. Zweitens zeigt es in übersichtlicher Form, wo und wie häufig eine Tumorgruppe DNA-Gewinne und -Verluste aufweist. Dritter und wichtigster Punkt ist die Tatsache, daß sich erstmals phänotypisch unterschiedliche Tumorgruppen über das gesamte Chromosomenkomplement statistisch miteinander vergleichen lassen ( siehe f). Es ist damit ein ideales Werkzeug, um signifikante Unterschiede zwischen Tumorgruppen zu erarbeiten und somit Korrelationen zwischen dem Geno- und Phänotyp aufzudecken.

Die nähere Beschreibung der Erstellung von Histogrammen und Differenzhistogrammen


24

ist den Arbeiten “Patterns of chromosomal imbalances in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung“ und “Patterns of chromosomal alterations in metastasizing and non-metastasizing primary head and neck carcinomas“ zu entnehmen.


25

4.2. Korrelation der genetischen Veränderungen mit den Histotypen

4.2.1. Gut und schlecht differenzierte Plattenepithelkarzinome des HNO-Bereiches

In der ersten CGH Studie über Plattenepithelkarzinome des HNO-Traktes wurden insgesamt 30 Tumoren analysiert. Davon war die Mehrzahl mäßig differenziert und nur insgesamt 3 Tumoren eindeutig gut (G1) und 5 schlecht differenziert (G3). Wir benutzten den Ansatz der CGH-Superkaryogramme, um solche Veränderungen aufzudecken, die mit einer guten bzw. schlechten Tumordifferenzierung verbunden waren. Das Ergebnis ist in siehe dargestellt.

Die Analyse zeigte, daß die G1 Tumoren lediglich Deletionen auf Chromosom 3p und 9p sowie Überrepräsentationen auf Chromosom 3q aufwiesen. Demgegenüber zeigten die G3-Karzinome auf diesen beiden Chromosomen ähnliche Veränderungen.


26

Zusätzlich traten jedoch multiple weitere Aberrationen auf, u.a. Deletionen auf 8p, 11q, 13q, 18q, 21q und Überrepräsentierungen auf 8q, 11q13, 19, 20 und 22.

4.2.2. Kleinzellige Bronchialkarzinome

Es wurden insgesamt 3 Studien über kleinzellige Karzinome durchgeführt (Ried et al. 1994, Petersen et al. 1997a, Schwendel et al. 1997). Die erste, die in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer in Heidelberg angefertigt wurde (“Mapping of multiple DNA gains and losses in primary small cell lung carcinomas by Comparative Genomic Hybridization“) zeigte bereits ein wiederkehrendes Muster von Veränderungen. In der Beurteilung wurde neben häufigen Deletionen der Chromosomenarme 3p, 5q, 10q, 13q, 17p insbesondere auf DNA-Überrepräsentationen auf 3q, 5p, 8q, 17q und distinkte Amplifikationen der chromosomalen Banden 1p32, 2p23, 7q11.2, 8q24, 13q33-34 und 19q13.1) hingewiesen. In einer zweiten Studie mit einer erweiterten Fallzahl kleinzelliger Bronchialkarzinome (“Small cell lung cancer is characterized by a high incidence of deletions on chromosomes 3p, 4q, 5q, 10q, 13q and 17p“) konnte gezeigt werden, daß Deletionen insgesamt häufiger vorkommen und damit aller Wahrscheinlichkeit nach eine größere Bedeutung für die Biologie dieses Tumors haben als DNA-Überrepräsentationen. Das Auftreten von Verlusten der Chromosomenarme 3p, 4q, 5q, 10q, 13q und 17p ist sehr charakteristisch. Als Einzelveränderung treten sie in über 85%, simultan in über 50% der Tumoren auf. Die Deletion von Chromosom 10q war mit 94% die zweithäufigste Läsion nach dem Chromosom 3q-Verlust mit 100%. Diese typischen Veränderungen sind auch im Superkaryogramm der 22 analysierten Karzinome sichtbar ( siehe ). Interessanterweise weisen die kleinzelligen Karzinome in der Regel große Deletionen eines gesamten Chromosomens oder Chromosomenarms auf.


27

Eine dritte Studie über den Vergleich von Primärtumoren und Metastasen (“Primary small cell lung carcinomas and their metastases are characterized by a recurrent pattern of genetic alterations“) konnte diese Ergebnisse bestätigen. Insbesondere liess sich bei den 10 untersuchten Fällen immer ein klonaler Zusammenhang zwischen dem Primärtumor und seinen Metastasen feststellen (siehe auch unten).


28

4.2.3. Adeno- und Plattenepithelkarzinome der Lunge

Es wurde eine erste Studie an nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen publiziert, die insgesamt 25 Plattenepithel- und 25 Adenokarzinome beinhaltete (“Patterns of chromosomal imbalances in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung“). Sie zeigte, dass sie ebenfalls durch ein Muster rekurrenter Veränderungen charakterisiert sind. Ähnlich wie das kleinzellige Karzinom haben nicht-kleinzellige Karzinome häufig Deletionen der Chromosomen 3p, 4q, 5q und 13q. Deletionen von Chromosom 10q treten deutlich seltener auf. Zusätzlich lassen sich Deletionen der Chromosomenarme 6q, 8p, 9p, 18q und 21q beobachten. DNA-Überrepräsentationen zeigen sich in beiden Gruppen bei der chromosomalen Bande 11q13. Adenokarzinome zeigten sehr viel häufiger Überrepräsentationen des Chromosomenarms 1q, während bei Plattenepithelkarzinomen typischerweise Amplifikationen des distalen Chromosomenarms 3q auftraten.

In dieser Arbeit wurde erstmals die Analyse mittels Histogrammen und statistische Vergleiche über Differenzhistogrammen und Chi-Quadrattest angewandt (Abb. 10). Dabei zeigte sich, daß die Überrepräsentation der chromosomalen Bande 1q23 und die Deletionen auf den Chromosomen 9q22 und 19 signifikant mit der adenoiden Differenzierung assoziiert waren, während der Verlust auf Chromosom 2q36-37 und Amplifikationen auf Chromosom 3qter signifikant mit der plattenepithelialen Differenzierung korrelierte.


29

4.2.4. Morphologische Tumorheterogenität mit Übergang SCC rarr SCLC

Es wurden bisher in einem Fall unterschiedliche Areale eines morphologisch heterogenen Tumors untersucht. Es handelt sich um den Fall, dessen Histologie in siehe dargestellt ist. Der Primärtumor ließ überwiegend eine plattenepitheliale Differenzierung erkennen. Daneben fanden sich auch Areale mit kleinzelliger Differenzierung. Immunhistologisch ließen sich in diesen Arealen die neuroenkrinen Marker Chromogranin und Synaptophysin nachweisen, während der plattenepitheliale Anteil negativ war. Eine synchrone Metastase zeigte eine rein kleinzellige Differenzierung. Es wurde mit Hilfe der CGH der Primärtumor als auch die kleinzellige Metastase untersucht. Das Ergebnis ist in siehe dargestellt.


30

Beide Tumoren lassen einen klonalen Zusammenhang erkennen, was bedeutet, daß der eine Tumoranteil aus dem anderen hervorgegangen sein muß. Die genetische Analyse unterstützt damit die Bewertung der Morphologie, die einen Übergang zwischen beiden Differenzierungen nahe legt, und nicht das Vorliegen eines genetischen unabhängigen Kollisionstumors. Da der Primärtumor überwiegend plattenepithelial differenziert war, ist es sehr wahrscheinlich, daß sich das kleinzellige Karzinom aus dem Plattenepithelkarzinom entwickelt hat.

Für die Entstehung des kleinzelligen Bronchialkarzinoms lassen sich folgende Schlußfolgerungen ziehen. Einerseits kann es sich auf dem Boden eines nicht-kleinzelligen Karzinom entwickeln, was einer Dedifferenzierung und der Transformation zu einem maligneren Phänotyp gleichkommt. Andererseits kann es de novo ohne morphologisch faßbare Vorläuferläsion entstehen. Letzteres ist zweifelsfrei sehr viel häufiger. Das kleinzellige Bronchialkarzinom zeigt damit sowohl bezüglich der genetischen Veränderungen als auch der Entstehungsmechanismen Parallelen zum Glioblastoma multiforme. Dieses weist auch typischerweise Deletionen des Chromosom 10 auf. Es kann entweder direkt oder durch maligne Transformation eines low grade Astrozytoms entstehen, wobei die erste Variante sehr viel häufiger ist.

Die mögliche Transformation eines NSCLC in ein SCLC unterstützt zudem die Hypothese, daß es vermutlich nicht eine neuroendokrinen Stammzelle sondern eher eine proliferationsaktive epitheliale Zelle ist, aus der sich das kleinzellige Karzinom entwickelt.


31


32

4.3. Genetische Veränderungen in Assoziation mit der Metastasierung

4.3.1. HNO-Plattenepithelkarzinome

In einer ersten Studie wurden metastasierende und nicht-metastasierende Primär-tumoren der Kopf-Hals-Regionen miteinander verglichen (“Patterns of chromosomal alterations in metastasizing and non-metastasizing primary head and neck carcinomas“). Dabei wurden zwei Gruppen von Tumoren gebildet. Eine Gruppe umfaßte Karzinome, die trotz fortgeschrittenem Primärtumorstadium keine Lymphknotenabsiedlungen zeigten, während diese bei der zweiten Gruppe in jedem Fall nachweisbar waren. Der Vergleich mittels Differenzhistogramm ist in siehe dargestellt.


33

4.3.2. Bronchialkarzinome - Vergleich von SCLC Primärtumoren und Metastasen

Es wurde eine erste CGH-Arbeit über den Vergleich von Primärtumoren und Metastasen publiziert (Schwendel et al. 1997). Dabei wurden insgesamt die Fälle von 10 Patienten untersucht. Neben dem Primärtumor wurden bis zu drei unterschiedliche Metastasen pro Fall analysiert. Dabei war in jedem Fall ein klonales Verhältnis zwischen den Tumoren eines Patienten mit der CGH nachweisbar, d.h. in allen 10 Fällen überwog die Zahl der gemeinsamen gegenüber denjenigen der unterschiedlichen Veränderungen.

Es ließen sich zwar zusätzliche Alterationen feststellen, jedoch keine, die gegenüber den Primärtumoren signifikant häufiger auftrat und somit für die Metastasierung verantwortlich gemacht werden konnte. Diese Beobachtung ist insofern nicht verwunderlich, da das kleinzellige Karzinom ein primär hochmaligner Tumor ist, der zum Zeitpunkt der Diagnose in der Regel bereits metastasiert hat. Somit sollten die genetischen Alterationen, die die Metastasierung vermitteln, bereits im Primärtumor nachweisbar sein. Es wurden Unterschiede sowohl zwischen Primärtumor und Metastasen als auch innerhalb der Metastasen eines Patienten beobachtet, was die hohe genetische Instabilität dieses Tumortyps belegt.

4.3.2.1. LOH-Analyse von SCLC und NSCLC der Lunge

In mehreren Einzelfällen von Plattenepithelkarzinomen zeigten die CGH-Ergebnisse, daß in den Metastasen häufig ein Verlust auf Chromosom 10q auftrat, der in den Primärtumoren nicht oder nicht so ausgeprägt nachweisbar war. Wir führten daraufhin eine erste LOH-Studie an insgesamt 79 Bronchialkarzinomen (SCLC, metastasierte und nicht-metastasierte SCC und weitere NSCLC) durch (“Allelic loss on chromosome 10q in human lung cancer: association with tumor progression and the metastastic phenotype“). Dabei zeigten sich signifikant häufiger Allelverluste auf Chromosom 10q in der Gruppe der metastasierten Plattenepithelkarzinome. Allelverluste


34

waren ebenfalls in 91% (20/22) der kleinzelligen Karzinome detektierbar, wobei interessanterweise der einzige nicht-metastasierte Tumor keinen Allelverlust aufwies. Die Allelotypisierung von 3 Karzinomen ist beispielhaft in Abb. 13 wiedergegeben. Diese Arbeit konnte belegen, daß Allelverluste auf Chromosom 10q mit der Tumorprogression und der Metastasierung assoziiert sind.

Da die metastasierten Plattenepithelkarzinome gehäuft interstitielle Deletionen aufwiesen, wurde eine zweite Studie angeschlossen, in der lediglich dieser Tumortyp analysiert wurde (“Distinct regions of allelic imbalance on chromosome 10q22-q26 in squamous cell carcinomas of the lung“). Diese Studie umfasste zwar weniger Fälle, dafür wurde aber eine sehr viel größere Anzahl von DNA-Polymorphismen untersucht.

Es gelang insgesamt drei minimale Regionen interstitieller Deletionen aufzudecken, die jeweils als Kandidatenregionen für Tumorsuppressorgene gewertet werden können. In den beiden Arbeiten (Petersen et al. 1998a, Petersen et al. 1998b) wurden zudem die bereits identifizierten Kandidatengene MXI1 und PTEN/MMAC1 untersucht. Beide zeigten keine Mutationen, so daß noch unbekannte Gene die Tumorprogression und Metastasierung vermitteln müssen.


35


36

4.3.2.2. CGH an pM0 und pM1 Plattenepithelkarzinomen der Lunge

Mittlerweile konnte auch eine CGH-Untersuchung an metastasierten und nicht-metastasierten Plattenepithelkarzinomen der Lunge abgeschlossen werden. Die Studie umfaßte insgesamt 50 Fälle, davon je 25 im Stadium pM0 und pM1. Bei den metastasierten Tumoren wurden zusätzlich 16 synchrone Fernmetastasen untersucht.

Der Vergleich beider Gruppen mittels Differenzhistogramm ist in siehe dargestellt. Die vorherrschende rote Farbe zeigt eindeutig, daß die Tumoren im Rahmen der Metastasierung zusätzliche Veränderungen akkumulieren.


37

Es wurden für mehrere Chromosomen signifikante Veränderungen angezeigt, was gut mit der Tatsache korreliert, daß die Metastasierung ein komplexer Vorgang ist, bei dem multiple Mechanismen zusammenspielen. Da im Gegensatz zu den HNO-Tumoren (vgl. siehe ) in der Gruppe der pM1-Tumoren vornehmlich Metastasen analysiert wurden, zeigen sich sehr viel mehr Veränderungen, die mit der Metastasierung assoziiert sind.

4.3.3. Chromosomale Mechanismen im Rahmen der Tumorprogression

In der Arbeit über pM0 und pM1-Tumoren konnte wiederum - wie auch bei den kleinzelligen Karzinomen - in jedem Fall ein klonaler Zusammenhang zwischen dem Primärtumor und den Metastasen nachgewiesen werden. Dies ist aus Abb. 15a ersichtlich, die die CGH-Ergebnisse eines primären Plattenepithelkarzinoms sowie


38

zweier synchroner Lebermetastasen zeigt. Die eine Metastase war 25 mm groß, die zweite maß lediglich 10 mm. Es kann daher angenommen werden, daß die größere Metastase vor der kleineren Metastase entstanden ist. Zudem deuten die Untersuchungsergebnisse auf spezifische Mechanismen chromosomaler Veränderungen hin, die offenbar während der Tumorprogression auftreten. Sie sind ebenfalls in Abb. 15 dargestellt.

Interessanterweise zeigen die Beispiele von Chromosom 6q und 8 ( siehe a), daß sich Deletionen im Rahmen der Tumorprogression offenbar ausdehnen können. Weitere Mechanismen sind aus siehe b ablesbar, die jeweils die Profile eines Primärtumor und seiner Metastase für ein spezielles Chromosom zeigen. Wie das Beispiel für Chromosom 1 zeigt, kann offenbar die DNA Überrepräsentationen eines ganzen Chromosomenarms zu einem kleineren Amplicon verringert werden. Die Veränderungen können sich intensivieren, wie beispielsweise bei Chromosom 8 von einer einfachen Überrepräsentation zu einer Mehrkopien-Amplifikation. Schließlich zeigt das Profil von Chromosom 10, daß kleinen Läsionen bei der Generierung größerer DNA-Imbalanzen offenbar eine Trigger-Funktion zukommt.

Dieser Beobachtung kommt insofern große Bedeutung zu, da sie darauf hinweist, daß auch kleinere Abweichungen des Profils von Chromosomen, die metastasierungsrelevante Gene beherbergen, für die Prognose des Patienten entscheidend sein können.


39


40

4.4. Tabellarische Übersicht der chromosomalen Imbalanzen

Tabelle Chromosomale Imbalanzen von Karzinomen des Respirationstraktes

DNA Verluste

DNA Verluste

HNSCC

1p, 3p, 4, 5q, 6q, 8p, 9p

1pter, 3q, 5p, 8q, 11q13,

11q21, 13q, 18q, 21q

16p, 17q, 19q, 20q, 22

G1

3p, 9p

3q

G3

3p, 4q, 8p, 9p, 11q21-qter, 13q, 18q, 21q

1pter, 3q, 11q13, 19, 22q

pN0

5p, 6p, 7p

pN+

7q, 10q21, 10q25-q26, 11p13-p14,

19q13

11q21-qter, 15q

5p, 8q, 11q13, 16p, 17q,

NSCLC

1p, 3p, 4, 5q, 6q, 8p, 9p, 11q21,

19q, 20q, 22q

(Adeno & SCC)

13q, 18q, 21q

1q23

Adeno

3q, 9q, 19

3q21-22, 3q24-qter, 12p

SCC

2q36-37

3q21-22, 3q24-qter, 12p

pM1

3p12, 4p16, 6p22-p24, 6q24-q27,

1q21-q25, 8q, 9q34, 11q13,

8p23, 10q21-q24, 10q26, 21q22

15q11-q13

SCLC

3p, 4q, 5q, 10q, 13q, 15q, 17p

3q, 5p, 19q13, 20q

Abkürzungen: Adeno, Adenokarzinom; HNSCC, HNO SCC; G1, gut differenziert; G3, wenig differenziert; pN0, nicht-metastasiert; pN+, LK-positive HNSCC; NSCLC, Nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome; SCC, Plattenepithelkarzinome; SCLC, kleinzellige Bronchialkarzinome


[Titelseite] [1] [2] [3] [4] [5] [Bibliographie] [Danksagung] [Selbständigkeitserklärung] [Lebenslauf] [Anhang]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Wed Feb 2 10:26:49 2000