Petersen, Iver: Genetik von Karzinomen des Respirationstraktes: Korrelation Genotyp - Phänotyp

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Kapitel 5. Diskussion und Ausblick

5.1.1.1. Korrelation von CGH und molekulargenetischen Untersuchungen

Die molekularzytogenetischen Daten, die durch die CGH gewonnen wurden, weisen chromosomale Regionen aus, die Tumor-assoziierte Gene beherbergen können. Viele der aufgestellten Korrelationen zwischen Genotyp und Phänotyp sind neu und waren bisher unbekannt. Es stellen sich daher unmittelbar die Fragen, wie zuverlässig einerseits die aufgestellten Korrelationen sind und inwieweit sie andererseits mit Läsionen bekannter Tumorsuppressor-Gene und Onkogene vereinbar sind.

Zur ersten Frage läßt sich feststellen, daß die von uns erhobenen LOH- und CGH-Daten sehr gut miteinander kompatibel waren, was insbesondere durch die ausgedehnten Allelotypisierungsstudien für Chromosom 10q belegt wurde (Petersen et al. 1997a, Bockmühl et al. 1997, Petersen et al. 1998a, Petersen et al. 1998b). Ein Beispiel für die Korrelation gibt siehe .


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Bezüglich der zweiten Frage haben wir bisher keinen Vergleich unserer CGH-Befunde mit den Mutationen in bekannten Krebs-assoziierten Genen durchgeführt. Es lassen sich jedoch die Ergebnisse gut mit publizierten Daten in Einklang bringen. Bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen beispielsweise entspricht die Inzidenz der Deletionen im Bereich der chromosomalen Banden 17p13 und 13q14 in etwa der Häufigkeit an Mutationen im p53 bzw. Rb1 Tumorsuppressor-Gen (Sameshima et al. 1992, Kelley et al. 1995). Die chromosomale Deletion ist somit sehr wahrscheinlich mit der Inaktivierung des korrespondierenden Tumorsuppressor-Gens verbunden. Entsprechendes gilt für den DNA Gewinn der chromosomalen Bande 11q13 und der Amplifikation bzw. des Cyclin D1 Proto-Onkogen. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß das Muster der chromosomalen Imbalanzen mit der Aktivierung bzw. Inaktivierung spezifischer Onko- und Anti-Onkogene verbunden ist

Die Untersuchungen an gut differenzierten Plattenepithelkarzinomen lassen sich sehr gut mit einem Progressionsmodell von HNO-Karzinomen in Einklang bringen, das von der Gruppe um David Sidransky an der Johns-Hopkins-Universität in Baltimore (USA) aufgestellt wurde (Califano et al. 1996). Sie fanden in frühen Tumorstadien und dysplastischen Vorläuferläsionen vor allem Allelverluste auf den Chromosomen 9p und 3p, d.h. genau diejenigen Veränderungen, die wir in den hochdifferenzierten Plattenepithelkarzinomen nachweisen konnten. In fortgeschrittenen Tumorstadien wurden beispielsweise Deletionen auf den Chromosomen 11q, 13q, 14q, 6p, 8, 4q beobachtet sowie die Inaktivierungen der Tumorsuppressor-Gene p53, Rb1 und Amplifikationen von Cyclin D1. Diese Veränderungen zeigen Übereinstimmungen mit den CGH Ergebnissen der wenig differenzierten HNSCC. Andererseits weisen die CGH-Daten weitere Läsionen aus wie Deletionen auf 4p, 6q, 18q, 21q als auch Überrepräsentierungen von 1pter, 17, 19, 20q und 22q, die vermutlich ebenso in der Tumorprogression von Bedeutung sind (Bockmühl et al. 1996).


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Die Tatsache, daß Deletionen auf Chromosom 10q mit der Metastasierung von Bronchialkarzinomen verbunden sind, waren unbekannt. Sie paßt jedoch gut zu der Beobachtung, daß diese Läsion in anderen soliden Tumoren mit der Tumorprogression assoziiert ist (von Deimling et al. 1992, Rempel et al. 1993, Gray et al. 1995). Diese Vergleiche sollen exemplarisch zeigen, daß durch die umfassende Analyse des Genoms mit der CGH neue und wichtige genetische Veränderungen aufgedeckt werden konnten. Trotz ihres limitierten Auflösungsvermögens hat sich die CGH als Screeningmethode gegenüber den traditionellen molekulargenetischen Untersuchungen bewährt. Ziel einer weitergehenden Analyse muß aber die Definition der zugrundeliegenden genetischen Läsionen sein.

5.1.1.2. Charakterisierung der zugrundeliegenden genetischen Läsionen

Traditionelle Verfahren zur Identifizierung neuer Kandidatengene sind sehr arbeits- und zeitaufwendig. Durch die Untersuchung differentiell exprimierter Gene kann diese Suche möglicherweise entscheidend erleichtert werden. Diese neuen Techniken erlauben es, innerhalb weniger Wochen Genbibliotheken zu erstellen, beispielsweise durch den Vergleich von Zellinien (Karzinomzellen versus normale Epithelien) oder Geweben (Dysplasie versus Normalepithel), die durch Mikrodissektion gewonnen werden. In den USA wird dieser Ansatz zur Zeit in grossem Umfang durchgeführt im Rahmen des sogenannten “Cancer Gene Anatomy Project“ (CGAP), das vom National Cancer Institute (NCI) gefördert wird (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ncicgap/)

Eine weitere Entwicklung, die die Tumorcharakterisierung und -diagnostik möglicherweise revolutionieren wird, ist die Chip- und Filter-Technologie. Sie beruht darauf, daß (Teil-) Sequenzen vieler Gene in geordneter Weise auf eine Trägermatrix aufgebracht werden. Diese Matrix kann beispielsweise ein speziell beschichteter Objektträger sein oder eine Membran. Bei den Oligonukleotid-Chips werden in der Regel nur kurze Fragmente aufgebracht. Es erfolgt dann eine Hybridisierung von DNA


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oder RNA auf diese Matrix. Ähnlich zur CGH erfolgt diese Hybridisierung häufig zusammen mit einer Referenz-DNA/RNA sowie mit Fluoreszenz-markierten Proben. Insofern hat die CGH eine wichtigen konzeptionellen Beitrag zu der Entwicklung dieser Verfahren geleistet.

Mit Hilfe der DNA/RNA-Chips können DNA-Imbalanzen, Expressionsunterschiede aber auch DNA-Punktmutationen in bekannten Genen nachgewiesen werden. Sie besitzen prinzipiell ein sehr viel höheres Auflösungsvermögen als die CGH und haben ihr gegenüber insbesondere das Potential zur Automatisierung. Einschränkend muß jedoch festgestellt werden, daß noch technischen Schwierigkeiten bestehen. So können zwar bereits mehrere hundert bis tausend Gene auf einen Chip aufgebracht werden, eine komplette Analyse aller Gene mit einem Chip ist jedoch bisher nicht möglich. Für die Matrix-CGH (Solinas-Toldo et al. 1997) als Beispiel einer Chip-Technologie, die in der Lage ist, DNA-Imbalanzen zu detektieren, besteht eine Schwierigkeit darin, daß für vereinzelte Chromosomenabschnitte keine Bibliotheken benachbarter DNA-Fragmente vorhanden sind. Mit der Entschlüsselung sämtlicher Gene im Rahmen des menschlichen Genomprojektes, ist es jedoch nur eine Frage der Zeit bis diese Lücken geschlossen sein werden. Auch ist zu erwarten, daß für die technischen Probleme Lösungen gefunden werden können.

Eine weitere Schwierigkeit ist die Datenauswertung. Es müssen geeignete Computerprogramme entwickelt werden, die in der Lage sind, die ungeheure Datenmenge, die sich bei der Analyse eines Tumors ergeben, zu analysieren und zu gewichten, d.h. zu klassifizieren. Wie solche Klassifikationsalgorithmen aussehen müßten, ist noch weitestgehend unklar, sie müßten jedoch zunächst an gut charakterisierten Tumorkollektiven ausgetestet werden. Zudem wird es vermutlich notwendig sein, am Anfang eine limitierte Anzahl von Parametern zu verwenden bevor mehrere tausend Gene berücksichtigt werden können. Insofern könnte die CGH


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auch hier als relativ einfaches Modell einer umfassenden genetischen Tumoranalyse möglicherweise Hilfestellung geben.

Aufgrund des limitierten Auflösungsvermögen (Bentz et al. 1998) kann die CGH zwar keine spezifischen Gendefekte aufdecken, hat sich aber bereits als sehr hilfreich bei der Identifizierung neuer Kandidatenregionen und Kandidatengene erwiesen. Das Auffinden und vor allem die Charakterisierung neuer Tumor-assoziierter Gene schreitet zwar schnell voran, sie wird aber noch mehrere Jahre oder Jahrzehnte in Anspruch nehmen. Dies liegt vor allem darin begründet, daß zwar mittlerweile Methoden zur Verfügung stehen, die es erlauben, viele Tumoren in relativ kurzer Zeit auf Mutationen zu untersuchen. So erscheinen in der Regel innerhalb weniger Monate nach der Veröffentlichung eines neuen Kandidatengens Publikationen, die entweder die ursprünglichen Befunde bestätigen oder manchmal auch widerlegen. Andererseits bedarf es zur funktionellen Charakterisierung dieser Mutationen immer noch sehr aufwendiger Methoden, deren Durchführung häufig mehrere Jahre in Anspruch nimmt.


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5.1.1.3. Genetische Tumorklassifikation

Das Ziel einer umfassenden Tumorgenomanalyse muß letztlich die Entwicklung einer genetischen Klassifikation sein. Sie sollte nicht primär deskriptiv wie die bisherige morphologische Klassifikation sein, sondern prädiktiv das biologische Verhalten eines Tumors vorhersagen können. Die CGH Untersuchungen weisen darauf hin, daß eine solche Klassifikation möglich ist. Eine CGH Analyse ausgewählter Fälle ist bereits heute sinnvoll. Obwohl eher zweifelhaft ist, ob die CGH jemals Methode der Wahl für eine genetische Routineanalyse werden wird, weist sie doch auf die reale Möglichkeit einer genetischen Klassifikation hin.

Mit der Entschlüsselung des menschlichen Genoms und der Entwicklung neuer Verfahren stehen uns nie dagewesene Mittel in der genetischen Forschung zur Verfügung. Es wird sehr spannend sein, mit ihnen alte Fragen der Medizin zu beantworten und neue aufzuwerfen. Damit einher geht die Verpflichtung, sie verantwortungsvoll zum Wohle des Patienten einzusetzen. Der Arzt und Forscher sollte sich stets über die Grenzen seines Wissens und Handels im Klaren sein. Diese Schwierigkeit drückte Viktor McKusick im Rahmen seiner Rede anläßlich der Verleihung der Ehrendoktorwürde an der Züricher Universität 1990 so aus:

“We are all slaves of our methods.“

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