2 Morphogenese und neuronale Konnektivität telencephaler Strukturen im Gesangssystem des Zebrafinken

2.1  Gibt es einen Zusammenhang zwischen der Größe von Kernregionen und dem Gesangsverhalten?

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Innerhalb der Singvögel gibt es ein breites Spektrum von Gesangsstrukturen, von einfachen bis hoch komplexen Mustern, die sich im Laufe der Evolution aufgrund sexueller Selektion im Zusammenhang mit der Verteidigung des Territoriums sowie auch beim Weibchenerwerb entwickelt haben (Catchpole, 1986). Männchen mit großem Gesangsrepertoire können Feinde effektiver abwehren, auf Weibchen attraktiver wirken und dadurch schneller zum Bruterfolg kommen als Männchen mit einem kleineren Gesangsrepertoire (King und West, 1990; Brenowitz, 1997). Einen Zusammenhang zwischen Gesangsrepertoire und der Größe von Gesangskernen wurde erstmals für den HVC und den RA beim Kanarienvogel aufgezeigt (Nottebohm et al., 1981). Einen Zusammenhang zwischen Gesangsrepertoire und dem Volumen von Gesangskernen konnte auch für zwei regional getrennte Unterarten der Sumpfzaunkönige (Cistothorus palustris) festgestellt werden (Canady et al., 1984). Ein Vergleich zwischen verschiedenen Arten unter Berücksichtigung phylogenetischer Effekte zeigte ebenso eine positive Korrelation zwischen HVC-Volumen und der Größe des Gesangsrepertoires auf (DeVoogd et al., 1993). Allerdings ist ein solcher Zusammenhang nicht immer zwingend, vielmehr können auch andere Parameter der Gesangsstruktur, wie Gesangsdauer, Häufigkeit oder Anzahl der Elemente innerhalb eines Motivs mit der Größe der Gesangskerne korrelieren. So gibt es beim Zebrafinken einen positiven Zusammenhang zwischen dem HVC-Volumen und der Anzahl der Elemente, die ein Jungtier von seinem Tutor lernen kann (Ward et al., 1998). Im allgemeinen singen bei den meisten Singvogelarten vor allem die Männchen, die Weibchen singen weniger oder garnicht und ein solch stark ausgebildeter Sexualdimorphismus auf der Verhaltensebene spiegelt sich, wie bereits erwähnt, deutlich in der Größe der Gesangskerne wider (Nottebohm und Arnold, 1976; Konishi und Akutagawa, 1985; Arnold et al., 1986). Singen dagegen Männchen und Weibchen einer Art gleich viel, wie z.B. bei einer Duettsängerart (Thryothorus nigricapillus), so unterscheiden sich deren Gesangskerne kaum in ihrer Größe (Brenowitz et al., 1985). Zahlreiche Beispiele aus der Literatur belegen einen mehr oder weniger klaren Zusammenhang zwischen Verhaltensparametern und der Größe der Gesangskerne (Ball et al., 1994).

Die Volumina der Gesangskerne HVC und RA sind bereits in der frühen Ontogenese sexualdimorph.

Die Gesangskerne HVC und RA in adulten Zebrafinkenmännchen sind um ein Vielfaches größer als bei Weibchen. Diese Größenunterschiede lassen sich bereits in den Anschnittsflächen der Kernregionen erkennen. Die Abbildung 4 zeigt exemplarisch Anschnittsflächen von 100 µm dicken Lateralschnitten, an denen bereits der Sexualdimorphismus der Kernregionen HVC (Abb. 4c, d) und RA (Abb. 4e, f) sichtbar wird. Der LMAN dagegen (Abb. 4a, b) unterscheidet sich zwischen den Geschlechtern nicht, wie noch später gezeigt werden wird. Für den HVC und RA war bekannt, daß in der frühen postnatalen Entwicklung die Kernregionen bei Weibchen ebenso stark ausgeprägt sind wie bei den Männchen (Nottebohm und Arnold, 1976; Bottjer et al., 1985; Kirn und DeVoogd, 1989). Daher stellt sich die Frage, zu welchem Zeitpunkt in der Ontogenese sich die Kernregionen HVC und RA bei Männchen von denen der Weibchen unterscheiden. Für den HVC und RA, beides Kernregionen, die für die motorische Kontrolle der Gesangsproduktion bei Männchen verantwortlich sind, sollte ein Sexualdimorphismus schon sehr früh in der Entwicklung zu erkennen sein. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir in kleinen Zeitintervallen im Abstand von 10 Tagen die Größe der Gesangskerne HVC und RA anhand von 100 µm Vibratomschnitten bestimmt (Nixdorf-Bergweiler, 1996). Dabei bestätigte sich unsere Hypothese, daß die Kernregionen der prämotorischen Bahn schon sehr früh sexualdimorph sein sollten, da der HVC bei Männchen bereits mit 20 Tagen (Abb. 5B) und der RA mit 30 Tagen (Abb. 5C) größer als bei Weibchen ist. Demnach etabliert sich noch vor dem Beginn der motorischen Phase, die nur bei Männchen stattfindet, ein Sexualdimorphismus. Bei Weibchen verkleinert sich bis zum 40.Tag sowohl der HVC als auch der RA dramatisch, wohingegen bei Männchen eine enorme Größenzunahme während der gesamten Gesangsentwicklungsphase für den RA bis zum 50. Tag und für den HVC bis zum 60. Tag zu beobachten ist. Die detaillierte Volumenmessung der Gesangskerne konnte somit einen genauen Zeitverlauf der Größenentwicklung, sowie die Unterschiede zwischen den Geschlechtern in der Entwicklung aufzeigen. Repräsentieren HVC und RA Kernregionen

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Abb. 4: Repräsentative 100 µm dicke Sagittalschnitte (Vibratom) von Gesangskernen adulter Zebrafinken (Nissl-Färbung). Die Gesangskerne LMAN (oben), HVC (Mitte) und RA (unten) sind für Männchen rechts und für Weibchen links abgebildet. Starke Geschlechtsunterschiede sind im HVC (Mitte) und im RA (unten) bereits in den Anschnittsflächen der Kernregionen zu erkennen. Für den LMAN (oben) dagegen treten im Nissl-Präparat kaum Größenunterschiede zwischen den Geschlechtern auf. Die Pfeile markieren jeweils die ventrale Lage der Kernregion im Schnittpräparat. d dorsal, r rostral

der motorischen Bahn, so gehören die area X und der LMAN zur AFP, die maßgeblich am Gesangslernen beteiligt ist. Unsere Daten zeigen, daß bei Männchen die area X bereits mit 40 Tagen Adultgröße erreicht, also weitaus früher als die prämotorischen Kerne HVC und RA (Abb. 5D). Die schnellere Volumenentwicklung der area X könnte daher im Zusammenhang

Abb. 5: Volumenentwicklung der Gesangskerne LMAN (A), HVC (B), RA (C), und area X (D) bei Zebrafinken. In erwachsenen Tieren (≥100 Tage) ist der HVC bei Männchen, sowie auch der RA um ein Vielfaches größer als bei Weibchen. Der LMAN hingegen unterscheidet sich kaum zwischen den Geschlechtern und weist bei Männchen sowie Weibchen einen ähnlichen Entwicklungsverlauf auf. Eine area X ist bei Weibchen nicht vorhanden. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, 1996)

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mit der Template-Formation für das artspezifische Gesangsmuster angesehen werden, denn nach Doya und Sejnowski (2000) sollte die area X als Gedächtnisspeicher dienen, mit deren Hilfe Zebrafinken ihre eigene Vokalisation beim Gesangslernen überprüfen (1. 3. 5). Das artspezifisches Gesangsmuster sollte bereits mit 35 Tagen in Form eines Gedächtnisses vorhanden sein, wie Verhaltensdaten an Zebrafinken zeigen (Böhner, 1990). Für Weibchen konnten keine Volumendaten erhoben werden, da die area X im Nissl-Präparat bei Weibchen nicht sichtbar ist.

In der Volumenentwicklung des LMAN treten beim Zebrafinken keine prinzipiellen Unterschiede zwischen den Geschlechtern auf.

Ein weiteres Gesangsareal, das zur AFP gehört, ist der LMAN (Abb. 4, 6). Volumendaten über den LMAN in adulten Weibchen fehlten, da die Grenzen des LMANs in konventionellen histologischen Präparaten mit Schnittdicken von 30 µm oder weniger nicht eindeutig erkennbar sind. Somit war unklar, ob neben der area X, dem HVC und dem RA, auch der LMAN in adulten Tieren sexualdimorph ist. Das Problem der Identifizierung von LMAN im Schnittpräparat wurde gelöst, indem dicke Vibratomschnitte (100 µm) zur Volumenanalyse herangezogen wurden (Nixdorf-Bergweiler, 1996). Überraschenderweise konnte in der Größe der LMAN-Volumen in adulten Tieren kein Unterschied zwischen den Geschlechtern nachgewiesen werden (Abb. 4, 5A). Ebenso überraschend war der Befund, daß auch in der Entwicklung des LMAN-Volumens Männchen und Weibchen sich kaum voneinander unterschieden. Wie bei Männchen so verkleinert sich auch bei Weibchen der LMAN vom ca 30. Tag an und nimmt mit 50 Tagen in beiden Geschlechtern seine Adultgröße ein (Abb. 5A). Wenn die Volumenentwicklung vom LMAN in beiden Geschlechtern sich prinzipiell nicht unterscheidet, so könnte man aufgrund der oben angeführten Zusammenhänge zwischen Kernvolumen und Verhalten vermuten, daß der LMAN für beide Geschlechter von ähnlicher Bedeutung ist. Interessanterweise konnte für eine andere Art, dem Kuhsperling (Molothrus ater), gezeigt werden, daß auch hier der LMAN in beiden Geschlechtern gleich groß ist (Hamilton et al., 1997). Bei Kuhsperlingen singen wie beim Zebrafinken nur die Männchen, die Weibchen singen nicht. Weibliche Kuhsperlinge können aber sehr wohl unterschiedliche Gesangstypen unterscheiden und bevorzugen den Gesang lokal ansässiger Männchen (King und West, 1990). Auch Zebrafinkenweibchen sind in der Lage unterschiedliche Gesangsmuster zu unterscheiden. Ihr Diskriminationsvermögen ist so gut, daß sie, wie bereits erwähnt (1. 3. 3) sogar innerhalb einer einzeln dargebotenen Note den Wegfall einer Harmonischen erkennen (Miller, 1979; Cynx et al., 1990). Die Rolle des LMAN bei dieser Diskriminierungsaufgabe wurde allerdings nicht untersucht. Für den Kuhsperling konnte dagegen gezeigt werden, daß die Größe des Kernvolumens des LMAN bei Weibchen in einem engen Zusammenhang zu ihrer Antwortreaktion auf verschiedene Balzgesänge steht. Das wiederum bedeutet, daß der LMAN bei Kuhsperlingsweibchen eine wichtige Rolle bei der Gesangswahrnehmung einnimmt. Einen ähnlichen Zusammenhang zwischen der Größe des LMAN-Volumen bei Weibchen und der Komplexität des Männchengesangs konnte auch für den Europäischen warbler (Sylviidae) festgestellt werden (DeVoogd et al., 1996). Auch bei Männchen spielt der LMAN eine wichtige Rolle bei der Unterscheidung von Gesangsstrukturen (bei Kanarienvögel: Burt et al., 1997; bei Zebrafinken: Scharff et al., 1999). Aufgrund dieser und oben angeführten Befunde, könnte auch bei Zebrafinkenweibchen der LMAN eine entscheidende Rolle in der Gesangswahrnehmung spielen. Die Frage, ob mit der gemeinsamen Volumenentwicklung des LMANs bei Zebrafinken auch in den neuronalen Parametern ein ähnlicher Entwicklungsverlauf stattfindet, wurde in einer detaillierten Strukturanalyse untersucht.

2.2 Cytomorphometrische Charakterisierung der Entwicklung neuronaler Strukturen im LMAN, einer Kernregion, die an Lernprozessen beteiligt ist.

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Der laterale magnocellulare Nucleus des anterioren Neostriatums (LMAN) ist dorsal von der Lamina hyperstriatica (LH) und ventral von der Lamina medullaris dorsalis (LMD) eingebettet und läßt sich bei Männchen aufgrund seiner relativ großen Zellkörper sehr gut von anderen neostriatalen Bereichen abgrenzen (Abb. 6). Die Kernregionen der anterioren Vorderhirnschleife, zu der auch der LMAN gehört, entwickeln ihre afferenten und efferenten Verbindungen beim Männchen relativ früh in der Ontogenese. Eine Innervation des LMANs vom thalamischen DLM kann bereits am 15. Tag beobachtet werden (Johnson und Bottjer, 1992). Zur gleichen Zeit haben auch LMAN-Neurone durch ihre Axone eine Verbindung mit dem RA aufgebaut (Mooney, 1992). Bis zum 35. Tag vergrößert sich das Innervationsgebiet des DLMs um das Dreifache, um sich dann wieder auf einen kleineren Bereich einzuschränken (Johnson und Bottjer, 1992). Dabei enden die DLM-Axone auch außerhalb des Nissl-definierten LMAN. In adulten Zebrafinken wird der LMAN aufgrund seines Projektionsmusters in eine „core“-Region (LMANcore) und in eine „shell“-Region (LMANshell) unterteilt: der dorsolaterale Teil des DLMs projiziert in den LMANcore, die ventromediale DLM-Region projiziert in die LMANshell-Region, die durch kleinere Zellen gekennzeichnet ist (Johnson et al., 1995; Bottjer und Johnson, 1997). LMANcore wiederum gibt seine Axone zum RA, LMANshell sendet Axone ins Archistriatum unmittelbar lateral vom RA. Für die Entwicklung dieses spezifischen Projektionsmusters liegen noch keine Daten vor. Mit dem Abbau der DLM-Terminalien, verkleinert sich auch die LMANcore-Region (Bottjer et al., 1985; Bottjer und Sengelaub, 1989; Burek et al., 1991, Nixdorf-Bergweiler, 1996). Obwohl der LMAN sich auf die Hälfte seines Volumens beim Männchen

Abb. 6: Repräsentativer 100 µm dicker Vibratomschnitt, der die Lage des LMAN im anterioren Neostriatum zeigt. Der LMAN ist durch Pfeilspitzen markiert (Sagittalschnitt).

verkleinert, bleiben die Verbindungen zum RA im erwachsenen Tier erhalten (Nordeen et al., 1992). Ein Verlust an Neuronen wurde bisher lediglich in einem frühen Entwicklungszeitraum zwischen 20 und 35 Tagen gemessen (Bottjer et al., 1985; Nordeen und Nordeen, 1988; Bottjer und Sengelaub, 1989; Burek et al., 1991). Daher stellt sich die Frage, welche morphologischen Strukturen an der Volumenreduktion des LMANs beteiligt sind? Wenngleich ein Gehirnareal sich offensichtlich größtenteils aus Neuronen zusammensetzt, sollten bei der folgenden Darstellung neuronaler Parameter andere Faktoren wie Gliazellen, Kapillare oder durchziehende Fasersysteme in dieser Fragestellung letztendlich auch mit berücksichtigt werden. Neuronale Strukturen lassen sich durch eine Vielfalt von Parametern charakterisieren.

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Während der Gesangsentwicklung nimmt bei Männchen die Anzahl dendritischer Spines ab.

Mit der Golgi-Cox-Methode können einzelne Neurone mit all ihren Fortsätzen einschließlich dendritischer Spines, dargestellt werden (Abb. 7). Daher können mit dieser Methode nicht nur die Anzahl dendritischer Spines entlang eines Dendriten quantifiziert werden, sondern auch Aussagen über die Form und Größe des Dendritenbaumes, des dendritischen Verzweigungsmuster, sowie weiterer Paramenter gemacht werden. Wir haben die Entwicklung der Neurone am Golgi-Cox-Präparat in der zentralen „core“ Region des LMANs (LMANcore) beim Männchen untersucht (Nixdorf-Bergweiler, Wallhäusser-Franke und DeVoogd, 1995). Da zum Zeitpunkt der Golgi-Studie diese lokalen Unterscheidungen aber noch nicht bekannt waren, wird in der Arbeit nicht explizit „core“ und „shell“ voneinander differenziert betrachtet. Prinzipiell kann unter „LMAN“ die core-Region verstanden werden (Iyengar et al., 1999). Um ein möglichst umfassendes Bild der neuronalen Struktur in verschiedenen Entwicklungsstadien des Gesangslernens zu erhalten, haben wir Neurone vor dem Beginn des Gesangslernens, während, sowie auch nach dem Gesangslernen analysiert. Daher wurden Zebrafinken im Alter von 21 Tagen, also noch vor dem Beginn der Gesangsentwicklungsphase, sowie im Alter von 35 und 49 Tagen, also während der sensomotorischen Phase des Gesangslernens und im Alter von mehr als 100 Tagen, wenn der Gesang auskristallisiert ist, untersucht und die Neuronen charakterisiert. Bevor mit der Analyse einzelner Neurone in den verschiedenen Entwicklungsstadien begonnen werden konnte, mußte zuerst ein Gesamtbild der Neuronentypen im LMAN erstellt werden. Dabei zeigte sich, daß es beim Zebrafinken im LMAN prinzipiell zwei Typen von Neuronen gibt: einen Neuronentyp mit multipolaren Dendriten, die mit zahlreichen Spines besetzt sind und einen weiteren Neuronentyp, der auch multipolar orientiert ist, aber so gut wie keine Spines an seinen Dendriten aufweist. Wir haben uns auf die Quantifizierung der neuronalen Struktur

Abb. 7: Repräsentative Camera-Lucida-Zeichnungen Golgi-imprägnierter Neurone im LMAN von Zebrafinken im Alter von einer Woche (A), zwei Wochen (B) und drei Wochen (C), sowie von adulten Tieren (D). In sehr jungen Tieren (A) sind dendritische Spines kaum vorhanden, in 2-Wochen alten Tieren (B) dagegen bereits zahlreich repräsentiert. In (C) und (D) weist ein Pfeil auf das vom Zellkörper abzweigende Axon hin. Zwischen dem Neuron in (C) und (D) ist ein hoher Verlust an dendritischen Spines erkennbar.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, Wallhäusser-Franke und DeVoogd, 1995)

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des spinereichen Neuronentyps fokussiert. In der Abbildung 7 sind Camera-Lucida-Zeichnungen von Golgi-Cox-imprägnierten Neuronen aus dem LMAN von verschiedenen Altersstadien bei Männchen dargestellt. Unsere Golgi-Studie zeigte, daß während der gesamten Gesangsentwicklungsphase dynamische Veränderungen an den LMAN-Neuronen stattfinden und daß die gemessenen neuronalen Parameter in erwachsenen Tieren kleinere Werte aufweisen als in Juvenilen (Nixdorf-Bergweiler, Wallhäusser-Franke und DeVoogd, 1995). In der frühen postnatalen Entwicklung kommt es zwischen der 3. und 5. Woche zu einem Anstieg in der Anzahl dendritischer Spines. Nach diesem Anstieg folgt eine Reduktion, die auch noch nach der 7. Woche fortschreitet, so daß erwachsene Tiere nur noch die Hälfte an dendritischen Spines aufweisen als 35-tägige Männchen (Abb. 8). Die Verminderung des Spinebesatzes und damit auch sehr wahrscheinlich eine Verminderung synaptischer Kontakte findet entlang des gesamten Dendriten statt. Wir haben Neurone aber nicht nur anhand ihrer Spinefrequenz charakterisiert, sondern auch durch eine Vielfalt weiterer neuronaler Parameter

Abb. 8: Dendritische Spinefrequenzen von LMAN-Neuronen verschiedener Altersstadien. Dargestellt ist die mittlere Anzahl dendritischer Spines (x ± SEM) pro 10 µm Dendritensegment für jedes 20 µm Intervall entlang eines Dendriten in 3-, 5- und 7-Wochen alten Tieren sowie in adulten Zebrafinkenmännchen. Zwischen 3 und 5 Wochen ist ein kleiner, aber signifikanter Anstieg in den Spinefrequenzen aller Dendritenabschnitte zu erkennen. Zwischen 5 und 7 Wochen dagegen reduziert sich die Spinefrequenz. Diese regressive Entwicklung der Spinefrequenz hält weiterhin an und ist zwischen 7-Wochen alten Tieren und Adulten besonders stark ausgeprägt.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, Wallhäusser-Franke und DeVoogd, 1995)

wie z.B. der Anzahl primärer Dendriten, der Segmentlänge, dendritische Feldgröße, dendritisches Verzweigungsmuster und der Anzahl dendritischer Endigungen. Im Vergleich zu der dramatischen Veränderung in der Spinefrequenz gibt es nur geringe oder keine Veränderungen in den genannten neuronalen Paramentern. So fanden wir weder einen Unterschied in der Anzahl der Dendritensegmente, der dendritischen Endigungen pro Neuron, noch in der durchschnittlichen Dendritensegmentlänge in den entsprechenden Zeitabschnitten, also zwischen 3, 5 und 7 Wochen, sowie adulten Tieren (≥100 Tage). Eine detaillierte Sholl-Analyse zeigte aber, daß auch das Dendritenmuster sich verändert hat: in adulten Tiere enden die Terminalsegmente näher am Zellkörper als in juvenilen Tieren. Diese Reduktion geht auf die Verkürzung tertiärer Dendritensegmente zurück, primäre und sekundäre Dendriten-segmente hingegen verändern ihren Abstand vom Zellkörper nicht. Damit könnte die Entwicklung primärer und sekundärer Dendriten einem genetischen Programm folgen, tertiäre Dendriten hingegen unmittelbar von spezifischen Eingangssignalen abhängig sein. Insgesamt betrachtet, nimmt die Entwicklung im LMAN einen langen Zeitraum ein, da auch noch nach 7 Wochen regressive Veränderungen im Dendritenmuster, sowie in der Anzahl dendritischer Spines stattfinden. Während der gesamten Gesangsentwicklungsphase verändern sich demnach die Neurone in ihrer morphologischen Struktur. Eine solche regressive Entwicklung wie sie im LMAN beim Vogel aufgezeigt wurde (Nixdorf-Bergweiler, Wallhäusser-Franke und DeVoogd, 1995), wird auch während verschiedener Entwicklungsprozesse bei Säugern beschrieben (e.g. Rakic et al., 1986). Für den visuellen Cortex konnte z.B. gezeigt werden, daß nach einem anfänglichen Überangebot an synaptischen Verbindungen nur solche Kontakte erhalten bleiben, die für das System von Bedeutung sind und somit ihre synaptischen Verbindungen erhalten und manifestieren können (Shatz, 1996). Die Hypothese einer spezifischen Reduktion, bzw. eines selektiven Erhalts einiger weniger Verbindungen aus einer großen Population aufgrund kompetetiver Mechanismen wurde von Changeux und Danchin (1976) ausformuliert. Eine Reduktion dendritischer Spines in spezifischen Gehirnarealen wurde auch bei verschiedenen Prägungsvorgängen nachgewiesen, wie der sexuellen Prägung beim Zebrafinken und der akustischen Prägung beim Hühnchen (Wallhäusser und Scheich, 1987; Rollenhagen und Bischof, 1991; Bock und Braun, 1999; Braun et al., 1999). Damit könnte es sich bei den beobachteten regressiven Entwicklungsvorgängen um generelle Mechanismen handeln, wie sie in der entwicklungs- und erfahrungsabhängigen Plastizität eine wichtige Rolle spielen.

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Die Reduktion dendritischer Spines geht mit synaptischen Veränderungen einher

Dendritische Spines stellen im allgemeinen den postsynaptischen Teil einer Synapse dar (Peters et al., 1991). Im Golgi-Präparat ist nur dieser Teil der Synapse erkennbar: der präsynaptische Teil, wobei es sich zumeist um eine axonale Endigung handelt, sowie der synaptische Spalt sind im Golgi-Präparat nicht zu sehen. Es wird allerdings davon ausgegangen, daß dendritische Spines von präsynaptischen Strukturen besetzt sind, was nicht immer notwendigerweise der Fall sein muß (Wolff, 1981). Um zu überprüfen, ob die dendritischen Spines im Golgi-Präparat tatsächlich synaptische Kontakte repräsentieren, habe ich in einer elektronenmikroskopischen (EM) Entwicklungsstudie die Synapsendichte im LMAN bestimmt (Nixdorf-Bergweiler, unveröffentlicht). Die Abbildung 9 zeigt EM-Aufnahmen aus dem Neuropil des LMAN von 10-, 20- und 30-tägigen (10d, 20d, 30d), sowie von adulten Männchen (ad). In 10-tägigen Zebrafinken sind nur sehr wenige Synapsen im LMAN zu sehen. Einzelne synaptische Kontakte können aber schon recht gut differenziert sein, wie ein axo-dendritischer Kontakt an einem Spine (sp) in der unteren Bildhälfte in 10d zeigt. In der EM-Aufnahme eines 20-tägigen Männchens (20d) ist ein Axon mit seinem Endknöpfchen längs angeschnitten zu erkennen. Sein Verlauf ist durch Pfeilspitzen markiert. Zahlreiche Synapsen, die durch ein präsynaptisches Areal (At), einen synaptischen Spalt, sowie einer postsynaptischen Struktur (Den, sp) gekennzeichnet sind, charakterisieren das Bild. Zahlreiche Synapsen finden sich auch im Neuropil des LMANs von 30- und 40-Tage alten Tieren. Typisch für adultes Gewebe (ad) ist eine geringere Anzahl von Synapsen sowie das Vorhandensein von Myelin. Ein quer angeschnittenes myelinisiertes Axon (Ax) ist in der linken Bildhälfte zu sehen und markiert. Direkt unterhalb des Axons befindet sich ein präsynaptisches Areal, was von einem Dendritenfortsatz (Den) umhüllt wird. Die synaptische Kontaktzone, markiert durch Pfeilspitzen, ist bei dieser Synapse an einer Stelle unterbrochen (offenes Dreieck). Ein solcher Synapsentyp wird „perforierte Synapse“ genannt. Anhand der EM-Studie konnte ich zeigen, daß während der Entwicklung die Synapsendichte ähnlich wie die dendritischen Spines im Golgi-Präparat sich um mehr als die Hälfte reduziert (Abb. 10). Daher ist anzunehmen, daß die dendritischen Spines im Golgi-Präparat synaptische Kontakte repräsentieren. Während der Gesangsentwicklung findet aber nicht nur ein Abbau von

Abb. 9: Elektronenmikroskokpische Aufnahmen aus dem Neuropil des LMAN von Zebrafinkenmännchem im Alter von 10 (10d), 20 (20d) und 30 Tagen (30d), sowie von adulten Tieren (adult: > 100 Tage). Die Fotokollage soll einen Einblick in die Feinstruktur des LMANs vermitteln und die Entwicklung von Synapsen auf ultrastruktureller Ebene dokumentieren. Strukturelle Komponenten von Synapsen wie das präsynaptische Areal (At, Axon terminal) oder das postsynaptische Element, im allgemeinen ein Dendrit (Den) oder ein dendritischer Spine (sp) sind punktuell exemplarisch gekennzeichnet. Der synaptische Spalt zwischen prä- und postsynaptischen Element ist bei dieser Vergrößerung nur bei einigen wenigen Synapsen gut erkennbar. Die Länge synaptischer Kontaktzonen sind ebenso exemplarisch an einigen Synapsen durch Pfeilspitzen markiert. In 10-tägigen Tieren (10d) sind Synapsen kaum vorhanden und zudem noch sehr undifferenziert. In 20-Tage alten Tieren (20d) sind dagegen bereits viele Synapsen zu erkennen, wie auch im Gewebe von 30-tägigen (30d). In Adulten hingegen verringert sich die Synapsendichte (Näheres siehe Text).

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Synapsen statt, sondern auch eine weitere Differenzierung subsynaptischer Parameter. Bei der Längenmessung synaptischer Kontaktzonen stellte sich heraus, daß sich in Männchen die synaptischen Kontaktzonen um 36 % von etwa 300 nm im juvenilen Stadium auf 400 nm im adulten Tier verlängern. Bei weiblichen Zebrafinken dagegen bleibt die Länge der synaptischen Kontaktzone während der gesamten Entwicklungsphase vom 10. Tag an mit einem Wert von 350 nm relativ konstant. Der Längenunterschied im adulten Tier zwischen Männchen und Weibchen ist signifikant, sowie auch die Synapsendichte, die bei Weibchen

Abb. 10: Entwicklungsverlauf der Synapsenanzahl männlicher und weiblicher Zebrafinken im LMAN (x ± SEM). Während in juvenilen Tieren in der Synapsenanzahl kein Unterschied zwischen den Geschlechtern festgestellt werden kann, weisen adulte Tiere (≥100d) einen starken Sexualdimorphismus auf. In weiblichen Tieren bleibt die Synapsenanzahl erhalten, bei Männchen hingegen nimmt die Synapsenanzahl dramatisch um mehr als die Hälfte ab.

unverändert hoch ist. Ich vermute, daß die synaptischen Veränderungen, wie sie bei Männchen zu beobachten sind, erfahrungsabhängige Veränderungen aufgrund des Gesangslernens reflektieren. Ein weiterer Nachweis synaptischer Plastizität im LMAN beim Zebrafinken zeigen ebenso eigene Untersuchungen zu "perforierten Synapsen", einem Synapsentyp, der an Lernprozessen beteiligt sein soll (Jones et al., 1991). Die Quantifizierung perforierter Synapsen zeigt, daß im LMAN juveniler Tiere dieser Synapsentyp weitaus häufiger anzutreffen ist als in adulten Tieren. Interessanterweise trifft das sowohl für Männchen als auch für Weibchen zu (Nixdorf-Bergweiler, unveröffentlicht).

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Die Vergrößerung neuronaler Zellkörper bei Männchen findet während der sensomotorischen Phase statt.

Mit den morphologischen Veränderungen der synaptischen Struktur sollten auch Veränderungen auf zellulärer Ebene einhergehen, sind doch für die Umbau-und Abbauprozesse der Dendritenstruktur erhöhte Stoffwechselaktivitäten und biochemische Resourcen notwendig, die von dem Zellkörper gestellt werden müssen. Paradoxerweise nahm man aber bisher an, daß sich bei Männchen die Zellgröße im LMAN während des Gesangslernens nicht weiter verändert (Bottjer et al., 1985; Bottjer, 1987; Korsia und Bottjer, 1989). Um diesen Widerspruch aufzukären haben wir in einer Entwicklungsstudie die Größe der neuronalen Somata im LMAN an Semidünnschnitten bestimmt. Die Abbildung 11 zeigt exemplarisch lichtmikroskopische Aufnahmen dieser Entwicklungsstudie. Die 1 µm dicken Schnitte wurden mit Toluidineblau gegengefärbt. Die Ergebnisse zeigen, daß anhand klein gewählter Zeitintervalle (10 Tage) vom 10. Lebenstag ein erheblicher Wachstumszuwachs der neuronalen Zellkörper zwischen dem 40. und 60. Tag nachgewiesen werden konnte (Nixdorf-Bergweiler, 1998). Die neuronalen Somata vergrößern sich demnach vor allem in der sensomotorische Phase des Gesangslernens. Ursache für die fehlende Entdeckung der Größenzunahme in den Zellsomata vorhergehender Studien könnten zu groß gewählte Zeitabstände sein oder auch die Wahl nicht relevanter Zeitabschnitte in der Entwicklung des LMANs. Im Vergleich zur Zellgrößenentwicklung anderer Gesangsareale wie HVC oder RA, die bereits um den 40. Tag bei Männchen adulte Somagrößen aufweisen (Konishi und Akutagawa, 1985, 1988, 1990; Herrmann und Bischof, 1986), nimmt der LMAN, der erst am 60. Tag adulte Somagrößen aufweist, einen weitaus längeren Zeitraum ein (Abb. 11). Interessanterweise sind die Zellkörper im LMAN bis zum 40. Lebenstag bei Männchen und Weibchen gleich groß. Der für Adulte bekannte Sexualdimorphismus in der Zellgröße tritt erst sehr spät um den 50. Tag in der Ontogenese auf (Nixdorf-Bergweiler, 1998). Der lange gemeinsame Entwicklungsverlauf könnte in engem Zusammenhang mit der Gedächtnisbildungsphase zu sehen sein, die in beiden Geschlechtern stattfindet, wohingegen bei Männchen der späte Wachstumsschub in der Zellgröße mit dem motorischen Gesangslernen korrelieren könnte. Da Steroidbehandlung juveniler Zebrafinkenweibchen Gesangsareale maskulinisiert (Gahr und Konishi, 1988; Konishi und Akutagawa, 1990: Schlinger und Arnold, 1991; Simpson und Vicario, 1991a; Grisham und Arnold, 1995; Jacobs et al., 1995; Grisham et al., 1997; Gong et al., 1999) und diese Tiere einen männchen-ähnlichen Gesang hervorbringen (Gurney, 1982; Pohl-Apel und Sossinka, 1984; Simpson und Vicario, 1991b; Adkins-Regan et al., 1994), könnte die Zellgrößenentwicklung im LMAN bei Männchen auch in der hormonellen Konstitution begründet sein. Neuere Untersuchungen von White et al. (1999) bestätigen allerdings diese Hypothese nicht, da in ihren Experimenten Testosteronbehandlung juveniler Tiere keinen Einfluß auf das Zellgrößenwachstum im LMAN bei Männchen hat, wohl aber die elektrophysiologischen Eigenschaften der LMAN-Neurone verändert, indem die Entwicklung der synaptischen Transmission beschleunigt wird. Testosteronbehandlung adulter weiblicher Kanarienvögel hingegen bewirkt eine Vergrößerung der Zellkörper im LMAN, nicht nur der hormonsensitiven Zellen, sondern aller Zellen im LMAN (Brenowitz und Arnold, 1990). In einem anderen Gesangsareal, dem HVC, führt hormonelle Manipulation nicht nur zu einer Zellgrößenveränderung, sondern auch zu einer Veränderung in der Größe der Kernregion, der Anzahl und dem prozentualen Anteil androngensensitiver Zellen, sowie der Zelldichte (Johnson und Bottjer, 1993). Die Gesamtneuronenanzahl dagegen bleibt im HVC bei hormoneller Behandlung unverändert. Testosteron und/oder seine Metaboliten Estradiol und Dihydrotestosteron regulieren somit beim Kanarienvogel das HVC-Volumen, indem Projektionsneurone und androgensensitive Zellen unterschiedlich beeinflußt werden. Beim Zebrafinken, der im Gegensatz zum Kanarienvogel seinen Gesang nur einmal lernt und ihn zeitlebens beibehält, verliert Östrogen bei Weibchen seinen maskulinisierenden Einfluß auf die Zellgröße im Laufe der Entwicklung. Die Steroidsensitivität im HVC und im RA nimmt bei Weibchen bereits nach dem 35. Tag rapide ab, zu einem Zeitpunkt also, wenn die Zellkörper im HVC und RA stark zu schrumpfen beginnen (Nordeen et al., 1986; Konishi und Akutagawa, 1988; Adkins-Regan et al., 1994). Da im LMAN die neuronalen Somata der Weibchen zwischen dem 40. und 50. Tag ihre Adultwerte erreichen, könnte damit auch ihre Steroidsensitivität auf ein Minimum

Abb. 11: Lichtmikroskopische Aufnahmen von 1 µm Semidünnschnitten vom LMAN in Weibchen (A, B) und Männchen (C, D). Das Gewebe 30-tägiger Tiere ist in den oberen beiden Aufnahmen dargestellt (A, C), das Gewebe 60- tägiger Tiere in den beiden unteren Aufnahmen (B, D). Während in 30-Tage alten Tieren (A, C) kein Unterschied in der Zellgröße gemessen werden kann, sind in 60-tägigen (B, D) und adulten Tieren die Zellsomata bei Männchen um ein Vielfaches größer als bei Weibchen. Wie der Grafik „Somata“ weiter zu entnehmen ist, vergrößern sich bei Männchen die Zellkörper zwischen dem 40. und 60. Tag, während sie sich bei Weibchen stark verkleinern,. Die Neuronendichte (x ± SEM) hingegen bleibt zwischen 30 und 60 Tagen in beiden Geschlechtern konstant, verändert sich aber noch nach dem 60. Tag: Bei Weibchen nimmt die Neuronendichte zu, bei Männchen verkleinert sie sich weiter.
(modifiziert nach: Nixdorf-Bergweiler, 1998)

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reduziert sein. Mit dem Schrumpfen der Zellkörper bei Weibchen geht auch eine Verkleinerung in den Anschnittsflächen der Zellnuklei einher, so daß für ein Gesangsareal auf der Ebene von neuronalen Zellnuklei erstmals ein Sexualdimorphismus beschrieben werden konnte. Dieser Sexualdimorphismus ist erst am 60. Lebenstag erkennbar und im adulten Tier besonders stark ausgeprägt (Nixdorf-Bergweiler, 1998).

Wie verändert sich die Neuronendichte während des Gesangslernens?

Mit der Verkleinerung des LMAN-Volumens gehen bei Männchen bis zu 50 % der LMAN-Neurone verloren (Bottjer, 1987; Bottjer et al., 1985; Burek et al., 1991; Korsia und Bottjer, 1989; Nordeen und Nordeen, 1988). Man nimmt an, daß der größte Teil dieser Neurone zwischen dem 20. und 35. Tag verloren geht, da in diesem Zeitraum die Anzahl degenerierender Zellen weitaus höher ist als zu einem späteren Zeitpunkt (Bottjer und Sengelaub, 1989). In dem gleichen Zeitraum massiver Neuronenverluste findet ebenso eine verstärkte Innervation des LMAN aus dem thalamischen DLM statt (Johnson und Bottjer, 1992). Ob diese Situation auch auf Weibchen zutrifft ist noch völlig unbekannt. Der für adulte Tiere typische Sexualdimorphismus in der Größe der Gesangsareale HVC und RA entsteht als Folge von Zellschrumpfungsprozessen und programmierten Zelltod bei Weibchen, sowie durch Vergrößerung der Zellkörper und des axonalen Verzweigungsmusters bei Männchen (Konishi und Akutagawa, 1987; Kirn und DeVoogd, 1989). Da sich aber das LMAN-Volumen in beiden Geschlechtern verkleinert stellt sich hier die Frage, ob auch bei Weibchen eine Reduktion der Neuronendichte stattfindet (Nixdorf-Bergweiler, 1996). Ursprünglich nahm man an, daß aufgrund einer kleineren Anzahl androgensensitiver Zellen im LMAN die Neuronendichte bei Weibchen weitaus geringer ist als bei Männchen (Nottebohm und Arnold, 1976; Arnold und Saltiel, 1979; Arnold, 1980; Nordeen et al., 1986, 1987, 1992). Retrograde Markierungsexperimente schienen diese Annahme zu bestätigen, da LMAN-Neurone, die in den RA projizieren bei Weibchen im adulten Tier in geringerer Anzahl vorhanden sind als in Juvenilen (Nordeen et al., 1992). Allerdings bleiben die Verbindungen vom LMAN in den RA bei Männchen auch im erwachsenen Tier erhalten, so daß diese Aussagen so noch nicht schlüssig sind, sollte doch nach Bottjer und Sengelaub (1989) die Neuronenanzahl bei Männchen abnehmen und nicht wie von Nordeen et al., (1992) gezeigt, konstant bleiben. Eine Erklärung für den Erhalt der LMAN-RA-Projektionsneurone bei Männchen, bzw. den Verlust bei Weibchen, könnte dadurch begründet sein, daß Neurone des LMANs nicht nur zum RA projizieren, sondern auch in die area X (Nixdorf-Bergweiler, Lips und Heinemann, 1995; Vates und Nottebohm, 1995; Kreck und Nixdorf-Bergweiler, 1999). LMAN-Neurone, die nicht in den RA projizieren, sondern nur in die area X können durch retrograde Markierungsexperimente vom RA ausgehend, die Neuronenpopulation im LMAN nur unvollständig repräsentieren. Dies könnte der Grund für die Unterschiede der an Nissl-Präparaten und Farbstoffmarkierungen gewonnen Ergebnisse sein. Diese von uns neu identifizierte LMAN - area X- Projektion wird in 2. 3. ausführlich dargestellt.

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Um ein genaueres Bild über die Anzahl der Neuronen im LMAN während der Gesangsentwicklungsphase zu erhalten und um zu überprüfen, ob es in der Anzahl der Neurone einen Sexualdimorphismus gibt, haben wir an Semidünnschnitten mit der stereologischen Disector-Technik (Sterio, 1984) die Anzahl der Neurone im LMAN in kleinen Zeitabständen von 10 Tagen bestimmt (Nixdorf-Bergweiler, Hintz und Kreck, zur Veröffentlichung eingereicht). Dabei konnten wir mit unserer Auswertmethode die bis zum 35. Tag stattfindenden bekannten Neuronenverluste bei den Zebrafinkenmännchen bestätigen (Bottjer et al., 1985; Nordeen und Nordeen, 1988; Bottjer und Sengelaub, 1989; Burek et al., 1991). Für Zebrafinkenweibchen kann kein eindeutiger Trend zu einer kleineren Neuronendichte festgestellt werden, weder in juvenilen Stadien noch später. Die Neuronendichte variiert bei Weibchen sehr stark bis zum 60. Tag, steigt dann aber um 51 % in erwachsenen Tieren an (Abb. 11). Auch bei Männchen findet noch nach dem 60. Tag eine Veränderung in der Neuronendichte statt, da adulte Männchen 41 % weniger Neurone pro Volumeneinheit aufweisen als 60-tägige. Aufgrund der erhöhten Neuronendichte bei Weibchen und einer Verminderung bei Männchen ist die Neuronendichte des LMANs in adulten Weibchen fast viermal so hoch wie bei adulten Männchen (Abb. 11). Da die LMAN-Volumen sich zwischen den Geschlechtern kaum unterscheiden (Nixdorf-Bergweiler, 1996), ergibt sich für die Gesamtanzahl der Neuronen im LMAN ein ähnliches Bild wie für die Neuronendichte. Für den LMAN wurde somit ein Sexualdimorphismus mit umgekehrten Vorzeichen aufgezeigt: im LMAN bei Weibchen gibt es weitaus mehr Neurone als bei Männchen. Wie läßt sich die erhöhte Neuronendichte bei Weibchen erklären? Wo kommen die Neurone her? Da im Telencephalon bei Vögeln auch noch im erwachsenen Tier Neubildung von Nervenzellen stattfindet, könnten diese Zellen neugebildete Nervenzellen darstellen (Goldman, 1983; Kirn und DeVoogd, 1989). Neurogenese findet aber vor allem im HVC und in der area X, nicht aber im LMAN statt (Nottebohm, 1993). Für den LMAN ist der Anteil an neugebildeten Zellen nach dem 20. Lebenstag bei Männchen mit 0.8 % verschwindend gering (Nordeen und Nordeen, 1988). Für Weibchen liegen keine Daten vor. Daher ist es sehr unwahrscheinlich, daß es sich bei der erhöhten Neuronendichte um neugebildete Nervenzellen handelt. Eher könnte es sich um Neurone handeln, die aus der unmittelbaren Umgebung in den LMAN hineingewandert sind und ihren Phänotyp derart verändert haben, daß sie von den „ursprünglichen“ LMAN-Neuronen im Nissl-Präparat nicht mehr zu unterscheiden sind. Die bei Männchen nachgewiesene Reduzierung in der Neuronendichte könnte durch selektiven Zelltod erklärt werden, wie er für juvenile Stadien im LMAN, sowie auch bei Weibchen in den Gesangsarealen HVC, area X und RA aufgezeigt wurde (Konishi und Akutagawa, 1985; Bottjer und Sengelaub, 1989; Kirn und DeVoogd, 1989; Burek und Opprnheim, 1996; Burek et al., 1997).

Läßt sich der auf zellulärer Ebene nachgewiesene Sexualdimorphismus auch auf der Ebene von Nukleoli nachweisen?

In der Entwicklungsstudie zur Bestimmung von Neuronendichten im LMAN wurde der Nukleolus als Markierungseinheit für das Vorhandensein eines Neurons gewählt. Dies ist in der Wissenschaft eine allgemein übliche Methode für die Bestimmung von Neuronendichten (Tramontin et al., 1998). Interessanterweise schienen Nukleoli von LMAN-Neuronen nicht in allen Altersstufen in ihrem morphologischen Erscheinungsbild gleich zu sein. Auffallend war, daß manche Nukleoli "ringförmig" waren, bzw. "durchlöchert" erschienen, andere wiederum eine recht kompakte Struktur aufwiesen. Diese auf der lichtmikroskopischen Ebene schon recht gut erkennbaren Unterschiede konnten durch elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigt werden (Abb. 12, obere und mittlere Abbildung). Da der Begriff „ringförmig“ nur für die Anschnittsfläche von Nukleoli zutrifft, nicht aber für die gesamte Struktur in räumlicher Darstellung, habe ich den Begriff CLA (central light area)-Nukleoli eingeführt: also Nukleoli, die eine helle centrale Region aufwiesen (Nixdorf-Bergweiler, 1997). Das Phänomen der CLA-Nukleoli im LMAN wurde in einer Entwicklungsstudie systematisch untersucht. Bei der Quantifizierung der CLA-Nukleoli zeigte sich, daß in juvenilen Stadien sowohl bei Männchen als auch bei Weibchen ca. 10 % der Nukleoli zum CLA-Typ gehören (Abb. 12, untere Abbildung). In adulten Tieren dagegen sind bei Männchen mehr als 35 % der Nukleoli CLA-Nukleoli, bei Weibchen hingegen liegt der prozentuale Anteil unverändert bei ca. 10 % (Nixdorf-Bergweiler, 1997). Das verstärkte Vorkommen dieses spezifischen Nukleolustyps bei Männchen erfolgt in einer progressiven Entwicklung: zwischen dem 20. und 50. Lebenstag nimmt der prozentuale Anteil an CLA-Nukleoli um das 3-fache zu und erhöht sich noch einmal signifikant um 72 % bis zum 60. Tag, an dem der Adultwert erreicht wird. Wir fragten uns, ob der spezifische CLA-Nukleolustyp auch in anderen Gesangsarealen in dieser Form repräsentiert ist. In meiner Arbeitsgruppe zeigte Claudia Freyer in ihrer Studienjahresarbeit (1998), daß im Gesangskern RA adulter Männchen es lediglich 1.6 % und im HVC 2.8 % CLA-Nukleoli gibt, also ein weitaus geringeres Vorkommen als im LMAN. Untersuchungen der area X, sowie zwei visueller Regionen, dem Ectostriatum und dem Nucleus Rotundus, weisen ebenso ein nur sehr geringes Vorkommen dieses speziellen Nukleolustyps auf. Somit nimmt der LMAN bzgl. CLA-Nukleoli eine Sonderstellung ein. Die Nukleoli im LMAN unterscheiden sich zwischen den Geschlechtern aber nicht nur in ihrer cytomorphologischen Form, sondern auch in ihrer Größe, da bei Männchen die Anschnittsfläche von Nukleoli bis zu 50 % größer sind als bei Weibchen und dieser Unterschied sowohl in juvenilen als auch in adulten Tieren auftritt (Nixdorf-Bergweiler, 1997). Mit diesem Befund wurde erstmalig ein Sexualdimorphismus auf der Ebene von Nukleoli in der Literatur nachgewiesen. Auch im RA sind die Nukleoli bei Männchen weitaus

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Abb. 12: Darstellung von Geschlechtsunterschieden im LMAN auf der Ebene von Nucleoli.
Obere Abbildung: Repräsentative hochauflösende lichtmikroskopische Aufnahme eines angeschnittenen Neurons mit Nucleoplasma und Nucleolus im 1 µm Semidünnschnitt eines adulten Zebrafinkenmännchens (x100 Öl). Im Nucleoplasma (Bildmitte) befindet sich in unmittelbarer Nähe der Kernmembran ein Nucleolus. Dieser Nucleolus ist durch eine zentral gelegene helle Region (central light area) charakterisiert und wird daher in die Gruppe der CLA-Nucleoli eingeordnet (Nixdorf-Bergweiler, 1997). Zahlreiche längs- und quergeschnittene Axone, typisch für adultes LMAN-Gewebe, sind ebenso auf der Aufnahme zu erkennen. Mittlere Abbildung: Die beiden nebeneinander angeordneten elektronenmikroskopsichen Abbildungen repräsentieren jeweils einen CLA-Nucleolus auf ultrastruktureller Ebene bei Weibchen (links) und bei Männchen (rechts). Die Größe von LMAN-Nucleoli ist sexualdimorph: Männchen haben signifikant größere Nucleoli als Weibchen. Die CLA-Nucleoli sind in ihrer maximalen Ausdehnung angeschnitten und einige ihrer strukturellen Komponenten exemplarisch markiert. Zu den strukturellen Komponenten des Nucleolus gehören die granuläre (G) und die dichte fibrilläre Komponente (F), sowie fibrilläre Zentren (Fc), wie auch in vielen Fällen eine Vakuole (V). Im allgemeinen ist ein fibrilläres Zentrum von dichten Fibrillen umgeben. Untere Abbildung: Prozentuales Vorkommen von CLA-Nucleoli im LMAN während der Entwicklung dargestellt für Männchen und Weibchen. Signifikante Unterschiede zwischen den Geschlechtern sind gekennzeichnet (*p≤ 0.05; ***p≤ 0.001).
(modifiziert nach: Nixdorf-Bergweiler, 1997)

größer als bei Weibchen (Freyer, Studienjahresarbeit 1998; Freyer und Nixdorf-Bergweiler, 1998). Wir vermuten, daß auch in anderen sexualdimor-phen Systemen wie z.B. dem präoptischen anterioren hypothalamischen Areal (POA/AH) oder dem Nucleus bulbocavernosus (SNB), also Systemen, die bei Säugern für die Steuerung von Sexualverhalten eine Rolle spielen (Cherry et al., 1992; Breedlove und Arnold, 1980), Nukleoli sich in ihrer Größe unterscheiden. Dieses Phänomen wurde bisher jedoch nicht untersucht.

Die Größenunterschiede auf nukleolärer Ebene könnten Unteschiede in der Protein-Biosynthese reflektieren, spielt doch der Nukleolus eine wichige Rolle bei der Biogenese von Ribosomen. Transkription ribosomaler RNA-Gene wie auch die Weiterverarbeitung ihrer Transkripte mit ribosomalen und nicht-ribosomaler Proteine, all diese Prozesse laufen wohlkoordiniert in definierten Regionen des Nukleolus ab (Goessens, 1984; Scheer und Benavente, 1990). Somit steht also der Nukleolus in enger Beziehung zur Proteinbiosynthese einer Zelle und es ist anzunehmen, daß seine Morphologie den Proteinsynthesestatus eines Neurons widerspiegeln kann, wie es für nicht-neuronale Zellen bereits vielfach nachgewiesen wurde (Underwood, 1990). Für neuronale Zellen gibt es nur wenige Beispiele. Unter anderem ist bekannt, daß Purkinje-Zellen im Cerebellum eines Winterschläfers (Erinaceus europaeus L.) saisonale Größenunterschiede aufweisen, da während Hibernation Purkinjezell-Nukleoli weitaus kleiner sind als unter Aktivitätsbedingungen (Giacometti et al., 1989). Inwiefern diese saisonalen Effekte auch einen Einfluß auf Nukleoli in Gesangsarealen, insbesondere bei Kanarienvögel haben, muß noch gezeigt werden.

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Ein weiteres Merkmal des Nukleolus, das physiologische Eigenschaften von Zellen auf zytologischer Ebene widerspiegelt, ist die Verlagerung des Nukleolus in die Peripherie des Nucleus, ein Charakteristikum, das in der Literatur unter verschiedenen experimentellen und pathologischen Einflüssen beschrieben wird (Kamel et al., 1990). Um mehr Information über die Besonderheit der Nuceloli im LMAN zu erfahren, hat Claudia Freyer (Studienjahresarbeit, 1998) die Lage des Nukleolus innerhalb eines Nucleus in Neuronen des LMANs, sowie vergleichend die Exzentrizität von Nukleoli in dem Projektionsgebiet des LMAN, dem RA, bestimmt. Die Berechnung der prozentualen Exzentrizität von Nukleoli im Nucleus wurde in Analogie zur prozentualen Exzentrizität vom Nucleus im Soma nach Born, Carman und Rubel (1987) ermittelt. Dabei zeigte sie, dass in adulten Zebrafinkenmännchen im prämotorischen RA die höchste prozentuale Exzentrizität (52.2 %) auftritt und im LMAN mit 40.5 % ein signifikant geringerer Wert vorlag. Die Werte für die prozentuale Exzentrizität in adulten Weibchen im LMAN (46.8 %) und RA (44.8 %) unterschieden sich dagegen nicht. In juvenilen Tieren (20d) lag die prozentuale Exzentrizität im RA bei nur 37.7 % und war somit signifikant kleiner als in adulten Tieren. Demnach wandert der Nukleolus in RA-Neuronen während der Entwicklung in die Nähe zur Kernmembran hin. Uns interessierte nun, zu welchem Zeitpunkt in der Gesangsentwicklung der Adultwert erreicht wird. Bei der Untersuchung weiterer Alterstadien zeigte sich, daß es zwischen dem 20. und 30. Tag einen signifikanten Anstieg in der prozentualen Exzentrizität gibt, also noch vor dem Einwandern der HVC-Neurone in den RA. Dieser Wert entspricht jedoch noch nicht dem Adultwert. Zwischen dem 30. und 60. Tag verändert sich die prozentualen Exzentrizität im RA nicht, steigt dann aber noch einmal nach dem 60. Tag signifikant an. Diese Befunde sind insofern interessant, als im RA auch noch nach dem 60. Tag zelluläre Veränderungen stattfinden, obwohl die Zellkörper bereits mit 40 Tagen und das RA-Volumen um den 50. Tag ihre Adultwerte erreicht haben (Konishi und Akutagawa, 1985, 1988, 1990; Nixdorf-Bergweiler, 1996; Bottjer et al., 1986). Da zahlreichen Experimente das Vorhandensein exzentrischer Nukleoli mit größtenteils Kontakt zur Kernmembran in hauptsächlich regenerierenden Zellen belegen, also in Zellen mit vermutlich erhöhter Stoffwechselaktivität und somit auch gesteigerter RNA-Syntheserate, könnte aufgrund der hohen Exzentrizität im RA entsprechend eine hohe Aktivität dieses Kernes im adulten Tier gefordert werden. Diese Interpretation deckt sich auch mit der Tatsache, daß die hohe Exzentrizität in 20-tägigen Männchen noch nicht vorhanden war und sich erst während der sensomotorischen Phase bis ins Erwachsenenalter (Ende der Gesangsentwicklung) ausbildet.

Der Anteil myelinisierter Axone im LMAN nimmt in beiden Geschlechtern den gleichen Entwicklungsverlauf.

Da für den LMAN bei Männchen regressive Entwicklungsprozesse in der Volumengröße, dem Auftreten dendritischer Spines, der Synapsendichte, sowie der Zelldichte aufgezeigt wurden, andererseits die Zellkörper sich noch sehr spät in der Ontogenese vergrößerten, stellte sich die Frage, in welchem Zeitraum Myelinisierung bei der Ausdifferenzierung des neuronalen Netzwerks im LMAN eine Rolle spielt. Dabei ist die Myelinisierung des LMAN bei Weibchen von besonderem Interesse. Generell spielen Myelinisierungsprozesse eine

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Abb. 13: Entwicklung myelinisierter Axonprofile im LMAN und HVC. (A) Die Anzahl myelinisierter Axon-Anschnittsflächen pro Flächeneinheit erhöht sich während der Entwicklung im LMAN in beiden Geschlechter. Im HVC dagegen findet nur bei Männchen eine Zunahme statt. (B) Die Gesamtfläche axonaler Profile, gemessen in Quadratmicrometer pro Flächeneinheit, zeigt eine ähnliche Entwicklung wie die Anzahl.
(aus: V. Hintz, Diplomarbeit, 1996)

wichtige Rolle beim Aufbau neuronaler Verbindungen und eine zum größten Teil abgeschlossene Myelinisierung einer Kernregion kann als Indiz für die Einschränkung neuronaler Plastizität gewertet werden (Wolff, 1981). Einen Zusammenhang zwischen Myelinisierung, funktionellen Eigenschaften bestimmter Gehirnareale sowie spezifischer Verhaltensabläufe wurde schon seit langem für verschiedene Systeme gefordert (van der Knaap, 1991). Für das Gesangssystem liegen einige wenige Daten zur Myelinisierung vor, aber eine detaillierte Analyse, insbesondere ein Vergleich der Myelinisierung zwischen den Geschlechtern wurde bisher nicht durchgeführt (Herrmann und Bischof, 1986; Güttinger et al., 1993; Stocker et al., 1994). Daher hat Viola Hintz in einer Diplomarbeit (1996) bei mir die Entwicklung axonaler Profile im LMAN beiMännchen und Weibchen anhand von Semidünnschnitten ausgewertet und zum Vergleich eine weitere Gesangsregion, den HVC, herangezogen (Abb. 13). Entsprechend der Volumenentwicklung im LMAN, die in beiden Geschlechter recht ähnlich abläuft (Nixdorf-Bergweiler, 1996), gibt es in den von uns gewählten Parameter zur Quantifizierung von Myelinisierungsprozesse keine Unterschiede im LMAN zwischen Männchen und Weibchen,weder in juvenilen, noch in adulten Tieren. Während für den LMAN bereits in den ersten 40 Lebenstagen signifikante Anstiege in der Myelinisierung gemessen werden können, findet im HVC meßbare Myelinisierung erst nach dem 60. Lebenstag statt und das auch nur bei Männchen. Bei Weibchen hingegen bleibt im HVC die Myelinisierung während der gesamten Entwicklung auf relativ niedrigem Niveau (Hintz und Nixdorf-Bergweiler, 1997). Die von uns nachgewiesene frühe Myelisierung im LMAN, die noch vor der Myelinisierung im HVC einsetzt, steht im Einklang mit den Entwicklungsbefunden zum Aufbau der Konnektivität der Gesangskerne der anterioren Vorderhirnbahn, die zeitlich vor der Innervation des HVCs mit dem RA stattfindet (Konishi und Agutagawa, 1985; Mooney und Rao, 1994). Der lange Entwicklungsprozess der Myelini-

sierung ist ein weiteres Indiz für die langandauernde neuronale Entwicklung in den Gesangskernen sowohl im LMAN als auch im HVC. Für den LMAN scheint eine erhöhte Myelinisierung mit einer Reduktion an Synapsen einherzugehen, womit nach Wolff (1981) neuronale Plastizität letztendlich eingeschränkt wird.

2.3 Aufklärung neuronaler Verbindungen in vivo und am in vitro Hirnschnittpräparat weisen neue Projektionen auf.

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Ursprünglich nahm man an, daß das Gesangssystem neuronal von in Serie geschalteten Gesangskernen repräsentiert wird. Mit der Entdeckung der anterioren Vorderhirnbahn (Okuhata und Saito, 1987; Bottjer et al., 1989), sowie der Einbindung eng angrenzender Regionen, die Gesangszentren unmittelbar aufliegen und topographisch in entsprechende angrenzende Regionen weiterer Gesangszentren projizieren (Johnson et al., 1995; Vates et al., 1996; Mello et al., 1998) und neuer mehrfach repräsentierter Verbindungen zwischen bereits bekannten Gesangsarealen (Wild, 1993a; Vates und Nottebohm, 1995; Foster et al., 1997), sowie die Entdeckung neuer Kernregionen, die ebenso in das Gesangssystem eingebunden werden müssen (Vicario, 1993; Wild, 1993b; Vates et al., 1996; Foster et al., 1997), erweist sich das Gesangssystem als ein komplex aufgebautes neuronales System, das in seinen Grundzügen den thalamo-corticalen Schaltkreisen der Säuger ähnelt (Vates et al., 1997).

Innerhalb der AFP gibt es bei Männchen eine rekursive Schleife, die Information vom LMAN zurück in den Lobus olfactorius projiziert.

Zur Aufklärung neuronaler Verbindungen haben wir mit elektrophysiologischen Methoden am in vitro Hirnschnittpräparat in adulten Zebrafinkenmännchen die Verbindung des LMAN mit seiner unmittelbaren Nachbarschaft untersucht. Dabei konnte Mario Lips in seiner bei mir durchgeführten Diplomarbeit (1994) im Labor von Professor Heinemann, Neurone im LMAN anhand antidromer Spikeantworten identifizieren, die ihr axonales Verzweigungsmuster in die area X projizieren (Abb. 14). Diese Projektion konnten wir durch intrazelluläre Zellfüllungen

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Abb. 14: Intrazelluläre Ableitungen von einem LMAN-Neuron während area X-Stimulation am in vitro Hirnschnittpräparat. Niederschwellige Reize (2 V) erzeugen exzitatorische postsynaptische Potentiale, da das Fasersystem DLM-LMAN, das teilweise auch durch die area X zieht, aktiviert wird. Höhere Reizstärken (5 bis 8 V) evozieren antidrome Aktionspotentiale (die Latenz zwischen Reiz und Antwortreaktion beträgt weniger als 1 ms) und belegen somit elektrophysiologisch eine Projektion vom LMAN zur area X.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, Lips und Heinemann, 1995)

mit Biocytin (Abb. 15), sowie extrazellulärer Applikation von dem fluoreszierenden Tracer Fluoro Ruby (Abb. 16) in vitro verifizieren (Nixdorf-Bergweiler, Lips und Heinemann, 1995). Ein solches Biocytin-markiertes Neuron habe ich mit seinem Dendritenbaum und axonalen Verzweigungsmuster rekonstruiert (Abb. 15, unten) und seine Lage im LMAN schematisch dargestellt (Abb. 15, oben). Viele LMAN-Neurone, die bekanntermaßen in den RA projizieren (Bottjer et al., 1989), bilden ebenso Kollaterale aus, die zur area X im Lobus parolfactorius ziehen. Zwischen dem LMAN und der area X ist die Projektion topographisch organisiert (Vates und Nottebohm, 1995; G. Kreck, Diplomarbeit 1998). Diese Topographie

ist bereits in juvenilen Tieren vorhanden, im Gegensatz zur Projektion in den RA, die erst im Laufe der Gesangsentwicklung ihre topographischen Eigenschaften erhält (Iyengar et al., 1999). Unsere elektrophysiologischen Befunde zeigen, daß sich LMAN-Neurone entsprechend ihrer Spikefrequenz bei stärkerer und länger anhaltender Depolarisation durch eine positive Strominjektion in funktionell verschiedene Klassen einteilen lassen. LMAN-Neurone zeigten Feuerraten, die nach einer anfänglich hohen Frequenz zu einer niederen Frequenz wechselten (regular-spiking cells) oder hohe Feuerraten, die über den gesamten

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Abb. 15: Biocytin-gefüllte Zelle im LMAN. Ein Biocytin-gefülltes Neuron, dessen Axon sich in unmittelbarer Nähe vom Zellkörper in zwei Kollaterale aufspaltet, wobei ein Teil in Richtung area X zieht und die andere Abzweigung in das frontale Neostriatum verläuft, ist anhand einer Camera-Lucida-Zeichnung durch Rekonstruktion dargestellt. Morphologisch läßt sich das abgebildete Neuron dem spinereichen Neuronentyp zuordnen. Dieser Neuronentyp bildet den größten Teil der Neuronenpopulation im LMAN.

Zeitraum der Strominjektion kaum eine Frequenzveränderung aufwiesen (fast-spiking cell). Bursterzellen mit hochfrequenten Spikes zu Beginn einer Depolarisation durch Strominjektion, wie sie z.B. im HVC nachgewiesen wurden (Lewicki, 1996), wurden im LMAN nicht identifiziert. Viele Zellen zeigten interneuronalen Charakter.

Abb. 16: Fluoreszierende retrograd markierte Neurone im LMAN, die in die area X projizieren. (A) zeigt die Applikationsstelle des Tracers (Fluoro Ruby) in der area X bei schwacher Vergrößerung. Einzelne fluoreszierende Neurone sind bei dieser Vergrößerung noch nicht gut erkennbar. In (B) ist zur besseren Orientierung die gleiche Region des Fluoreszenzbildes aus (A) im Dunkelfeld dargestellt. Auch in einem nicht-gefärbten Schnitt lassen sich mit dem Dunkelfeld spezifische Gehirnstrukturen recht gut erkennen: area X (X) und LMAN (*), sowie auch ein kleiner Teil der Lamina hyperstriatica (LH) und der Lamina frontalis superior (LFS) sind gekennzeichnet. Schwarz-weiße Pfeilspitzen zeigen auf die Lamina medullaris dorsalis (LMD), die sich zwischen area X und LMAN schiebt. Im Fluoreszenzbild (c) sind erst bei höherer Vergrößerung markierte Neurone im LMAN erkennbar. Eines dieser Neurone wurde exemplarisch mit einem Pfeil gekennzeichnet und ist in (D) vergrößert dargestellt. Bei den Präparaten handelt es sich um Gefrierschnitte. Dorsal ist oben und rostral liegt links im Präparat. In (A), (B) und (C) beträgt der Vergrößerungsmaßstab 500 µm, in (D) beträgt er 100 µm.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, Lips und Heinemann, 1995)

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Gibt es auch bei Weibchen eine rekursive Schleife innerhalb der AFP?

Um der Frage nachzugehen, ob auch in weiblichen Tieren wie bei Männchen eine Projektion aus dem LMAN in den Lobus parolfactorius zieht, hat Gunter Kreck in seiner Diplomarbeit (1998) Farbstoffapplikationen am in vitro Hirnschnittpräparat bei Weibchen in den Lobus parolfactorius durchgeführt. In der Abbildung 17 ist ein solcher 400 µm dicker Hirnschnitt im Frischpräparat zu sehen. Der Lobus parolfactorius, sowie der LMAN ist gut zu erkennen.

Abb. 17: Aufsicht auf einen 400 µm dicken nativen ungefärbten Vibratomschnitt (Lateralschnitt) von einem Zebrafinkengehirn eines adulten Weibchens. Der LMAN im anterioren Neostriatum ist auch in Weibchen recht gut erkennbar. Eine area X wurde für Weibchen bisher nicht beschrieben.
(aus: G. Kreck, Diplomarbeit 1998)

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Herr Kreck nutzte die Möglichkeit mit dem Nanoliterinjektor kleinste Farbstoffmengen extrazellulär in den Lobus olfactorius am Hirnschnitt zu applizieren, um retrograd Neurone im LMAN aufzuzeigen. Parallel dazu wurden auch Farbstoffapplikationen am Hirnschnittpräparat bei Männchen durchgeführt. Als Fluoreszenzfarbstoffe wurden Fluoro Ruby und Oregon Green eingesetzt, als nicht-fluoreszierenden Farbstoffe dienten biotinylierte Dextran Amine und Choleratoxin B. Mit den Farbstoffapplikationen konnten wir zeigen, daß auch bei Weibchen eine Projektion in den Lobus parolfactorius existiert, und diese Region der area X bei Männchen entspricht. Neben den eindeutig markierten Neuronen im LMAN, eines davon ist in der Abbildung 18 dargestellt, waren auch viele Axone mit axonalen Schwellungen markiert, die sehr wahrscheinlich Axone der Projektionsneurone aus dem DLM darstellen. Das bedeutet, daß auch bei Weibchen die Verbindungen vom DLM zum LMAN derart durch den LPO ziehen, wie es bei Männchen beobachtet wird. Stereotaktische Injektionen in den LMAN konnten retrograd neuronale Zellkörper im thalamischen Nucleus DLM markieren, womit wir eine Projektion des DLMs zum LMAN auch bei Weibchen nachgewiesen haben (Kreck und Nixdorf-Bergweiler, 1999). Bisher liegen aber keine Daten

Abb. 18: Repräsentatives BDA-markiertes Neuron im LMAN, das in eine der area X äquivalenten Region im Lobus parolfactorius bei Weibchen projiziert. Viele dieser markierten Neurone weisen Axonkollaterale auf, wie sie auch bei Männchen beobachtet wurden. Mit diesen Befunden am in vitro Hirnschnittpräparat konnte auch bei Weibchen erstmals eine Projektion vom LMAN in den Lobus parolfactorius nachgewiesen werden.
(aus: G. Kreck, Diplomarbeit 1998)

vor, ob diese durchziehenden Axone auch synaptische Kontake mit dem LPO-Areal ausbilden. Es wäre gut möglich, daß z.B. „en passant Synapsen“ ihre Information aus dem DLM bereits schon auf diese Weise an Neurone im LPO abgeben, noch bevor der LMAN, das Zielgebiet des DLMs, seine Information wiederum in den LPO abgibt. Damit könnte Information aus dem RA, der kleine axonale Verbindungen in den DLM sendet (Wild, 1993a), schneller und ohne eine weitere Verarbeitungsstufe, also ohne LMAN, motorische Information in den LPO einfließen. Interessanterweise wurden auch durchziehende Fasern aus dem LMAN zum RA im HVC entdeckt (Nixdorf-Bergweiler, Lips und Heinemann, 1995). Auch hier stellt sich die Frage nach möglichen „en passant“ Synapsen, was elektronenmikroskopisch in Verbindung mit Farbstoffapplikation nachgewiesen werden könnte. Die Entdeckung von rekursiven Schleifen beim Vogel unterstützen die Betrachtungsweise der telencephalen Projektionen als thalamo-corticales Projektionssystem (Iyengar et al., 199; Bottjer und Johnson, 1997; Vates et al., 1997; Waldman und Güntürkün, 1993).

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Die Umrisse des LMAN im Nissl-Präparat (Bottjer et al., 1989; Nixdorf-Bergweiler, 1996) entsprechen nicht immer eindeutig der Größe der LMAN-Region, wie sie mit retrograder Markierung über den RA erzielt wird (Nordeen et al., 1992) oder über ihr afferentes Innervationsgebiet (Johnson und Bottjer, 1992). Mit Farbstoffapplikationen direkt in den LMAN im Hirnschnittpräparat, konnten die Grenzen des LMANs bei Männchen und Weibchen markiert werden. Hierbei zeigte sich, daß die Umrisse des LMAN zwischen den Geschlechtern recht ähnlich sind und somit der im Nissl-Präparat definierten LMAN-Region entspricht (Nixdorf-Bergweiler, 1996; Kreck und Nixdorf-Bergweiler, 1999). Stereotaktische Farbstoffinjektionen bei Weibchen in den RA in vivo markieren ebenso gleichermaßen den LMAN (Kreck und Nixdorf-Bergweiler, 1999).

Elektrophysiologische Identifizierung afferenter und efferenter Projektionen im RA bei Männchen weisen neue Verbindungen auf.

Neurone im LMAN projizieren bekanntermaßen in den RA, der ebenso Eingänge vom HVC erhält (Bottjer et al, 1989; Herrmann und Arnold, 1991b). Die Projektion vom LMAN in den RA ist topographisch organisiert und erreicht den RA auf seiner lateral gelegenen Seite. Dabei innervieren Axone aus der lateralen Region des LMAN den ventromediale RA, der dorsale RA erhält Afferenzen aus der medial gelegenen LMAN-Region (Johnson et al., 1995). Diese Topographie bildet sich zwischen dem 20. und 35. Lebenstag aus (Iyengar et al., 1999). Auch der prämotorische Ausgang zum Nucleus Hypoglossus ist bei Männchen topographisch organisiert (Vicario, 1991), wie auch die Projektion der Motoneurone auf die verschiedenen Muskelgruppen des Syrinx (Vicario und Nottebohm, 1988; Ruan und Suthers, 1996). So könnte bereits im RA eine myotopische Organisation ausgebildet sein. In einer Studienjahresarbeit von Svenja Steinfelder (2000) konnten die Projektionen vom RA in den nXIIts anhand stereotaktischer Injektionen verifiziert werden. Der RA innerviert im Hirnstamm aber nicht nur den nXII, sondern auch den Nucleus Retroambigualis und N. Ambigualis, die an der Koordination der Atmung beteiligt sind (Vicario, 1993; Wild, 1993b). Eine andere Projektion, die ihren Ausgang in einer schmalen dorsal gelegenen RA-Region nimmt, zieht in das Mittelhirn zum Nucleus Dorsomedialis, der zum Nucleus Intercollicularis-Komplex gehört (Nottebohm et al., 1976; Wild, 1993a). Ein weiteres Projektionsgebiet stellt wiederum der DLM dar, der seine Information in die anteriore Vorderhirnbahn einspeist. Diese Projektion könnte, wie bereits erwähnt, eine interne Rückkopplungsschleife während des Singens darstellen, die besonders in der Zeit der motorischen Gesangseinübung eine wichtige Rolle einnimmt. Der RA als prämotorischer Kern weist somit vier verschiedene Zielgebiete auf. Die Axone des RAs verlassen dabei die Kernregion an der ventralen Seite, wobei die Axone sich dem Tractus Occipito-Mesencephalicus anschließen. Wir haben uns gefragt, ob es neben diesen den RA verlassenen Faserkomplex auch noch andere Ausgangsregionen für den RA gibt. Eingangsinformation bekommen die RA-Neurone sowohl vom HVC als auch vom LMAN. Da die HVC-Axone von dorsal in den RA einlaufen, die LMAN-Axone von lateral (Bottjer et al., 1989; Mooney und Konishi, 1991), fragten wir uns, ob auch in der ventralen Region HVC-Afferenzen lokalisiert sind, oder diese nur auf die weiter dorsal gelegene RA-Region treffen. Neben diesem Interesse an dem Projektionsmuster wollten wir auch mehr über die elektrophysiologischen Eigenschaften dieser in der ventralen Region gelegenen Projektionsneurone erfahren. Diese Neurone spielen sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Umsetzung der vom HVC einlaufenden Information der Muster-generierung für Gesangssequenzen (Wild, 1997).

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In einem Kooperationsprojekt mit Prof. Heinemann und Dmitry Sandakov wurden am in vitro Hirnschnittpräparat mit elektrophysiologische Methoden die Ein- und Ausgangsbe-ziehungen in der ventralen Region des RAs überprüft und die intrinsischen und extrinsischen Eigenschaften dieser Neurone bestimmt (Abb. 19). Bei der Hirnschnittpräparation wurden im Gegensatz zu den sonst benutzten Lateralschnitten, Querschnitte benutzt, um die Eingänge vom HVC und vom LMAN getrennt vorliegen zu haben (Mooney and Konishi, 1991; Kubota und Saito, 1991b). Da die Afferenzen zum RA topographisch organisiert sind, war es wichtig, immer aus dem gleichen Areal abzuleiten. Gute stabile intrazelluläre Ableitungen werden für die Stimulationsexperimente, bei denen beide Fasersysteme (HVC-RA-Projektion und LMAN-RA-Projektion) getrennt stimuliert werden, vorausgesetzt. Solche stabilen intrazellulären Ableitungen konnten zuverlässig in der ventromedialen Region des RA erzielt werden. Die Abbildung 19 zeigt erregende postsynaptische Potentiale bei Stimulation von HVC-RA Fasern (‘HVC‘) und bei Stimulation von LMAN-RA Fasern (‘LMAN‘). Die beiden Antwortreaktionen unterscheiden sich in ihrem Anstiegsverlauf, sowie in der Amplitude. Werden beide Fasersysteme gleichzeitig gereizt, so kommt es zu einer erhöhten Antwortreaktion (‘lMAN and HVC‘).

Abb. 19: Intrazelluläre Ableitungen von einem ventral gelegenen RA-Neuron während Stimulationen des HVC-RA Fasertrakts oder des LMAN-RA-Fasertrakts (untere Kurvenverläufe) oder bei gleichzeitiger Stimulation beider Fasersysteme (oberer Kurvenverlauf) am in vitro Hirnschnittpräparat adulter Männchen. Die exzitatorischen postsynaptischen Potentiale unterscheiden sich in ihrer Anstiegsflanke, sowie in ihrer Amplitude entsprechend dem aktivierten LMAN-, bzw. HVC-Eingangsfasern zum RA.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, Sandakov und Heinemann, in Vorbereitung)

Die meisten der Projektionsneurone der ventromedialen Region unterscheiden sich von anderen in der Literatur beschriebenen RA-Projektionsneuronen (Spiro et al., 1999) insofern, daß sie rhythmisch aktiv sind und konstant Aktionspotentiale mit einer hohen Spikefrequenz abfeuern. Die Amplitude der Aktionspotentiale (AP) der rhythmisch aktiven Neurone betrug im Mittel 54.5±4.5 mV, die Dauer (gemessen am Schwellenwert) 0.70±0.07 mit einer Anstiegsflanke von 0.33±0.03 msec und die dem AP folgende starke Nachhyperpolarisierung (AHP) lag bei 19.1±3.2 mV. Depolarisierende Ströme erhöhten die Spikefrequenz (400pA DC bewirkte APs mit 99 Spikes per sec). Alle Neurone antworteten entweder ausschließlich auf HVC-RA-Fasertrakt Stimulation (33 %) oder auf HVC- und LMAN-RA-Fasertrakt Stimulation (67 %) (Sandakov und Nixdorf-Bergweiler, 1998). Abbildung 20 zeigt eine antidrome Antwortreaktion bei HVC-Fasertraktstimulation, sowie bei LMAN-Fasertraktstimulation. Nach dem bisherigen Wissensstand über das Verschaltungsschema im Gesangssystem dürften aber keine antidromen Spikes bei HVC-, bzw. LMAN-Faserstimulation meßbar sein. Somit könnten unsere Befunde sehr wahrscheinlich, ähnlich wie die Befunde am LMAN, ein Hinweis für weitere Projektionen sein. Entsprechend antidromer und orthodromer Antworten können RA-Neurone der ventromedialen Region in 4

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Abb. 20: Antidrom evozierte Aktionspotentiale in ventral gelegenen RA-Neuronen adulter Zebrafinkenmännchen am in vitro Hirnschnittpräparat. (A) Eine Reizstärke von 4 V auf das HVC-RA Fasersystem dorsal vom RA ruft ein antidromes Aktionspotential im RA-Neuron hervor. (B) Bei Überschreitung des Schwellenpotentials durch LMAN-RA Faserstimulation von 2 V feuert dieses ventral gelegene RA-Neuron mit einem antidrom evozierten Aktionspotential.
(aus: Nixdorf-Bergweiler, Sandakov und Heinemann, in Vorbereitung)

Gruppen eingeteilt werden: Neurone der ersten Gruppe erhalten nur Information vom HVC (11 von 15: 73 %) oder vom LMAN (6 von 13: 47 %), Neurone der zweiten Klasse projizieren ausschließlich zu einem der beiden Kerne (zum HVC: 7 %; zum LMAN: 31 %), Neurone der dritten Gruppe bilden einen Schaltkreis mit einem Nukleus, d.h. sie erhalten/senden Information von/zum Nukleus (RA-HVC-RA: 20 %; RA-LMAN-RA: 15 %) , die vierte Gruppe betrifft Neurone, die weder mit HVC noch mit LMAN verbunden sind (n=1). Neueren Befunden zufolge müssen aber auch noch andere Kernregionen als der HVC und der LMAN in dieses Verschaltungsmuster einbezogen werden (Vates et al., 1997; Foster et al., 1997). Die vorliegende Studie erweitert damit das komplexe Verschaltungsbild von RA-Neuronen (Nixdorf-Bergweiler, Sandakov und Heinemann, in Vorbereitung).


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22.11.2006