2.  Darstellung der eigenen Arbeiten

Die Permeabilität eines Hämofilters für ein bestimmtes Molekül ist abhängig vom Molekulargewicht, der Porengröße und -gestalt, der Porenanzahl, der Membrandicke und der sterischen Molekülform. Weitere Faktoren, welche die Eliminierbarkeit gelöster Stoffe bestimmen, sind elektrostatische Wechselwirkungen mit dem Hämofilter sowie ihre Wasser- bzw. Fettlöslichkeit und damit ihr Bindungsgrad an höhermolekulare Proteine (95).

Der cut-off point eines Hämofilters gibt das Molekulargewicht an, bis zu welchem der Hämofilter für Substanzen durchlässig ist. Er ist definiert durch einen Siebkoeffizienten von 0,10; d.h. der Hämofilter ist durchlässig für Moleküle, die zu mindestens 10% aus dem Blutplasma ins Ultrafiltrat eliminiert werden. Je kleiner ein Molekül ist, desto besser kann es eliminiert werden. Bei Molekulargewichten, die sich dem cut-off des Hämofilters nähern, nimmt die Permeabilität sigmoidal ab. Wird der cut-off point überschritten, geht die Permeabilität gegen Null (96, 97). Die heute im Gebrauch befindlichen Hämofilter haben einen in-vitro bestimmten cut-off von 15-40 kD (98).

Für eine optimale konvektive Elimination sollte das Molekulargewicht der zu eliminierenden Substanz den cut-off des Hämofilters nicht überschreiten, besser noch deutlich unter dem cut-off point des Hämofilters liegen. Die derzeit kommerziell erhältlichen Hämofilter sind für die Nierenersatztherapie zur Behandlung des akuten oder chronischen Nierenversagens optimiert. Sie sind konzipiert worden, um eine gute Elimination niedermolekularer Substanzen bei möglichst geringem Eiweißverlust zu erzielen. Die Molekulargröße vieler septischer Mediatoren liegt im Bereich der sogenannten Mittelmoleküle, in einem Bereich zwischen 15-60 kD (96, 99)und überschreitet somit die cut-off Grenze vieler kommerzieller Hämofilter. Dies ist ein wesentlicher Grund, weshalb es bislang nicht gelang, eine signifikante Senkung inflammatorischer Mediatoren im Blut septischer Patienten zu erzielen (38, 93, 100-103).

Um dieses Problem zu lösen, baten wir die Firma Gambro (Grambro Research Group, Hechingen, Deutschland), uns bei der Entwicklung eines Hämofilters behilflich zu sein, der es uns ermöglichen sollte, den Bereich der Mittelmoleküle besser zu erreichen.

Die Entwicklung eines Hämofilters mit Optimierung im Mittelmolekülbereich ging einher mit Erhöhung des Porendurchmessers des Hämofilters. Voraussetzung war ein neuartiges Mischungsverhältnis der Polymere, die den Hämofilter bilden. Mit Optimierung eines Hämofilters in Richtung Mittelmoleküle war zwangsläufig auch mit einem unerwünschten Verlust an Serumeiweißen zu rechnen. Aus klinischer Sicht war für uns ein Proteinverlust von bis zu 10 g pro Tag als vertretbar eingeschätzt worden (bei einer Lebergenerartionsrate von zirka 15 g/Tag) (104). Der Verlust an gerinnungswirksamen Eiweißen sollte so gering wie möglich gehalten werden. Auf Basis dieser Vorgabe entwickelten wir zunächst den Prototyp P1SH und später den P2SH mit größerer effektiver Oberfläche.

Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen in Abbildung 2 zeigen den Querschnitt einer Kapillare sowie dessen Wandstruktur.

	Abbildung 2: Rasterelektronenmikroskopie der P2SH (Polyamid).

Lp H₂O bestimmt gemäß H/TP 5806/1
UF Plasma bestimmt gemäß H/TP 5811
Protein bestimmt gemäß H/TC 5506
Siebkoeffizient für Myoglobine and Albumine bestimmt gemäß H/TP 5809
Hämodialyse bestimmt gemäß to EN 1283

	Abbildung 3: In-vitro Bestimmung des Siebkoeffizienten (Hämofilter P2SH) mit Hilfe von Dextranlösungen.

Der in-vitro mittels Dextranlösungen bestimmte Siebkoeffizient lag bei 100-110 kD.

Mittlere Größe der eingesetzten Dextrane

In einer ersten prospektiven Studie untersuchten wir die Anwendbarkeit und Sicherheit der großporigen Hämofiltration (P1SH) bei septischen Patienten mit Multiorganversagen. Die großporige Hämofiltration wurde in einem 12 Stunden Modus, im Wechsel mit der konventionellen Hämofiltration durchgeführt. Fokussiert wurde auf die hämodynamische Verträglichkeit, den Protein- und Gerinnungsstatus der Patienten sowie auf die Eliminationskapazität von IL-6 und TNF-α. Ziel dieser Studie war es, den Unbedenklichkeitsnachweis für den Einsatz der großporigen Hämofiltration bei septischen Patienten zu erbringen.

Alle untersuchten Patienten zeigten das Vollbild eines kardiozirkulatorischen, katecholaminpflichtigen Schocks. Dokumentiert wurden Blutdruck, Herzfrequenz, Herz-Index, Herzauswurfleistung und Katecholaminpflichtigkeit. Im Studienverlauf zeigte sich unter großporiger Hämofiltration eine Stabilisierung der kardiovaskulären Hämodynamik. Der Noradrenalinbedarf nahm signifikant ab, der mittlere arterielle Druck stabilisierte sich.

Das Serumalbumin macht ca. 60% der Gesamteiweiße im Blutplasma aus. Seine Bedeutung besteht in der Regelung des intravasalen onkotischen Drucks und als Transportprotein wasserunlöslicher Substanzen. Obwohl die Gabe von Humanalbumin bei septischen Patienten bisher keinen nachweisbaren therapeutischen Vorteil erbracht hat, ist die Bedeutung der Überwachung und ggf. Korrektur des Albuminspiegels im Rahmen eines hämofiltrationsbedingten Albuminverlustes von besonderer klinischer Wichtigkeit. Ein iatrogener, schwerer Albuminverlust bei septischen Patienten könnte zu einem Blutdruckabfall und progredientem Kreislaufversagen durch eine Verkleinerung [Seite 22↓]des effektiven arteriellen Blutvolumens führen. Aufgrund der Größe des Proteins mit einem Molekulargewicht von ca. 66,3 kD und einem Durchmesser von 5-15 nm (105) bestand das Risiko einer signifikanten Albumin-Elimination mittels großporiger Hämofiltration.

Der Albuminverlust über den großporigen Hämofilter war in der initialen Phase der Therapie, also unmittelbar nach Anschluss der CVVH am größten und nahm im Verlauf sigmoidal ab. Eine Gefährdung des Patienten durch einen übermäßigen Albuminverlust konnte ausgeschlossen werden.

Vor dem Hintergrund des erhöhten Proteinverlustes über den großporigen Hämofilter war die Beurteilung des Verlustes gerinnungswirksamer Mediatoren essentiell. Sowohl Protein C, als auch Antithrombin III und der Faktor II (Prothrombin) fallen mit ihren Molekulargewichten von 62-69 kD in das potentielle Eliminationsspektrum der großporigen Hämofilter mit einem in-vitro bestimmten cut-off von ca. 100 kD. Bei höheren Verlusten könnten hämostaseologische Probleme, die oftmals ohnehin im Verlauf der Sepsis eine große Rolle spielen, verstärkt werden und zu einer Gefährdung des Patienten führen.

Die engmaschig kontrollierten Gerinnungsparameter (einschließlich Faktorenanalyse) zeigten, dass unter der großporigen Hämofiltration kein nennenswerter Verlust zu verzeichnen ist.

Zur Beurteilung der Eliminationskapazität für septische Mediatoren wurden exemplarisch die proinflammatorischen Mediatoren IL-6 (28 KD) und TNF-α (52 kD) untersucht. Es zeigte sich, dass die großporige Hämofiltration in der Lage ist, eine effektive Elimination von IL-6 zu erzielen. Die Eliminationskapazität für TNF-α war jedoch begrenzt, eine signifikante Filtration von TNF-α konnte nicht nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass durch den raschen Abfall des Siebkoeffizienten TNF-αmit [Seite 23↓]seinem im Bereich des cut-off point der Membran liegenden Molekülgröße die Membran nur schwer passieren kann.

Die Begriffe Sepsis und Störungen des Immunsystems sind in komplexer Weise miteinander verbunden. Im septischen Verlauf werden infolge der massiven Abwehrreaktion gegen eindringende Keime andere spezifische Leistungen des Immunsystems unterdrückt. Betroffen ist vor allem die zelluläre Immunität mit einer Störung der Monozyten- und Lymphozytenfunktion. Polymorphkernige Leukozyten und Monozyten spielen eine zentrale Rolle in der Abwehr infektiöser Erreger. Aktivierte PML migrieren in den Entzündungsherd, wo sie Mikroorganismen und Zelltrümmer phagozytieren und durch Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen die körpereigene Immunreaktion amplifizieren.

Wir untersuchten die Bedeutung der großporigen Hämofiltration auf die Phagozytoseeigenschaft polymorphkerniger Leukozyten und Monozyten in-vivo sowie den Einfluss septischen Ultrafiltrats auf gesunde Monozyten in-vitro.

Zudem betrachteten wir die Proliferationsfähigkeit von Lymphozyten in-vivo. Unter Zugabe von anti-CD3, einem starken Lymphozytenproliferations-Antikörper, sollte die Proliferationsfähigkeit septisch geschädigter Lymphozyten untersucht und mit dem Verhalten nicht septisch-geschädigter Lymphozyten verglichen werden.

Wir konnten zeigen, dass die großporige Hämofiltration sowohl die Phagozytoseaktivität polymorphkerniger Leukozyten, als auch die Proliferationseigenschaften von Lymphozyten günstig beeinflußt. Das untersuchte septische Ultrafiltrat der großporigen Hämofiltration zeigte zudem – im Gegensatz zur konventionellen Hämofiltration mit kommerziellen Hämofiltern - starke Effekte auf isolierte Monozyten und Lymphozyten gesunder Probanden.

Eigene Arbeiten:

Artikel E 2: Morgera S, Rocktaschel J, Haase M, Lehmann C, Von Heymann C, Ziemer S, Priem F, Hocher B, Gohl H, Kox WJ, Buder HW, Neumayer HH. Intermittent high permeability hemofiltration in septic patients with acute renal failure. Intensive Care Med. 2003, 29(11):1989-95

Artikel E 3: Morgera S, Haase M, Rocktaschel J, Böhler T, Von Heymann C, Vargas-Hein O, Krausch D, Zuckermann-Becker H, Müller JM, Kox WJ, Neumayer HH. High Permeability haemofiltration improves peripheral blood mononuclear cell proliferation in septic patients with acute renal failure. Nephrol Dial Transplant. 2003, 18(12):2570-6

Artikel E 4: Morgera S, Haase M, Rocktaschel J, Bohler T, Vargas-Hein O, Melzer C, Krausch D, Kox WJ, Baumann G, Beck W, Gohl H, Neumayer HH. Intermittent high-permeability hemofiltration modulates inflammatory response in septic patients with multiorgan failure. Nephron Clin Pract. 2003, 94:75-80

Ein entscheidender Nachteil der großporigen Hämofiltration ist der unerwünschte Verlust essentieller Eiweiße. Ein kumulativer Proteinverlust von 10g pro Tag kann bei einem intensivpflichtigen Patienten, vor allem bei Einsatz der großporigen Hämofiltrationstherapie über Tage, zu einem nicht unerheblichen Proteindefizit führen. Die Entwicklung neuer Strategien, die eine gute Clearance inflammatorischer Mediatoren bei geringem Eiweißverlust erlauben, sind daher wünschenswert. In einer prospektiv, randomisierten Studie untersuchten wir den Einfluss von Konvektion und Diffusion auf die Eliminationscharakteristika inflammatorischer Zytokine und Bluteiweiße. Zusätzlich wurde der Einfluss des Umsatzvolumens betrachtet. Exemplarisch wurden die proinflammatorischen Mediatoren IL-1ß, IL-6 und TNF-α sowie das antiinflammatorische IL-1ra untersucht. Als Proteinmarker wurden das Serumalbumin sowie das Gesamteiweiß herangezogen.

Wir konnten zeigen, dass mittels Diffusion eine gute Elimination von Mediatoren bei insgesamt tolerablem Eiweißverlust erzielt werden kann. Der Eiweißverlust unterschied sich signifikant zwischen dem konvektiven und diffusiven Verfahren. Der Unterschied war besonders betont beim Einsatz hoher Umsatzvolumina. Aufgrund dieser [Seite 25↓]Ergebnisse empfehlen wir den Einsatz der großporigen Hämofilter im diffusiven Stofftransport.

Derzeit wird - unter unserer Leitung - eine multizentrische Studie zur großporigen Eliminationstherapie im Dialysemodus durchgeführt. Ziel der Studie ist es, die Bedeutung der großporigen Eliminationstherapie für den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Mit ersten Ergebnissen ist in zirka 12 Monaten zu rechnen.

Eigene Arbeiten:

Artikel E 5: Morgera S, Slowinski T, Melzer C, Sobottke V, Vargas-Hein O, Volk T, Zuckermann-Becker H, Wegner B, Müller JM, Baumann G, Kox WJ, Bellomo R, Neumayer HH. Renal replacement therapy with high cut-off hemofilters : Impact of convection and diffusion on cytokine clearances and protein status. Am J Kidney Dis. 2004, 43(3):444-53

Artikel K 2: Lee WCR, Uchino S, Fealy N, Baldwin I, Panagiotopoulos S, Goehl H, Morgera S, Neumayer HH, Bellomo R. Super high flux hemodialysis at high dialysate flows: An ex vivo assessment. Int J Artif Organs. 2004, 27:24-8

Artikel K 3: Uchino S, Bellomo R, Morimatsu H, Goldsmith D, Davenport P, Cole L, Baldwin I, Panagiotopoulos S, Tipping P, Morgera S, Neumayer HH, Goehl H. Cytokine dialysis: an ex vivo study. Asaio J. 2002, 48:650-3

TNF-α spielt eine herausragende Rolle in der Initialphase des septischen Krankheitsbildes. Die Persistenz hoher zirkulierender TNF-α Plasmaspiegel ist mit einer erhöhten Mortalität assoziiert. Zudem gibt es zunehmend Daten, die einen kausalen Zusammenhang zwischen TNF-αund dem septischen akuten Nierenversagen belegen (24).

Die Filter P1SH bzw. P2SH sind nicht in der Lage, eine Elimination von TNF-α zu erzielen.

Vor diesem Hintergrund entwickelten wir in Kooperation mit der Firma Gambro [Seite 26↓](Gambro, Research, Hechingen, Germany) eine zweite Generation großporiger Hämofilter mit dem Ziel, Substanzen im Molekülbereich von bis zu 70 kD zu eliminieren.

Die in-vitro Bestimmung des cut-off points ergab einen Wert zwischen 120-140 kD (Abbildung 4). Die mittlere Größen der eingesetzten Dextrane betrugen 18300, 39100, 70000 und 110000 Dalton.

Die Oberfläche des P2XS betrug 1,27 m², die Wandstärke 40 µm, der Kapillarinnendurchmesser 200 µm.

	Abbildung 4: In-vitro Bestimmung des cut-off points (Hämofilter P2XS) mit Hilfe von Dextranlösungen.

In einem Vollblut in-vitro Ansatz untersuchten wir die Modalitäten:

1. Konvektion (niedrig- und hochvolumiger Umsatz)
2. Diffusion (niedrig- und hochvolumiger Dialysatfluss)
3. Albumin-Dialyse (2% und 4% Albuminlösung)

Ziel der Studie war es, die Eliminationseigenschaften für einige ausgewählte Zytokine einschließlich TNF-α zu beschreiben sowie den Eiweißverlust zu quantifizieren. Die Bestimmung der Kreatinkinase (80 kD) und des IgG (140 kD) diente der Beurteilung des cut-off points in Vollblut.

Die in dieser Studie gewonnen Daten zeigten, dass ein klinischer Einsatz der P2SX nur im intermittierenden Modus und nur unter bilanzierter Proteinsubstitution stattfinden sollte. Diffusive Transporte sollten den konvektiven vorgezogen werden. Die Albumindialyse führte zwar zu einer deutlichen Reduktion des Eiweißverlustes, war aber auch mit einer schlechten Zytokinelimination assoziiert.

Eigene Arbeiten:

Artikel E 6: Morgera S, Klonower D, Rocktaschel J, Haase M, Priem F, Ziemer S, Wegner B, Gohl H, Neumayer HH. TNF-alpha elimination with high cut-off haemofilters: a feasible clinical modality for septic patients? Nephrol Dial Transplant. 2003, 18:1361-9