Müller-Hilke, Brigitte: Die differentielle Expression von MHC II-Genen als Mechanismus bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Differentielle Expression der MHC II Gene in der Maus

3.1.1 in vivo Analyse der differentiellen MHC II Expression

3.1.1.1 B-Zellen stellen den größten Anteil an APZ im Lymphknoten

In der Maus gibt es zwei verschiedene MHC II Moleküle, das I-A und das I-E, die zusammen den H-2 Haplotypen bestimmen. Um die MHC II-Expression auf den verschiedenen Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) im Verlauf einer Immunantwort zu untersuchen, wurden B10. Mäuse mit jeweils 200 µg KLH in Adjuvans nahe der Schwanzwurzel immunisiert, die ableitenden Lymphknoten nach 12, 36, 50 bzw. 98 Stunden isoliert, zu Einzelzell-Suspensionen verarbeitet und die B-Zellen, dendritische Zellen und Makrophagen wurden mit Zelltyp- sowie MHC II-spezifischen Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern (mAk) angefärbt und im Durchflußzytometer analysiert. So konnten die Anteile der B220+ B-Lymphozyten an den mononukleären Zellen der Lymphknoten mit im Mittel 25% zu Beginn der Immunantwort und 35% nach 41/2 Tagen als zahlenmäßig stärkste APZ-Population ermittelt werden (Abb. 6A). Die Anteile der CD11b+ Makrophagen schwankten zwischen 2.5% am Tag 0.5 und 3.2 am Tag 4.5 und erreichten den maximalen Anteil von 4% am Tag 1.5. Die CD11c+ dendritischen Zellen stellten die kleinste Population und erreichten ihren maximalen Anteil von 0.5% am Tag 2.5 (Abb. 6A). Diese Analysen wurden mit 5 verschiedenen kongenen B10. Mausstämmen durchgeführt, deren I-A und I-E Moleküle in Tabelle 3 aufgelistet sind. Die jeweiligen Anteile der APZ-Populationen zu den verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung waren für alle 5 getesteten Stämme identisch.

3.1.1.2 Differentielle Expression der MHC II Gene auf Lymphknoten-Makrophagen

Parallel zu der Bestimmung der Anteile der APZ im Lymphnoten wurde die Expression der MHC II Moleküle auf den verschiedenen APZ im Verlauf einer Immunantwort untersucht. Die Expression der MHC II Moleküle wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (mFi) und Veränderungen in der Expression im Verlauf der Immunantwort als Anstieg der mFi gemessen. Die für die einzelnen Haplotypen ermittelten mFi können nicht direkt miteinander verglichen werden, da sie durch unterschiedliche mAk hervorgerufen werden. Wir haben deshalb für jeden Haplotypen die mFi auf B-Zellen zu Beginn der Immunantwort als Bezugspunkt gewählt und als 1 festgelegt, um dann eine Veränderung in der MHC II Expression und die Expression auf dendritischen Zellen und Makrophagen mit der frühen Expression auf B-Zellen vergleichen zu können. Anschließend konnte die Verteilung der MHC II Expression bei den verschiedenen Haplotypen miteinander verglichen werden (Abb. 6B). Wir konnten so für beide, die I-Aq und die I-Ek Expression auf B-Lymphozyten einen langsamen Anstieg zeigen, der sich nach 4.5 Tagen mit einer 3-4fach höheren mFi beschreiben läßt. Dendritische Zellen exprimieren die meisten MHC II Moleküle und sind durch eine 20-30fach höhere mFi als B-Lymphozyten charakterisiert, die sich im Verlauf der Immunantwort kaum verändert. In bezug auf die MHC II Expression auf B-Zellen und dendritischen Zellen ähneln sich die verschiedenen Haplotypen sehr (nicht alle Daten sind


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gezeigt). Allerdings gibt es in bezug auf die MHC II Expression auf Makrophagen Unterschiede und Abbildung 6B zeigt mit dem Verlauf der Expression vom I-Aq im

Abb. 6 APZ-Populationen und MHC II Expression im Verlauf einer Immunantwort. In A sind die Anteile der B220+ B-Zellen, CD11c+ dendritischen Zellen und der CD11b+ Monozyten in % der mononukleären Lymphknoten-Zellen im Verlauf einer Immunantwort dargestellt. B zeigt die I-Aq und die I-Ek Expression auf B220+, CD11c+ und CD11b+ Zellen. Um einen Vergleich der mFi zu ermöglichen, ist die MHC II Expression auf den B220+ B-Zellen jeweils zu Beginn der Immunantwort als 1 festgelegt und alle weiteren Messungen beziehen sich auf diesen Wert.

Vergleich zum I-Ek Molekül die beiden beobachteten Extreme: Obwohl sich die Expression beider Moleküle auf Makrophagen im Verlauf der Immunantwort kaum ändert, ist die mFi für das I-Ek Molekül am Tag 0.5 etwa doppelt so hoch wie auf B-Zellen und es dauert bis nach Tag 3, bis B-Zellen und Makrophagen die gleiche mFi zeigen. Erst am Tag 4 ist die mFi auf B-Zellen höher als auf den Makrophagen. Anders für das I-Aq Molekül: Hier ist die mFi auf B-Zellen von Anbeginn an höher als auf den Makrophagen (Abb. 6B) und deutet bereits auf eine differentielle Expression der MHC II Moleküle auf den Makrophagen hin.

3.1.2 in vitro Analyse der MHC II Expression auf den Antigen-präsentierenden Zellen

3.1.2.1 Verlängerte Expression zweier protektiver Allele auf Knochenmark-Makrophagen

Um die Kinetik der MHC II Expression auf Makrophagen untersuchen zu können, wurde das


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Knochenmark verschiedener Mausstämme isoliert und in konditioniertem Medium - bestehend aus 30% L929 Überstand (Stanley et al., 1978) - für 25 Tage kultiviert und so die Entwicklung von Knochenmark-Makrophagen ermöglicht. Über diesen Zeitraum wurden die CD11b Expression als Maß für die Entwicklung von adherent wachsenden Makrophagen sowie die MHC II Expression als Differenz zwischen der mFi ungefärbter und gefärbter Makrophagen gemessen. Nach etwa 7 Tagen enthielten alle Kulturen zwischen 95 und 99% CD11b+ Zellen, wobei die CD11b Expression über den Zeitraum von 25 Tagen - ebenfalls in allen Kulturen - langsam abnahm (s. Abb. 7). Bei der Messung der MHC II Expression haben wir uns auf die als protektiv/immunsuppressiv beschriebenen I-Ab und I-Ek, auf die als neutral geltenden I-Ad und I-Ak sowie auf das mit der CIA assoziierte I-Aq Molekül konzentriert.

Für die I-Ab und I-Ek Expression auf Knochenmark-Makrophagen konnte gezeigt werden, dass die Kinetiken der MHC II Expression etwa parallel zur CD11b Expression verlaufen, d.h. langsam über die 25 Tage in vitro Kultur abfallen (Abb. 7). Die Kinetiken der der I-Ad, I-Ak und I-Aq Expression hingegen fallen sehr schnell ab und nach 20 Tagen läßt sich eine spezifische Anfärbung mit mAk nur noch schwach beobachten. Durch die Analyse von BALB/c Mäusen, der F1 aus B10.A(5R) und BALB/c, sowie CBA/J Mäusen, DBA/1 Mäusen und der F1 aus DBA/1 und B10.Q konnten wir ausschließen, dass die differentielle Expression auf den B10.-Hintergrund beschränkt ist (Abb. 7).

Abb. 7 Kinetiken der CD11b und MHC II Expression auf Knochenmark-Makrophagen. Die Expression ist als Deltamfi, als Differenz zwischen der mFi gefärbter und ungefärbter Zellen, angegeben. Die Angabe der Mausstämme ermöglicht die Zuordnung der Symbole zu den jeweiligen MHC II Molekülen. Um individuelle Unterschiede auszugleichen, wurde für jede Kurve das Knochenmark von 6-10 Mäusen vereinigt.


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3.1.2.2 Die differentielle MHC II Expression ist auf die Makrophagen beschränkt

Die Quantifizierung der verschiedenen MHC II Moleküle auf den Antigen-präsentierenden Zellen wurden sowohl an frisch aus der Maus isolierten als auch an in vitro aktivierten B-Zellen, dendritischen Zellen und Makrophagen unterschiedlicher Haplotypen durchgeführt. Frische Zellen wurden aus den Milzen nicht-immunisierter Mäuse isoliert und durch die Anfärbung mit mAk gegen B220, CD11b oder CD11c identifiziert. Aktivierte Zellen waren frische B220+ Milzzellen, die für 24 Stunden mit 5µg/ml LPS stimuliert worden waren, Knochenmark-dendritische Zellen, die mit 100U/ml TNFalpha zur terminalen Differenzierung angeregt waren (Inaba et al. 1992) und adherent gewachsene Knochenmark-Makrophagen. Für die Quantifizierung wurden “Quantum Simply Cellular Microbeads“ verwendet, die aus 5 verschiedenen Populationen von Partikeln bestehen, die jeweils eine definierte Menge von Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche tragen und damit eine definierte Bindungskapazität für Maus IgG Antikörper besitzen. Mit diesen Microbeads wurde für jeden anti-MHC II mAk eine Kalibrierungs-Kurve erstellt, um die durch den jeweiligen mAk hervorgerufene Fluoreszenz-Intensität mit einer Bindungskapazität korrelieren zu können, die man dann als Maß für die Expression des entsprechenden MHC II Moleküls verwendet.

Insgesamt wurde die Oberflächenexpression 5 verschiedener MHC II Moleküle, des I-Ek, I-Ab, I-Ad, I-Ak und I-Aq, quantifiziert (Abb. 8). Auf frischen B-Zellen schwankt die MHC II Expression je nach Haplotyp zwischen 28.000 und 61.000 und auf LPS-aktivierten B-Zellen zwischen 230.000 und 480.000 Molekülen/Zelle, ohne signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Haplotypen. Frische dendritische Zellen exprimieren zwischen 35.000 und 205.000 und terminal differenzierte dendritische Zellen aus dem Knochenmark exprimieren die meisten MHC II Moleküle/Zelle, nämlich zwischen 2 x106 und 7.5x106. Auch bei den dendritischen Zellen gab es keine signifikanten Unterschiede in der Expression der verschiedenen Haplotypen, der größte Unterschied war 6-fach und wurde zwischen I-Ek und I-Aq gemessen (Abb. 8). Auf frische Makrophagen war die MHC II Expression am niedrigsten, betrug zwischen 3.400 und 7.200 Molekülen/Zelle und war für alle Haplotypen ähnlich. Deutlich wurde die differentielle Expression auf aktivierten Knochenmark-Makrophagen, wo etwa 680.000 I-Ek und 607.000 I-Ab Moleküle aber nur 7.000 I-Aq Moleküle/Zelle gemessen wurden. Hier ist die Expression der als protektiv/immunsuppressiv beschriebenen MHC II Moleküle 100-fach stärker als die des mit der CIA assoziierten I-Aq.

3.1.3 Immun-Deviation durch differentielle MHC II Expression auf den Makrophagen

Um eine physiologische Bedeutung der differentiellen MHC II Expression bei der Immunantwort zu untersuchen, wurden die Zytokinantworten von in vitro restimulierten T-Zellen, die durch differentiell exprimierte MHC II Moleküle restringiert waren, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden F1-Mäuse, die jeweils einen auf Makrophagen hoch exprimierten und einen auf Makrophagen niedrig exprimierten parentalen Haplotyp tragen, mit cIg oder KLH als Antigen in Adjuvans immunisiert. Am Tag 7 nach der Immunisierung wurden die ableitenden Lymphknoten entnommen, die T-Zellen in Gegenwart von Antigen und Knochenmark-Makrophagen, die entweder den väterlichen oder mütterlichen MHC II Haplotypen exprimieren, restimuliert und die resultierende Zytokinantwort gemessen. Das experimentelle Schema ist in Abbildung 9 dargestellt.


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Abb. 8 Differentielle MHC II Expression auf APZ. Für die Analyse frischer und für 24 Stunden LPS-aktivierter B-Zellen wurden je 3-5 Milzen gepoolt und in Doppelfärbungen mit mAk gegen B220 und das entsprechende MHC II Molekül untersucht. Für die Analyse frischer Makrophagen und dendritischer Zellen wurden ebenfalls 3-5 Milzen vereinigt und über Tripelfärbungen mit mAk gegen CD11b, CD11c und das entsprechende MHC II Molekül untersucht. Für die Analyse der Knochenmark-Makrophagen wurde das Knochenmark aus Tibia und Femur von je 10 Mäusen vereinigt, in konditioniertem Medium mit 30% L929 Überstand kultiviert und am Tag 7 der Kultur (vgl. mit Abb. 7) in Doppelfärbungen mit mAk gegen CD11b und das entsprechende MHC II Molekül untersucht. Für die Analyse der dendritischen Zellen aus dem Knochenmark wurde wieder das Mark aus Tibia und Femur von je 5 Mäusen vereinigt, in Gegenwart von rGM-CSF kultiviert, am Tag 6 der Kultur mit rTNFalpha stimuliert und am Tag 7 in Doppelfärbungen mit mAk gegen CD11c und das entsprechende MHC II Molekül untersucht.


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Abb. 9 Experimentelles Schema bei der Messung von T-Zellantworten in Abhängigkeit vom restringierenden MHC II Haplotyp. Kongene F1 Mäuse wurden mit 250µg cIg (Hühner-Immunoglobulin) oder KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) in Adjuvans immunisiert. Die ableitenden Lymphknoten wurden isoliert, APZ (MHC II+ Zellen) aus den Lymphknoten wurden depletiert und die T-Zellen in vitro in Gegenwart von Antigen und Knochenmark-Makrophagen restimuliert. Die Zytokinexpression wurde als intrazelluläres IL-4 oder IFNgamma im Durchflußzytometer gemessen.

3.1.3.1 Eine hohe MHC II Expression auf Makrophagen begünstigt eine Typ1 Antwort

Die Zytokinantwort der in vitro restimulierten F1 T-Zellen wurde im Durchflußzytometer nach intrazellulärer Anfärbung von IL-4 bzw. IFNgamma gemessen. Abbildung 10 zeigt exemplarisch eine FACS-Analyse von T-Zellen aus B10.A(5R) x B10.D2 Mäusen, die mit KLH immunisiert worden waren. Wie zu erwarten, werden T-Zellen in Abwesenheit von APZ nicht stimuliert und produzieren keine Zytokine. Eine Restimulation durch Makrophagen mit hoher Dichte des I-Ab Moleküls induziert eine höhere IFNgamma-Produktion in I-Ab restringierten T-Zellen (4.7%), als die Restimulation durch Makrophagen mit niedriger I-Ad Expression in I-Ad restringierten T-Zellen (2.4%), (Abb. 10).


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Abb. 10 FACS-Analyse intrazellulärer IFNgamma Produktion. H-2b und H-2d restringierte T-Zellen aus F1 Mäusen wurden in Abwesenheit von oder in Anwesenheit von H-2b und H-2d exprimierenden Knochenmark-Makrophagen (KM-Mphi-gr) restimuliert, um intrazelluläres IFNgamma zu bestimmen (obere Reihe). Die Spezifität der Färbungen wurde in der unteren Reihe gezeigt, wo die IFNgamma-Färbung mit einem unmarkierten Antikörper gegen IFNgamma blockiert, bzw. die Zellen mit einer Fluoreszenz-markierten Isotyp-Kontrolle inkubiert wurden. Die Ordinate zeigt die Anfärbung mit einem mAk gegen CD69, einem sehr frühen Aktivierungsmarker auf T-Zellen.

Abbildung 11 faßt die Ergebnisse der IFNgamma Produktion von je drei Restimulationsexperimenten zusammen, in denen F1 Mäuse mit dem B10. Hintergrund immunisiert wurden. Dabei wurden zwei Kreuzungen so gewählt, dass jeweils ein hoch und ein niedrig exprimierter H-2 Haplotyp ausgeprägt werden (bxd und bxq). Die dritte Kreuzung trägt zwei niedrig exprimierte Haplotypen (dxq). Bei den durch das auf Makrophagen hoch exprimierte I-Ab Molekül restringierten T-Zellen produzierten im Mittel zwischen 4 und 4.5% der T-Zellen IFNgamma, wohingegen es bei den durch die auf Makrophagen niedrig exprimierten I-Ad und I-Aq restringierten T-Zellen im Mittel nur 1.8 - 3% waren. Die IFNgamma Antworten der I-Ad und I-Aq restringierten T-Zellen aus den F1 Mäusen mit zwei auf Makrophagen nur niedrig exprimierten H-2 Haplotypen brachten im Mittel nur 2.2 bzw. 2% IFNgamma+ Zellen hervor (Abb. 11).


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Abb. 11 IFNgamma Produktion von in vitro restimulierten B10. T-Zellen. Die jeweilige Restriktion der T-Zellen sowie das von den interagierenden Knochenmark-Makrophagen (KM-Mphi-gr) exprimierte MHC II Molekül sind angegeben. Jedes Balkendiagramm faßt die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten zusammen, in denen jeweils 3-5 Mäuse mit KLH in Adjuvans immunisiert worden sind. Die Balken repräsentieren die jeweiligen Mittelwerte mit Standardabweichungen. Der experimentelle Ansatz erfolgte wie in Abb. 9 beschrieben.

3.1.3.2 Eine niedrige MHC II Expression auf Makrophagen begünstigt eine Typ 2 Antwort

Die IL-4 Produktion von in vitro restimulierten T-Zellen wurde an Mäusen mit dem BALB Hintergrund ebenfalls intrazellulär im Durchflußzytometer bestimmt. Dazu wurden Mäuse der Kreuzung BALB/b x BALB/c immunisiert und am Tag 7 wurden - wie in Abbildung 9 gezeigt - die Lymphknoten isoliert, die T-Zellen daraus isoliert und in vitro restimuliert. Abbildung 12 zeigt

Abb. 12 FACS Analyse einer intrazellulären IL-4 Färbung. Die IL-4 Färbung der Lymphozyten ist auf der Abszisse, die Anfärbung mit dem mAk gegen den sehr frühen Aktivierungsmarker CD69 auf der Ordinate gezeigt.


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exemplarisch eine FACS-Analyse, bei der 2.7% der T-Zellen, die durch das niedrig exprimierte I-Ad Molekül restringiert sind, IL-4 produzieren. Im Gegensatz dazu sind es bei den durch das hoch exprimierte I-Ab restringierten T-Zellen nur 0.4%.

In Abbildung 13 sind wieder die Ergebnisse aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten, bei denen jeweils 3-5 Mäuse immunisiert wurden, zusammengefaßt. Die IFNgamma Produktion der in vitro restimulierten T-Zellen aus BALB Mäusen werden durch die Interaktion mit Makrophagen mit hoher MHC II Dichte begünstigt und bestätigten somit die Ergebnisse der Experimente an B10. Mäusen. Bei der IL-4 Produktion, die wir in den B10. Mäusen kaum messen konnten, wurde genau das Gegenteil beobachtet, nämlich dass eine niedrige MHC II Dichte auf den Makrophagen die IL-4 Produktion fördert. Eine gemeinsame statistische Auswertung der Daten aus Abbildungen 11 und 13 ergibt einen signifikanten Unterschied (P Wert = 0.0417) zwischen der Zytokinantwort in Abhängigkeit von der MHC II Dichte auf den Makrophagen.

Abb. 13 IFNgamma und IL-4 Produktion von in vitro restimulierten BALB T-Zellen. Die jeweilige Restriktion der T-Zellen sowie das von den interagierenden Knochenmark-Makrophagen (KM-Mphi-gr) exprimierte MHC II Molekül sind angegeben. Jedes Balkendiagramm faßt die Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten zusammen, in denen jeweils 3-5 Mäuse mit KLH in Adjuvans immunisiert worden sind. Die Balken repräsentieren die jeweiligen Mittelwerte mit Standardabweichungen. Der experimentelle Ansatz erfolgte wie in Abb. 9 beschrieben.

3.2 Differentielle Expression der MHC II Gene im Menschen

Nachdem wir in der Maus die differentielle Expression von MHC II Molekülen und deren Bedeutung bei der Polarisierung von Th-Zell Zytokin-Antworten zeigen konnten, wurden unsere Analysen auf


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den Menschen ausgedehnt. Beim Menschen wollten wir zunächst an einer Berliner Kohorte den Einfluß der HLA II Gene auf die Entstehung und den Verlauf der Rheumatoiden Arthritis als Beispiel einer Autoimmunerkrankung aufzeigen.

3.2.1 Assoziation von DR4 und DR10 mit der RA bei einer Kohorte früher Patienten

Zunächst wurde bei den uns zur Verfügung stehenden RA-Patienten eine Assoziation zwischen dem HLA-DR Haplotyp und der Entstehung der Erkrankung untersucht. Die RA-Patienten gehörten zu einer Inzeptionskohorte, die die ACR (American College for Rheumatology)-Kriterien von 1988 für RA (Arnett et al., 1988) erfüllen und zu Beginn der Studie eine Krankheitsdauer von weniger als 2 Jahren hatten (Listing et al., 1997). Diese Kohorte umfaßte ursprünglich 302 Patienten und von 173 dieser Patienten konnte der HLA-DR Haplotyp bestimmt werden. Die Typisierung wurde mittels der SSO-Methode durchgeführt (Scharf et al., 1991) und alle DR4 Gene wurden zusätzlich sequenziert, um eine genaue Zuordnung zu einem Allel zu ermöglichen.

Abbildung 14 vergleicht die HLA-DRB1 Haplotypen der Patienten mit denen von 139 gesunden Kontrollen (Listing et al., im Druck). Bei dieser frühen Kohorte gab es - wie zu erwarten - eine deutliche Assoziation zwischen der RA und Genen der Subgruppe HLA-DRB1*04 und *10 (Lang et al., 1990, Weyand et al., 1995) . Eine Assoziation mit der Subgruppe *01 konnte bei diesen frühen Berliner Patienten nicht beobachtet werden.

Abb. 14 Assoziation von DR4 und RA bei einer Kohorte früher Patienten. Die gestreiften Balken zeigen anteilig, wieviele Patienten welche Allele der 10 verschiedenen HLA-DRB1 Subgruppen (DRB1*01-*10) tragen. Die weißen Balken repräsentieren die Kontrollen.


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3.2.2 Assoziation von DR1 und DR4 mit einem schweren Krankheitsverlauf

Um den Einfluß der HLA-DRB Gene auf den Verlauf der Erkrankung zu ermitteln, wurden bei 139 Patienten in regelmäßigen Intervallen die Erosionen an den Händen, den Handgelenken und den Vorderfüßen als Ratingen Score bestimmt (Rau and Herborn, 1995) und anschließend mit den jeweiligen HLA-DR Haplotypen korreliert. Da der Ratingen Score für alle Patienten zu einem vergleichbaren Zeitpunkt im Verlauf der Erkrankung bestimmt wurde, kann er als Maß für die Schwere des jeweiligen Verlaufs herangezogen werden. Abbildung 15 vergleicht die Ratingen Scores mit dem jeweiligen HLA-DRB1 Haplotyp und stellt jeden Patienten gemäß der beiden vorhandenen HLA-DRB1 Allele zweimal dar. Da das Vorhandensein eines DR1-Allels - ebenso wie die DR4 Allele - für einen schwereren Verlauf zu sorgen schien, wird in Abb. 15 differenziert, ob ein bestimmtes DR Allel in Kombination mit einem DR1 oder DR4 zu dem entsprechenden Ratingen Score geführt hat. Tatsächlich hatten 63% aller DR1- (17/27) und 67% aller DR4- (41/61) positiven Patienten einen Ratingen Score von > 0. Bei allen anderen Haplotypen waren es nur 20 - 50%. Die höchsten Ratingen Scores von über 30 wurden bei zwei DR4-homozygoten Patienten und einem Patienten mit der Kombination DR4/DR5 gefunden (Abb. 15).

Abb. 15 Einfluß des HLA-DRB1 Haplotyps auf den Ratingen Score. Jeder Patient ist gemäß der beiden vorhandenen HLA-DRB1 Allele zweimal dargestellt. Alle DR1 oder DR4 Allele sowie alle anderen Allele, die mit einem DR1 oder DR4 kombiniert vorliegen, sind als schwarze Kreise gezeichnet. Alle weiteren Haplotypen sind durch leere Kreise repräsentiert.

3.2.3 Erhöhte DR4 Expression auf den B-Zellen von RA-Patienten

Der menschliche MHC II Haplotyp besteht aus drei verschiedenen Molekülen, dem HLA-DP, -DQ und dem -DR. Während auf jedem menschlichen Chromosom 6 jeweils nur ein funktionelles -DP


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und -DQ Molekül kodiert ist, gibt es für das -DR Molekül 5 verschiedene allelische Linien. Diese verschiedenen allelischen Linien tragen alle das gleiche-DRA aber ein oder zwei verschiedene funktionelle DRB Gene und führen deswegen zur Ausprägung von ein oder zwei unterschiedlichen -DR Molekülen. Im Menschen gibt es 4 verschiedene Gruppen von DRB Genen, DRB1, DRB3, DRB4 und DRB5, die auf die 5 allelischen Linien verteilt sind. Die DRB1 Gene werden in die 10 Untergruppen DR1-DR10 unterteilt und jedes Chromosom 6 trägt ein DRB1 Allel und - je nach allelische Linie - ein DRB3, DRB4, DRB5 oder kein weiteres funktionelle DRB Gen. Ein DR2 Allel wird gekoppelt mit einem DRB5 vererbt, ein DR3, DR5 oder DR6 jeweils mit einem DRB3 und ein DR4, DR7 oder DR9 jeweils mit einem DRB4. Für die DR1-, DR10- und DR8-positiven Individuen ist das DRB1 das einzige funktionelle Gen. Je nach Haplotyp exprimieren wir also zwischen ein und vier unterschiedlichen HLA-DR, ein bis zwei unterschiedlichen -DP und ein bis zwei unterschiedlichen -DQ Molekülen. Allen diesen Molekülen ist gemeinsam, dass sie die für MHC II Moleküle charakteristische Sekundärstruktur beibehalten, aber in der Peptid-bindenden Grube einen extrem hohen Polymorphismus entwickelt haben. Die letzte Veröffentlichung der Nomenklatur für HLA Moleküle listet 184 DRB1, 11 DRB3, 5 DRB4 und 12 DRB5 Allele (Bodmer et al., 1996). Aus dieser Vielfalt ist unmittelbar ableitbar, dass die Verfügbarkeit spezifischer mAk gegen einzelne Vertreter der HLA-DR Moleküle sehr begrenzt sein muß und eine Untersuchung der Expression von HLA-DRB Molekülen auf menschlichen APZ deswegen nur bedingt möglich ist.

Wir haben uns aufgrund der Verfügbarkeit von spezifischen mAk auf die Expression der mit der RA assoziierten HLA-DRB1*04 Allele und des - je nach Studie - neutralen bis protektiven HLA-DRB1*07 Allels konzentriert. Abbildung 16 zeigt schematisch die auf dem DR4 und DR7 Haplotyp

Abb. 16 Schematische Darstellung der DR4 und DR7 Genloci. Funktionelle Gene sind als grau unterlegte, Pseudogene als weiße Rechtecke und die dazugehörigen Promotoren als Pentagone gezeichnet. DRB8 besteht aus den Exonen 3-6, DRB9 besteht nur aus Exon 2 und beide Pseudogene sind ohne Promotoren. DRB7 besteht aus einem Promotor und Exon 1. Das mit dem DR7 gekoppelte DRB4 kann am 3´Ende des 1. Introns eine defekte Splice-Schnittstelle tragen (durch ** gekennzeichnet) und wird dann nicht exprimiert. Die verwendeten mAk und die Gene, deren Genprodukte sie erkennen, sind eingezeichnet.


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enthaltenen HLA-DR Gene und die mAk, die in den nachfolgend beschriebenen Experimenten benutzt wurden. L243 (Shackelford et al., 1983) und Immu357 erkennen spezifisch alle DR Moleküle, NFLD.D1 (Drover et al., 1994) erkennt alle DR4 Allele und SFR16-DR7G (Radka et al., 1984) ist spezifisch für DR7.

In Abbildung 17 ist die FACS Analyse einer Färbung von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut eines DR4 homozygoten gesunden Spenders mit mAk gegen T-Zell-, B-Zell- und Monozyten-spezifische Oberflächenmoleküle sowie gegen gesamt-DR und DR4 gezeigt. Während nur wenige T-Zellen DR Moleküle exprimieren, zeigen alle B-Zellen und alle Monozyten eine positive Färbung mit dem anti DR4 und dem anti Gesamt-DR mAk.

Abb. 17 HLA-DR Expression auf T-Zellen, B-Zellen und Monozyten aus dem peripheren Blut eines DR4 homozygoten gesunden Spenders. Die oberen drei Bilder zeigen jeweils eine Doppelfärbung mit dem mAk gegen Gesamt-DR sowie CD3, CD19 und CD14. Die unteren drei Bilder zeigen ebenfalls Doppelfärbungen, aber mit dem DR4 spezifischen mAk.

Zunächst wurde die DR4 Expression auf frischen B-Zellen, Monozyten und T-Zellen aus dem peripheren Blut von DR4 homozygoten gesunden Kontrollen und RA-Patienten analysiert. Die Patienten wurden nochmals unterteilt, je nachdem ob sie Corticosteroide einnahmen oder nicht. Die tägliche Dosis vom Prednisolon lag zwischen 2.5 und 20 mg/Tag.

Menschliche B-Zellen zeigen eine höhere DR4 Expression als die Monozyten und die T-Zellen zeigen deutlich die geringste DR4 Expression. Aufgrund der unter-schiedlichen Eigenfluoreszenz von Lymphozyten und Monozyten wurde die jeweilige Expression als Differenz der Kanalwerte zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen angegeben. Im Vergleich mit den B-Zellen von RA-Patienten unter Prednisolon-Einfluß zeigten die B-Zellen von Patienten, die keine Corticosteroide einnahmen, eine signifikant höhere DR4 Expression (Abb. 18). Für Monozyten und T-Zellen waren diese Unterschiede vernachlässigbar.


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Abb. 18 Erhöhte DR4 Expression auf den B-Zellen von RA-Patienten. Die DR4 Expression wurde auf B-Zellen, Monozyten und T-Zellen des peripheren Bluts von DR4 homozygoten gesunden Spendern (Kontrollen) und RA Patienten (RA) analysiert und wegen der unterschiedlichen Eigenfluoreszenz von Lymphozyten und Monozyten als Differenz der Kanalwerte zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen angegeben. RA (P) steht für RA-Patienten unter dem Einfluß von 2.5-20mg Prednisolon/Tag. Kontrollen sind durch graue, RA-Patienten als weiße und RA-Patienten unter Prednisolon-Einfluß als schwarze Symbole dargestellt. Die Kreise symbolisieren die Expression auf B-Zellen, Rauten die Expression auf Monozyten und Quadrate die Expression auf T-Zellen. Die Balken entsprechen den Medianen. Der P Wert für die unterschiedliche DR4 Expression auf B-Zellen von Patienten unter Prednisolon-Einfluß und auf B-Zellen von Patienten, die keine Corticosteroide einnahmen, beträgt 0.0055.

3.2.4 Differentielle Regulation der Expression von DR4 und DRB4 auf Monozyten

Die Regulation der Expression von HLA-DRB4 und DR4 Genen wurde an mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut dreier DR4 homozygoter Spender untersucht. Dafür wurden die Zellen für zwei Tage in vitro mit PMA und LPS stimuliert und die DR4 sowie die Gesamt-DR Expression auf B-Zellen und auf Monozyten analysiert (Abb. 19). Aus der gesamt-DR Expression abzüglich der DR4 Expression ergeben sich dann Rückschlüsse auf die DRB4 Expression (s. auch Abb. 16). Beide, die DR4 und die gesamt-DR Expression waren auf B-Zellen stärker als auf den Monozyten. Die Stimulation mit PMA und LPS hatte auf die gesamt-DR Expression auf B-Zellen und auf die DR4 Expression auf B-Zellen und auf Monozyten kaum einen Einfluß. Bemerkenswert war ein 4-6facher Anstieg in der Expression von gesamt-DR auf den Monozyten der drei Spender, der die differentielle Regulation der Expression von DR4 und DRB4 zeigt.


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Abb. 19 Differentielle Regulation von DRB4 und DR4 auf Monozyten. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts dreier DR4 homozygoter gesunder Spender wurden für 2 Tage mit PMA und LPS stimuliert. Die Kinetik der DR4 und der DRB4 Expression auf B-Zellen und Monozyten wurde in Doppelfärbungen mit mAk gegen DR4 und Gesamt-DR sowie gegen CD19 und CD14 gemesssen und als Differenz der Kanalwerte zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen dargestellt. Die Expression auf B-Zellen ist durch Kreise, die Expression auf Monozyten durch Rauten symbolisiert.

3.2.5 Differentielle gesamt-DR Expression DR4 und DR7 homozygoter B-Zellen

Um die Anzahl der verschiedenen HLA DR Molekülen auf menschlichen APZ zu quantifizieren, wurden frische B-Zellen und Monozyten aus dem peripheren Blut von 6 DR4 und 3 DR7 homozygoten Kontrollspendern analysiert. Über Doppelfärbungen mit CD14 bzw. CD19 spezifischen mAk wurden die gesamten DR Moleküle sowie die DR4 oder DR7 Moleküle auf B-Zellen und Monozyten bestimmt. Die Menge aller DR Moleküle schwankte auf den DR4 homozygoten B-Zellen zwischen 32.000 und 98.000 Molekülen/Zelle und war damit im Median 3.3x höher als auf den DR7 homozygoten B-Zellen, wo die Werte zwischen 18.600 und 23.800 variierten (Abb. 20). Diese Unterschiede sind signifikant (P = 0.0173). Bei den Monozyten schwankt die Anzahl der gesamt-DR Moleküle zwischen 6.200 und 18.600 bei den DR4 positiven Spendern und ist damit 4,9x niedriger als auf den B-Zellen. Auf den DR7 homozygoten Monozyten habe wir zwischen 5.000 und 17.800 gesamt-DR Moleküle/Zelle gemessen und das entspricht im Median 2,6x weniger als auf den B-Zellen.

Wider unsere Erwartung waren die Unterschiede in der gesamt-DR Expression auf den B-Zellen


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nicht auf die unterschiedliche Expression von DR4 und DR7 zurückzuführen. In Abbildung 20 ist im mittleren Feld die DRB1 Expression dargestellt: Die B-Zellen tragen zwischen 6.600 und 20.700 DR7 und zwischen 2.200 und 6.700 DR4 Moleküle auf der Oberfläche. Bei den Monozyten sind es zwischen 900 und 7.400 DR7 und zwischen 1.600 und 4.000 DR4 Moleküle. Keiner dieser Unterschiede ist signifikant.

Sehr signifikant hingegen ist der Unterschied in der DRB4 Expression auf B-Zellen, je nachdem ob das DRB4 mit einem DR4 oder einem DR7 gekoppelt ist. Da uns kein spezifischer anti-DRB4 mAk zur Verfügung stand, haben wir die DRB4 Expression über die gesamt-DR abzüglich der DRB1 Expression errechnet. Auf den DR4 homozygoten B-Zellen wurden zwischen 40.700 und 94.300 und auf den DR7 homozygoten B-Zellen wurden zwischen 3.065 und 14.800 DRB4 Moleküle bestimmt. Auf den DR4 homozygoten Monozyten waren es zwischen 4.000 und 17.000 und auf den DR7 homozygoten Monozyten zwischen 4.000 und 10.300 (Abb. 20). Zusätzlich tragen zwei der DR7 homozygoten Spender auf je einem Allel die DRB4 Splice-Variante (Sutton et al., 1989), so dass die DRB4 Expression ausschließlich von dem zweiten Allel stammen kann.

Durch den Vergleich der Mediane wird nicht nur die unterschiedliche Menge an DR Molekülen auf den B-Zellen DR4 und DR7 homozygoter Spender deutlich, sondern auch die unterschiedliche Zusammensetzung: Auf den DR7 positiven B-Zellen gibt es etwa 1,5x mehr DRB4 als DR7 Moleküle, wohingegen die DRB4 Moleküle auf den DR4 positiven B-Zellen 26x häufiger exprimiert werden (Abb. 20).

Abb. 20 Differentielle gesamt-DR Expression bei B-Zellen und Monozyten DR4 und DR7 homozygoter Spender. Signifikante Unterschiede in der DRB4 Expression (s. auch Abb.16) führen zu einem unterschiedlichen Anteil von DR4 bzw. DR7 an der gesamt-DR Expression. Die jeweilige Menge der DR Moleküle ist in Antikörperbindungs-Kapazität gemessen, die weißen Kreise repräsentieren die Werte für die DR4 homozygoten und die schwarzen Kreise für die DR7 homozygoten B-Zellen und Monozyten.


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3.2.6 Unterschiedliche Kopplung verschiedener DRB4-Promotoren mit DR4 und DR7

Um herauszufinden, ob die unterschiedliche Oberflächenexpression der DRB4 Moleküle auf den B-Zellen DR4 und DR7 homozygoter Spender auf einer unterschiedlichen Transkriptionsrate beruht, haben wir von DR4 und DR7 positiven Spendern die jeweiligen DRB4 Promotoren sequenziert und miteinander verglichen. Hauptsächlich haben wir dabei 3 verschiedene Sequenzen identifiziert, nämlich die in der Literatur bereits als DRB5, DRB(DR102) und DRBsDR53 bezeichneten Promotoren (Louis et al., 1994). Wir haben bei insgesamt 16 DNA Proben von DR4 bzw. DR7 positiven Spendern keine als DRB4 bezeichnete Promotorsequenz gefunden.


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3.3 Immun-Deviation im drei-Zelltyp-Cluster

Autoimmunerkrankungen wie die Rheumatoide Arthritis und ihr Mausmodell der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) sind durch ein Ungleichgewicht zwischen den Typ 1 und den Typ 2 Effektor Th-Zellen charakterisiert und von diesem Ungleichgewicht nimmt man an, dass es bei der Entstehung der Erkrankung oder für deren Verlauf von Bedeutung ist (Müller et al. 1998). Während ich mich in den ersten beiden Kapiteln mit der differentiellen Expression der MHC II Gene und deren möglichem Einfluß auf die Entstehung eines Ungleichgewichts zwischen diesen regulatorischen Effektor Th-Zellen und damit auf die Entstehung einer Erkrankung beschäftige, dreht sich das letzte Kapitel darum, wie man ein bereits bestehendes Ungleichgewicht beeinflussen könnte, um den Verlauf der Erkrankung abzuschwächen oder gar aufzuhalten.

Abb. 21 Schema des experimentellen Ansatzes zur Untersuchung der T-Zell-Kommunikation im drei-Zelltyp-Cluster. Bei der gekoppelten Antigen-Präsentation ist die DZ mit den beiden Antigenen Cytochrom C (CytC) und Ovalbumin (OVA) beladen, so dass die bereits polarisierte, regulatorische Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zelle über die DZ mit der naiven Th-Zelle in Kontakt treten kann. Bei der nicht-gekoppelten Antigen-Präsentation sind die DZ entweder mit CytC oder mit OVA beladen, so dass die bereits polarisierten Effektor Th-Zellen keinen direkten zellulären Kontakt mit den naiven Th-Zelle haben.


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Die Voraussetzung für eine gezielte Manipulation der Zytokin-Produktion von Th-Zellen ist ein Verständnis darüber, wie T-Zellen überhaupt zur Zytokin-Produktion angeregt werden und das haben wir untersucht. Unser experimenteller Ansatz beinhaltet bereits polarisierte Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellen als Regulatoren, die die Zytokinproduktion naiver Th-Zellen beeinflußen und damit die Polarisierung einleiten sollen. Für beide, die regulatorischen und die naiven Th-Zellen wird das Signal, Zytokine zu produzieren, durch eine Antigen-spezifische Stimulation ausgelöst, so dass unser System zusätzlich dendritische Zellen (DZ) als APZ enthält. Unser Hauptinteresse galt der Frage, ob die regulatorischen Typ 1 und Typ 2 Effektor Th-Zellen den direkten zellulären Kontakt mit der naiven Th-Zelle über die DZ benötigen, um ihren Einfluß auf die naiven Th-Zellen geltend zu machen, oder ob lösliche Faktoren wie Zytokine ausreichen, um die Polarisierung der naiven Th-Zellen zu induzieren. Wir haben deshalb die nicht-gekoppelte Antigenpräsentation mit der gekoppelten verglichen (Abb. 21) und als Maß für eine effektive Kommunikation zwischen den beteiligten Th-Zellen die Zytokinproduktion der naiven Th-Zellen nach dem ersten Antigen-spezifischen Kontakt mit DZ in Gegenwart bereits polarisierter Th-Zellen gemessen.

3.3.1 Das experimentelle System des drei-Zelltyp-Clusters

Um die regulatorischen Effektor Th-Zellen von den naiven Th-Zellen mit der Hilfe klonotypischer mAk unterscheiden zu können, haben wir mit zwei unterschiedlichen T-Zellrezeptor (TZR) transgenen Mausstämmen gearbeitet. Die regulatorischen Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellen werden in unserem System aus 5CC7-Mäusen generiert. Diese Mäuse tragen einen Tauben-Cytochrom C (CytC)-spezifischen TZR, der das CytC-Peptid 88-104 im Zusammenhang mit dem I-Ek Molekül erkennt (Seder et al., 1992). Die naiven Th-Zellen stammen aus dem zweiten TZR- transgenen Mausstamm DO11.10, dessen T-Zellen das Hühnerei-Albuminpeptid 323-339 (OVA) erkennen, wenn es im Zusammenhang mit einem I-Ad Molekül präsentiert wird (Murphy et al., 1990). Damit Alloreaktionen in vitro weitestgehend ausgeschlossen werden und die DZ beide Antigene präsentieren können, haben wir sie aus dem Knochenmark von F1-Mäusen (B10.A x BALB/c), die eine Kreuzung der beiden Hintergrundstämme der TZR-transgenen Mäuse sind und damit sowohl das I-Ek als auch das I-Ad Molekül tragen, generiert.

Die DZ wurden in vitro nach einem veränderten Protokoll von Inaba et al. kultiviert, wobei Knochenmark-Vorläuferzellen in Gegenwart von GM-CSF für 6 Tage kultiviert, mit Antigen beladen und dann mit rTNFalpha zur terminalen Differenzierung angeregt wurden (Inaba et al., 1992). Am Tag 7 sind etwa 30% der Zellen dieser Kulturen CD11c+/MHC II+ DZ. Die naiven OVA-spezifischen Th-Zellen wurden jeweils frisch als CD62L+/CD4+ Fraktion aus den Lymphknoten und den Milzen von DO11.10 Mäusen isoliert. Für die Generierung von Th-Effektorzell-Linien werden naive CD4+ Th-Zellen aus den Lymphknoten und Milzen von 5CC7-Mäusen isoliert, in vitro in Gegenwart von APZ, Antigen und - für die Generierung von Typ 1 Effektor Th-Zellen - IL-12 und anti-IL-4 mAk oder - für die Generierung von Typ 2 Effektor Th-Zellen - IL-4, anti-IFNgamma und anti-IL-12 mAk stimuliert und mindestens 2-mal im Abstand von nicht weniger als 14 Tagen restimuliert (Schuhbauer et al., 2000). Abbildung 22 zeigt exemplarisch die IFNgamma und IL-4 Produktion je einer Typ 1 und einer Typ 2 Effektor Th-Zellinie, wie sie für die nachfolgenden Experimente verwendet wurden. Etwa 96% der Typ 1 Effektor Th-Zellen produzierten IFNgamma und kein IL-4 und in 81% der Typ 2 Effektor Th-Zellen konnten wir IL-4 und kein IFNgamma nachweisen.


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Abb. 22 FACS-Analyse einer intrazellulären Zytokinfärbung von CytC-spezifischen Typ 1 und Typ 2 Effektor Th-Zellen. Für die Generierung dieser Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellinien werden naive CD4+ Th-Zellen aus den 5CC7-Mäusen isoliert, in vitro in Gegenwart von APZ, 1µM Antigen und entweder 10ng/ml IL-12 und 10µg/ml anti-IL-4 mAk oder 30ng/ml IL-4, 10µg/ml anti-IFNgamma mAk und 10µg/ml anti-IL-12 mAk stimuliert und mehrmals im Abstand von mindestens 14 Tagen restimuliert. Die Analyse zeigt die IFNgamma bzw. IL-4 Produktion einer Typ 1 und einer Typ 2 Linie nach 3-maliger Stimulation. Die Prozentzahlen der CD4+ Zytokin-produzierenden Th-Zellen sind in den jeweiligen Quadranten angegeben.

Um den Einfluß der regulatorischen CytC-spezifischen Effektor Th-Zellen auf die naiven OVA-spezifischen Th-Zellen zu messen, wurden drei-Zelltyp-Cluster angesetzt. Diese Cluster bestehen jeweils aus den regulatorischen Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellen, naiven Th-Zellen und DZ. Bei der gekoppelten Antigen-Präsentation werden die DZ gleichzeitig mit OVA und CytC, bei der nicht-gekoppelten mit nur OVA oder CytC beladen (s.Abb. 21). Nach 5-7 Tagen Cluster-Kultur werden die OVA-spezifischen Th-Zellen mit APZ aus der Milz von BALB/c Mäusen und OVA restimuliert und anschließend die intrazelluläre IFNgamma und IL-4 Produktion der klonotypischen CD4+ Th-Zellen gemessen. Die Abbildungen 23a und b zeigen jeweils das Beispiel einer FACS- Analyse eines Typ 1 und eines Typ 2 Clusters. In Gegenwart regulatorischer Typ 1 Effektor Th-Zellen werden die OVA-spezifischen Th-Zellen überwiegend zur IFNgamma und nicht zur IL-4 Produktion angeregt. Die Situation ist im Typ 2 Cluster genau umgekehrt, hier werden die OVA-spezifischen Th-Zellen überwiegend zu IL-4 produzierenden Typ 2 Th- Effektorzellen polarisiert (Abb. 23). In Abwesenheit von regulatorischen Effektor Th-Zellen und polarisierenden Zytokinen (negative Kontrolle) produzieren die OVA- spezifischen Th-Zellen nur wenig IFNgamma (zwischen 1.5 und 6.3%) und IL-4 (zwischen 0.1 und 0.7%). In Gegenwart von 10ng/ml rekombinantem IL-12 oder 30ng/ml IL-4 (positive Kontrollen) produzierten 21.4% der OVA-spezifischen Th-Zellen IFNgamma und nur 0.3% IL-4 (Abb. 23 a) bzw. 15.4% IL-4 und nur 1.8% IFNgamma (Abb. 23 b).


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Abb. 23 Zytokinproduktion der OVA-spezifischen Th-Zellen im Typ 1 (a) und Typ 2 (b) Cluster. Nach 5-7 Tagen Kultur im drei-Zelltyp-Cluster wurden die OVA-spezifischen Th-Zellen mit BALB/c-APZ und 1µM OVA für 6 Stunden in Gegenwart von Brefeldin A restimuliert, bevor ihre intrazelluläre IFNgamma und IL-4 Produktion im FACS analysiert wurde. A) FSC/SSC-Diagramm mit eingekreisten Lymphozyten (oben) und Darstellung der klonotypischen CD4+ Zellen unten. B) Vergleich der Zytokinproduktion im Cluster mit nicht-gekoppelter (oben) und gekoppelter Antigen-Präsentation (unten). C) Zytokinproduktion der negativen Kontrolle (oben) mit F1-DZ und naiven OVA-spezifischen Th-Zellen und der positiven Kontrolle (unten) mit F1-DZ, naiven OVA-spezifischen Th-Zellen und entweder rIL-12 in (a) oder rIL-4 in (b). Die Prozentzahlen der positiv gefärbten Zellen sind für jeden Quadranten angegeben.


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3.3.2 Für eine effektive Polarisierung der naiven Th-Zellen wird die gekoppelte Antigen-Präsentation benötigt

In drei-Zelltyp-Clustern mit regulatorischen Effektor Th-Zellen werden die OVA-spezifischen Th-Zellen dann am effektivsten polarisiert, wenn die beiden Antigene CytC und OVA gekoppelt präsentiert werden. Dadurch wird über die DZ ein zellulärer Kontakt zwischen regulatorischen und naiven Th-Zellen bewirkt und eine enge räumliche Nähe hergestellt. Abbildung 24 faßt die Ergebnisse aus 8 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten zusammen und vergleicht die unterschiedliche Zytokin Produktion der negativen Kontrollen mit denen der gekoppelten und nicht-gekoppelten Antigen-Präsentation im Typ 1 und Typ 2 Cluster. Für das drei-Zelltyp-Cluster mit Typ 1 regulatorischen Effektor Th-Zellen lag der Anteil der IFNgamma produzierenden OVA-spezifischen Th-Zellen bei der nagativen Kontrolle im Mittel bei 4.8±0.7%, bei der nicht-gekoppelten Antigen-Präsentation bei 6.9±0.8% und bei der gekoppelten Antigen-Präsentation bei 9.6±0.9%. Für das drei-Zelltyp-Cluster mit regulatorischen Effektor Th-Zellen des Typs 2 wurde der Anteil der IL-4 produzierenden OVA-spezifischen Th-Zellen gemessen, der bei der nagativen Kontrolle im Mittel bei 1.4±0.4%, bei der nicht-gekoppelten Antigen-Präsentation bei 4.7±0.5% und bei der gekoppelten Antigen-Präsentation bei 8.6±0.9% lag. Diese Unterschiede sind nach Durchführung des Studenten T-Tests für die Typ 1 Cluster statistisch sehr signifikant (P=0.0027) und für die Typ 2 Cluster statistisch extrem signifikant (P<0.0001) und deuten daraufhin, dass eine enge räumliche Nähe zwischen naiven und regulatorischen Th-Zellen, wie sie nur bei gekoppleter Antigen-Präsentation entstehen kann, für die Polarisierung von naiven Th-Zellen wichtig ist.

Abb. 24 Eine effektive Polarisierung der naiven OVA-spezifischen Th-Zellen im drei-Zelltyp-Cluster erfordert den direkten zellulären Kontakt über die DZ mit den regulatorischen Effektor Th-Zellen. Die Balken repräsentieren die Mittelwerte und Standardabweichungen der intrazellulären Zytokinproduktion von 8 unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (vgl. auch mit Abb. 23). Die Sternchen deuten die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen negativen Kontrollen und Ansätzen mit nicht-gekoppelter und gekoppelter Antigen-Präsentation an.


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3.3.3 Polarisierte Typ 1 Th-Zellen induzieren die IL-12 Produktion der DZ am effektivsten

Um die Rolle der DZ bei der Polarisierung der naiven OVA-spezifischen Th-Zellen näher zu untersuchen, wurde die IL-12 Produktion der DZ als Antwort auf verschiedene Stimuli analysiert. Dazu wurden DZ alleine, mit naiven OVA-spezifischen oder mit naiven OVA-spezifischen und Typ 1 regulatorischen Effektor Th-Zellen bei gekoppelter sowie bei nicht-gekoppelter Antigen-Präsentation inkubiert und die Kinetik der IL-12 Produktion durch intrazelluläre Anfärbung der DZ mit einem mAk, der die konstitutiv exprimierte p40 Untereinheit und den p70 Heterodimer erkennt, gemessen. Abbildung 25 zeigt exemplarisch eine solche Kinetik. Ohne zusätzlichen Stimulus produzierten die DZ so gut wie kein IL-12 und als Folge der Inkubation mit naiven OVA-spezifischen Th-Zellen ließen sich in dem in Abb. 25 dargestellten Experiment 1.7% IL-12+ Zellen nachweisen, die ihre maximale Produktion nach 8 Stunden erreichten (Abb. 25). Typ 1 regulatorische Effektor Th-Zellen induzierten schon nach 6 Stunden bei gekoppelter Antigen-Präsentation 16.6% und bei nicht-gekoppelter Antigen-Präsentation 12.6% IL-12 produzierende DZ. Der Unterschied in der IL-12 Produktion der DZ zwischen gekoppelter und nicht-gekoppelter Antigen-Präsentation liegt vermutlich an einem experimentellen Detail, da bei der gekoppelten Antigen-Präsentation alle mit Antigen beladenen DZ mit den polarisierten Typ 1 Effektor Th-Zellen interagieren können, wohingegen bei der nicht-gekoppelten Antigen-Präsentation nur die Hälfte der DZ mit CytC beladen ist und deswegen auch nur die Hälfte mit den Typ 1 Th-Zellen in Kontakt treten kann. Aus Abbildung 25 geht hervor, dass polarisierte Typ 1 Effektor Th-Zellen bei den DZ die IL-12 Produktion schneller und effektiver induzieren als naive Th-Zellen.

Abb. 25 Kinetik der IL-12 Produktion von DZ im Typ 1 Cluster. DZ wurden entweder alleine (schwarze Kreise) oder mit naiven OVA-spezifischen (weiße Kreise) oder mit naiven OVA-spezifischen und Typ 1 regulatorischen Effektor Th-Zellen bei gekoppelter (schwarze Quadrate) sowie bei nicht-gekoppelter Antigen-Präsentation (weiße Quadrate) inkubiert. Jeweils 4 Stunden vor den angegebenen Zeitpunkten wurden die Kulturen mit Brefeldin A versetzt und zu den angegebenen Zeitpunkten mit PFA fixiert. Die IL-12 Produktion der CD11b+ DZ wurde intrazellulär im Durchflußzytometer bestimmt.


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Um zu erklären, warum polarisierte Effektor Th-Zellen die IL-12 Produktion der DZ stärker induzieren können als die naiven OVA-spezifischen Th-Zellen, sollte untersucht werden, welche Rolle das CD40 Molekül bei der Induktion der IL-12 Produktion der DZ spielt. Dazu wurden DZ wieder alleine, mit einem stimulierenden anti-CD40 mAk, mit naiven OVA-spezifischen oder mit naiven und regulatorischen Typ 1 Effektor Th-Zellen bei gekoppelter Antigen-Präsentation inkubiert und nach 6 Stunden die intrazelluläre IL-12 Produktion der CD11b+ DZ gemessen. Ohne zusätzliche Stimulation produzierten nur 5.5% der CD11b+ DZ IL-12, die Inkubation mit dem anti-CD40 mAk bedingte 13.1% und mit naiven OVA-spezifischen Th-Zellen 19.6% IL-12 produzierende DZ. Die Inkubation mit naiven und Typ 1 Effektor Th-Zellen bei gekoppelter Antigen-Präsentation induzierte bei 50.9% der DZ die stärkste IL-12 Produktion (Abb. 26) und deutet auf eine untergeordnete Rolle des CD40 Molekül bei der Induktion der IL-12 Expression. Der Vergleich der Abbildungen 25 und 26 verdeutlicht die von Experiment zu Experiment recht unterschiedliche Fähigkeit der DZ, IL-12 zu produzieren.

Abb. 26 Die Stimulation über CD40 spielt bei der Induktion der IL-12 Expression in DZ eine untergeordnete Rolle. DZ wurden entweder alleine (oben links), mit 10µgml anti CD40 mAk (oben rechts), mit naiven OVA-spezifischen Th-Zellen (unten links) oder mit naiven und regulatorischen Typ 1 Effektor Th-Zellen bei gekoppelter Antigen-Präsentation (unten rechts) inkubiert und nach 6 Stunden die intrazelluläre IL-12 Produktion der DZ gemessen. Die jeweiligen Prozentzahlen der CD11b+ DZ sind angegeben. Die CD11b- Zellen im unteren rechten Fenster der Abbildung sind Typ 1 Effektor Th-Zellen, die aufgrund des gleichen FSC/SSC Verhaltens wie DZ nicht ausgeblendet werden können.


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3.3.4 Bei der Polarisierung von naiven Th zu Typ 1 Effektor Th-Zellen werden IFNgamma und IL-12 nacheinander benötigt

Über die Blockierung von IFNgamma oder IL-12 im Typ 1 Cluster wollten wir eine mögliche Hierarchie unter den Zytokinen, die für eine Typ 1 Polarisierung benötigt werden, untersuchen. In einer ersten Näherung wurden Typ 1 Cluster bei gekoppelter Antigen-Präsentation mit entweder 20µg/ml anti-IFNgamma oder 20µg/ml anti-IL-12 mAk angesetzt. Entgegen unserer Erwartung reduzierten beide mAk etwa gleich stark die Polarisierung der OVA-spezifischen Th-Zellen: Im Vergleich zu Cluster-Ansätzen ohne blockierende mAk reduzierte der anti-IFNgamma mAk die IFNgamma produzierende OVA-spezifischen Th-Zellen auf 68 und der anti-IL-12 mAk auf 58.8% (Abb. 27). Aus diesem Ergebnis ging hervor, dass die Bedeutung von IFNgamma und IL-12 nicht hierarchisch zu betrachten ist, sondern dass ein Unterschied in der Wirkung der beiden Zytokine eher in der zeitlichen Abfolge während einer Polarisierung zu suchen ist. Um diese zeitliche Abfolge zu analysieren, wurden wieder Typ 1 Cluster bei gekoppelter Antigen-Präsentation in Gegenwart von entweder anti-IFNgamma oder anti-IL-12 mAk angesetzt. Diesmal wurden allerdings die blockierenden mAk erst nach 2, 4, 6 oder 8 Stunden nach Beginn der Cluster-Kulturen zugesetzt und die Anteile der IFNgamma produzierenen OVA-spezifischen Th-Zellen wieder im Vergleich zu unblockierten Clustern in % errechnet. Abbildung 27 verdeutlicht, dass der anti-IFNgamma mAk, wenn er zu Beginn der Cluster-Kulturen oder erst zwei Stunden später zugesetzt wird, die Polarisierung der OVA-spezifischen Zellen aug etwa 70% reduziert. Wird der mAk hingegen erst 4 Stunden oder später nach Beginn der Cluster-Kulturen zugesetzt, so zeigt er kaum mehr eine Wirkung auf die Polarisierung und räumt dem IFNgamma somit nur während der ersten 4 Stunden eine Bedeutung ein. Im Gegensatz dazu reduziert der anti-IL-12

Abb. 27 Bei der Polarisierung zu Typ 1 Th-Zellen werden IFNgamma und IL-12 nacheinander in einem engen zeitlichen Rahmen benötigt. Drei-Zelltyp-Cluster mit Typ 1 Effektor Th-Zellen und gekoppelter Antigen-Präsentation wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach Kulturbeginn mit 20µg/ml anti-IFNgamma (weiße Quadrate) oder 20µg/ml anti-IL-12 (schwarze Quadrate) versetzt oder ohne blockierenden mAk (schwarze Kreise) kultiviert. Nach der Restimulation der gesamten Clusteransätze wurden die IFNgamma Produzenten unter den OVA-spezifischen Th-Zellen in Bezug auf die Kontrolle ohne blockierenden mAk normalisiert. Die negative Kontrolle besteht aus naiven OVA-spezifischen Th-Zellen und DZ (weiße Kreise). Die Werte stellen die Mittelwerte und Standardabweichungen von zwischen 3 und 5 Experimenten.


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mAk die Polarisierung der OVA-spezifischen Zellen auf etwa 60%, wenn er zu Beginn oder während der ersten 8 Stunden nach Beginn der Cluster-Kulturen zugesetzt wird. Wir haben diese Blockierungsexperimente dahingehend gedeutet, dass IFNgamma in den ersten 2-4 Stunden der Polarisierung wichtig ist, wohingegen IL-12 über einen längeren Zeitraum, nämlich mindestens 8 Stunden, benötigt wird (Abb. 27).

3.3.5 Übertragung der Arthritis durch adoptiven Transfer von Milz-Zellen aus CIA Tieren in SCID Mäuse

Abschließend sollte unser experimentelles drei-Zelltyp-Cluster dazu benutzen werden, am Mausmodell der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Kadowaki et al. haben bereits 1994 beschrieben, dass die CIA durch CD4+ Th-Zellen von einem erkrankten Tier auf SCID-Mäuse übertragen werden kann (Kadowaki et al., 1994). Dieses Modellsystem haben wir benuzt, um zunächst die Arthritis auszulösen, um sie dann durch regulatorische Effektor Th-Zellen abzuschwächen. Im Transfer werden die T-Zellen mit bovinem Kollagen Typ II restimuliert, und dieses Kollagen kann entweder in löslicher Form oder auf dendritischen Zellen präsentiert werden (Abb. 21). In unseren Experimenten löste die Restimulation der CIA-Th-Zellen durch Kollagen-beladene DZ einen höheren Arthritis-Index aus als die Restimulation mit löslichem Kollagen. Bei den negativ-Kontrollen lag der Median der Arthritis-Indices bei 3, bei den Mäusen, die mit löslichem Kollagen im Transfer stimuliert wurden, lag er bei 5.5 und bei den Mäusen, die mit Kollagen-beladenen DZ stimuliert wurden, lag der Median der Arthritis-Indices bei 6 (Abb. 28).

Abb. 28 Übertragung der Arthritis durch adoptiven Transfer. 5x106 Milzzellen aus DBA/J Mäusen mit CIA wurden i.p. in SCID Mäuse transferiert, und am Tag 20 nach dem Transfer wurden die Arthritis-Indices nach Holmdahl bestimmt. Zusammen mit dem Transfer der Milzzellen erhielten die Empfängermäuse entweder mit bovinem Kollagen II (bKII) beladene DZ (weiße Quadrate), 250µg gelöstes bovines Kollagen (weiße Kreise) oder kein zusätzliches Antigen als negativ-Kontrolle (halb gefüllte Quadrate). Jedes Symbol repräsentiert den Arthritis-Index einer Empfängermaus und die Mediane für die jeweils 4 Mäuse pro experimenteller Gruppe sind als Linien gezeigt.


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3.3.6 Verhinderung der CIA durch regulatorische Typ 2 Effektor Th-Zellen im drei-Zelltyp-Cluster

Da die Arthritis auslösenden Th-Zellen als Typ 1 Effektor Th-Zellen beschrieben worden sind, wollten wir diesen entgegenwirken und den Verlauf der Arthritis mit polarisierten Typ 2 Effektor Th-Zellen abschwächen. Zu diesem Zweck wurde unser in vitro drei-Zelltyp-Cluster modifiziert: Als Typ 2 Effektor Th-Zellen wurden OVA-spezifische T-Zellinien, die zuvor in Richtung der Typ 2 Zytokinproduktion polarisiert worden waren, verwendet und mit diesen sollte die Zytokinproduktion der Kollagen Typ II-spezifischen Th-Zellen aus CIA Mäusen manipuliert werden. Die DZ werden für diese Experimente aus dem Knochenmark der F1 Generation von BALB/c und DBA/J Mäusen gewonnen.

Grundsätzlich zeichnen sich die CIA-Experimente durch eine geringe Reproduzierbarkeit aus. Obwohl für die Induktion der Arthritis mit Inzuchtstämmen gearbeitet wird, gibt es immer einen erheblichen Anteil an sogen. “non-respondern“, die überhaupt keine Arthritis entwickeln. Und bei den Mäusen, die eine Arthritis entwickeln, gibt es erhebliche Unterschiede in den Arthritis-Indices (s.Abb. 28). Auch in unseren Experimenten gab es zwischen den einzelnen Transfers große Schwankungen und wir hätten, um unsere Ergebnisse statistisch abzusichern, viele Transfers mehr mit wesentlich höheren Zahlen an Tieren durchführen müssen.

Ich möchte mit Abbildung 29 einen Transfer zeigen, bei dem durch den adoptiven Transfer von Typ 2 Effektor Th-Zellen zusätzlich zu den Milzzellen aus CIA-Mäusen die Entstehung der Arthritis deutlich verhindet werden konnte. Zum Vergleich sind in Abb. 29 die Arthritis-Entwicklung in SCID Mäusen, die ausschließlich 5x106 Milzzellen aus CIA-Mäusen und 106 mit OVA und Kollagen Typ II

Abb. 29 Verhinderung der CIA durch regulatorische Typ 2 Effektor Th-Zellen. 106 mit OVA und Kollagen Typ II beladene F1-DZ wurden zusammen mit 5x106 Milzzellen aus CIA-Mäusen (weiße Quadrate) oder 2x106 Milzzellen aus CIA-Mäusen und 2x106 OVA-spezifischen Typ 2 Effektor Th-Zellen (schwarze Kreise) i.p. in SCID-Mäuse transferiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Arthritis-Indices bestimmt. Die Mediane für die jeweils 4 Mäuse pro experimenteller Gruppe sind als Linien gekennzeichnet.


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beladene F1-DZ i.p. transferiert bekamen, und die Verhinderung der Arthritis durch den gleichzeitigen Transfer von 2x106 OVA-spezifischen Typ 2 Effektor Th-Zellen dargestellt. Man erkennt auch bei diesen Transfers, dass der Arthritis-Index großen Schwankungen unterworfen ist. Bei den Mäusen, die mit Antigen beladene DZ und CIA-Milzzellen transferiert bekamen, entwickelten sich Arthritiden mit Indices zwischen 4 und 11 (Abb. 29). Bei den Mäusen, die zusätzlich Typ 2 Effektor Th-Zellen erhielten, überschritten die Arthritis-Indices nie den Wert 4 und entsprechen damit den negativen Kontrollen aus Abbildung 28. Trotz der geringen Anzahl von jeweils nur 4 Mäusen in den beiden experimentellen Gruppen ist das Ergebnis ermutigend.


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