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2  Patienten und Methoden

2.1 Charakterisierung der Patienten und Probanden, Ein- und Ausschlußkriterien

Im folgenden werden die Charakteristika der untersuchten Patienten und Probanden überwiegend tabellarisch zusammengefaßt.

2.1.1 Untersuchungen an Patienten mit akutem Koronarsyndrom

Es wurden drei Studien an Patienten mit akutem Koronarsyndrom mit Zustimmung der Ethik-Kommission der Charité/Campus Virchow-Klinikum durchgeführt.

Die erste Studie, nachfolgend Myoglobin Studie genannt, diente dem Zweck, den klinischen Einsatz der kardialen Marker Troponin, Myoglobin und CK-MB/CK entsprechend den Richtlinien der National Academy of Clinical Biochemistry (NACB, USA) und dem Committee on Standardization of Markers of Cardiac Damage of the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) zu validieren. Diese Richtlinien besagen im wesentlichen:

  1. Die Notwendigkeit eines akzelerierten Protokolls für den Einsatz biochemischer Marker zum “rule in/out” von Patienten mit Brustschmerzen.
  2. Der Einsatz eines frühen Markers (Myoglobin) und eines definitiven biochemischen Markers (kardiales Troponin) für die Routinediagnostik des akuten Myokardinfarkts.
  3. Das Protokoll der Blutentnahmen sollte an der Aufnahmezeit in der Klinik orientiert sein, da die Angabe des Symptombeginns oft unzuverlässig und nicht überprüfbar ist.
  4. Es sollten zwei Schwellenwerte für das kardiale Troponin verwendet werden (für MMD und AMI).
  5. MMD soll als wesentliche Diagnose etabliert werden.
  6. Die Bestimmung der CK-MB-Masse sollte durch kardiales Troponin ersetzt werden.
  7. Die Verwendung von Plasma als Probe der Wahl.


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Zur Validierung dieser Richtlinien und Ableitung eines Schemas zur Bestimmung der Marker wurden 213 konsekutive Patienten gesichtet, die mit akutem Koronarsyndrom auf der internistischen Intensivstation aufgenommen wurden. Von diesen Patienten wurden 200 in die Studie eingeschlossen. Ausschlußkriterien waren: Anämie (mit einem Hämoglobinwert < 10g/dL), Endstadium einer chronischen Erkrankung beliebiger Ursache und die Unfähigkeit zum „informed consent“. Die Abbildung 2 zeigt die Patientenselektion im Überblick.

Abbildung 2. Patientenselektion der Myoglobin-Studie

ACS, akutes Koronarsyndrom; SD, Standardabweichung; CK, Kreatinkinase; CK-MB, CK-Isoenzym MB; ALGO, Algorithmus, siehe Kapitel Studienprotokolle (2.2.1) und Abbildung 4.


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Die kombinierte Testung von Myoglobin und Troponin I wurde nach einem von Gerhardt et al. entwickelten Schema durchgeführt (siehe Studienprotokoll, Kapitel 2.2.1, ALGO [Gerhardt, 98] ). Die klinischen Charakteristika der Patienten sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Eine konsekutive Subgruppe der Patienten erhielt zusätzliche Bestimmungen von kardialem Troponin I (Dade Behring, Stratus®II-System) und der CK-MB-Masse (Dade Behring, Opus®plus-System). In dieser Subgruppe kam das Schema ALGO zur Anwendung. Die Tabelle 2 zeigt, daß die Patienten der Subgruppe sich statistisch nicht von der Gesamtgruppe der Patienten unterschieden.


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Tabelle 2. Klinische Charakteristika der 200 Patienten der Myoglobin-Studie

Variable

Alle Patienten (n=200)

Subgruppe

ALGO (n=141)

Alter [Jahre]

61,08 SD12,75 (29-90)

61,4 SD13,14 (31-90)

BMI [kg/m²]

26,57 (24,21/29,7)

26,73 (24,19/29,32)

Kreatinin [mg/dL]a

1,1 (0,9/1,2)

1,1 (0,9/1,3)

Männliches Geschlecht [%]

75 (68-81)

75 (67-82)

Zigarettenrauchen [%]

53 (46-60)

50 (42-53)

Diabetes mellitus [%]

23 (17-29)

20 (14-28)

Hypercholesterinämieb [%]

46 (39-54)

42 (34-50)

Arterieller Hypertonus [%]

58 (50-65)

58 (46-63)

Vorbekannte KHK [%]

51 (43-58)

46 (37-55)

Positive Familienanamnesec [%]

58 (51-65)

54 (44-62)

Akuter Myokardinfarkt [%]

60 (52-66)

60 (52-68)

Akut-PTCA [%]

34 (28-42)

40 (32-49)

 

Delay [min]

375 (20-1800)

360 (20-1440)

Thrombolysetherapie [%]

20 (15-27)

20 (13-27)

 

Delay [min]

120 (30-660)

112,5 (30-300)

ST-Hebungen bei Aufnahme [%]

45 (38-52)

48 (39-57)

Alter als Mittelwert und Standardabweichung (SD), alle anderen quantitativen Variablen als Median und Quartilen (25%/75%) oder Range (Minimum - Maximum); qualitative Variablen in Prozent und 95%-Konfidenz-Intervallen; MYO, Myoglobin; TnI, Troponin I; BMI, body mass index; KHK, koronare Herzkrankheit; PTCA, perkutane transluminale koronare Angioplastie; Delay, Zeit vom Symptombeginn bis zum Start der spezifischen Therapie; a normal bis 1,3mg/dL; b Cholesterin >200mg/dL; c bezüglich koronarer Herzerkrankung.


[Seite 23↓]

Die zweite Studie, nachfolgend Troponin I-Studie genannt,diente dem Zweck, die klinische Bedeutung der unterschiedlichen biochemischen Charakteristika zweier Troponin I-Testsysteme zu ergründen.

In diese Studie wurden 162 konsekutive Patienten eingeschlossen, die mit einem akuten Koronarsyndrom auf der internistischen Intensivstation aufgenommen wurden. Ausschlußkriterien waren dieselben wie in der Myoglobin-Studie (siehe oben). Tabelle 3 zeigt die klinischen Charakteristika der Patienten insgesamt und nach ihrem Troponin-Status anhand der zu vergleichenden Testsysteme.


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Tabelle 3. Klinische Charakteristika der 162 Patienten der Troponin I-Studie insgesamt und nach dem Troponin-Status

Variable

Gesamtgruppe
(n=162)

TnI-S (+) bei
Aufnahme (n=57)

TnI-S (-) bei Aufnahme (n=105)

TnI-O (+) bei Aufnahme (n=36)

TnI-O (-) bei Aufnahme (n=126)

Alter [Jahre]

61,28 SD11,05

62,42 SD11,78

60,34 SD10,82

64,11 SD11,72

60,34 SD10,80

Männliches Geschlecht [%]

69

70

68

75

69

Diabetes mellitus [%]

17

19

14

14

16

Arterieller Hypertonus [%]

49

42

54

47

50

Zigarettenrauchen [%]

56

51

57

57

55

Hypercholesterinämiea [%]

44

44

46

33

47

Vorbekannte KHK [%]

48

46

50

36

51

Früherer AMI [%]

38

26

44*

28

41

Familienanamneseb [%]

33

28

37

28

35

Thrombolysetherapie [%]

14

14

13

14

13

Delay [min]

157,5 (60,0/302,5)

290,0 (157,5/547,5)

75,0 (60,0/215,0)

220,0 (160,0/660,0)

97,5 (60,0/302,5)

Akut-PTCA [%]

37

49

31*

47

32

Delay [min]

260,0 (176,3/450,0)

300,0 (172,5/607,5)

240,0 (176,3/420,0)

345,0 (240,0/765,0)

240,0 (172,5/375,0)

Symptomdauer [min]

210,0 (90,0/450,0)

275,0 (120,0/585,0)

180,0 (75,0/392,5)#

390,0 (180,0/900,0)

180,0 (70,0/360,0)#

Gesicherter AMI [%]

67

97

50*

94

57*

ST-Streckenhebungen [%]

44

16

61*

17

56*

Alter als Mittelwert und Standardabweichung (SD), alle anderen quantitativen Variablen als Median und Quartilen (25%/75%); qualitative Variablen in Prozent; TnI-S (+), Stratus®II-Troponin I ≥ 1,5µg/L, TnI-S (-), < 1,5µg/L; TnI-O (+), Opus®-Troponin I ≥ 1,6µg/L, TnI-O (-) < 1,6µg/L bei Aufnahme; KHK, koronare Herzerkrankung; AMI, akuter Myokardinfarkt; Delay, Zeit vom Symptombeginn bis zum Start der spezifischen Therapie; PTCA, perkutane transluminale koronare Angioplastie; a Gesamtcholesterin > 200mg/dL; bpositiv bezüglich koronarer Herzerkrankung; * p < 0,05 im Chi-Quadrat-Test; # p < 0,05 im Wilcoxon-Test versus die korrespondierende positive Gruppe.


[Seite 25↓]

Die dritte Studie, im folgenden Troponin T-Studie genannt, hatte die Evaluierung von Troponin T bei Patienten mit instabiler Angina pectoris und ausgeschlossenem AMI, jedoch nur geringgradiger oder atypischer Symptomatik zum Gegenstand. Einschlußkriterium war die klinische Verdachtsdiagnose eines akuten Koronarsyndroms. Ausschlußkriterien waren: definitive Zeichen des akuten Myokardinfarkts anhand der WHO-Kriterien, schwere instabile AP nach Braunwald-Kriterien (Klasse II/III; siehe Tabelle 1), offensichtliche extrakardiale Ursache der Beschwerden, Unfähigkeit zum „informed consent“, schwere Infektion oder Tumorerkrankung, symptomatische angeborene Herzfehler und Herzinsuffizienz im Stadium III oder IV der Klassifikation der New York Heart Association (NYHA). Die Diagnosestellung und die Einteilung in die Braunwald- bzw. NYHA-Klassifikation wurden von einem erfahrenen Facharzt vorgenommen, der nicht an der Studie beteiligt war und die Troponin-Werte der Patienten nicht kannte. Die Patientenselektion erfolgte aus 702 konsekutiven Patienten mit akutem Koronarsyndrom, die in den Jahren 1993 und 1994 auf der kardiologischen Intensivstation zur Aufnahme kamen. Bei 421 (entspricht 60%) dieser Patienten wurde nach WHO-Kriterien ein akuter Myokardinfarkt diagnostiziert. Bei grenzwertigen Veränderungen der Enzyme CK-MB/CK wurden auch die Ergebnisse serieller echokardiographischer Untersuchungen und die Ergebnisse der Koronarangiographie in die Diagnosestellung mit einbezogen. Die Abbildung 3 zeigt die Patientenselektion dieser Studie und die Tabelle 4 die klinischen Charakteristika der Patienten.


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Abbildung 3. Patientenselektion der Troponin T-Studie Patientenzahl in Prozent; ACS, akutes Koronarsyndrom; AP, Angina pectoris; CKMB, Kreatinkinase-Isoemzym MB; TnT, Troponin T; TnT (+), TnT ≥ 0,2 µg/L; TnT (-), TnT < 0,2 µg/L; MACE, major cardiac events (im Krankenhaus) waren: akuter Myokardinfarkt, Tod, lebensbedrohliche Arrhythmie und Herzinsuffizienz.


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Tabelle 4. Klinische Charakteristika der 106 Patienten der Troponin T-Studie

Variable

TnT (+) (n = 11)

TnT (-) (n = 95)

Alter [Jahre]

61 (43-72)

57 (21-82)

Männliches Geschlecht

64 (31-89)

70 (59-79)

BMI [kg/m2]

28,0 (22,52-36,13)

27,6 (18,1-37,28)

Zigarettenrauchen

70 (35-93)

66 (55-76)

Arterieller Hypertonus

64 (31-89)

58 (47-69)

Diabetes mellitus

33 (8-70)

16 (9-26)

Positive Familienanamnesea

20 (3-56)

42 (32-53)

EKG-Veränderungenb

82 (48-98)

65 (54-75)

Braunwald Score

IB1-2

IB1-2

Vorbekannte KHK

36 (11-69)

61 (50-71)

Quantitative Variablen als Median und Range; qualitative Variablen in Prozent und 95%-Konfidenz-Intervallen; TnT (+), Troponin T ≥ 0,2 µg/L, TnT (-), < 0,2 µg/L; BMI, body mass index; KHK, koronare Herzerkrankung; a bezüglich koronarer Herzerkrankung; b ST/T-Veränderungen ohne ST-Hebungen.

2.1.2 Untersuchungen an Gesunden

Dreißig gesunde Sportler (Triathleten) wurden vor und nach einem Triathlon-Wettkampf untersucht. Sechsundzwanzig Teilnehmer beendeten den Wettkampf, von diesen wurden 15 Freiwillige über weitere zwei Stunden nachuntersucht. In dieser Gruppe wurden Troponin I und T sowie Myoglobin bestimmt. Keiner der Probanden nahm regelmäßig Medikamente ein; 11 Teilnehmer konsumierten Magnesium, 12 Teilnehmer Vitamin E und 12 Teilnehmer weitere Vitaminpräparate. 7 der Teilnehmer litten an Allergien, drei von ihnen nahmen gelegentlich, jedoch nicht in den letzten 7 Tagen vor der Untersuchung, Allergiemedikamente ein.


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Tabelle 5. Anthropometrische Charakteristika der 15 gesunden männlichen Teilnehmer am Triathlon-Wettkampf

Variable

Median (Quartilen)

Range

Alter [Jahre]

28 SD5,3

20 - 39

Training [Jahre]

5 (4/6)

2 - 8

Training [Tage/Woche]a

6 (6/7)

4 - 7

Herzfrequenz [1/min]b

52 (52/60)

48 - 76

Body-mass-index [kg/m²]

23,0 (20,8/23,9)

20,1 - 25,7

RRsys [mmHg]

130 (120/135)

110 - 160

RRdia [mmHg]

90 (85/90)

80 - 95

SD, Standardabweichung; RRsys, systolischer, RRdia, diastolischer Blutdruck in Ruhe; a Wettkampfsaison; b in Ruhe.

2.1.3 Untersuchungen an Patienten mit Niereninsuffizienz

Es wurden 40 konsekutive stationäre Patienten mit Plasma-Kreatininwerten über 1,5mg/dL (pre end stage renal disease, pre-ESRD; n = 20) bzw. chronischer Hämodialysetherapie seit mindestens einem Monat (ESRD; n = 20) in die Studie eingeschlossen. Ausschlußkriterien waren: schwere Anämie (Hämoglobin unter 8,0g/dL), Alter über 80 Jahre, deutlich reduzierter Allgemeinzustand, bekanntes malignes Tumorleiden, akutes Nierenversagen, Angina pectoris während der letzten 14 Tage oder ein akutes Koronarsyndrom in den letzten 4 Wochen vor Einschluß. Alle Patienten erklärten sich vor Studienbeginn im Sinne eines „informed consent“ mit der Teilnahme einverstanden. Die Tabelle 6 zeigt die klinischen Charakteristika der Patienten und die Tabelle 7 die Begleiterkrankungen und die nephrologischen Diagnosen. Die Hämodialysetherapie wurde von dem zuständigen Arzt der Dialyseeinheit unabhängig von der Studie gestaltet. Die verwendeten Dialysemembranen wurden dokumentiert (siehe Abschnitt Ergebnisse).


[Seite 29↓]

Tabelle 6. Klinische Charakteristika der 40 Patienten mit Niereninsuffizienz

Variable

ESRD

Pre-ESRD

Alter [Jahre]

51,5 (28-75)

63,5 (27-78)**

Geschlecht (m : w)

10 : 10

12 : 8

Body-mass-index [kg/m²]

21,48 (15,79-33,36)

25,51 (19,37-40,35)*

ESRD-Dauer [Jahre]

2,5 (0,1-21,9)

--

Kreatinin-Clearance [mL/min]

--

13,4 (3,5-68,3)

Natrium [mmol/L]

138 (131-143)

138 (130-145)

Kalium [mmol/L]

5,0 (3,5-7,2)

4,3 (3,3-5,2)**

Kreatinin [mg/dL]

7,7 (2,9-13,8)

2,8 (1,5-7,6)***

Aufnahme-Diagnosen

  
 

Shunt-Chirurgie

40 (19-64)

5 (0-25)

 

Parathyeroidektomie

25 (9-49)

0 (0-17)+

 

Allgemeinchirurgie

15 (3-38)

1 (1-32)

 

PA-PTA

5 (0-25)

1 (1-32)

 

Progression der

Niereninsuffizienz

0 (0-17)+

35(15-59)

 

Arterieller Hypertonusa

0 (0-17)+

20 (6-44)

 

Diabetes mellitusa

0 (0-17)+

15 (3-38)

 

Pneumonie

10 (1-32)

0 (0-17)+

 

Akute Pankreatitis

5 (0-25)

5 (0-25)

Quantitative Variablen als Median und Range; qualitative Variablen in Prozent und 95%-Konfidenz-Intervallen; ESRD, end stage renal disease; PA-PTA, perkutane transluminale Angioplastie peripherer Arterien; a akut aggraviert; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 versus ESRD (Werte vor Hämodialyse); + einseitiges 97,5%-Konfidenz-Intervall.


[Seite 30↓]

Tabelle 7. Begleiterkrankungen und nephrologische Diagnosen der 40 Patienten mit Niereninsuffizienz

Variable

ESRD

Pre-ESRD

Angina pectoris:

Keine

Stabile

75 (51-81)

25 (9-49)

30 (12-54)

70 (48-88)

Koronare Herzerkrankung

30 (12-54)

80 (56-84)

Früherer Myokardinfarkt

15 (3-38)

45 (23-68)

Arterieller Hypertonus

80 (56-94)

80 (56-94)

Diabetes mellitus

65 (41-85)

50 (27-73)

Hyperlipoproteinämiea

50 (27-73)

55 (32-77)

Hyperfibrinogenämieb

25 (9-49)

45 (23-68)

Hyperurikämiec

10 (1-32)

30 (12-54)

Positive Familienanamnesed

50 (27-73)

30 (12-54)

Zigarettenrauchen

55 (32-77)

60 (36-81)

Mediane Packungsjahre [Range]

15 [0-240]

20 [0-50]

Nephrologische Diagnosen

  

Diabetische Nephropathie

55 (32-77)

50 (27-73)

Goodpasture-Syndrom

10 (1-32)

0 (0-17)+

IgA-Nephritis

5 (0-25)

0 (0-17)+

Poststreptokokken-GN

5 (0-25)

5 (0-25)

Chronische GN

5 (0-25)

0 (0-17)+

Alport-Syndrom

5 (0-25)

0 (0-17)+

PKD

5(0-25)

10 (1-32)

Nierenarterienstenose

0 (0-17)+

15 (3-38)

Analgetika-Nephropathie

5 (0-25)

5 (0-25)

Hypertensive Nephrosklerose

5 (0-25)

15 (3-38)

Angaben in Prozent und 95%-Konfidenz-Intervallen; ESRD, end stage renal disease; GN, Glomerulonephritis; PKD, polyzystische Nierendegeneration; a Gesamtcholesterin > 200mg/dL; b Fibrinogen > 300mg/dL; c Harnsäure > 10mg/dL; d bezüglich koronarer Herzerkrankung; + einseitiges 97,5%-Konfidenz-Intervall.


[Seite 31↓]

2.2 Studienprotokolle

2.2.1 Untersuchungen an Patienten mit akutem Koronarsyndrom

Im folgenden Abschnitt werden die einzelnen Studienprotokolle der oben beschriebenen Studien an Patienten mit akutem Koronarsyndrom dargestellt. Die diagnostischen Klassifikationskriterien gelten für alle drei Studien gleichermaßen.

Diagnostische Klassifikation und Therapie in allen drei Studien

Die definitive Diagnose eines akuten Myokardinfarkts wurde auf der Basis der WHO-Kriterien [WHO, 59; WHO, 79] retrospektiv von erfahrenen Ärzten der internistischen Intensivstation, die nicht an der Studie beteiligt waren, gestellt. Als primäres biochemisches Kriterium wurde die relative CK-MB-/CK-Aktivität mit einem Cutoff von 6% verwendet. Mindestens zwei der drei folgenden Kriterien mußten erfüllt sein:

  1. typische nitrorefraktäre AP für mehr 20 Minuten Dauer,
  2. CK-MB-/CK-Erhöhung (siehe oben),
  3. ST-Elevation (≥ 0,1mV in I, II, III, aVL, aVF oder ≥ 0,2mV in V1-V6) in mindestens zwei gleichsinnigen Ableitungen.

In wenigen Fällen mit grenzwertigen CK-MB-/CK-Befunden wurde die Diagnose AMI durch Ergebnisse der Koronarangiographie (frisch verschlossenes Gefäß, Thromben) oder echokardiographisch durch in mindestens zwei aufeinander folgenden Untersuchungen festgestellte und neu aufgetretene segmentale Wandbewegungsstörungen gesichert. Patienten mit instabiler Angina pectoris wurden nach Braunwald-Kriterien eingeteilt (siehe Tabelle 1).

Das therapeutische Vorgehen bei den Patienten, einschließlich der Einleitung einer Thrombolysetherapie oder Akut-PTCA, oblag dem zuständigen verantwortlichen Arzt der Intensivstation, der nicht an der Studie beteiligt war.

Alle Patienten erhielten unfraktioniertes Heparin intravenös mit dem Ziel einer aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) von 60-85s und initial 500mg Acetylsalizylsäure intravenös. Die medikamentöse Begleittherapie oblag ebenfalls [Seite 32↓]dem zuständigen, an der Studie unbeteiligten Arzt und beinhaltete in der Regel die Gabe von Metoprolol und Captopril unter Beachtung der Kontraindikationen. Die Überwachung der Patienten auf der Intensivstation wurde bei den AMI-Patienten bis zum Erreichen einer CK unter 100U/L und vollständigen klinischen Stabilisierung, insgesamt jedoch mindestens bis zum folgenden Tag fortgesetzt.

Myoglobin-Studie

Im Einklang mit den NACB/IFCC-Richtlinien erfolgten die Blutabnahmen in Lithium-Heparin-Plasma-Röhrchen (Sarstedt, Deutschland) bei Aufnahme (0 Stunden) und nach 2, 4, 8, und 12 Stunden. Eine 24 Stunden-Probe wurde zusätzlich zur weiteren Risikostratifizierung entnommen. Die Proben wurden in gleicher Weise, wie unten (siehe Kapitel 2.2.3) ausgeführt, verarbeitet.

Für die Kombination von Myoglobin und Troponin I wurden zwei unterschiedliche Regeln verwendet:

  1. Der primäre Algorithmus (ALGO, siehe Abbildung 4). Ein positives Ergebnis hinsichtlich der Diagnose AMI bei Aufnahme liegt vor, wenn Myoglobin über dem Cutoff gefunden wird. Ein negatives Ergebnis erfordert ein negatives Myoglobin. Nach 2 und 4 Stunden liegt ein positives Ergebnis vor, wenn Myoglobin und Troponin I positiv gefunden werden. Insgesamt gilt ein positives Ergebnis, wenn mindestens ein positives Einzelergebnis vorliegt, es sei denn, bei positivem Aufnahmewert sind die folgenden Werte negativ.
  2. Zu Vergleichszwecken wurde eine alternative Regel (AR) angewendet: Ein positives Testresultat liegt vor, wenn Myoglobin oder Troponin I über dem Cutoff liegen. Insgesamt gilt auch hier ein positives Ergebnis, wenn mindestens ein positives Einzelergebnis vorliegt, es sei denn, bei positivem Aufnahmewert sind die folgenden Werte negativ.


[Seite 33↓]

Abbildung 4. Algorithmus (ALGO) zur Interpretation von Myoglobin- und Troponin- Messungen bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom. Abbildung modifiziert nach Möckel et al. [Möckel, 01]

Myo, Myoglobin; Trop, kardiales Troponin, hier Troponin I; (+), positives Testergebnis, (-), negatives Testergebnis; AMI, akuter Myokardinfarkt; MMD, minor myocardial damage.

Das Follow up der Patienten wurde bis 6 Wochen nach Entlassung aus der Klinik durchgeführt. Der primäre Endpunkt war prospektiv als Kombination aus neuerlichem akuten Koronarsyndrom oder Tod jeglicher Ursache definiert worden. Das Follow up war bei 89,5% der Patienten komplett. Die verbleibenden 21 Patienten (10,5%) waren unbekannt verzogen. Das Follow up nach Entlassung wurde telephonisch im Gespräch mit dem Patienten, seinen Angehörigen oder dem Hausarzt durchgeführt. Im Falle erfolgloser telephonischer Kontaktaufnahme wurden die Patienten persönlich aufgesucht.

[Seite 34↓]Troponin I-Studie

In dieser Studie wurden Blutproben bei Aufnahme und nach 1, 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden entnommen. Die Bestimmung der übrigen klinisch-chemischen Variablen und die Verarbeitung der Plasma-Proben erfolgte wie unten angegeben (siehe Abschnitt 2.2.3).

Troponin I- und CK-MB-Masse-Bestimmungen wurden nur zu wissenschaftlichen Zwecken durchgeführt und standen den klinisch verantwortlichen Ärzten nicht zur Verfügung. Allerdings wurden bei einigen Patienten zusätzliche Troponin I- oder T-Bestimmungen aus klinischer Indikation durchgeführt. Alle Patienten wurden für 6 Monate nachbeobachtet.

Der primäre Endpunkt dieser Studie war die Kombination aus akutem Myokardinfarkt oder Tod jeglicher Ursache. Die Gesamtletalität, anstelle der kardialen Letalität, wurde als harter Endpunkt gewählt, da die kardiale Letalität weniger eindeutig bestimmbar ist. Sekundäre Endpunkte waren die Gesamtletalität, akuter Myokardinfarkt, instabile Angina pectoris, Entwicklung einer Herzinsuffizienz, PTCA, aortokoronare Bypass-Operation und neuerliche stationäre Aufnahme. Das Follow up war für alle Patienten vollständig.

Troponin T-Studie

Blutabnahmen zur Bestimmung von Serum-Troponin T erfolgten bei Aufnahme und nach 4 Stunden. Die Verarbeitung der Proben und die Bestimmung der übrigen klinisch-chemischen Variablen erfolgte, wie unten angegeben (siehe Abschnitt 2.2.3). Allerdings wurde bei dieser Studie Serum statt Plasma verwendet. Der primäre Endpunkt der Studie war bis zur Entlassung aus dem Krankenhaus die Kombination aus akutem Myokardinfarkt, neu aufgetretener schwerer Herzinsuffizienz, lebensbedrohlicher Arrhythmie oder Tod jeglicher Ursache. Nach Entlassung war der primäre Endpunkt als Kombination aus neuerlichem akuten Koronarsyndrom, Tod jeglicher Ursache oder stationärer Wiederaufnahme definiert. Das Follow up wurde während des Krankenhausaufenthaltes der Patienten anhand der Krankenakte durchgeführt. Nach 3 und 6 Monaten im Anschluß an die Entlassung wurden die Patienten selbst oder der Hausarzt telephonisch kontaktiert. Wurde ein Patient mehrfach nicht erreicht und konnte der Hausarzt keine Auskünfte erteilen, wurde [Seite 35↓]versucht, die Patientin oder den Patienten persönlich aufzusuchen. Das Follow up war im Krankenhaus vollständig und nach drei Monaten bei 91% sowie nach 6 Monaten bei 85% der Patienten komplett. Die nicht erreichten Patienten waren unbekannt verzogen.

2.2.2 Untersuchungen an Gesunden

In der Woche vor den Berliner Triathlon-Meisterschaften 1994 wurde den ruhenden Probanden morgendliches Blut zur Ermittlung von Basiswerten abgenommen. Die weiteren Blutproben wurden den Studienteilnehmern unmittelbar nach Abschluß des Wettkampfes in einem Sanitätszelt an der Ziellinie entnommen. Bei 15 der Probanden erfolgten weitere Abnahmen alle 30 Minuten bis zu zwei Stunden nach dem Wettkampf. Bei dem Wettkampf handelte es sich um einen sogenannten Kurz-Triathlon mit 1,4km Schwimmen, 42km Radfahren und 10,6km Laufen. Das entnommene Blut wurde sofort in Eiswasser gekühlt und innerhalb von zwei Stunden bei 5°C für 10 Minuten mit 3000rpm zentrifugiert. Serumproben wurden bei -80°C zur späteren Analyse gelagert.

2.2.3 Untersuchungen an Patienten mit Niereninsuffizienz

Bei allen Patienten wurden zunächst eine ausführliche kardiale Anamnese erhoben sowie ein 12-Kanal-EKG und eine Echokardiographie durchgeführt. Die Blutentnahmen erfolgten unmittelbar vor und nach der Hämodialysetherapie bzw. bei den pre-ESRD-Patienten einmalig nüchtern morgens um 8.00 Uhr. Plasmakonzentrationen von Natrium, Kalium, Kreatinin, Kreatinkinase, einschließlich des Isoenzyms MB, und Myoglobin wurden innerhalb von zwei Stunden in unserem Zentrallabor bestimmt. Für die Bestimmung von kardialem Troponin I und T wurden 5mL Lithium-Heparin-Blut bei 5°C für 10min mit 3000rpm zentrifugiert. Drei Aliquots von mindestens 500µL wurden unmittelbar bei -80°C für die spätere Analyse tiefgefroren. Die Kreatinin-Clearance der Patienten wurde nach der Cockcroft-Gault-Formel berechnet [Cockcroft, 76] .

Bei allen Patienten erfolgte nach mindestens 6 Monaten ein telephonisches Follow up hinsichtlich eines akuten Myokardinfarkts, Tod jeglicher Ursache und Wiederaufnahme in ein Krankenhaus. Als primärer Endpunkt war die Kombination [Seite 36↓]dieser drei Ereignisse prospektiv festgelegt worden. Die mediane Follow up-Dauer lag bei 9 (7 - 11) Monaten. Das Follow up wurde für alle Patienten abgeschlossen.

2.2.4 Tierexperimentelle Untersuchungen

Diese Studie war Teil eines größeren tierexperimentellen Projektes in Kooperation mit dem Deutschen Herzzentrum Berlin. Das Projekt war unter der Nummer G0353/98 vom zuständigen Landesamt Berlin genehmigt worden. Die Tierversuche erfolgten in Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Physiological Society und der American Heart Association. Das tierexperimentelle Projekt beinhaltete primär die Messung der renalen Hämodynamik unter verschiedenen hämodynamischen Bedingungen (Perikardtamponade, kardiogener Schock, Herz-Lungen-Maschine). Einzelheiten sind bei Möckel et al. beschrieben [Möckel, 00] .

Für die vorliegende Arbeit wurden die Daten von 5 Schweinen mit kardiogenem Schock in Folge passageren medialen Verschlusses der linken vorderen absteigenden Koronararterie (left anterior descending, LAD) verwendet.

Es erfolgte zunächst die Narkose und Instrumentierung der Tiere wie bei Möckel et al. beschrieben [Möckel, 00] . Zusätzlich wurde eine 8,5-French(F)-Schleuse in die rechte Arteria carotis communis der Tiere implantiert. Anschließend erfolgte die Erhebung von Basiswerten sowie eine arterielle Blutabnahme. Lithium-Heparin-Plasma wurde, wie oben (siehe Abschnitt 2.2.3) beschrieben, aus der Arteria femoralis gewonnen und eingefroren. Alle Tiere erhielten 5000IE Heparin intravenös nach der ersten Blutabnahme sowie weitere 5000IE zwei Stunden später. Der linke koronare Hauptstamm wurde anschließend mit einem 7F-multi-purpose-Führungskatheter intubiert. Das linke Koronarsystem wurde mit 2-5mL Kontrastmittel dargestellt. Anschließend wurde ein 2,0/2,5 x 20mm-PTCA-Ballon in den Bereich der medialen LAD gebracht und dort für 30min entfaltet. Die erfolgreiche Okklusion wurde mittels koronarer Druckregistrierung hinter dem Ballon (Radi® Tip-Druck-Meßdraht) dokumentiert. Der Führungskatheter wurde nun in die Aorta zurückgezogen. Dieses Manöver wurde bei allen Tieren erfolgreich abgeschlossen. Während der Ischämiephase kam es zu einem Abfall des arteriellen Blutdrucks und des Herzzeitvolumens. Eine zusätzliche intravenöse Gabe von Volumen (physiologische Kochsalzlösung und Hydroxyethylstärke 6%) und Katecholaminen war erforderlich, um die Tiere am Leben zu halten. Nach 30min wurde der PTCA-Ballon geöffnet und [Seite 37↓]der Führungskatheter erneut in den linken Hauptstamm eingebracht. Durch Injektion von 2-5mL Kontrastmittel wurde dokumentiert, daß die LAD offen war. Anschließend wurden Führungskatheter und Ballon entfernt. Weitere Blutentnahmen erfolgten bei Öffnen des Ballons sowie alle 30min bis 4 Stunden nach Beginn der Reperfusionsphase. 4 der 5 Tiere ließen sich im Anschluß an die Ischämie erfolgreich stabilisieren und erreichten katecholaminfrei das Ende der Nachbeobachtungszeit. Ein Tier mußte vorzeitig getötet werden, da eine hämodynamische Stabilisierung nicht erreicht werden konnte. Die Tötung der Tiere erfolgte durch intravenöse Bolusinjektion von Kaliumchlorid. Unmittelbar nach Eintreten des Herzstillstandes wurden die Tiere thorakotomiert und das Herz komplett entnommen und mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. Anschließend wurden etwa einen Kubikzentimeter große Proben aus dem ischämischen Bezirk des linken Ventrikels sowie zur Kontrolle Proben aus der linksventrikulären Hinterwand entnommen. Diese Proben wurden mit physiologischer Kochsalzlösung überschichtet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zu weiteren Analyse wurden die Proben bei -20°C gelagert.

Aus den Blutproben wurden kardiales Troponin T und I bestimmt. Die Herzmuskelbiopsien wurden in drei Teile geteilt: (1) zur lichtmikroskopischen Analyse, (2) zur quantitativen Bestimmung von Troponin T und (3) zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) von Troponin I.

2.3 Analytische Methoden

2.3.1 Kardiale Marker

Die Plasma- bzw. Serum-Konzentrationen von Natrium, Kalium (ionenselektive Elektroden, indirekt) und Kreatinin (Jaffe-Reaktion, kinetisch) wurden an einem DAX® 72 Clinical Chemistry Analyzer (Bayer Diagnostics) nach Herstellervorschriften bestimmt. CK, CK-MB und Myoglobin wurden mit einem Hitachi 911®-System unter Verwendung von System-Testkits (Roche Diagnostics) gemessen. Der obere Referenzbereich der CK (optimierte Standardmethode der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie) liegt bei 70U/L für Frauen und 80U/L für Männer. [Seite 38↓]Referenzwerte für die CK-MB, kinetisch nach Immuninhibition bestimmt, reichen bis zu 10U/L oder bis zu 6% der gesamten CK-Aktivität. Myoglobin wurde mit einem latexverstärkten immunturbidimetrischen Test bestimmt. Der Referenzbereich geht hierbei bis 70µg/L. Die biochemischen Kriterien für einen Myokardinfarkt waren eine CK von ≥ 100U/L mit einem MB-Anteil von ≥ 6% oder ein Myoglobinwert ≥ 90µg/L. Die kardialen Troponine und die CK-MB-Masse wurden aus den eingefrorenen Proben bestimmt. Diese wurden zügig bei 21°C aufgetaut, für 5min mit 2500rpm zentrifugiert und anschließend mit den jeweiligen Testsystemen verarbeitet.

Kardiales Troponin T wurde mit einem kommerziellen Enzymimmunoassay der Firma Roche Diagnostics bestimmt. Bei der Troponin T-Studie kam die erste Generation dieses Tests zum Einsatz und wurde auf einem ES®300 Enzymimmoassayautomaten (Roche Diagnostics; zum Zeitpunkt der Studie: Boehringer Mannheim) durchgeführt. Bei diesem Immunoassay wurden ein polyklonaler und ein spezifischer monoklonaler Antikörper gegen kardiales Troponin T eingesetzt. Die abschließende Messung beruht auf der photometrischen Bestimmung der im Immun-Sandwich gebundenen Peroxidaseaktivität. Die analytische Sensitivität des Tests liegt bei 0,04µg/L, der Meßbereich geht von 0,04 bis 15,0µg/L, und der Interassay-VK betrug nach Herstellerangaben <10% bei niedrigen Troponin T-Konzentrationen (> 0,1µg/L), <5% bei mittleren (0,5-5µg/L) und 2% bei hohen Troponin T-Konzentrationen (>5µg/L).

Bei den Untersuchungen an Gesunden und den Patienten mit Niereninsuffizienz sowie den Tierversuchen wurde eine neuere, verbesserte Generation dieses Tests am Elecsys 2010® (Roche Diagnostics) verwendet. Dieser Immunoassay setzt zwei monoklonale murine Antikörper ein, die spezifisch für kardiales Troponin T sind. Beide Antikörper tragen assayspezifische Markierungen für die Festphasenbindung beziehungsweise die Detektion, die abschließende Messung beruht auf Elektrochemilumineszenz [Baum, 97] . Die analytische Sensitivität des Tests liegt bei 0,01µg/L, der Meßbereich geht von 0,01 bis 25,0µg/L, und der Interassay-VK betrug 9,3% bei niedrigen Troponin T-Konzentrationen (im Mittel 0,1µg/L), 6,1% bei mittleren (0,33µg/L) und 4,5% bei hohen Troponin T-Konzentrationen (5,9µg/L). Die Meßdauer beträgt 9min.

Kardiales Troponin T ist im Blut Gesunder normalerweise nicht nachweisbar.


[Seite 39↓]

Kardiales Troponin I wurde in den klinischen Studien mittels zweier verschiedener kommerziell verfügbarer Testsysteme der Firmen Dade (Stratus®II-TnI; TnI-S) und Behring Diagnostics (Opus®plus-TnI; TnI-O) gemessen. Mittlerweile haben sich beide Firmen zu Dade Behring zusammengeschlossen.

Bei dem Immunofluoreszenz-Assay TnI-S kommt das Gerät Stratus®II zum Einsatz. Hierbei werden ein primärer spezifischer monoklonaler Antikörper gegen kardiales Troponin I und ein zweiter, mit alkalischer Phosphatase gekoppelter Antikörper eingesetzt. Die analytische Sensitivität liegt bei 0,35µg/L, der Meßbereich reicht von 0,35 bis 50µg/L. Der Interassay-VK betrug 8,5% bei niedrigen Troponin I-Konzentrationen (im Mittel 5,1µg/L), 7,5% bei mittleren (18,5µg/L) und 4,4% bei hohen Konzentrationen (33,4µg/L). Die Meßdauer beträgt 10min. Dieser Assay hat eine gleich hohe Affinität zu dem terniären (T-I-C) wie zu dem binären (I-C) Troponin-Komplex [Wu, 98] .

Bei Gesunden liegen die Meßwerte nach Herstellerangaben unterhalb des Meßbereichs.

Bei dem Immunofluoreszenz-Assay TnI-O kommt das Gerät Opus®plus zum Einsatz. Der verwendete Immunoassay enthält zwei polyklonale Ziegen-Antikörper gegen kardiales Troponin I, die mittels Affinitätschromatographie gereinigt und damit im Hinblick auf die analytische Spezifität monoklonalen Antikörpern vergleichbar sein sollen, allerdings eine höhere Avidität als diese aufweisen [Fagan, 97] . Die analytische Sensitivität dieses Assays liegt bei 0,5µg/L, der Meßbereich zwischen 0,5 und 150µg/L. Der Interassay-VK betrug 4,5% bei niedrigen Troponin I-Konzentrationen (im Mittel 3,7µg/L), 5,6% bei mittleren (19,5µg/L) und 4;8% bei hohen Konzentrationen (99,1µg/L). Die Meßdauer beträgt 20min. Dieses Testsystem erkennt den binären Troponin-Komplex mit zweifach höherer Affinität als den terniären Komplex [Wu, 98] .

Bei Gesunden liegen die Meßwerte unterhalb des Meßbereichs [Fagan, 97] .

Die CK-MB-Masse wurde ebenfalls mit dem Opus®plus bestimmt. Der verwendete Immunoassay enthält einen monoklonalen Maus-Festphasenantikörper gegen die CK-MB. Ein weiterer polyklonaler Antikörper gegen CK-MM ist mit alkalischer Phosphatase gekoppelt. Die analytische Sensitivität betrug 0,6µg/L, der Meßbereich lag zwischen 0,6 und 300µg/L. Der Interassay-VK betrug 9,2% bei niedrigen CK-MB-[Seite 40↓]Konzentrationen (im Mittel 6,3µg/L), 9,3% bei mittleren (20,2µg/L) und 7,7% bei hohen Konzentrationen (93,3µg/L). Die Meßdauer beträgt 20min.

Bei gesunden Probanden liegen die Werte unter 5µg/L.

Bei den Tierversuchen wurde kardiales Troponin I mit dem Vitros Eci® Immundiagnostik-System (Ortho Clinical Diagnostics, UK) gemessen. Dieser Troponin I-Assay enthält einen monoklonalen anti-Troponin I-Maus-Antikörper und einen weiteren polyklonalen anti-Troponin I-Ziegen-Antikörper. Die analytische Sensitivität dieses Assays liegt bei 0,02µg/L, der Meßbereich zwischen 0,02 und 100µg/L. Der Interassay-VK betrug 5,3% bei niedrigen Troponin I-Konzentrationen (im Mittel 0,761µg/L), 3,4% bei mittleren Konzentrationen (4,13µg/L) und 2,8% bei hohen Konzentrationen (15,7µg/L). Der obere Referenzbereich (97,5%-Quantile von 200 gesunden Blutspendern) lag nach Angaben des Herstellers bei 0,08µg/L für Plasma.

Schwellenwerte. Die Wahl der Schwellenwerte (Cutoffs) ist essentiell für den Vergleich analytischer Methoden und die Aussagekraft der Ergebnisse im klinischen Einsatz. Wie oben beschrieben wurde, unterscheiden sich insbesondere die Charakteristika der verschiedenen Troponin-Tests erheblich. In Kürze: (1) Der Konzentrationsbereich von Troponin T unterscheidet sich von dem von Troponin I. Standardisierungsbemühungen werden unternommen, sind aber bisher nicht erfolgreich [Jaffe, 00] . (2) Die im Plasma gesunder Blutspender enthaltenen Troponin T-Konzentrationen liegen an oder unter der Nachweisgrenze der neuesten Testgeneration. Verschiedene Troponin I-Tests wie auch TnI-S und TnI-O messen entgegen den Herstellerangaben vereinzelt geringe Werte in diesen Kollektiven (siehe Tabelle 8). (3) Die drei verwendeten Troponin I-Tests sind nicht standardisiert.

Demzufolge repräsentieren die Testergebnisse nicht dieselbe Menge an Substanz. Eine Umrechnung der Testergebnisse ineinander ist nicht möglich.

In Abhängigkeit von dem Zweck der jeweiligen Untersuchung wurden unterschiedliche Cutoffs für die Troponin-Tests verwendet:

  1. Cutoffs für die Risikostratifizierung bei Patienten mit MMD: 0,1µg/L für TnT [Hamm, 92; Lindahl, 96; Ohman, 96] , 0,4µg/L für TnI-S [Antman, 96] und 2,0µg/L [Lüscher, 97; Hegner, 97] bzw. 1,6µg/L [Wu, 96] für TnI-O. In der Troponin T-Studie wurde ein Cutoff von 0,2µg/L verwendet, da die [Seite 41↓]erste Generation des Troponin T-Tests verwendet wurde (siehe vorheriger Abschnitt).
  2. Cutoffs für den akuten Myokardinfarkt: 0,5µg/L für TnT [Katus, 91] , 3,1µg/L für TnI-S [Adams, 93] und 2,5µg/L für TnI-O [Wu, 96] .
  3. Die generell empfohlenen Cutoffs der Hersteller lauteten zum Zeitpunkt der Messungen: 0,1µg/L für TnT (Ausnahme siehe (1)), 1,5µg/L für TnI-S und 2,0µg/L für TnI-O. Bisher nicht publizierte Daten von Patienten mit akutem Myokardinfarkt legen einen Cutoff von 0,2µg/L für TnT nahe (A. Wu, Hartford, CT, USA, persönliche Mitteilung).
  4. Bei dem Vergleich der Troponin I-Testsysteme (Troponin I-Studie) wurden zusätzlich optimierte Cutoffs anhand der jeweils besten Odds ratio für den primären Endpunkt berechnet.

Für Myoglobin wurde auf der Basis früherer eigener Studien ein Cutoff von 90µg/L gewählt [Störk, 95] . Für die CK-MB-Masse verwendeten wir einen Schwellenwert von 7µg/L [Hegner, 97] .

Qualitätskontrolle, Kalibrierung, Referenzbereiche. Die Bestimmungen von Troponin T und der CK-MB-Masse wurde nach den Vorschriften der Hersteller durchgeführt. Präzisionsangaben beziehen sich auf Messungen an 5-10 aufeinander folgenden Arbeitstagen. Die Richtigkeitskontrolle wurde an Hand kommerziell erhältlicher Kontrollplasmen durchgeführt. Die Kalibrierung der Geräte erfolgte ebenfalls in den vom Hersteller empfohlenen Abständen. Das Opus®plus-System wurde abweichend häufiger kalibriert (wöchtentlich statt 14tägig). Für jede neue Charge von Testmodulen wurde eine neue Kalibrierung durchgeführt. Präzisionsangaben beziehen sich hier auf Messungen innerhalb einer Charge von Testmodulen an 5 aufeinander folgenden Arbeitstagen.

Die Messungen von Natrium, Kalium, Kreatinin, CK-, CK-MB-Aktivität, Myoglobin, Troponin T (Elecsys®) und Troponin I (Stratus®II) wurden in unserem Zentrallabor durchgeführt; die übrigen Messungen erfolgten in unsererm Forschungslabor in Zusammenarbeit mit erfahrenen Medizinisch-technischen Assistentinnen. Die Troponin I-Messungen am Vitros Eci® wurden im Labor von Prof. Alan H. Wu, Hartford, CT, USA durchgeführt.

Für die Troponin-Tests in den klinischen Studien (Troponin T, TnI-S und TnI-O) wurden eigene Referenzwerte bei 20 Gesunden (10 Männer, 10 Frauen) gemessen. [Seite 42↓]Hierbei handelte es sich um Mitarbeiter der Internistischen Intensivstation im Alter von 20 bis 50 Jahren. Die Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der Messungen in diesem Kollektiv.

Tabelle 8. Referenzwerte der kardialen Troponine bei gesunden Probanden

Probandennummer

Troponin T [µg/L]

TnI-S [µg/L]

TnI-O [µg/L]

1

<0,01

<0,35

<0,5

2

<0,01

<0,35

<0,5

3

<0,01

<0,35

<0,5

4

<0,01

<0,35

2,55/1,68#

5

<0,01

<0,35

1,67/0,618#

6

<0,01

<0,35

<0,5

7

<0,01

<0,35

<0,5

8

<0,01

<0,35

<0,5

9

<0,01

<0,35

<0,5

10

<0,01

1,4

<0,5

11

<0,01

<0,35

<0,5

12

<0,01

<0,35

<0,5

13

<0,01

<0,35

1,5/<0,5#

14

<0,01

0,7

<0,5

15

<0,01

<0,35

2,37/2,67#

16

<0,01

0,6

2,55/2,42#

17

<0,01

<0,35

4,86/<0,5#

18

<0,01

<0,35

1,46

19

<0,01

<0,35

<0,5

20

<0,01

<0,35

<0,5

TnI-S, Stratus®II-Troponin I; TnI-O, Opus®-Troponin I; # Nachbestimmung.


[Seite 43↓]

Aufgrund der im Einzelfall falsch positiven Einzelbestimmungen von TnI-O wurden prinzipiell Doppelbestimmungen vorgenommen. Bei einem Unterschied von > 20% wurde eine dritte Bestimmung vorgenommen und dann der mittlere Wert verwendet. Die Ursache der im Einzelfall falsch positiven Troponin I-Werte des Opus®-Systems liegt wahrscheinlich in der störanfälligen Pipetiereinrichtung des Systems begründet. Häufige Wartung, Kalibrierung und die Doppelbestimmungen sollten die Fehler minimieren. Darüberhinaus scheinen bei TnI-S und TnI-O geringe Werte bei Gesunden vorkommen zu können. Bei TnI-S lagen diese Werte immer unter dem empfohlenen Cutoff von 1,5µg/L.

2.3.2 Analyse von Myokard-Gewebeproben Lichtmikroskopie

Die Gewebeproben wurden zunächst bei Zimmertemperatur aufgetaut und in neutral gepuffertem Formaldehyd (8%) fixiert sowie anschließend in Paraffin eingebettet. Es wurden 1-3µm dicke Schnitte gefertigt. Anschließend erfolgten Färbungen mit Hämatoxylin-Eosin (HE) sowie nach van Gieson zur Darstellung des Bindegewebes entsprechend standardisierter Routinevorschriften. Repräsentative Ausschnitte der Proben wurden in einer 200fachen Vergößerung (Zeiss Axioskor®-Mikroskop) photographiert (Sony 3CCD) und digital im JPG-Format abgespeichert.

Quantitative Messung von Troponin T im Myokard

Zytosolische Fraktion. Das Myokardgewebe (65mg) wurde in 6,5mL Tris-Puffer (Puffer 1) mit einem pH-Wert von 7,4 homogenisiert und anschließend bei 100000g für 60min ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und die Prozedur mit dem Pellet wiederholt. Die beiden Überstände wurden am Ende zusammengeführt.

Myofibrilläre Fraktion. Das verbleibende Pellet nach Entfernen des Überstandes mit der zytosolischen Fraktion (siehe oben) wurde in 6mL Harnstoff-Puffer (Puffer 2) bei einem pH-Wert von 7,4 suspendiert und 30min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde mit 20000g für 30min zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde die Prozedur mit einer verlängerten Inkubationszeit (über Nacht bei Raumtemperatur) wiederholt. Die beiden gewonnenen Überstände wurden kombiniert [Voss, 95] . Beide Fraktionen wurden bis zur weiteren Analyse tiefgefroren.

Die Gesamtprotein-Konzentration der Gewebeproben wurde mittels Photometrie bei 280nM (A280) bestimmt. Zur Konzentrationsbestimmung wurde eine Albumin-[Seite 44↓]Standardkurve erstellt (siehe Abbildung 5). Dieses Vorgehen wurde gewählt, weil das Standardverfahren zur Proteinbestimmung (Bradford-Assay) mit dem verwendeten Harnstoff-Puffer interferiert. Die Abbildung 5 zeigt, daß bei 280nM keine Interferenzen mit den verwendeten Puffern auftreten.

Abbildung 5. Standardkurve der Proteinbestimmung

NaCl, Natriumchlorid; Troponin T-Konzentrationen wurden mit dem Elecsys® 2010 (siehe oben) bestimmt. Die myofibrilläre Fraktion wurde zuvor 1:3 verdünnt.

mRNA-Bestimmung von Troponin I

Messenger-RNA des kardialen Troponin I wurde mittels SYBR®-Green reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) gemessen. Eine Troponin I-DNA-Sequenz vom Schwein wurde uns von R. Young und J.M. Canthy, State University New York, New York, USA, mitgeteilt (persönliche Mitteilung, bisher nicht publizierte Daten). Der Primer wurde mittels PrimerExpress® Software entworfen. Die PCR wurde mit einem Sequence Detection System GeneAmp 5700® (PE Applied Biosystems, USA) unter Verwendung des SYBR®-Green Core Reagent Kits (Perkin-Elmer, USA) durchgeführt. Für jede Probe erfolgte eine 4fach-Bestimmung der threshold cycle Differenzen (delta-ct). Zur Vermeidung von Kontaminationen wurde die Reaktion inklusive AmpErase® UNG und dUTP-Nukleotiden durchgeführt. Die Spezifität der Reaktion wurde abschließend durch eine Schmelzkurve am GenAmp [Seite 45↓]5700® überprüft. Die Zielgenexpression wurde mit 18s-RNA normalisiert (delta-delta-ct-Methode).

2.4 Statistik

Die Analyse der Daten wurde nach dem intention-to-treat-Prinzip durchgeführt, das heißt alle dokumentierten Daten wurden analysiert, kein Wert wurde ausgeschlossen.

Die Verteilung der analysierten Variablen war in den meisten Fällen nicht sicher normal, daher wurden quantitative Variablen grundsätzlich als Mediane und Quartilen oder Range angegeben. Entsprechend wurden die Daten graphisch als Box-Visker-Plots dargestellt. Hier werden Minimum, Maximum, Median und Quartilen graphisch aufgetragen. 50% der Werte befinden sich in der Box. Extremwerte, die mehr als 1,5fach (o) bzw. 3fach (*) außerhalb der Box liegen, werden gesondert dargestellt (siehe z. B. Abbildung 13). Unterschiede wurden mittels Wilcoxon-Test für verbundene bzw. unverbundene Stichproben auf Signifikanz geprüft. Verläufe von Variablen wurden mittels nicht parametrischer Varianzanalyse (Friedman) analysiert. Ein α-Fehler von 5% wurde angenommen. Lediglich das Alter der Probanden und Patienten erschien normal verteilt und wurde zu Vergleichszwecken mit der Literatur als Mittelwert und Standardabweichung angegeben.

Lineare Korrelationskoeffizienten wurden nach Pearson berechnet. Dies Verfahren wurde verwendet, da es wenig anfällig bei Verletzung der Voraussetzung einer Normalverteilung ist, welche in den meisten Fällen zwar nicht belegt wurde, aber auch nicht sicher nicht vorlag und der Pearson-Test eine deutliche höhere Power als die nicht parametrische Spearman-Korrelationsanalyse hat.

Qualitative Variablen wurden in Prozent und 95%-Konfidenzintervallen (CI) angegeben. Unterschiede zwischen qualitativen Variablen wurden mittels Chi-Quadrat-Test analysiert. Auch hier wurde ein α-Fehler von 5% angenommen.

Für den Vergleich der Troponin I-Verfahren hinsichtlich ihres diagnostischen Nutzens wurden Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven, Sensitivität und Spezifität berechnet. Die ROC-Statistik wurde nach den Vorschlägen von Henderson und Bhayana [Henderson, 95] durchgeführt.

Der Wert einzelner Marker für die Risikostratifizierung wurde durch die Berechnung von Odds ratios (OR) mittels logistischer Regressionsanalyse festgestellt. In die [Seite 46↓]logistische Regressionsanalyse wurden jeweils geeignete Kontrollvariablen in Abhängigkeit von der Fallzahl und jeweiligen Fragestellung einbezogen. Diese Kontrollvariablen waren in der Regel: Alter, Geschlecht und Therapieform. Die jeweils verwendeten Kontrollvariablen sind bei den Ergebnissen angegeben.

Die Ergebnisse der Troponin I-Studie sind auch in Form von Kaplan-Meier-Überlebenskurven angegeben. Zum Vergleich der Kurven wurde eine Cox-Regression mit denselben Kontrollvariablen wie in der logistischen Regression durchgeführt.

Bei einigen Studien wurde die erforderliche Fallzahl vorher mittels einer Power-Analyse errechnet. Dabei wurde ein β-Fehler von 20% angenommen. Die Analyse wurde mittels MedCalc® ,Version 4.31.001,vorgenommen. Die Tabelle 9 faßt die Ergebnisse der Power-Analysen für die verschiedenen Studien zusammen.

Die statistischen Berechnungen und Erstellung der Graphiken erfolgten auf einem Personal Computer mittels MedCalc® und SPSS® für Windows® (SPSS® Inc., V. 9.01).

Tabelle 9. Power-Analysen für die klinischen Studien

Studie

α

β

Literatura

CALC

Fallzahl

Myoglobin-Studie

5

20

39*

80**

85***

190+
108/137++
78+++

200

141

Troponin I-Studie

5

20

60§

160§§

162

Troponin und Niereninsuffizienz

5

20

(+) 5,9-20,4

(-) 1,6-8,7

31-47

40

a Ereignishäufigkeit in Prozent für Troponin-positive (+) und -negative (-) Patienten anhand früherer Studien [Lindahl, 97; Lopez-Jimenez, 97] ; CALC, kalkulierte Fallzahl; * frühe Sensitivität (etwa 4 h nach Symptombeginn); ** frühe Spezifität; *** früher positiv-prädiktiver Wert (PPW) für Myoglobin nach [Bakker, 93] ;+ minimale Fallzahl, um Differenz von 10% nachzuweisen; ++ minimale Fallzahlen, um 10% niedrigere/höhere Spezifität zu erkennen; +++ minimale Fallzahl, um 10% höheren PPW zu erkennen; § Sensitivität nach 2 h für Troponin; §§ Fallzahl, um 15% höhere Sensitivität zu erkennen.


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HTML-Version erstellt am:
18.01.2005