Müller-Hilke, Brigitte: Die differentielle Expression von MHC II-Genen als Mechanismus bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Differentielle Expression als Mechanismus, mit dem MHC II Gene für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen prädisponieren

Mit dieser Arbeit gehe ich der Frage nach, wie bestimmte MHC II Gene für eine Autoimmunerkrankung prädisponieren bzw. vor deren Entstehung schützen können und untersuche als Mechanismus die differentielle Expression (Abb. 5). Dieses Modell beinhaltet, dass das Immunsystem durch eine differentielle Expression der unter-schiedlichen Haplotypen auf den verschiedenen Antigen-präsentierenden Zellen eine stete Polarisierung erfährt, die im fortgeschrittenen Alter des betroffenen Individuums dazu führt, dass überwiegend nur noch Typ 1 oder Typ 2 Antworten erfolgen (Müller and Mitchison 97). In diesem polarisierten Milieu könnten Immunreaktionen, die unter ausgewogenen Zytokinbedingungen das auslösende Agens eliminieren und danach zum Erliegen kommen, in eine chronische Immunantwort gegen Selbst übergehen. Die Spezifität des MHC II Moleküls bei der Antigen-Präsentation spielt zwar auch eine Rolle, aber nur insofern, als das MHC II Molekül sowohl das krankheitsinduzierende Erreger-Epitop als auch ein ihm sehr ähnliches Selbst-Epitop präsentieren können muß, so dass über molekulare Mimikry die ursprünglich gegen den Erreger gerichtete Immunantwort auf Selbst umgeleitet werden kann. Dadurch, dass die regularorische Region des MHC II Moleküls über die jeweilige Expression entscheidet und die Spezifität eine untergeordnete Rolle spielt, bietet der Mechanismus der differentiellen Expression eine Erklärung sowohl für die gleichzeitige Assoziation von einem HLA-DR Molekül mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen als auch für die fehlende Assoziation anderer MHC II Allele, die ein „shared epitope“ tragen (s. Tabelle 2 und Abb. 4).

Autoimmunerkrankungen sind durch ein Ungleichgewicht zwischen den regulatorischen Typ 1 und Typ 2 Effektor Th-Zellen charakterisiert (Müller et al. 1998, Mitchison et al. im Druck) und erste Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen einer Verschiebung des Zytokin-Gleichgewichts und protektiven/immunsuppressiven MHC II Allelen gab es in der Maus im Zusammenhang mit der Antikörper-Antwort auf eine Immunisierung mit allo-HPPD: Mäuse des empfänglichen Haplotyps I-Ad reagierten innerhalb von 24 Stunden mit einer kurzen IL-4 Ausschüttung und später mit einer Antikörper-Produktion. Die Anwesenheit von nur einem protektiven/immunsuppressiven I-Ab Allel reichte aus, die Typ 2 Zytokinproduktion und die spätere Antikörper-Antwort zu unterbinden (Brunner et al., 1995). Hesse und Mitchison haben diese Beobachtungen einen Schritt weiter getragen, als sie im System der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) den Effekt eines protektiven Allels durch die Verabreichung eines anti-IL-4 mAk zum Zeitpunkt der Immunisierung mit Kollagen ersetzt haben (Hesse et al., 1996).

Ein deutlicher Hinweis auf eine differentielle Expression von MHC II Molekülen ging später aus den Arbeiten von Janitz et al. hervor, die einen einzelnen Basenpaar-Austausch in der X-Box des Promotors des I-Abetab Gens beschrieben haben, der ausschließlich in einer Makrophagen-Zellinie zu einer erhöhten Transkription führt (Janitz et al., 1997).


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4.1.1 Die Differentielle Expression der MHC II Gene auf murinen Makrophagen ist mit dem T-Zell-Zytokinprofil und protektiven/immunsuppressiven Effekten assoziiert

Ich habe in der vorliegenden Arbeit die differentielle Expression verschiedener MHC II Haplotypen auf den unterschiedlichen Antigen-präsentierenden Zellen zum ersten Mal auf Proteinebene bestimmt. Dabei habe ich sowohl mit unterschiedlichen als auch mit kongenen Mausstämmen gearbeitet und die Expression von I-Ab, I-Ad, I-Ak, I-Aq und I-Ek auf Makrophagen, B-Zellen und dendritischen Zellen quantifiziert. Die Analyse erfolgte in vivo an frisch isolierten und an in vitro aus Knochenmark-Vorläuferzellen generierten und aktivierten APZ. Die erstaunliche Beobachtung war, dass auf aktivierten Knochenmark-Makrophagen die protektiven I-Ab und I-Ek Moleküle 100-fach stärker exprimiert werden als das mit der Kollagen-induzierten Arthritis assoziierte I-Aq (s. Abb. 7 und 8). Auf B-Zellen und dendritischen Zellen haben wir diese differentielle Expression nicht gefunden. Unsere in vitro Daten konnten wir durch in vivo Ergebnisse insofern bestätigen, als die Expression des I-Ek im Lymphknoten auf Makrophagen stärker und die Expression des I-Aq auf Makrophagen schwächer war als auf B-Zellen (s. Abb. 6). Da wir unsere in vivo Daten nicht quantifiziert haben, können wir nur die durch die Färbung entstandenen mittleren Immunfluoreszenzen miteinander vergleichen, die zwar keine 100-fachen dafür aber 2- bis 3-fache Unterschiede ergaben. Eine doppelte Intensität der Immunfluoreszenz entspricht allerdings mehr als einer doppelten Anzahl an gefärbten Oberflächenmolekülen. Eine mögliche Erklärung für die geringeren Unterschiede in der in vivo verglichen mit der in vitro Expression von I-Ek und I-Aq könnte darin liegen, dass alle in vitro generierten Knochenmark-Makrophagen durch adherentes Wachstum aktiviert wurden, wohingegen in vivo nur ein kleiner Bruchteil der Makrophagen im Lymphknoten eine Aktivierung durchläuft und als Folge die MHC II Expression verstärkt.

Die auf Knochenmark-Makrophagen verstärkte MHC II Expression bewirkte bei I-Ab und I-Ek restringierten Th-Zellen in vitro eine erhöhte IFNgamma-Produktion und damit eine Entwicklung zu Typ 1 Effektor Th-Zellen (s.Abb. 11). Im Gegensatz dazu antworteten Th-Zellen aus BALB Mäusen, die durch das auf Knochenmark-Makrophagen niedrig exprimierte I-Ad Molekül restringiert sind, mit einer stärkeren IL-4 Ausschüttung als die durch das hoch exprimierte I-Ab restringierte Th-Zellen (s. Abb. 13). Wir konnten somit unser Grundmodell der differentiellen MHC II Expression experimentell bestätigen und zeigen, dass eine unterschiedlich starke Expression auf Makrophagen zu einer unterschiedliche Polarisierung der mit ihnen interagierenden Effektor Th-Zellen führt (s. Abb. 5). Unsere Beobachtung der differentiellen MHC II Expression auf Makrophagen weist auf die Bedeutung der Makrophagen als Antigen-präsentierende Zelle hin und impliziert eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung naiver T-Zellen zu Beginn einer Immunantwort, die man bisher nur den dendritischen Zellen zugedacht hat, (Santin et al., 1999; Marland et al., 1996).

Wie könnte man nun die beiden Beobachtungen, dass einerseits die Kollagen-induzierte Arthritis in der Maus eine Erkrankung mit einem in Richtung der Typ 1 Zytokine verschobenen Gleichgewicht ist und andererseits die protektiven Allele durch ihre verstärkte Expression auf Makrophagen bevorzugt zu Typ 1 Th-Effektorzell-Antworten führen in Einklang bringen? Unsere Vorstellung der Entstehung von Kollagen-induzierter Arthritis ist in Abbildung 30 schematisch dargestellt: Die Immunisierung mit Kollagen Typ II (cII) bewirkt bei Mäusen des empfänglichen Haplotyps H-2q innerhalb von 24 Stunden eine IL-4 Ausschüttung, die für die Ausbildung von hoch-affinen anti-cII Antikörpern vom IgG1 Isotyp benötigt wird. Diese IgG1 Antikörper könnten dann über


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Komplement-Fixierung den ersten Angriff auf den Gelenkknorpel vermitteln und werden erst im späteren Verlauf der Erkrankung von Typ 1 Effektor Th-Zellen abgelöst. In unserem Modell sorgt die Anwesenheit protektiver MHC II Allele überwiegend für Typ 1 Antworten und verhindert damit eine frühe IL-4 Ausschüttung und die Entstehung der Arthritis.

Abb. 30 Abfolge von Typ 2- (IL-4 Ausschüttung, Antikörperproduktion) und Typ 1-Phase in der Arthritis-Entwicklung nach Immunisierung mit Kollagen Typ II (cII) in Mäusen eines empfänglichen H-2 Haplotyps.

4.1.2 Differentielle Expression der MHC II Gene beim Menschen

Der nächste Schritt meiner Arbeit bestand darin, unsere Untersuchungen auf den Menschen auszudehnen und zunächst einmal herauszufinden, ob es auch auf menschlichen APZ eine differentielle Expression der HLA Allele gibt. Als erstes haben wir bei einer Kohorte früher RA-Patienten die HLA-DR Gene typisiert und eine Assoziation zwischen DR4 und dem Auftreten von RA - wenn auch mit niedriger Frequenz - bestätigt (Listing et al., im Druck), (Abb. 14). Bei unserer Kohorte waren 37% der RA-Patienten positiv für DR4, bei der Studie von Lang et al. waren es 58%. Die in der Literatur beschriebene Assoziation mit DR10 mit der RA (Lang et al., 1990; Weyand et al., 1995; Valenzuela et al., 1999) konnten wir zwar ebenfalls an 4% der RA-Patienten beobachten, allerdings sind die Fallzahlen von 5 DR10 positiven Patienten im Vergleich zu keiner DR10 positiven Kontrollperson zu klein, um statistische Signifikanz zu erreichen. Eine Assoziation zwischen DR1 und dem Auftreten der RA konnten wir an unserer Kohorte nicht beobachten. Beide, die schwache Assoziation von DR4 mit dem Auftreten der RA sowie die fehlende Assoziation mit DR1 führen wir auf das frühe Krankheitsstadium der Patienten und damit verbunden, deren Heterogenität, zurück. Im Gegensatz zu den Sudien von Weyand et al. oder Lang et al., die sich ausschließlich mit Patienten mit schwerem Verlauf im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung oder mit RF+ Patienten beschäftigen, umfaßt unsere Studie ein noch völlig


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heterogenes Patienten-Kollektiv, aus dem sowohl schwere und mildere Verläufe als auch Spontanremissionen hervorgehen werden. Dafür konnten wir die Assoziation von DR1 und DR4 mit einem schwereren Krankheitsverlauf beobachten, wobei 63% der DR1 und 67% der DR4 positiven RA Patienten einen Ratingen Score von > 0 zeigten (Abb. 15). Diese unterschiedlichen Assoziationen deuten unterschiedliche Wirkungen der MHC II Gene bei der Entstehung und dem Verlauf der RA an.

Die Analyse der Expression menschlicher MHC II Moleküle auf Proteinebene ist wegen des hohen Polymorphismus bei den HLA Allelen deutlich komplizierter als die entsprechende Untersuchung in der Maus. Es gibt allein über 200 verschiedene HLA-DRB Allele, bei denen sich der Polymorpismus in der kodierenden Region ausschließlich auf das Exon 2, das für die 3. hypervariable Region im Protein kodiert, beschränkt und in einzelnen Fällen auf einem einzigen Aminosäure-Austausch beruht. Aus dieser auf einen kleinen Genabschnitt beschränkten Diversität resultiert die Schwierigkeit, gegen jedes Allel einen spezifischen, monoklonalen Antikörper herzustellen, der für die Analyse der Proteinexpression nötig ist. Für unsere Arbeiten standen uns 4 verschiedene Antikörper zur Verfügung, von denen zwei sämtliche DR Moleküle, der dritte alle DR4 Moleküle und der vierte DR7 erkennt (s. Abb. 16). Damit konnten wir in homozygoten Individuen die Expression von DR4, DR7 und indirekt auch von DRB4 auf der Proteinebene analysieren und die differentielle Expression beobachten. Auf die folgenden Ergebnisse möchte ich im Einzelnen eingehen:

i) Die Expression von DR4 und DRB4 wird auf Monozyten unterschiedlich reguliert. Wir haben mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut DR4 homozygoter Spender für 2 Tage unter stimulierenden Bedingungen in Kultur genommen und sowohl auf frischen als auch auf 1 und 2 Tage stimulierten B-Zellen und Monozyten die HLA-DR Expression analysiert (Abb. 19). Während die DR4 Expression auf beiden, den B-Zellen und Monozyten, über den Zeitraum von 2 Tagen unverändert blieb, nahm die gesamt-DR Expression auf Monozyten innerhalb der ersten 24 Stunden um das 4 - 6-fache an mittlerer Fluoreszenzintensität zu. Daraus schließen wir, dass DRB4 - im Gegensatz zu DR4 - in seiner Expression stimulierbar ist und dass die DRB4 Expression auf stimulierten Monozyten mindestens 4 - 6-fach höher sein muß als die DR4 Expression, da bei der Analyse der gesamt-DR Expression ein Anstieg in der Expression des geringer exprimierten Proteins nicht auffallen würde. Physiologisch könnte es von großem Vorteil sein, zwei unterschiedliche DR-Moleküle, die zwar beide konstitutiv exprimiert werden, von denen eines aber bei Bedarf noch hochreguliert werden kann, zu tragen. Wir könnten so flexibel auf die antigene Belastung reagieren und die Antigen-präsentierende Wirkung verstärken, wenn der Erreger perisistiert. Die Tatsache, dass wir die Hochregulation der DRB4 Expression ausschließlich auf den Monozyten und nicht auf den B-Zellen beobachten konnten, weist erneut auf eine entscheidende Rolle der Monozyten bei der Antigen-Präsentation hin. Wir können an dieser Stelle keine Aussagen zur HLA-DR Expression auf menschlichen dendritischen Zellen treffen, da z.Zt. keine spezifischen monoklonalen Antikörper zur Verfügung stehen, mit denen wir unsere Analysen auf DZ hätten ausdehnen können.

ii) Die gesamt-HLA-DR Expression ist auf B-Zellen stärker als auf Monozyten. Wir haben die auf den B-Zellen und Monozyten aus peripherem Blut von DR4 und DR7 homozygoten Spendern exprimierten HLA-DR Moleküle quantifiziert und für die gesamt-DR Moleküle auf den B-


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Zellen eine 2.6 - 4.9-fach höhere Expression als auf den Monozyten festgestellt (Abb. 20). In der Maus ist die I-A bzw. I-E Expression auf den B-Zellen etwa 8-mal höher als auf den Makrophagen (s. Abb. 8) und damit liegen die Unterschiede in der MHC II Expression auf B-Zellen und Monozyten zwischen Mensch und Maus in der gleichen Größenordnung. In Anbetracht der geringeren Oberfläche von B-Zellen im Vergleich zu Monozyten muß die Dichte an MHC II Molekülen auf den B-Zellen erheblich größer sein, so dass die diskutierte Unfähigkeit von B-Zellen, naive Th-Zellen zu aktivieren, tatsächlich in der mangelnden Expression von kostimulatorischen Molekülen zu suchen sein könnte (Croft and Swain, 1995).

iii) DR4 homozygote B-Zellen exprimieren signifikant mehr HLA-DR Moleküle als DR7 homozygote. Die Analyse der Expression aller HLA-DR Moleküle auf den Oberflächen von B-Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Spender ergab eine signifikant höhere gesamt-DR Expression auf den DR4 verglichen mit den DR7 homozygoten B-Zellen. Dieser Unterschied war 3.3-fach beim Vergleich der Mediane und beruhte zu unserer Überraschung nicht auf der unterschiedlichen Expression von DR4 und DR7 (Abb. 20). Auf der Transkriptionsebene haben Louis et al. bereits ähnliche Daten beschrieben, als sie die Transkriptionsaktivitäten von DR4 und DR7 in einer B-Zellinie miteinander verglichen und maximal einen zweifachen Unterschied gezeigt haben (Louis et al., 1994). Unsere Beobachtung der unterschiedlichen gesamt-DR bei gleichbleibender DR4 und DR7 Expression deutet eine differentielle Expession der DRB4 Gene, je nachdem ob sie mit einem DR4 oder einem DR7 gekoppelt vererbten werden, an.

Um diese differentielle Expression der DRB4 Gene zu untersuchen und möglicherweise auch mit der Entstehung einer Autoimmunerkrankung zu assoziieren, haben wir aus verschiedenen DR4 oder DR7 positiven gesunden Spendern und RA-Patienten die DRB4 Promotoren sequenziert und miteinander verglichen. Tatsächlich fanden wir unterschiedliche und hauptsächlich die in der Literatur bereits als DRB5, DRB(DR102) und DRBs(DR53) genannten Promotoren (Louis et al., 1993). Hier wollen wirin nächster Zukunft zwei verschiedene Ziele verfolgen: Erstens möchten wir herausfinden, ob ein DR4 Allel mit einem anderen DRB4 Promotor gekoppelt ist als ein DR7 oder ein DR9. Und zweitens möchten wir von den verschiedenen DRB4 Promotoren die Transkriptionsaktivität bestimmen, um dann eine bestimmte Expression mit dem Auftreten der RA und ggf. einem milden oder schwereren Krankheitsverlauf zu korrelieren. In B-Zellinien wurde die Transkriptionsaktivität einzelner DRB Gene bereits ermittelt und dabei wurde für das DRB4 Gen eine etwa 5-fach höhere Transkription als für das DRB5 beschrieben, wobei es zur Transkriptionsaktivität des DRBs(DR53) Promotors noch keine Daten gibt (Louis et al., 1994). Wir konnten bei den von uns sequenzierten Promotor-Sequenzen keine der als DRB4 bezeichneten Sequenzen erkennen und leiten daraus sowohl eine Diversität bei den Promotoren der mit DR4 oder DR7 gekoppelten DRB4 Genen als auch die Schwierigkeit, die an PCR-Produkten sequenzierten Promotoren den entsprechenden Strukturgenen zuzuordnen, ab. (Louis et al., 1993).

iv) DR4 wird auf den B-Zellen homozygoter RA Patienten erhöht exprimiert und durch die Behandlung mit Prednisolon signifikant herabgesänkt. Wir haben die DR4 und gesamt-DR Expression auf den B-Zellen von homozygoten gesunden Kontrollen und RA-Patienten mit und ohne Prednisolon-Behandlung analysiert und die mittleren Fluoreszenzintensitäten miteinander verglichen. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression des DR4 bei den RA-Patienten, die durch


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die tägliche Einnahme von 2.5 - 20mg/Tag signifikant herabgesetzt wurde (Abb. 18 und Czerwony et al., 1999). Interessant war, dass Prednisolon auf die gesamt-DR Expression und damit auf die Expression des DRB4 kaum einen Einfluß zeigte und somit der entzündungshemmende Effekt über das DR4 Molekül vermittelt zu werden scheint.

4.1.3 Parallelen zwischen der differentiellen Expression in der Maus und beim Menschen

Wie können wir nun unsere Beobachtungen aus der Maus, wo die mit der CIA assoziierten Allele auf den Makrophagen schwächer exprimiert werden, mit den Ergebnissen beim Menschen, wo die RA-assoziierten HLA-DRB Haplotypen auf den B-Zellen verstärkt exprimiert werden, in Einklang bringen? Die Gemeinsamkeit besteht darin, dass sowohl eine abgeschwächte MHC II Expression auf Makrophagen als auch die verstärkte Expression auf B-Zellen eine Differenzierung der interagierenden Th-Zellen zu Typ 2 Effektorzellen begünstigt. Unter der Voraussetzung, dass für die Auslösung der Autoimmunreaktion im Menschen ebenfalls zuerst eine Typ 2 Antwort wichtig ist, wäre ein ähnlicher Mechanismus wie in Abb. 30 beschrieben, auch für den Menschen denkbar.

Das Neue am Modell der differentiellen Expression der MHC II Gene liegt darin, dass wir nicht nur den Polymorphismus in den kodierenden Regionen der Gene betrachten, sondern auch die vorhandenen Polymorphismen in den Promotor-Regionen mit einer funktionellen Bedeutung belegen (Mitchison et al. im Druck). Unterschiedliche Promotoren würden so durch unterschiedliche Transkriptionsaktivitäten differentielle Expressionen bewirken, wodurch der Population ein Höchstmaß an Flexibilität bei der Immunantwort auf die verschiedenen Erreger ermöglicht wird. Das hohe Maß an Diversität innerhalb der kodierenden Region der MHC II Gene deutet bereits daraufhin, dass es für das Überleben einer Art von Vorteil ist, vielfältig reagieren zu können. Die beobachteten Polymorphismen in den Promotor-Regionen deuten auf einen ähnlichen Vorteil durch differentielle Expression hin.

Die MHC II Promotoren sind zwischen Mensch und Maus so stark konserviert, dass an ihnen ursprünglich die Transkriptionsfaktor-bindenden Boxen definiert werden konnten. Diese starke Konservierung über die Evolution von der Maus zum Menschen deutet bereits an, dass diese Promotoren für eine kontrollierte und gewebespezifische Expression, die für das Überleben der jeweiligen Art wichtig ist, optimiert sind. Im Gegensatz zu den Unterschieden zwischen menschlichen und murinen MHC II Promotoren, die hauptsächlich außerhalb der S-, X- und Y-Boxen liegen, sind die bei verschiedenen Allelen der Maus auftretenden Polymorphismen genau auf diese Boxen konzentriert (Glimcher and Kara, 1992; Cowell et al., 1998). Diese innerhalb einer Art auftretenden Polymorphismen sind vermutlich nach der Trennung von Maus und Mensch eingeführt worden und deuten einen Vorteil in Form von Zugewinn an Flexibilität für die Gesamtpopulation an.

Von entscheidender Bedeutung für die Oberflächenexpression eines MHC II Proteins ist neben der Transkription und Translation die Heterodimer-Bildung. Dabei ist es möglich, dass bestimmte HLA-DR beta-Ketten besser oder schlechter mit der alpha-Kette paaren, so dass bei gleicher Transkriptions- und Translationsrate mehr von dem einen als dem anderen Heterodimer auf die Oberfläche gelangt. Da bei unseren Ergebnissen die differentielle Expression jedoch auf jeweils einen Zelltyp


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sowohl beim Menschen als auch bei der Maus beschränkt ist, schließe ich eine unterschiedliche Paarung der entsprechenden beta- und alpha-Ketten aus. Zusätzlich wurde kürzlich in der Maus auf besondere Proteasen, die Cathepsine, hingewiesen, die eine Rolle bei der Degradierung der invarianten Kette (Ii) des MHC II Moleküls und damit bei der Beladung mit Peptid bzw. Transport an die Zelloberfläche spielen. In Cathespin S-/- Mäusen des H-2b Haplotyps exprimierten B-Zellen und DZ weit mehr Ii-beladene MHC II Oberflächenmoleküle als in Mäusen des H-2q Haplotyps. Allerdings hatte das Fehlen von Cathepsin S nicht die differentielle Oberflächenexpression der betroffenen MHC II Moleküle zur Folge (Nakagawa et al., 1999). Ich nehme daher an, dass die beobachtete differentielle Expression der MHC II Gene eher auf einer unterschiedlichen Transkription beruht und dass die jeweiligen Promotoren direkt für diese Unterschiede verantwortlich sind.

4.2 Immun-Deviation im drei-Zelltyp-Cluster

In den ersten beiden Abschnitten der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit der differentiellen Expression der MHC II Gene beschäftigt und aufgezeigt, dass eine unterschiedliche Expression auf den verschiedenen APZ die Th-Effektorzell-Antworten polarisiert und damit die Voraussetzung für die Entstehung einer Autoimmunerkrankung schafft. In diesem letzten Abschnitt interessiert mich, wie bereits polarisierte Effektor Th-Zellen manipuliert werden können, so dass der weitere Krankheitsverlauf aufgehalten oder abgeschwächt wird. Als Alternative zu rekombinanten Zytokinen, die in vivo nur eine geringe Halbwertzeit haben und deswegen eine begrenzte therapeutische Wirkung erzielen, haben wir das drei-Zelltyp-Cluster entwickelt und sowohl in vivo am Modell der CIA als auch in vitro getestet.

Durch den adoptiven Transfer von gleichzeitig CIA-auslösenden Milzzellen, mit bovinem Kollagen Typ II (bKII) und Ovalbumin (OVA) beladenen dendritischen Zellen (DZ) sowie OVA-spezifischen Typ 2 Effektor Th-Zellen wurden die Voraussetzungen für die Generierung eines drei-Zelltyp-Clusters in vivo gebildet und die Entstehung der CIA drastisch verringert (Abb. 29). Wir haben uns für die Auslösung der Arthritis über einen adoptiven Transfer von CIA-auslösenden Milzzellen aus dem empfänglichen Mausstamm DBA/J in SCID-Mäuse entschieden, weil wir damit einen Einfluß des bei der Immunisierung benötigten Adjuvans auf die Th-Zellantworten umgehen. Allerdings müssen wir im Gegenzug grundsätzlich niedrigere Arthritis-Indices, eine „graft-vs-host“-Reaktion bei einigen Empfängermäusen sowie hohe Hintergrundwerte beim Transfer von CIA-Milzzellen ohne lösliches bKII hinnehmen und wir haben deswegen in unseren Experimenten große Schwankungen erlebt. Mit dem in Abb. 29 dargestellten Experiment zeigen wir jedoch, dass drei-Zelltyp-Cluster therapeutische Bedeutung haben könnten und es wäre denkbar, diese Therapie auf RA-Patienten auszudehnen. Voraussetzung dafür sind die in vitro Generierung von autologen Typ 2 Effektor Th-Zellen und APZ, die über die zusätzliche Beladung mit einem Antigen, das für artikulären Knorpel spezifisch ist, in die Gelenke dirigiert werden. Eine Manipulation des für die Autoimmunerkrankung charakteristischen Th-Zell-Zytokinprofils könnte für die Patienten einen nur gering invasiven Eingriff bedeuten.

Die Analyse der drei-Zelltyp-Cluster in vitro hat uns grundlegende Erkenntnisse zur T-Zellkommunikation ermöglicht, die für die Entwicklung einer effektiven Therapie wichtig sind. Aus


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Abb. 24 geht hervor, dass DZ innerhalb eines drei-Zelltyp-Clusters in der Lage sind, die Differenzierung zu Typ 1 oder zu Typ 2 Effektor Th-Zellen gleich gut zu vermitteln. Da wir die DZ einheitlich in vitro in Gegenwart von rGM-CSF aus Knochenmark-Vorläuferzellen generiert und durch die Zugabe von rTNF-alpha zur Reifung gebracht haben, sind in unserem System ausschließlich die regulatorischen Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellen für die Differenzierung der naiven Th-Zellen im Cluster verantwortlich. Damit stehen unsere Daten im Widerspruch zu bereits veröffentlichten Ergebnissen, bei denen myeloische und lymphatische DZ unterschieden werden und leztere in der Maus für die Differenzierung zu Typ 1 Effektor Th-Zellen verantwortlich gemacht wurden (Pulendran et al., 1999). Menschliche DZ können in vitro in Gegenwart von rGM-CSF und rIL-4 aus peripherem Blut generiert und für einen therapeutischen Ansatz in genügend hoher Zahl gewonnen werden (Kalinski et al., 1997). Auch im Menschen unterscheidet man DZ1 und DZ2 und man stellt sich vor, dass sie durch ihre Herkunft oder rekombinante Zytokine instruiert werden, die Differenzierung zu entweder Typ 1 oder Typ 2 Effektor Th-Zellen zu bewirken (Kalinski et al., 1997; Kalinski et al., 1998; Rissoan et al., 1999).

Aus Abb. 24 geht ebenfalls hervor, dass in Abwesenheit hoher Konzentrationen rekombinanter Zytokine eine gekoppelte Antigen-Präsentation für eine effektive Manipulation der zu beeinflussenden Th-Zellen wichtig ist. Wir gehen davon aus, dass für die Immun-Deviation in unserem drei-Zelltyp-Cluster zweierlei benötigt wird: Das sind zum einen lösliche Faktoren wie die Zytokine, welche nur über sehr kleine Entfernungen zwischen zwei direkt benachbarten Zellen wirken. Und zum anderen sind es wahrscheinlich Oberflächenmoleküle, die durch den zellulären Kontakt stimuliert werden und eine Reaktion der betroffenen Zellen hervorrufen. In Abb. 26 sehen wir, dass der Kontakt mit polarisierten Typ 1 Effektor Th-Zellen bei den DZ die stärkste IL-12 Produktion bewirkt, die weder durch den Kontakt mit naiven Th-Zellen, polarisierten Typ 2 Effektor Th-Zellen (diese Daten sind nicht gezeigt), noch über die Stimulation mit einem anti-CD40 mAk erreicht wird. Da die IL-12 Produktion - ebenso wie die Produktion aller anderen bekannten Zytokine - bereits nach 6 Stunden ihren Höhepunkt erreicht (Abb. 25) nehme ich an, dass ein für Typ 1 Effektor Th-Zellen charakteristisches Oberflächenmolekül für die Stimulierung der DZ verantwortlich ist. Somit wäre in vivo gewährleistet, dass polarisierte Typ 1 Th-Effektor-Gedächtniszellen bei erneutem Kontakt mit dem entsprechenden Antigen für eine Differenzierung der frisch rekrutierten, naiven Th-Zellen zu Typ 1 Effektor Th-Zellen sorgen und die Antwort, die sich bei einem früheren Antigenkontakt bereits bewährt hat, schnell wiederholt werden kann. Die Identifizierung und Charakterisierung eines solchen Typ 1 Th-Effektorzell-typischen Oberflächen-moleküls, das die IL-12 Produktion in DZ stimuliert, wird uns in nächster Zukunft beschäftigen und wird nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch therapeutisch von Interesse sein. Man könnte sich vorstellen, dass in einem drei-Zelltyp-Cluster die polarisierten Typ 1 Effektor Th-Zellen durch einen mAk gegen dieses Oberflächenmolekül ersetzt werden könnten, so dass die DZ auch ohne Typ 1 Effektor Th-Zellen zur maximalen IL-12 Produktion angeregt wird. Den in Abb. 27 angedeuteten, sequentiellen Bedarf von IFNgamma und IL-12 bei der Polarisierung naiver Th-Zellen zu Typ 1 Effektor Th-Zellen deuten wir wie in Abb. 31 gezeigt: Der Kontakt zwischen der bereits polarisierten Typ 1 Effektor Th-Zelle und der DZ bewirkt bei der T-Zelle die Ausschüttung von IFNgamma, welches in den ersten 4 Stunden der Polarisierung der naiven Th-Zellen benötigt wird und zweierlei induzieren könnte: Die Induktion der Expression des hoch-affinen IL-12 Rezeptors auf den naiven Th-Zellen (Guler et al., 1997; Szabo et al., 1997) und die Verstärkung der Expression


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von MHC II auf den DZ (Akbar et al., 1996). An unseren Blockierungsexperimenten mit anti-IFNgamma mAk konnten wir sehen, dass das von den Typ 1 Effektor Th-Zellen sekretierte IFNgamma auf die IL-12 Produktion der DZ keinen Einfluß hat (diese Daten sind nicht gezeigt). Das IL-12 der DZ wird in den ersten 8 Stunden der Polarisierung - aber wahrscheinlich über einen längeren Zeitraum hinweg - benötigt und leitet die molekularen Veränderungen wie Demethylierung und Remethylierung ein, die mit Zellteilungen und mit der irreversiblen Differenzierung zu polarisierten Effektor Th-Zellen einhergehen (Agarwal and Rao, 1998; Bird et al., 1998; Brown et al., 1999; Richter et al., im Druck).

Abb. 31 Sequentieller Bedarf von IFNgamma und IL-12 bei der Polarisierung naiver Th-Zellen (Tn) im drei-Zelltyp-Cluster mit dendritischen Zellen (DZ) und bereits polarisierten Typ 1 Effektor Th-Zellen (Typ 1). Die Pfeile symbolisieren, von welchen Zellen welche Zytokine ausgeschüttet werden und auf welche Zellen sie wirken.

Der sequentielle Bedarf an einerseits Th-Effektorzell- und andererseits DZ-typischen Zytokinen deutet die Möglichkeit einer „temporal bridge“, einer zeitlichen Entzerrung der Ereignisse im drei-Zelltyp-Cluster, an (Ridge et al., 1998). In vivo ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei unterschiedliche Th-Zellen gleichzeitig auf eine DZ, die für beide Th-Zellen das jeweils spezifische Peptid präsentiert, treffen, äußerst gering. Es würde aber physiologisch Sinn machen, wenn eine DZ i) am Ort der Entzündung Antigen aufnimmt, ii) von bereits vorhandenen Th-Effektor-Gedächtniszellen vorbereitet wird, die gleiche Polarisierung auf naive Th-Zellen zu übertragen und iii) in den nächsten Lymphknoten wandert, um dort naive erregerspezifische Th-Zellen zu rekrutieren und diese iv) zu Effektor Th-Zellen polarisiert. Diese „temporal bridge“ würde zwar zeitlich durch die begrenzte Lebensdauer reifer DZ limittiert, würde aber in einem größeren räumlichen Umfeld erregerspezifische Th-Zellen in eine laufende Immunantwort rekrutieren (Ridge et al., 1998).

Unser drei-Zelltyp-Cluster erlaubt uns, die Aktivierung und das Gedächtnis von DZ in vitro zu


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untersuchen, um unser Wissen später therapeutisch einzusetzen. Bei der Manipulation polarisierter Autoimmunreaktionen könnte es völlig ausreichend sein, DZ ex vivo vorzubehandeln, indem der Einfluß polarisierter Effektor Th-Zellen über mAk imittiert wird. Das mögliche Gedächtnis der DZ wird dann therapeutisch ausgenutzt und die auf eine bestimmte Polarisierung vorbereitete DZ wird mit einem für artikulären Knorpel spezifischen Antigen beladen und adoptiv in die Patienten transferiert. Der in Abb. 31 dargestellte kurze Bedarf an IFNgamma könnte leicht durch die Verabreichung von rekombinantem Zytokin nachgeahmt werden und für den langfristigen Bedarf an IL-12 - im Fall einer erwünschten Polarisierung zu Typ 1 Effektor Th-Zellen - wären die transferierten DZ zuständig.

Unser Wissen über die für eine Polarisierung zu Typ 2 Effektor Th-Zellen benötigten löslichen Faktoren und Oberflächenmoleküle ist noch viel zu gering, als dass wir Therapien entwickeln könnten. An unserem in vitro drei-Zelltyp-Cluster konnten wir sehen, dass für die Polarisierung zu Typ 2 Effektor Th-Zellen IL-4 unabdingbar ist (Schuhbauer et al., eingereicht). Möglich wäre, dass DZ deswegen Typ 2 Polarisierungen vermitteln können, weil sie von den Typ 2 Effektor Th-Zellen im drei-Zelltyp-Cluster instruiert wurden, kein IL-12 auszuschütten. Ob lösliche Faktoren oder ebenfalls Interaktionen über Oberflächenmoleküle die DZ vorbereiten, Typ 2 Polarisierungen zu vermitteln, werden wir in der nächsten Zukunft untersuchen. Möglicherweise bieten sich B-Zellen als APZ besser für eine Manipulation autoreaktiver Immunreaktionen an.

Zusammenfassend habe ich in meiner Arbeit zuerst die differentielle Expression als Mechanismus, mit dem MHC II Gene für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen prädisponieren, untersucht und gezeigt, dass sie die Polarisierung der Effektor Th-Zellen beeinflusst. Im meinem letzten Teil zeige ich eine neue Möglichkeit auf, mit der man therapeutisch auf bestehende Polarisierungen, wie sie in den von der Autoimmun-erkrankungen betroffenen Geweben charakteristisch sind, eingreifen könnte. Somit leistet meine Arbeit einen Beitrag zur Erforschung von Autoimmunerkrankungen und leitet direkt aus meinen Ergebnissen eine neue Möglichkeit zur Therapie ab.


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