[Seite 20↓]

3  Material und Methoden

3.1 Patienten

Dünndarmschleimhaut wurde aus dem Operationsmaterial von sechs Patienten mit Morbus Crohn gewonnen. Die Gewebeproben (Jejunum oder terminales Ileum) wurden jeweils von dem makroskopisch am wenigsten entzündlich veränderten Schleinmhautareal entnommen.

In allen Fällen wurde die Diagnose des Morbus Crohn durch die histopathologische Untersuchung des resezierten Darmabschnittes bestätigt. Zum Zeitpunkt der elektiven Operation wurde keiner der Patienten mit systemischen Steroiden oder Immunsuppressiva behandelt.

Als Kontrollpatienten dienten sechs Patienten, die nicht an einer entzündlichen Darmerkrankung litten. Bei zwei dieser Patienten wurde eine Operation nach Kausch-Whipple aufgrund eines Pankreakopfkarzinoms, bzw. einer chronischen Pankreatitis durchgeführt. Eine Patientin erhielt eine biliodigestive Anastomose wegen Gallengangstenose nach laparoskopischer Cholecystektomie. Ein Patient unterzog sich einer Magenresektion nach Billroth-II wegen rezidivierender Ulzera. Bei diesen Patienten wurden die Dünndarmschleimhautproben aus dem Jejunum bei Roux-Y-Rekonstruktion des Gastrointestinaltraktes gewonnen. Eine Gewebeprobe stammt aus dem terminalen Ileum eines Patienten, der sich einer Darmresektion aufgrund rezidivierender intestinaler Blutungen bei Angiodysplasien im terminalen Ileum und Zökum unterzog.

Alle Patienten hatten der Gewebeentnahme aus dem Operationsmaterial zugestimmt.

3.2 Tiere

Als Versuchstiere dienten 10-12 Wochen alte weibliche C57BL/6J (H-2b), DBA/2J (H-2d) und C57BL/6J x DBA/2J F1 (H-2b,d) Mäuse (The Jackson Laboratories, Bar Harbor USA), sowie männliche ACI (RT-1a) und Lewis (RT-1l) Ratten (Harlan Winkelmann, Deutschland) mit einem Körpergewicht von ca. 200-300 g. Die Tiere wurden in einem 12h/12h Tag/Nacht-Rhythmus gehalten und hatten freien Zugang [Seite 21↓]zu Wasser und Standardfutter. Das Akklimatisierungsintervall zwischen Eintreffen der Tiere und Versuchsbeginn betrug mind. eine Woche.

3.3 Krankheitsmodelle

3.3.1 Dünndarmtransplantation

Orthotope Dünndarmtransplantation wurde in Ratten sowohl in der allogenen Stammkombination ACI-Spender auf Lewis-Empfänger, als auch in der syngenen Kombination ACI-Spender auf ACI-Empfänger durchgeführt.

Die Transplantationen wurden in Standardtechnik durchgeführt (114). Dazu wurden die Tiere unter Vollnarkose mit Methoxyfluoran-Inhalation (Pittman Moore Inc., Mundelein, IL, USA) und 25 mg/kg Pentobarbital intraperitoneal (Abbott, Chicago, IL, USA) median laparotomiert. Zunächst wurde der Darm des Spendertieres vom Treitz’schen Band bis zur Ileozökalklappe dargestellt. Nach Perfusion und intraluminärer Spülung wurde der Darm mit einem Gefäßstiel, bestehend aus der Pfortader und der A. mesenterica superior mit Aortenpatch, entnommen. Dem Empfängertier wurde vor der Implantation des Spenderorgans der eigene Dünndarm komplett entfernt. Bei der Implantation des Spenderorgans wurden die Pfortader und die A. mes. sup. des Transplantates End-zu-Seit mit der Vena cava inferior, bzw. der infrarenalen Aorta anastomosiert. Proximal und distal wurde der Darm End-zu-End mit dem Empfängerdarm anastomosiert, so daß das Transplantat funktionell in den Gastrointestinaltrakt des Empfängertieres integriert wurde.

Die postoperative Immunsuppression bestand aus Tacrolimus in einer täglichen Dosis von 2 mg/kg. Diese Dosis verhindert in der vollallogenen Stammkombination ACI-in-Lewis zuverlässig eine akute Abstoßung des Transplantats (115,116).

3.3.2 Akute Graft-versus-Host-Reaktion

Als Modell einer akuten nicht-letalen Graft-versus-Host-Reaktion (GvHR) wurde ein murines “parent-into-F1-Modell“ verwendet, in dem nicht bestrahlte C57BL/6J [Seite 22↓]x DBA/2J F1 Mäuse zur Induktion der GvHR jeweils 5x107 elterliche C57BL/6J Milzzellen als intravenöse Injektion über eine Schwanzvene erhielten. Es ist mehrfach gezeigt worden (117,118), daß in dieser Stammkombination die Inokulation von 5x107 elterlichen Zellen regelmäßig zu einer akuten nicht-letalen GvHR im Empfängertier führt.

Als Kontrolltiere dienten gleichaltrige C57BL/6J und unbehandelte C57BL/6J x DBA/2J F1 Mäuse. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Tiere mittels CO2-Intoxikation getötet. Dünndarm und Milz wurden sofort zur Lymphozytenisolierung entnommen.

3.3.3 Sepsis

Weibliche C57BL/6J Mäuse erhielten zur Sepsisinduktion jeweils 2,5 mg/kg LPS (E.coli 0111:B4, Sigma, USA) in 1 ml Kochsalzlösung als intravenöse Injektion in eine Schwanzvene. Kontrolltieren wurde 1ml isotone Kochsalzlösung injiziert. 1h, 3h, 6h, 12h und 48h nach Sepsisinduktion wurden die Tiere getötet und Gewebeproben zur weiteren Analyse entnommen.

Die Gabe von 2,5 mg/kg LPS führt bei den Mäusen zu einem nicht-letalen septischen Krankheitsbild, das mit Fieber, Zytokinfreisetzung und Gewichtsabnahme einhergeht (119).

3.3.4 Intestinale Ischämie/Reperfusion

Männliche Lewis Ratten wurden unter Vollnarkose (Ketanest (100 mg/kg) / Xylacin (5 mg/kg), Äther-Inhalation) median laparatomiert. Nach Präparation der Arteria mesenterica superior (SMA) unter Schonung der Pfortader und der A. hepatica wurde der Blutfluß in der SMA selektiv aortennah mit einer Yasagil-Klemme unterbrochen. Das sofortige Abblassen des gesamten Dünndarms, sowie die Pulslosigkeit des Mesenteriums bei gleichzeitig unveränderter Perfusion der Leber diente der Kontrolle der richtigen Plazierung der Klemme. Die Ischämiedauer betrug bei allen Tieren 60 min. Fünf Minuten vor Ende der Ischämiephase wurde den Tieren entweder Interleukin-2 (40 µg/kg), Interleukin-10 (40µg/kg) oder isotone Kochsalzlösung (jeweils 1ml) intravenös in eine Penisvene injiziert. Nach [Seite 23↓]Abschluß der Ischämiephase wurde die Klemme entfernt und das Abdomen verschlossen.

Je nach Dauer der Reperfusionsphase wurden die Tiere noch während der Narkose durch aortalen Blutentzug in Narkose getötet (Reperfusionsphase <1h) oder bis zum Aufwachen aus der Narkose überwacht (Reperfusionphase >1h). Bei Reperfusionsphasen >1h wurden die Tiere nach Ende der Reperfusionsphase in erneuter tiefer Vollnarkose ebenfalls durch aortalen Blutentzug getötet. Neben den Blutproben wurden Gewebeproben aus dem Dünndarm (jeweils mittleres Jejunum und Ileum) und aus beiden Leberlappen für die nachfolgenden Untersuchungen entnommen.

Versuchsgruppen:

3.4 Zellisolierung

3.4.1 Intraepitheliale Lymphozyten

Die Isolierung humaner und tierischer IEL erfolgte mittels einer modifizierten, von Taguchi et al. (9). beschriebenen Methode.


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Durchführung:

Der Dünndarm einer Ratte oder Maus wurde mit kaltem RPMI 1640 (Bio-Whittaker, Walkersville, USA, supplementiert mit 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 2% hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS)) von Stuhl freigespült. Nachdem das Mesenterium entfernt und alle sichtbaren Peyerschen Plaques exzidiert wurden, wurde der Darm längs eröffnet und in ca. 1 cm große Stücke geschnitten.

Zur Isolierung humaner IEL aus Operationsmaterial wurde zunächst die Mukosa von der Submukosa und Muscularis des Präparats scharf abpräpariert. Die Mukosa wurde dann ebenfalls in RPMI 1640 gewaschen und in ca. 1x1 cm große Stücke geschnitten.

Die humanen oder tierischen Gewebestücke wurden dann zweimal in frischem RPMI 1640 gewaschen und in einem sterilen Erlenmeyerkolben mit auf 37°C erwärmten PBS (Phosphate-buffered-saline, ohne Calcium oder Magnesium, supplementiert mit 10% FCS und 0,1 mM Dithioerytrit) versetzt und 30 min. bei 37°C kräftig gerührt.

Nach dem Rührvorgang ließ man die Darmstücke sedimentieren und dekantierte und sammelte den Überstand, der u.a. Epithelzellen und IEL enthält. Der Rührvorgang wurde mit frischem PBS wiederholt. Bei der Isolierung humaner IEL wird der Rührvorgang dreimal durchgeführt.

Zur Entfernung von größeren Gewebestücken und Detritus wurde der gesammelte Überstand über Nylonwollesäulen gereinigt. Die Trennung der IEL von den Epithelzellen erfolgte danach mittels diskontinuierlicher Dichte­gradientenzentrifugation. Die Zellen wurden dazu in 44%iger Percoll-Lösung (44% isotones Percoll, 56% RPMI ohne FCS) resuspendiert und mit 67% Percoll-Lösung (67% isotones Percoll, 33% RPMI ohne FCS) unterschichtet. Nach Zentrifugation bei Zimmertemperatur für 20 Minuten bei 600 g wird die Interphase mit den IEL abpipettiert. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit RPMI gewaschen, in Kulturmedium resuspendiert und gezählt.


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3.4.2  Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten

Lymphozyten wurden bei Mäusen aus der Milz und bei Ratten aus der Milz, sowie mesenterialen und zervikalen Lymphknoten gewonnen.

Durchführung:

Milz oder Lymphknoten werden in einer Petrischale mit Medium (RPMI ohne FCS) mit einem Glasschliffstopfen zerdrückt. Die so gewonnene Zellsuspension wird mehrfach in Medium resuspendiert und dann durch ein Nylonnetz gefiltert. Die Zellsuspension wird einmal gewaschen und dann zur Lyse der darin enthaltenen Erythrozyten in TrisNH4HCL resuspendiert und für ca. 10 min. inkubiert. Nach der Inkubation wird die Zellsuspension dreimal gewaschen, in Kulturmedium resuspendiert und gezählt.

3.4.3 Humane periphere Blutlymphozyten

Periphere Blutlymphozyten wurden aus heparinisiertem Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll isoliert.

Durchführung:

Die heparinisierten Vollblutproben werden 1:2 mit PBS verdünnt und durchmischt. In 15 ml Falcon Röhrchen wird jeweils 3 ml Ficoll mit 9 ml der Blut/PBS-Mischung überschichtet und bei Raumtemperatur für 30 min. bei 900 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation reichern sich die Lymphozyten in der Interphase an. Nach Abpipettieren der Interphase wird die Lymphozytensuspension zweimal in HBSS gewaschen, in Kulturmedium resuspendiert und gezählt.

3.5 Durchflusszytometrie

Das Prinzip der Durchflußzytometrie beruht auf der Analyse von Fluoreszenz- und Lichtstreumerkmalen von Partikeln (Zellen), die in einer Suspension einzeln an einem Lichtstrahl vorbeigeführt werden. Idealerweise wird die zu untersuchende Zellsuspension in einem Flüssigkeitsmantel so an der Lichtquelle vorbeigeführt, daß jedes Partikel, bzw. jede Zelle einzeln wie in einer Perlenkette aufgereiht [Seite 26↓]hintereinander dem Lichtstrahl ausgesetzt wird (hydrodynamische Fokussierung). Dabei wird jedes Partikel als Event (Ereignis) vom Gerät erfaßt (120).

Das im Kreuzungspunkt zwischen dem Lichtstrahl und der Zelle entstehende Streulicht wird in verschiedenen Raumwinkeln ausgewertet und kann verschiedene Eigenschaften der Zelle wiedergeben. Die Streuung des Lichts im Engwinkel („forward scatter“ FSC) gibt Aufschluß über die Zellgröße, während die Streuung des Lichts im rechten Winkel (side scatter SSC) die Zellgranularität bestimmt. Entsprechend der FSC und SSC Charakteristika kann eine Population innerhalb der zu untersuchenden Zellsuspension für weitere Untersuchungen ausgewählt werden.

Nach Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern kann dann in der ausgewählten Population durch Fluoreszenzmessung die Verteilung und Dichte der zu untersuchenden Oberflächenantigene ermittelt werden. Dabei ist auf eine Korrektur (compensation) der sich überlappenden Emissionsspektren der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zu achten (120).

Durchführung:

Die Markierung der Zellen erfolgte bei 4°C. Die Zellen werden in FACS Medium (Hank’s balanced salt solution, 0,1% bovines Serumalbumin, 0,1% Natriumazid) resupendiert und in Aliquots à 1x106 Zellen eingesetzt. Bei Verwendung muriner Zellen werden diese zunächst 10 min. mit einem unmarkiertem anti-FcR Antikörper vorinkubiert, um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Zur Analyse humaner peripherer Blutlymphozyten wurden heparinisierte Vollblutproben verwendet, in denen nach Antikörpermarkierung die Erythrozyten lysiert wurden.

Für Zweifarben- und Dreifarben-Durchflußzytometrie werden die Zellen mit FITC-, PE- oder Cy-chrome-markierten Antikörpern für 30 min. im Dunkeln inkubiert und danach zweimal in FACS Medium gewaschen. Bei der Verwendung von Biotin-markierten Antikörpern, werden die Zellen zunächst mit FITC-AK inkubiert und danach zweimal mit FACS Medium gewaschen. Anschließend werden sie mit den entsprechenden biotinylierten AK markiert, zweimal gewaschen und in einem weiteren Schritt mit Streptavidin-PE (Southern Biotechnology Ass., Birmingham, AL, USA) für 10 min. inkubiert und schließlich nochmals gewaschen. Alle Zellen werden in 1% Paraformaldehydlösung fixiert und in einem FACScan (Becton [Seite 27↓]Dickinson & Co., Mountain View, CA) analysiert.

30.000 Ereignisse wurden im Analysenfeld für Zweifarb- und Dreifarb-Durchflußzytometrie gezählt. Das Analysenfeld wurde entsprechend der für Lymphozyten typischen Charakteristika im FSC und SSC ausgewählt und schließt Zelldebris, tote Zellen und Epithelzellen entsprechend ihrer Größe und Granularität von der Analyse aus. Die prozentualen Angaben der verschiedenen Lymphoyztenpopulationen basieren ausschließlich auf den Zellen im Analysenfeld. Die Rohdaten wurden mit Hilfe eine Computerprogramms (LYSIS II oder CellQuest Software von Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA, USA) analysiert und graphisch dargestellt.

3.5.1 Verwendete Antikörper


[Seite 28↓]

Spezies

Antigen

Fluoreszenz

Klon

Hersteller

Maus anti-Mensch

Leu-4

FITC

SK7

Becton Dickinson

San Jose, CA, USA

Maus anti-Mensch

Leu-4

Biotin

SK7

Becton Dickinson

Maus anti-Mensch

Leu-4

TC

SK7

Caltaq Laboratories

Burlingame, CA, USA

Maus anti-Mensch

CD3

FITC

UCHT1

Pharmingen

San Diego, CA USA

Maus anti-Mensch

CD4

PE

RPA-T4

Pharmingen

Maus anti-Mensch

CD8α

PE

HIT8a

Pharmingen

Maus anti-Mensch

CD16

PE

3G8

Pharmingen

Maus anti-Mensch

CD20

PE

2H7

Pharmingen

Maus anti-Mensch

αβ TCR

FITC

BMA0312

T-cell Diagnostics

Woburn, MA, USA

Maus anti-Mensch

γδ TCR

FITC

5A6.E91

Endogen

Woburn, MA, USA

Ratte anti-Maus

Fc receptor

-

2.4G2

Pharmingen

Hamster anti-Maus

CD3ε

FITC

145-2C11

Pharmingen

Ratte anti-Maus

CD4

Biotin

RM 4-5

Pharmingen

Ratte anti-Maus

CD45R/B220

FITC

Ra3-6B2

Pharmingen

Ratte anti-Maus

CD8α

Biotin

54-6.7

Pharmingen

Ratte anti-Maus

CD8α

TC

CT-CD8α

Caltaq Laboratories

Ratte anti-Maus

CD8β

R-PE

53-5.8

Pharmingen

Hamster anti-Maus

αβ TCR

FITC

H57-597

Pharmingen

Hamster anti-Maus

γδ TCR

FITC

GL3

Pharmingen

Maus anti-Maus

H-2d

FITC

SF-1.1

Pharmingen

Maus anti-Maus

H-2b

Biotin

AF6-88.5

Pharmingen

Maus anti-Maus

Vβ5.1,5.2

Biotin

MR9-4

Pharmingen

Ratte anti-Maus

Vβ6

Biotin

RR4-7

Pharmingen

Ratte anti-Maus

Vβ7

Biotin

TR310

Pharmingen

Maus anti-Maus

Vβ8.1,8.2

Biotin

MR5-2

Pharmingen

Maus anti-Maus

Vβ9

Biotin

MR10-2

Pharmingen

Ratte anti-Maus

Vβ11

Biotin

RR3-15

Pharmingen

Ratte anti-Maus

Vβ14

Biotin

14-2

Pharmingen

Maus anti-Ratte

CD3

FITC

G4.18

Pharmingen

Maus anti-Ratte

CD4

FITC

OX-35

Pharmingen

Maus anti-Ratte

CD8α

FITC

OX-8

Pharmingen

Maus anti-Ratte

αβ TCR

PE

R73

Pharmingen

Ratte anti-Ratte

RTIa

-

211-4D9-IE9

University of Pittsburgh

Ziege anti-Ratte

IgG

Biotin

R40015

Caltag Laboratories

3.6 Bestimmung der zytolytischen Aktivität isolierter Lymphozyten

Zur Bestimmung der zytotolytischen Aktivität isolierter Lymphozyten wurde ein 51Cr-Freisetzungsversuch durchgeführt. Bei diesem Experiment werden radioaktiv markierte Zielzellen mit den nicht markierten Effektorzellen (isolierten Lymphozyten) inkubiert. Die Menge der während einer festgelegten Inkubationsdauer freigesetzten Radioaktivität verhält sich proportional zur Lyse der markierten Zielzellen und ist damit ein Maß für die zytolytische Aktivität der Effektorzellen. Durch die Wahl verschiedener Zielzellen und die Zugabe von Lectinen kann sowohl die spezifische als auch die eher unspezifische „lectin-vermittelte“ zytolytische Aktivität der Effektorzellen untersucht werden (51).

Als Zielzellen dienten bei Experimenten mit humanen Lymphozyten Zellen der humanen epithelialen Kolonkarzinomzellinien DLD-1 oder Zellen der humanen Leukämiezellinie K-562. In Experimenten mit murinen IEL werden allogene (DBA/2) Zellen der Fc-Rezeptor-positiven Mastozytomzellinie P815 (H-2d positiv) als Zielzellen verwendet. Zellen der syngenen Zellinie EL-4 (H-2b positiv) dienten als negative Kontrolle. Zur Analyse der unspezifischen zytolytischen Aktivität wurde als Lectin 0,2 μg/ml des anti-CD3 mAk 145-2C11 verwendet.

In Experimenten mit IEL von Ratten wurden Zellen der murinen Mastozytomzellinie P815, sowie allogene LPS-stimulierte Lymphozyten als [Seite 29↓]Zielzellen verwendet. Syngene Lymphozyten dienen als negative Kontrolle. Als Lectin wurde hier PHA (0,5 µg/ml) verwendet.

Durchführung:

Die Zielzellen werden mit [51Cr] Natriumchromat (200 μCi / 5x106 Zellen) für eine Stunde bei 37°C inkubiert und danach dreimal in RPMI 1640 gewaschen, um überschüssiges Chrom zu entfernen. Für jedes Experiment wurden Dreifachansätze von je 2x103 radioaktiv markierter Zielzellen in 96-well Mikrotiterplatten mit steigender Anzahl von Effektorzellen (Effektor : Target Ratio von 1:10 bis 1:200) mit und ohne anti-CD3 mAk über 4-16 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen für 10 min. bei 650 g zentrifugiert und die Radioaktivität im Überstand bestimmt. Die prozentuale Zielzelllyse erechnet sich nach folgender Formel: % Zielzelllyse = [freigesetzte Radioaktivität einer Probe (cpm) - spontan freigesetzte Radioaktivität (cpm)] / [maximal freigesetzte Radioaktivität (cpm) - spontan freigesetzte Radioaktivität (cpm)] x 100%. Die spontan freigesetzte Radioaktivität aus den radioaktiv markierten Zielzellen lag bei <10% der maximal freigesetzten Radioaktivität.

3.7 Bestimmung der IFN-γ Konzentration

Das Prinzip des hier verwendeten Sandwich ELISA beruht auf dem Nachweis der zu untersuchenden Substanz durch einen spezifischen an das Probengefäß gekoppelten Antikörper. Durch Bindung an diesen Antikörper werden die Antigenmoleküle an das Probengefäß fixiert. An die Ag-Ak Komplexe wird ein zweiter Antikörper angelagert, der wiederum an ein Enzym gekoppelt ist. Die Aktivität des über Ak-Antigen-Ak (Sandwich) Technik an das Probengefäß gekoppelten Enzyms wird nach Zugabe des entsprechenden Substrats photometrisch bestimmt. Mit Hilfe von Standardkurven kann dann auf die Konzentration der zu untersuchenden Substanz in der Probe geschlossen werden (121).

Durchführung:

Frisch isolierte IEL wurden in Dreifachansätzen (2x106 Zellen/ml) mit jeweils 1x105 bestrahlten (10 Gy) P815 Zellen in 24-well Zellkulturplatten mit immobilisiertem [Seite 30↓]anti-CD3 mAk bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Kulturüberstände abgehoben und zur IFN-γ Bestimmung eingesetzt.

ELISA Mikrotiterplatten (Dynatech, Chantilly, VA, USA) wurden mit anti-IFN-γ mAk (clone R4-6A2, Pharmingen, San Diego, CA, USA) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit PBS-Tween gewaschen und zur Vemeidung unspezifischer Bindung der gesuchten Substanz an die Mikrotiterplatten erfolgte eine Blockierung mit 3% bovinem Serumalbumin in PBS-Tween. Danach wurden die Platten wieder gewaschen und mit je 100 μl Kulturüberstand oder IFN-γ Standardlösung über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Platten mit einem biotinylierten anti-IFN-γ mAk (clone XMG1.2, Pharmingen, San Diego, CA, USA) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem weiteren Waschvorgang erfolgte die Inkubation mit an Streptavidin gekoppelter alkalischer Phosphatase. Durch Zugabe des Substrats p-Nitrophenylphosphat wurde die Reaktion gestartet. Die photometrische Bestimmung der Proben erfolgte bei 405 nm. Die IFN-γ Konzentrationen der Proben wurden mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt. Für die Erstellung der Standardkurve werden Lösungen mit rekombinantem IFN-γ (Pharmingen, San Diego, CA, USA) bekannter Konzentration verwendet. Jede Bestimmung erfolgte im Dreifachansatz.

3.8 Bestimmung von Aspartat-aminotransferase und Hyaluronsäure

Der Anstieg der Aspartat-Aminotransferase (AST) im Serum diente als Maß für die hepatische Schädigung, während die Bestimmung der Hyaluronsäurekonzentration im Serum der Analyse der intestinalen Schädigung diente (122). Die Serumkonzentrationen von AST und Hyaluronsäure wurden mit handelsüblichen Reaktionskits gemessen.

3.9 Bestimmung der Stickstoffmonoxidderivate Nitrit und Nitrat

Stickstoffmonoxid (NO) reagiert in Gegenwart von Sauerstoff zu den stabilen Endprodukten Nitrit, Nitrat, sowie zu S-Nitrosothiolen (123).

Die hohe Reaktivität des NO-Moleküls gepaart mit seiner kurzen Halbwertzeit, [Seite 31↓]wirkt sich negativ auf die Präzision einer direkten Messung aus (124). Die Serumkonzentration von NO wurde deshalb durch Messung der stabilen Hauptmetabolite Nitrit und Nitrat entsprechend einer modifizierten Methode nach Grieß (124) bestimmt.

Nitrit (NO2 -) liegt in Körperflüssigkeiten hauptsächlich in oxidierter Form als Nitrat (NO3 -) vor (125). Zur spektralphotometrischen Untersuchung muß es daher zunächst vollständig zu Nitrit reduziert werden.

Dazu werden die Serumproben nach Ultrafiltration (um Störeffekte durch Serumproteine zu minimieren) mit den Kofaktoren FAD und NADPH sowie Nitratreduktase (Boehringer Mannheim, Mannheim Deutschland) versetzt und für 45 - 60 Minuten bei 30° C inkubiert. Die Quantifizierung der Nitritkonzentration erfolgte dann mittels Grießreaktion.

Das Prinzip der Grießreaktion beruht auf der Diazotisation von Sulfanilamid (Sigma Deisenhofen, Deutschland) durch das in der Probe vorliegende Nitrit. Die nachfolgende Bindung an Naphthylethylendiamin (Merck, Darmstadt Deutschland) führt zur Rotfärbung der Probe. Die damit verbundene Extinktionsänderung ist proportional zur Nitritkonzentration in der Probe und kann bei 550 nm bestimmt werden. Zur Erstellung einer Standardkurve dienten KNO3- Lösungen in Konzentrationen von 0,31 bis 80 µM.

3.10 Bestimmung der Glutathiongewebekonzentration

In einer kinetischen Reaktion kann reduziertes Glutathion (GSH) schrittweise durch DTNB (5,5`-dithiobis-(2-nitrobenzoic-acid)) zum Disulfid GSSG oxidiert werden. In Gegenwart von NADPH und Glutathion-Reduktase wird GSSG dann reduziert und kann danach erneut mit DTNB reagieren. Der Abfall der DTNB Konzentration in der Probe kann dabei photometrisch bestimmt werden. Mit Hilfe von Standardkurven kann dann die Glutathionkonzentration der Probe durch Korrelation mit dem Proteingehalt ermittelt werden. Nach Bestimmung der Gesamtkonzentration von GSH und der Konzentration des oxidierten Glutathion kann die Konzentration des reduzierten GSH wie folgt errechnet werden: reduziertes Glutathion (GSH) = Gesamt-Glutathion – oxidiertes Glutathion (GSSG) (126).


[Seite 32↓]

Durchführung:

Kryokonserviertes Gewebe wurde in eisgekühlter Meta-Phosphorsäure (m-H3PO4) homogenisiert und bei 3300 g und 0° C für 15 Minuten zentrifugiert. Nach Einstellung des pH auf 7,5 - 8,0 wurde der Überstand für die Messung des Gesamtglutathions direkt verwendet. Vor der Messung des oxidierten Glutathions muß nicht oxidiertes GSH in der Probe mit Vinylpyridin maskiert werden. Dazu wurden je 300 µl Probe mit 5 µl Vinylpyridin versetzt und 30 Minuten auf einem Rüttler inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (15 000 g, 5 min.) läßt sich die wässerige Phase für die weitere Messung von der öligen Vinylpyridin-Schicht abtrennen.

Die photometrische Analyse erfolgte bei 405 nm mittels kinetischem Recycling-Assay in 13 Zyklen, basierend auf der von Baker et al. modifizierten Methode nach Tietze (126-128). Dazu werden je 100 µl Probe mit einem Reaktionsgemisch aus NADPH, Glutathion-Reduktase und Kaliumphosphat-Puffer versetzt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 35 µl einer DTNB-Lösung gestartet.

Die Berechnung der Glutathionkonzentration erfolgte mittels einer Standardkurve, die mit Glutathionlösungen der Konzentration 0,31 µM - 10 µM, erstellt wurde.

3.11 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration in den Gewebeproben erfolgte mittels eines photometrischen Nachweise nach Lowry (129). Dazu wurden die Gewebeproben zunächst homogenisiert, mit Wasser und Aceton gewaschen und danach mit Natronlauge, Bicinochinic-Acid-Lösung und 4%-iger Kupfersulfatlösung versetzt. Danach erfolgte die photometrische Bestimmung der Lichtabsorption bei 562 nm, die proportional zum Proteingehalt der Probe ist. Mit Hilfe einer Standardkurve kann dann die Proteinkonzentration der Probe bestimmt werden.

3.12 RT-PCR Analyse der NOS-2 und HO-1mRNA-Expression

Die Technik der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ermöglicht den Nachweis auch sehr geringer Mengen mRNA in einer Gewebeprobe. Dazu wird aus dem zu [Seite 33↓]untersuchenden Gewebe die Gesamt-RNA isoliert und mit Hilfe einer reversen Transkriptase zu cDNA umgewandelt. Im nächsten Schritt, der eigentlichen Polymerase Kettenreaktion, werden dann die gewünschten Abschnitte der cDNA selektiv mit Hilfe spezifischer Primer und einer DNA-Polymerase amplifiziert und danach mittels Gelelektrophorese analysiert (130).

Durchführung:

Krykonservierte Gewebeproben wurden in einem RNA Extraktionsgemisch (4 M Guanidin-Thiocyanat, 25 mM Na-Zitrat, pH 7, 0,5% N-Lauroyl-Sarcosine, 0,1 M 2- Mercaptoethanol) aufgenommen und homogenisiert. Danach wurde das Homogenat mit Na-Acetat, Phenol und Chloroform- Isoamylalkohol versetzt und die mRNA ausgefällt. Dann wurde die RNA quantifiziert, in cDNA umgeschrieben und in der PCR zum Nachweis der gesuchten Gene eingesetzt (130,131).

Mit der gleichzeitigen Analyse eines sog. „house-keeping gene“, wie beta-actin, kann der Einsatz gleichmäßiger DNA Mengen in den untersuchten Proben kontrolliert werden.

Folgende Primer wurden von der Fa. INTERACTIVA, Ulm bezogen (131):

NOS-2

Antisense

5` CTG TAG TGT AAT CAC CAC AGC ´3

 

Sense

5` TTG GGT CTT GTT AGC CTA GTC ´3

HO-1

Antisense

5 `ATG TTG AGC AGG AAG GCG GTC ´3

 

Sense

5` AAG GAG GTG CAC ATC CGT GCA `3

β-actin

Antisense

5` ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA ´3

 

Sense

5` CGG AAC CGC TCA TTG CC ´3


[Seite 34↓]

PCR - Zyklen:

 

NOS-2

 

HO-1

 

Beta-actin

1

95° C

3 min.

 

94° C

5 min.

 

94° C

3 min.

2

95° C

30 sec

 

96° C

45 sec

 

94° C

1 min.

3

49° C

30 sec

 

65° C

45 sec

 

58° C

1 min.

4

72° C

1,5 min.

 

72° C

1 min.

 

72° C

2 min.

5

39 x

Zyklus 2 - 4

 

28 x

Zyklus 2 – 4

 

29 x

Zyklus 2 - 4

6

72° C

10 min.

 

72° C

10 min,

 

72°C

10 min.

7

4°C

 

4° C

 

4°C

Die elektrophoretische Auftrennung des PCR Produkts erfolgt in einem 1%igem Agarosegel. Die Laufzeit beträgt ca. 1,5 Stunden bei einer angelegten Spannung von 80 V. Durch Zugabe von Ethidiumbromid können die Banden nach Beendigung des Laufvorgangs unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert werden (130).

3.12.1 Quantifizierung der Gen-Expression

Die Quantifizierung der NOS-2 und HO-1 mRNA Expression in Darm und Leber erfolgte mittels real-time PCR unter Verwendung des ABI PRISM® 7700 Sequence Detection Systems (Taq Man) (132).

Die Methode basiert auf der Verwendung der 5´Nukleaseaktivität der Taq Polymerase zur Abtrennung einer nicht amplifizierbaren Hybridisierungssequenz während der Amplifikationsphase der PCR. Dazu werden zweifach-markierte fluorogene Hybridisierungssequenzen verwendet. Der eine fluoreszierende Farbstoff (FAM, 6-carboxyfluoresein) dient zum Nachweis der abgetrennten Sequenz. Das Emissionsspektrum wird dabei vom zweiten Farbstoff (TAMRA, 6 carboxy-tetramethyl-rhodamine) gequencht. Die Reaktionen werden in Echtzeit [Seite 35↓]während der logarhitmischen Phase der Amplifikation gemessen. Dabei verhält sich der Fluoreszenzanstieg des Nachweisfarbstoffes proportional zur Amplifikation der gesuchten Gensequenz. Die Anzahl der Zyklen, nach denen die Amplifikationskurve eine fixierte Schwelle oberhalb der baseline kreuzt, wird als Schwellenzyklus (Cs) definiert.

Um Unterschiede im cDNA Gehalt der verschiedenen Proben auszugleichen, werden alle Ergebnisse in Relation zur Konzentration eines sog. „house-keeping-gene“ gesetzt, dessen Expression konstant ist. In den vorliegenden Versuchen wurde β-actin als Kontrollgen eingesetzt.

Die Quantifizierung erfolgt nach der vergleichenden ΔCs Methode. Dabei wird die Differenz zwischen der mittleren CsNOS-2 oder CsHO-1 und der mittleren Cs β -Actin gebildet. Die mittleren CsNOS-2, CsHO-1 und Cs β -Actin Werte wurden durch Zweifachbestimmung ermittelt. Die relative Genexpression der untersuchten Sequenzen wird dann in einem einheitslosen Wert nach der Formel 2- Δ Cs angegeben.

Durchführung:

Die PCR wurde in einem Volumen von 25 µl durchgeführt. Darin enthalten sind 1 µl cDNA, 12,5µl Master Mix (TaqMan® Universal PCR Master Mix, Perkin-Elmer, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland), 1 µl Probe, 6 µl Primer Mix und 5,5 µl dest. Wasser.

Der erste Schritt von 2 min. bei 50°C beinhaltet die Aktivierung der Uracyl-n-Glukosylase und die Degradation kontaminierender RNA Sequenzen. Danach folgt die Denaturierung und der Start der AmpliTaq Gold DNA Polymerase bei 95°C für 10 min.. Die Amplifizierung erfolgt schließlich in einer Zweistufen PCR über 40 Zyklen (15 s Denaturierung bei 95°C und 1 min. annealing/extension bei 60°C).

3.13 Northern Blot Analyse der NOS-2 mRNA-Expression

Das Prinzip der Northern Blot Analyse beruht auf einer elektrophoretischen Auftrennung der Gesamt-RNA einer Probe und nachfolgender Detektion der [Seite 36↓]gesuchten mRNA mittels Bindung an spezifische Gensequenzen. Durch die Verwendung von Proben gleicher RNA-Konzentration kann eine quantitative Aussage über die Expression der jeweiligen Gene gemacht werden (130).

Gewebeproben für die Northern Blot Analyse wurden von unbehandelten Kontrolltieren und von Tieren nach LPS-Injektion gewonnen und sofort in flüssigen Stickstoff tiefgefroren. Als Negativ- und Positivkontrollen wurden unbehandelte und LPS-stimulierte RAW 264.7 Zellen verwendet (130).

Durchführung:

Jeweils 4 µg Kontroll - RNA und 20 µg RNA aus den Gewebeproben wurden in einem 1% Agarosegel mit 3% Formaldehyd elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde dann auf Gene Screen Membranen (Du Pont-New England Nuclear, USA) transferiert und unter ultraviolettem Licht autocrosslinked. Die Membranen wurden über Nacht mit einer Maus Makrophagen NOS-2 Sequenz (2.7 kilobase cDNA) bei 43°C in 50% deionisiertem Formamid, 0,25 M Natriumphosphat, 0,25 M NaCl-1 mM EDTA (pH 7.2), 7% Dodecylsulfat (SDS) und denaturierter Lachs Sperma DNA (100 µg/ml) hybridisiert. Die NOS-2 Sequenz wurde mittels eines random priming kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, USA) mit [32P]dCTP markiert. Die hybridisierte Membran wurde dreimal bei 53°C in 2-fach konzentrierter Kochsalzlösung mit 0,1% SDS gewaschen. Danach wurden die Membranen zweimal in einer Lösung mit 25 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA und 0.1% SDS und zweimal in einer Lösung mit 25 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA und 1% SDS gewaschen. Die autoradiographische Darstellung erfolgte durch Belichtung eines Kodak X-Omat Films bei - 70°C für drei Tage mit Verwendung eines Verstärkerschirms. Danach wurde die Membran mit kochender 5 mM EDTA-0.1% SDS-Lösung gereinigt und mit einer spezifischen Gensequenz für 18S RNA rehybridisiert.

3.14 Statistik

Zur statistischen Auswertung der Daten wurde aus allen Datensätzen der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwerts (SEM), sowie die Standardabweichung (SD) berechnet. Der statistische Unterschied zwischen nicht [Seite 37↓]verbundenen Datensätzen wurde mit Hilfe des student’s t-test ermittelt. Ein signifikanter Unterschied wurde bei p<0,05 angenommen.


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01.10.2004