Müller-Hilke, Brigitte: Die differentielle Expression von MHC II-Genen als Mechanismus bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen

Aus dem Deutschen RheumaForschungs Zentrum Berlin


Habilitationsschrift
Die differentielle Expression von MHC II-Genen als Mechanismus bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen

Zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach Immunologie

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dr. rer. nat. Brigitte Müller-Hilke ,
aus Bonn

Präsident: Prof. Dr. Dr. h. c. H. Meyer

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. med. Elisabeth Märker-Herrmann (Mainz)
PD Dr. med. Ralf Waßmuth (Erlangen)

eingereicht: 17.12.2000

Datum der Habilitation: 12.12.2000

Zusammenfassung

Protektive MHC II Allele sind sowohl für den Menschen als auch für die Maus beschrieben worden und verhindern die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Hier untersuche ich die differentielle Expression von MHC II Allelen auf den unterschiedlichen Antigen-praesentierenden Zellen als Wirkmechanismus, der das Typ 1-Typ 2 Gleichgewicht der T-Helferzellen beeinflusst. Ich konnte zeigen, dass die als protektiv geltenden murinen I-Ab und I-Ek Molekuele auf fast allen Knochenmark-Makrophagen fuer 5 - 8 Tage stark exprimiert werden und dass die Expression dann langsam abnimmt. Im Gegensatz dazu fanden wir eine etwa 100-fach schwaechere Expression des mit der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) assoziierten I-Aq. Diese Expression war von nur kurzer Dauer und nahm rasch ab. Eine aehnlich differentielle Expression konnten wir weder auf B- noch auf dendritischen Zellen (DZ) nachweisen. Zusätzlich konnte in in vitro Restimulationsexperimenten gezeigt werden, dass Makrophagen durch diese differentielle Expression die T-Zell-Zytokinantwort massgeblich beeinflussen. Unsere Ergebnisse deuten an, dass Makrophagen eines protektiven Haplotyps MHC II Molekuele in hoher Zahl exprimieren und damit bevorzugt Typ 1 Antworten hervorrufen, wohingegen eine niedrige MHC II Expression Typ 2 Antworten beguenstigt. Wir schliessen daraus, dass das Ausmass der MHC II Expression das Signal, welches von den T-Zellen zu den Makrophagen zurückgesendet wird, steuert und damit die Aktivitaet der Makrophagen reguliert. Dieser durch polymorphe, jedoch nicht-kodierende MHC II-Gensegmente hervorgerufene Effekt koennte bei der Empfaenglichkeit fuer Autoimmunerkrankungen sowohl beim Menschen als auch bei der Maus eine Rolle spielen. Tatsaechlich konnten wir auch auf menschlichen Monozyten und B-Zellen eine differentielle Expression von HLA II Genen nachweisen und sie scheint sich hier auf die nur gering-polymorphen DRB4 Gene, die sowohl mit dem Rheumatoide Arthritis (RA) assoziierten DR4 als auch mit dem neutralen DR7 koexprimiert werden, zu beschraenken.

In meinem letzten Teil ziele ich darauf ab, das den Verlauf der RA und der CIA begleitende Typ 1 Übergewicht in ein Gleichgewicht mit Typ 2 zu revertieren. Dazu wurde ein Mausmodell etabliert, bei dem bereits polarisierte Typ 2 Th-Effektorzellen als Manipulatoren der für die Entstehung der CIA verantwortlichen, Kollagen-spezifischen Typ 1 Zellen eingesetzt wurden. Tatsaechlich konnte die CIA dann am effektivsten verhindert werden, wenn beide T-Zellpopulationen, die Manipulierer und die Kollagen-spezifischen, im selben Zellcluster aktiviert wurden. Diese Aktivierung im selben Zellcluster konnte dadurch erreicht werden, dass DZ gleichzeitig Kollagen und das fuer die Manipulierer spezifische Epitop praesentieren.

Schlagwörter:
Autoimmunerkrankungen, MHC II, T-Helferzellen, Typ 1/Typ 2 Gleichgewicht

Abstract

Protective/suppressive MHC class II alleles have been identified in man and mouse where they exert a disease-protective and immunosuppressive effect. As a mode of action we here investigate differential expression of MHC class II genes in different types of antigen-presenting cells impacting on the Type 1-Type 2 balance. We found that the murine I-Ab and I-Ek molecules, both well characterized as protective/suppressive, are expressed at a high level on almost all bone marrow derived macrophages for five to eight days after which expression slowly declines. In contrast, the collagen-induced arthritis (CIA) associated I-Aq-expression is lower, peaks over a shorter period and declines more rapidly. No differential expression could be detected on B cells or dendritic cells (DC). In addition, the differential MHC class II expression found on macrophages skews the cytokine response of T cells as shown by an in vitro restimulation assay. The results indicate that macrophages of the protective/ suppressive haplotypes express MHC class II molecules at a high level and exert Type 1 bias whereas low level expression favors a Type 2 response. We suggest that the extent of expression of the class II gene gates the back-signal from T cells and in this way controls the activity of macrophages. This effect mediated by polymorphic non-exon segments of MHC class II genes may play a role in determining disease susceptibility in mouse and man. Indeed, we also found differential expression of HLA II genes on human antigen presenting cells. However, in humans, differential expression affects both, B cells and monocytes and seems to be restricted to the non-polymorphic DRB4 gene coexpressed with the rheumatoid arthritis (RA) associated DR4 and the neutral DR7.

We finally aimed at reverting the Type 1 bias characteristic of RA and CIA. A murine system was developed where polarized Type 2 cells were used to manipulate collagen II-specific type 1 T cells responsible for the development of collagen induced arthritis. The polarized inducer cells indeed exerted their maximum effect when the two T-cell populations were activated within the same cluster, implemented by allowing a single DC to present both their epitopes.

Keywords:
autoimmunity, MHC II, T helper cells, type 1/type 2 balance


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58-64] [65] [66] [67-70] [71] [72] [73]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDie differentielle Expression von MHC II-Genen als Mechanismus bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Fazit, Kontext und Visionen
2 Einleitung
2.1 Autoimmunerkrankungen
2.2 Toleranz und Autoimmunität
2.3 Die Rolle von B- und T-Lymphozyten bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen
2.4 Bedeutung der regulatorischen T-Zellen bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen
2.5 Genetik von Autoimmunerkrankungen
3 Ergebnisse
3.1 Differentielle Expression der MHC II Gene in der Maus
3.1.1 in vivo Analyse der differentiellen MHC II Expression
3.1.1.1B-Zellen stellen den größten Anteil an APZ im Lymphknoten
3.1.1.2Differentielle Expression der MHC II Gene auf Lymphknoten-Makrophagen
3.1.2in vitro Analyse der MHC II Expression auf den Antigen-präsentierenden Zellen
3.1.2.1 Verlängerte Expression zweier protektiver Allele auf Knochenmark-Makrophagen
3.1.2.2 Die differentielle MHC II Expression ist auf die Makrophagen beschränkt
3.1.3 Immun-Deviation durch differentielle MHC II Expression auf den Makrophagen
3.1.3.1Eine hohe MHC II Expression auf Makrophagen begünstigt eine Typ1 Antwort
3.1.3.2 Eine niedrige MHC II Expression auf Makrophagen begünstigt eine Typ 2 Antwort
3.2 Differentielle Expression der MHC II Gene im Menschen
3.2.1 Assoziation von DR4 und DR10 mit der RA bei einer Kohorte früher Patienten
3.2.2 Assoziation von DR1 und DR4 mit einem schweren Krankheitsverlauf
3.2.3 Erhöhte DR4 Expression auf den B-Zellen von RA-Patienten
3.2.4 Differentielle Regulation der Expression von DR4 und DRB4 auf Monozyten
3.2.5 Differentielle gesamt-DR Expression DR4 und DR7 homozygoter B-Zellen
3.2.6 Unterschiedliche Kopplung verschiedener DRB4-Promotoren mit DR4 und DR7
3.3 Immun-Deviation im drei-Zelltyp-Cluster
3.3.1 Das experimentelle System des drei-Zelltyp-Clusters
3.3.2 Für eine effektive Polarisierung der naiven Th-Zellen wird die gekoppelte Antigen-Präsentation benötigt
3.3.3 Polarisierte Typ 1 Th-Zellen induzieren die IL-12 Produktion der DZ am effektivsten
3.3.4 Bei der Polarisierung von naiven Th zu Typ 1 Effektor Th-Zellen werden IFNgamma und IL-12 nacheinander benötigt
3.3.5 Übertragung der Arthritis durch adoptiven Transfer von Milz-Zellen aus CIA Tieren in SCID Mäuse
3.3.6 Verhinderung der CIA durch regulatorische Typ 2 Effektor Th-Zellen im drei-Zelltyp-Cluster
4 Diskussion
4.1 Differentielle Expression als Mechanismus, mit dem MHC II Gene für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen prädisponieren
4.1.1 Die Differentielle Expression der MHC II Gene auf murinen Makrophagen ist mit dem T-Zell-Zytokinprofil und protektiven/immunsuppressiven Effekten assoziiert
4.1.2 Differentielle Expression der MHC II Gene beim Menschen
4.1.3 Parallelen zwischen der differentiellen Expression in der Maus und beim Menschen
4.2 Immun-Deviation im drei-Zelltyp-Cluster
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Antikörper, verwendete Mausstämme, Patienten-Daten
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Häufigkeiten von Autoimmunerkrankungen in der Gesamtbevölkerung und in Familien
Tabelle 2: Assoziationen zwischen Autoimmunerkrankungen und HLA- Haplotypen
Tabelle 3: Liste der verwendeten monoklonalen Antikörper
Tabelle 4: MHC II-Haplotypen der verwendeten Mausstämme
Tabelle 5: Patienten-Daten

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Schematische Darstellung der Interaktion zwischen naiver Th-Zelle und Antigen-präsentierender Zelle (APZ). Der primäre Kontakt führt zur IL-2 Produktion der Th-Zelle. Die aktivierte Th-Zelle kann dann durch zusätzliche Signale zu einer Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zelle differenzieren, die durch ihre jeweilige Zytokinproduktion die zelluläre bzw. die humorale Immunantwort kontrolliert.
Abb. 2 Die drei Typen der professionellen Antigen-präsentierenden Zellen und die von ihnen induzierten Effektor Zh-Zellen. Durch die Sekretion von IL-12 begünstigen die Makrophagen (Mphi-gr) und die dendritischen Zellen (DZ) eine Differenzierung zu Typ 1 Effektor Th-Zellen. Die B-Zellen (B) sekretieren kein IL-12 und fördern die Entwicklung von Typ 2 Effektor Th-Zellen, die dann T-Zellhilfe bieten.
Abb. 3 Zusammenspiel verschiedener Zytokine bei der Typ 1-/Typ 2-Differenzierung. Typ 1 Effektor Th-Zellen aktivieren ruhende Antigen-präsentierende Zellen (APZ) und stimulieren sie zur IL-12 Produktion, die widerum eine Typ 1-Differenzierung unterstützt. Von Typ 2 Effektor Th-Zellen sekretiertes IL-10 inhibiert die Aktivierung der APZ, verhindert dadurch die IL-12 Sekretion und begünstigt Typ 2-Differenzierungen. Durchgezogene Pfeile symbolisieren Differenzierungen, gestrichelte Pfeile und Linien symbolisieren die Richtung, in der Zytokine aktivierend (+) oder inhibierend (-) wirken.
Abb. 4 Aminosäuresequenz aller DRB1-Allele mit einem “shared epitope“. Die Abbildung zeigt den jeweiligen Vergleich mit der Konsensus-Sequenz, die in der obersten Zeile steht. Übereinstimmungen sind durch einen Strich, Unterschiede durch die entsprechende Aminosäure gekennzeichnet. Die dem “shared epitope“ entsprechende Sequenz ist fett gedruckt, die Namen der Allele stehen links.
Abb. 5 Modell der differentiellen Expression von MHC II-Genen. Quantitative Unterschiede in der Dichte von MHC II-Molekülen auf der Oberfläche der jeweiligen APZ bedingen quantitative Unterschiede in der Interaktion mit Th-Zellen und resultieren somit in unterschiedlichen Polarisierungen.
Abb. 6 APZ-Populationen und MHC II Expression im Verlauf einer Immunantwort. In A sind die Anteile der B220+ B-Zellen, CD11c+ dendritischen Zellen und der CD11b+ Monozyten in % der mononukleären Lymphknoten-Zellen im Verlauf einer Immunantwort dargestellt. B zeigt die I-Aq und die I-Ek Expression auf B220+, CD11c+ und CD11b+ Zellen. Um einen Vergleich der mFi zu ermöglichen, ist die MHC II Expression auf den B220+ B-Zellen jeweils zu Beginn der Immunantwort als 1 festgelegt und alle weiteren Messungen beziehen sich auf diesen Wert.
Abb. 7 Kinetiken der CD11b und MHC II Expression auf Knochenmark-Makrophagen. Die Expression ist als Deltamfi, als Differenz zwischen der mFi gefärbter und ungefärbter Zellen, angegeben. Die Angabe der Mausstämme ermöglicht die Zuordnung der Symbole zu den jeweiligen MHC II Molekülen. Um individuelle Unterschiede auszugleichen, wurde für jede Kurve das Knochenmark von 6-10 Mäusen vereinigt.
Abb. 8 Differentielle MHC II Expression auf APZ. Für die Analyse frischer und für 24 Stunden LPS-aktivierter B-Zellen wurden je 3-5 Milzen gepoolt und in Doppelfärbungen mit mAk gegen B220 und das entsprechende MHC II Molekül untersucht. Für die Analyse frischer Makrophagen und dendritischer Zellen wurden ebenfalls 3-5 Milzen vereinigt und über Tripelfärbungen mit mAk gegen CD11b, CD11c und das entsprechende MHC II Molekül untersucht. Für die Analyse der Knochenmark-Makrophagen wurde das Knochenmark aus Tibia und Femur von je 10 Mäusen vereinigt, in konditioniertem Medium mit 30% L929 Überstand kultiviert und am Tag 7 der Kultur (vgl. mit Abb. 7) in Doppelfärbungen mit mAk gegen CD11b und das entsprechende MHC II Molekül untersucht. Für die Analyse der dendritischen Zellen aus dem Knochenmark wurde wieder das Mark aus Tibia und Femur von je 5 Mäusen vereinigt, in Gegenwart von rGM-CSF kultiviert, am Tag 6 der Kultur mit rTNFalpha stimuliert und am Tag 7 in Doppelfärbungen mit mAk gegen CD11c und das entsprechende MHC II Molekül untersucht.
Abb. 9 Experimentelles Schema bei der Messung von T-Zellantworten in Abhängigkeit vom restringierenden MHC II Haplotyp. Kongene F1 Mäuse wurden mit 250µg cIg (Hühner-Immunoglobulin) oder KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) in Adjuvans immunisiert. Die ableitenden Lymphknoten wurden isoliert, APZ (MHC II+ Zellen) aus den Lymphknoten wurden depletiert und die T-Zellen in vitro in Gegenwart von Antigen und Knochenmark-Makrophagen restimuliert. Die Zytokinexpression wurde als intrazelluläres IL-4 oder IFNgamma im Durchflußzytometer gemessen.
Abb. 10 FACS-Analyse intrazellulärer IFNgamma Produktion. H-2b und H-2d restringierte T-Zellen aus F1 Mäusen wurden in Abwesenheit von oder in Anwesenheit von H-2b und H-2d exprimierenden Knochenmark-Makrophagen (KM-Mphi-gr) restimuliert, um intrazelluläres IFNgamma zu bestimmen (obere Reihe). Die Spezifität der Färbungen wurde in der unteren Reihe gezeigt, wo die IFNgamma-Färbung mit einem unmarkierten Antikörper gegen IFNgamma blockiert, bzw. die Zellen mit einer Fluoreszenz-markierten Isotyp-Kontrolle inkubiert wurden. Die Ordinate zeigt die Anfärbung mit einem mAk gegen CD69, einem sehr frühen Aktivierungsmarker auf T-Zellen.
Abb. 11 IFNgamma Produktion von in vitro restimulierten B10. T-Zellen. Die jeweilige Restriktion der T-Zellen sowie das von den interagierenden Knochenmark-Makrophagen (KM-Mphi-gr) exprimierte MHC II Molekül sind angegeben. Jedes Balkendiagramm faßt die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten zusammen, in denen jeweils 3-5 Mäuse mit KLH in Adjuvans immunisiert worden sind. Die Balken repräsentieren die jeweiligen Mittelwerte mit Standardabweichungen. Der experimentelle Ansatz erfolgte wie in Abb. 9 beschrieben.
Abb. 12 FACS Analyse einer intrazellulären IL-4 Färbung. Die IL-4 Färbung der Lymphozyten ist auf der Abszisse, die Anfärbung mit dem mAk gegen den sehr frühen Aktivierungsmarker CD69 auf der Ordinate gezeigt.
Abb. 13 IFNgamma und IL-4 Produktion von in vitro restimulierten BALB T-Zellen. Die jeweilige Restriktion der T-Zellen sowie das von den interagierenden Knochenmark-Makrophagen (KM-Mphi-gr) exprimierte MHC II Molekül sind angegeben. Jedes Balkendiagramm faßt die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten zusammen, in denen jeweils 3-5 Mäuse mit KLH in Adjuvans immunisiert worden sind. Die Balken repräsentieren die jeweiligen Mittelwerte mit Standardabweichungen. Der experimentelle Ansatz erfolgte wie in Abb. 9 beschrieben.
Abb. 14 Assoziation von DR4 und RA bei einer Kohorte früher Patienten. Die gestreiften Balken zeigen anteilig, wieviele Patienten welche Allele der 10 verschiedenen HLA-DRB1 Subgruppen (DRB1*01-*10) tragen. Die weißen Balken repräsentieren die Kontrollen.
Abb. 15 Einfluß des HLA-DRB1 Haplotyps auf den Ratingen Score. Jeder Patient ist gemäß der beiden vorhandenen HLA-DRB1 Allele zweimal dargestellt. Alle DR1 oder DR4 Allele sowie alle anderen Allele, die mit einem DR1 oder DR4 kombiniert vorliegen, sind als schwarze Kreise gezeichnet. Alle weiteren Haplotypen sind durch leere Kreise repräsentiert.
Abb. 16 Schematische Darstellung der DR4 und DR7 Genloci. Funktionelle Gene sind als grau unterlegte, Pseudogene als weiße Rechtecke und die dazugehörigen Promotoren als Pentagone gezeichnet. DRB8 besteht aus den Exonen 3-6, DRB9 besteht nur aus Exon 2 und beide Pseudogene sind ohne Promotoren. DRB7 besteht aus einem Promotor und Exon 1. Das mit dem DR7 gekoppelte DRB4 kann am 3´Ende des 1. Introns eine defekte Splice-Schnittstelle tragen (durch ** gekennzeichnet) und wird dann nicht exprimiert. Die verwendeten mAk und die Gene, deren Genprodukte sie erkennen, sind eingezeichnet.
Abb. 17 HLA-DR Expression auf T-Zellen, B-Zellen und Monozyten aus dem peripheren Blut eines DR4 homozygoten gesunden Spenders. Die oberen drei Bilder zeigen jeweils eine Doppelfärbung mit dem mAk gegen Gesamt-DR sowie CD3, CD19 und CD14. Die unteren drei Bilder zeigen ebenfalls Doppelfärbungen, aber mit dem DR4 spezifischen mAk.
Abb. 18 Erhöhte DR4 Expression auf den B-Zellen von RA-Patienten. Die DR4 Expression wurde auf B-Zellen, Monozyten und T-Zellen des peripheren Bluts von DR4 homozygoten gesunden Spendern (Kontrollen) und RA Patienten (RA) analysiert und wegen der unterschiedlichen Eigenfluoreszenz von Lymphozyten und Monozyten als Differenz der Kanalwerte zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen angegeben. RA (P) steht für RA-Patienten unter dem Einfluß von 2.5-20mg Prednisolon/Tag. Kontrollen sind durch graue, RA-Patienten als weiße und RA-Patienten unter Prednisolon-Einfluß als schwarze Symbole dargestellt. Die Kreise symbolisieren die Expression auf B-Zellen, Rauten die Expression auf Monozyten und Quadrate die Expression auf T-Zellen. Die Balken entsprechen den Medianen. Der P Wert für die unterschiedliche DR4 Expression auf B-Zellen von Patienten unter Prednisolon-Einfluß und auf B-Zellen von Patienten, die keine Corticosteroide einnahmen, beträgt 0.0055.
Abb. 19 Differentielle Regulation von DRB4 und DR4 auf Monozyten. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts dreier DR4 homozygoter gesunder Spender wurden für 2 Tage mit PMA und LPS stimuliert. Die Kinetik der DR4 und der DRB4 Expression auf B-Zellen und Monozyten wurde in Doppelfärbungen mit mAk gegen DR4 und Gesamt-DR sowie gegen CD19 und CD14 gemesssen und als Differenz der Kanalwerte zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen dargestellt. Die Expression auf B-Zellen ist durch Kreise, die Expression auf Monozyten durch Rauten symbolisiert.
Abb. 20 Differentielle gesamt-DR Expression bei B-Zellen und Monozyten DR4 und DR7 homozygoter Spender. Signifikante Unterschiede in der DRB4 Expression (s. auch Abb.16) führen zu einem unterschiedlichen Anteil von DR4 bzw. DR7 an der gesamt-DR Expression. Die jeweilige Menge der DR Moleküle ist in Antikörperbindungs-Kapazität gemessen, die weißen Kreise repräsentieren die Werte für die DR4 homozygoten und die schwarzen Kreise für die DR7 homozygoten B-Zellen und Monozyten.
Abb. 21 Schema des experimentellen Ansatzes zur Untersuchung der T-Zell-Kommunikation im drei-Zelltyp-Cluster. Bei der gekoppelten Antigen-Präsentation ist die DZ mit den beiden Antigenen Cytochrom C (CytC) und Ovalbumin (OVA) beladen, so dass die bereits polarisierte, regulatorische Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zelle über die DZ mit der naiven Th-Zelle in Kontakt treten kann. Bei der nicht-gekoppelten Antigen-Präsentation sind die DZ entweder mit CytC oder mit OVA beladen, so dass die bereits polarisierten Effektor Th-Zellen keinen direkten zellulären Kontakt mit den naiven Th-Zelle haben.
Abb. 22 FACS-Analyse einer intrazellulären Zytokinfärbung von CytC-spezifischen Typ 1 und Typ 2 Effektor Th-Zellen. Für die Generierung dieser Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellinien werden naive CD4+ Th-Zellen aus den 5CC7-Mäusen isoliert, in vitro in Gegenwart von APZ, 1µM Antigen und entweder 10ng/ml IL-12 und 10µg/ml anti-IL-4 mAk oder 30ng/ml IL-4, 10µg/ml anti-IFNgamma mAk und 10µg/ml anti-IL-12 mAk stimuliert und mehrmals im Abstand von mindestens 14 Tagen restimuliert. Die Analyse zeigt die IFNgamma bzw. IL-4 Produktion einer Typ 1 und einer Typ 2 Linie nach 3-maliger Stimulation. Die Prozentzahlen der CD4+ Zytokin-produzierenden Th-Zellen sind in den jeweiligen Quadranten angegeben.
Abb. 23 Zytokinproduktion der OVA-spezifischen Th-Zellen im Typ 1 (a) und Typ 2 (b) Cluster. Nach 5-7 Tagen Kultur im drei-Zelltyp-Cluster wurden die OVA-spezifischen Th-Zellen mit BALB/c-APZ und 1µM OVA für 6 Stunden in Gegenwart von Brefeldin A restimuliert, bevor ihre intrazelluläre IFNgamma und IL-4 Produktion im FACS analysiert wurde. A) FSC/SSC-Diagramm mit eingekreisten Lymphozyten (oben) und Darstellung der klonotypischen CD4+ Zellen unten. B) Vergleich der Zytokinproduktion im Cluster mit nicht-gekoppelter (oben) und gekoppelter Antigen-Präsentation (unten). C) Zytokinproduktion der negativen Kontrolle (oben) mit F1-DZ und naiven OVA-spezifischen Th-Zellen und der positiven Kontrolle (unten) mit F1-DZ, naiven OVA-spezifischen Th-Zellen und entweder rIL-12 in (a) oder rIL-4 in (b). Die Prozentzahlen der positiv gefärbten Zellen sind für jeden Quadranten angegeben.
Abb. 24 Eine effektive Polarisierung der naiven OVA-spezifischen Th-Zellen im drei-Zelltyp-Cluster erfordert den direkten zellulären Kontakt über die DZ mit den regulatorischen Effektor Th-Zellen. Die Balken repräsentieren die Mittelwerte und Standardabweichungen der intrazellulären Zytokinproduktion von 8 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (vgl. auch mit Abb. 23). Die Sternchen deuten die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen negativen Kontrollen und Ansätzen mit nicht-gekoppelter und gekoppelter Antigen-Präsentation an.
Abb. 25 Kinetik der IL-12 Produktion von DZ im Typ 1 Cluster. DZ wurden entweder alleine (schwarze Kreise) oder mit naiven OVA-spezifischen (weiße Kreise) oder mit naiven OVA-spezifischen und Typ 1 regulatorischen Effektor Th-Zellen bei gekoppelter (schwarze Quadrate) sowie bei nicht-gekoppelter Antigen-Präsentation (weiße Quadrate) inkubiert. Jeweils 4 Stunden vor den angegebenen Zeitpunkten wurden die Kulturen mit Brefeldin A versetzt und zu den angegebenen Zeitpunkten mit PFA fixiert. Die IL-12 Produktion der CD11b+ DZ wurde intrazellulär im Durchflußzytometer bestimmt.
Abb. 26 Die Stimulation über CD40 spielt bei der Induktion der IL-12 Expression in DZ eine untergeordnete Rolle. DZ wurden entweder alleine (oben links), mit 10µgml anti CD40 mAk (oben rechts), mit naiven OVA-spezifischen Th-Zellen (unten links) oder mit naiven und regulatorischen Typ 1 Effektor Th-Zellen bei gekoppelter Antigen-Präsentation (unten rechts) inkubiert und nach 6 Stunden die intrazelluläre IL-12 Produktion der DZ gemessen. Die jeweiligen Prozentzahlen der CD11b+ DZ sind angegeben. Die CD11b- Zellen im unteren rechten Fenster der Abbildung sind Typ 1 Effektor Th-Zellen, die aufgrund des gleichen FSC/SSC Verhaltens wie DZ nicht ausgeblendet werden können.
Abb. 27 Bei der Polarisierung zu Typ 1 Th-Zellen werden IFNgamma und IL-12 nacheinander in einem engen zeitlichen Rahmen benötigt. Drei-Zelltyp-Cluster mit Typ 1 Effektor Th-Zellen und gekoppelter Antigen-Präsentation wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach Kulturbeginn mit 20µg/ml anti-IFNgamma (weiße Quadrate) oder 20µg/ml anti-IL-12 (schwarze Quadrate) versetzt oder ohne blockierenden mAk (schwarze Kreise) kultiviert. Nach der Restimulation der gesamten Clusteransätze wurden die IFNgamma Produzenten unter den OVA-spezifischen Th-Zellen in Bezug auf die Kontrolle ohne blockierenden mAk normalisiert. Die negative Kontrolle besteht aus naiven OVA-spezifischen Th-Zellen und DZ (weiße Kreise). Die Werte stellen die Mittelwerte und Standardabweichungen von zwischen 3 und 5 Experimenten.
Abb. 28 Übertragung der Arthritis durch adoptiven Transfer. 5x106 Milzzellen aus DBA/J Mäusen mit CIA wurden i.p. in SCID Mäuse transferiert, und am Tag 20 nach dem Transfer wurden die Arthritis-Indices nach Holmdahl bestimmt. Zusammen mit dem Transfer der Milzzellen erhielten die Empfängermäuse entweder mit bovinem Kollagen II (bKII) beladene DZ (weiße Quadrate), 250µg gelöstes bovines Kollagen (weiße Kreise) oder kein zusätzliches Antigen als negativ-Kontrolle (halb gefüllte Quadrate). Jedes Symbol repräsentiert den Arthritis-Index einer Empfängermaus und die Mediane für die jeweils 4 Mäuse pro experimenteller Gruppe sind als Linien gezeigt.
Abb. 29 Verhinderung der CIA durch regulatorische Typ 2 Effektor Th-Zellen. 106 mit OVA und Kollagen Typ II beladene F1-DZ wurden zusammen mit 5x106 Milzzellen aus CIA-Mäusen (weiße Quadrate) oder 2x106 Milzzellen aus CIA-Mäusen und 2x106 OVA-spezifischen Typ 2 Effektor Th-Zellen (schwarze Kreise) i.p. in SCID-Mäuse transferiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Arthritis-Indices bestimmt. Die Mediane für die jeweils 4 Mäuse pro experimenteller Gruppe sind als Linien gekennzeichnet.
Abb. 30 Abfolge von Typ 2- (IL-4 Ausschüttung, Antikörperproduktion) und Typ 1-Phase in der Arthritis-Entwicklung nach Immunisierung mit Kollagen Typ II (cII) in Mäusen eines empfänglichen H-2 Haplotyps.
Abb. 31 Sequentieller Bedarf von IFNgamma und IL-12 bei der Polarisierung naiver Th-Zellen (Tn) im drei-Zelltyp-Cluster mit dendritischen Zellen (DZ) und bereits polarisierten Typ 1 Effektor Th-Zellen (Typ 1). Die Pfeile symbolisieren, von welchen Zellen welche Zytokine ausgeschüttet werden und auf welche Zellen sie wirken.

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