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4  Ergebnisse

4.1 IEL nach Dünndarmtransplantation

4.1.1 Phänotyp

Die Untersuchungen von IEL nach Dünndarmtransplantation konzentrierten sich zunächst auf die Frage, ob der Nachweis von Lymphozyten des Empfängers in der Dünndarmmukosa als Zeichen der akuten Abstoßung gewertet werden kann.

Dazu wurden allogene Dünndarmtransplantationen in der hoch immunogenen Kombination ACI (Spender) auf Lewis (Empfänger) durchgeführt. Dieses Modell ist durch eine akute Abstoßungsreaktion innerhalb der ersten Woche nach Transplantation gekennzeichnet (116,133).

Am 6. Tag nach Dünndarmtransplantation wurden Lymphozyten aus der Darmschleimhaut der transplantierten Tiere isoliert und der Anteil an Empfängerzellen durchflußzytometrisch bestimmt (Tabelle 1). Dazu wurde auf den isolierten Lymphozyten die Expression des Spender MHC Klasse I Antigens (RT-Ia) analysiert. Zellen, die RT-Ia aufwiesen, wurden als Spenderzellen, Zellen die negativ für RT-Ia waren, wurden als Empfängerzellen klassifiziert. Als Vergleichsgruppe dienten transplantierte Tiere, bei denen die akute Abstoßungsreaktion durch Behandlung mit Tacrolimus verhindert worden war (115,116).

Tabelle 1: Prozentualer Anteil der Empfängerlymphozyten in der Transplantatmukosa nach allogener Dünndarmtransplantation.

 

akute Abstoßung

Tacrolimus

% Empfängerzellen

32,0 ± 2,5

14,6 ± 2,6*

Am 6. postop. Tag wurden Lymphozyten aus der Darmschleimhaut isoliert und die Expression des Spender MHC I (RT-1a) durchflußzytometrisch analysiert. Zellen, die kein RT-1a exprimieren, wurden als Empfängerzellen klassifiziert. Die Meßwerte sind als Mittelwert ±SEM von fünf Ratten je Gruppe angegeben. *p<0,05 vs. akute Abstoßung

Es zeigte sich, daß bei akuter Abstoßung über 30% der Lymphozyten in der [Seite 39↓]Transplantatmukosa vom Empfänger stammten (Tabelle 1).

Im Gegensatz dazu stammten bei Tieren, die mit Tacrolimus behandelt worden waren und histologisch keine Zeichen der akuten Abstoßung aufwiesen (Daten nicht dargestellt), weniger als 15% der Lymphozyten in der Dünndarmmukosa vom Empfänger. Diese Ergebnisse zeigen, daß nach allogener Dünndarmtransplantation Lymphoyzten des Empfängers sowohl bei akuter Abstoßung, als auch bei suffizienter Immunsuppression in der Transplantatmukosa nachweisbar sind. Bei akuter Abstoßung ist der Anteil von Lymphozyten des Empfängers in der Dünndarmmukosa jedoch signifikant größer als bei Tieren unter Immunsuppression.

Die nächsten Versuche dienten der phänotypischen Analyse der Empfängerzellen in der Transplantatmukosa. (Tabelle 2).

Tabelle 2:Phänotyp der Empfängerzellen in der Transplantatmukosa nach allogener Dünndarmtransplantation.

  

% Empfängerzellen

 

Kontrolle

akute Abstoßung

Tacrolimus

CD3+

75,6 ± 1,2

86,5 ± 2,9

84,3 ± 4,1

CD4+

12,8 ± 1,0

15,6 ± 2,2

13,2 ± 0,9

CD8+

69,4 ± 2,9

78,0 ± 5,1

76,5 ± 5,3

αβTCR+

67,7 ± 2,9

70,5 ± 3,9

71,2 ± 1,7

Lymphozyten wurden aus der Dünndarmmukosa am 6. Tag nach Transplantation isoliert und die Expression von Spender MHC I (RT-1a) und verschiedener T-Zell Antigene durchflußzytometrisch analysiert. Zellen, die kein RT-1a exprimieren, wurden als Empfängerzellen klassifiziert. Die Meßwerte sind als Mittelwert ±SEM von fünf Ratten je Gruppe angegeben. Als Kontrolle dienten IEL von syngen transplantierten ACI-Ratten. Die Gabe von Tacrolimus nach syngener Transplantation blieb ohne Einfluß auf den Phänotyp der isolierten IEL (Daten nicht dargestellt).

Die durchflußzytometrische Analyse der aus der Darmschleimhaut isolierten [Seite 40↓]Zellen ergab, daß die Empfängerzellen sowohl bei Tieren mit akuter Abstoßung als auch bei immunsupprimierten Tieren fast ausschließlich aus CD3+ T-Zellen mit einem dominanten CD4-CD8+ Phänotyp bestanden (Tabelle 2). Die Verteilung der Subpopulationen der infiltrierenden Zellen stimmte somit mit der nativer IEL überein, unterschied sich aber deutlich von peripheren Lymphozytenpopulationen, aus denen sich die infiltrierenden Empfängerzellen vermutlich rekrutierten.

Die Ähnlichkeit zwischen IEL und infiltrierenden Empfängerzellen zeigte sich auch bei der Expression des T-Zell Rezeptors (TCR) (Tabelle 2). Empfängerzellen bestanden ebenso wie IEL von Kontrolltieren zu lediglich 70% aus αβTCR+ Lymphozyten, wohingegen diese Zellen in peripheren Lymphozytenpopulationen meist über 95% der T-Zellen ausmachen.

Der Phänotyp der Empfängerzellen im Dünndarm war dabei unabhängig von immunsuppressiver Therapie oder Abstoßungsreaktionen. Sowohl in Tieren mit akuter Abstoßung als auch in immunsupprimierten Ratten wiesen die infiltrierenden Zellen einen Phänotyp ähnlich dem nativer IEL auf. Unbeeinflußt von der Abtoßungsreaktion und der Immunsuppression blieb auch der Phänotyp der Spender-IEL im Dünndarm (Daten nicht dargestellt).

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Dünndarmmukosa nach Dünndarmtransplantation von Empfängerzellen infiltriert wird. Die immunsuppressive Therapie mit Tacrolimus bewirkte eine Verminderung dieser Infiltration, verhinderte sie jedoch nicht vollständig und blieb auch ohne Einfluß auf den Phänotyp der einwandernden Zellen.

4.1.2 Zytotoxizität

Eine der charakteristischen Eigenschaften der IEL ist ihre zytolytische Aktivität. In Übereinstimmung mit in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen (21,23,41) wiesen bereits IEL von unbehandelten Kontrolltieren eine unspezifische zytolytische Aktivität in vitro auf (Abb. 1A).

Diese war nach Dünndarmtransplantation unverändert nachweisbar und wurde weder durch akute Abstoßung noch durch immunsuppressive Therapie mit Tacrolimus beeinflußt (Abb. 1A;B). Auch bei Kontrolltieren verursachte die [Seite 41↓]Behandlung mit Tacrolimus keine Veränderung der unspezifischen zytolytischen Aktivität der isolierten IEL.

Abbildung 1: Unspezifische zytolytische Aktivität isolierter IEL nach allogener Dünndarmtransplantation.

IEL wurden am 6. Tag nach Transplantation von Tieren mit akuter Abstoßung (schwarze Kreise A), von immunsupprimierten Tieren (schwarze Quadrate B), oder von syngen transplantierten Kontrolltieren (weiße Kreise A, B) isoliert. Die unspezifische zytolytische Aktivität der IEL wurde gegenüber Zellen der Maus-Tumorzellinie P815 nach Zugabe von PHA (0,5 μg/ml) in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Die Ergebnisse sind als % Zielzell Lyse bei verschiedenen Effektor:Target Ratios angegeben (jeweils Mittelwert ± SEM von drei Experimenten je Gruppe).

Ohne Bedeutung für die unspezfische zytolytische Aktivität der IEL war auch der Anteil von Empfängerzellen in der Dünndarmmukosa. So zeigte sich kein [Seite 42↓]Unterschied in der zytolytischen Aktivität von IEL von Tieren mit oder ohne Abstoßung, obgleich bei Tieren mit akuter Abstoßung signifikant mehr Empfängerzellen in der Darmschleimhaut nachweisbar waren als bei Tieren ohne akute Abstoßung (siehe Tabelle 1).

Abbildung 2: Spezifische zytolytische anti-Spender- (A) und anti-Empfänger- (B) Aktivität isolierter IEL nach allogener Dünndarmtransplantation.

IEL wurden am 6. Tag nach Transplantation von Tieren mit akuter Abstoßung (schwarze Kreise), von immunsupprimierten Tieren (schwarze Quadrate), oder von syngen transplantierten Kontrolltieren (weiße Kreise) isoliert und analysiert. Die spezifische zytolytische Aktivität der IEL wurde gegenüber PHA Blasten von Spender (A) oder Empfänger (B) in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Die Ergebnisse sind als % Zielzell Lyse bei verschiedenen Effektor:Target Ratios angegeben (Mittelwert ± SEM von drei separaten Experimenten je Gruppe). * p<0,05 vs. akute Abstoßung, ** p<0,01 vs. akute Abstoßung.


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Ein anderes Bild zeigte sich bei der Analyse der spezifischen zytolytischen anti-Spender-Aktivität der isolierten Lymphozyten aus der Dünndarmmukosa (Abb. 2).

Wie erwartet war bei IEL von syngen transplantierten Kontrolltieren keine spezifische anti-Spender-Aktivität nachweisbar.

IEL von Tieren mit akuter Abstoßung wiesen hingegen eine spezifische anti-Spender-Aktivität auf (Abb. 2A). Träger dieser anti-Spender-Aktivität sind vermutlich infiltrierende Lymphozyten des Empfängers, die möglicherweise so zur Gewebezerstörung des Transplantats bei akuter Abstoßung beitragen (47). Bei Tieren, die zur Abstoßungsprophylaxe mit Tacrolimus behandelt wurden, war eine signifikante Verminderung der spezifischen anti-Spender-Aktivität der isolierten IEL zu beobachten (Abb. 2A).

Es bleibt allerdings offen, ob die Verminderung der spezifischen anti-Spender-Aktivität bei den mit Tacrolimus behandelten Tieren Resultat einer direkten immunsuppressiven Wirkung von Tacrolimus war. Denkbar ist auch eine Herabsetzung der spezifischen anti-Spender-Aktivität bei diesen Tieren aufgrund des geringeren Anteils an Empfängerzellen in der Dünndarmmukosa (siehe Tabelle 1).

Abhängig von der Kombination der Empfänger- und Spendertiere kann der Verlauf nach Dünndarmtransplantation bei Ratten erheblich variieren (133,1134). In der hier verwendeten Kombination von ACI Spendern und Lewis Empfängern entwickelt sich typischerweise innerhalb einer Woche eine schwere akute Abstoßung des Transplantats, wohingegen Symptome einer Graft-versus-Host-Reaktion fehlen (133).

Überraschenderweise wiesen IEL von Tieren mit akuter Rejektion aber nicht nur die für die Abstoßung typische anti-Spender-Aktivität auf, sondern zeigten auch eine spezifische zytolytische Aktvität gegenüber Empfängerzellen wie bei Graft-versus-Host-Reaktion (Abb. 2B). Diese zytolytische anti-Empfänger- (anti-Host) Aktivität ließ sich ebenso wie die anti-Spender-Aktivität (siehe Abb. 2A) durch immunsuppressive Behandlung der Tiere mit Tacrolimus reduzieren (Abb. 2B).

Diese Ergebnisse zeigen, daß es nach Dünndarmtransplantation zu einer Migration von Empfängerzellen in die Darmschleimhaut unabhängig von einer [Seite 44↓]Abstoßungsreaktion kommen kann. Die infiltrierenden Zellen weisen dabei eine spezifische anti-Spender-Aktivität auf, die zur Gewebezerstörung des Transplantats bei akuter Abstoßung beitragen kann. Zusätzlich zeigt sich in diesem von akuter Abstoßung dominierten Modell auch eine Graft-versus-Host-Aktivität isolierter Lymphozyten im Darm.

Die spezifische zytolytische Aktivität konnte durch immunsuppressive Therapie mit Tacrolimus reduziert werden, wohingegen die unspezifische Aktivität weder durch Immunsuppression noch durch Abstoßungsreaktionen beeinflußt wurde.

4.2 IEL bei akuter Graft versus Host Reaktion

4.2.1 Phänotyp

Akute GvHR ist das immunologische Gegenstück zur akuten Abstoßung und kann in Mäusen durch Injektion elterlicher Milzzellen in unbehandelte F1 Nachkommen induziert werden (49-51). Dabei kommt es im Verlauf der Erkrankung zur Infiltration der Empfängerorgane mit Lymphozyten des Spenders und zur Gewebezerstörung insbesondere im Gastrointestinaltrakt, der Leber und der Haut (53-55).

Das Ausmaß und der Verlauf der Infiltration der Dünndarmmukosa durch Spenderzellen wurde im wöchentlichen Abstand nach Induktion der GvHR analysiert (Abb.3). Dazu wurde mittels Zweifarben-Durchflußzytometrie die Expression von Spender- (H-2b) und Empfänger- (H-2b,d) MHC auf isolierten Lymphozyten bestimmt. Zellen, die sowohl H-2d als auch H-2b exprimierten, wurden als Empfängerzellen angesehen, während Zellen, die nur H-2b aufwiesen, als Spenderzellen galten.

Im Verlauf der GvH-Erkrankung konnte eine kontinuierliche Zunahme des prozentualen Anteils an Spenderzellen im Dünndarm festgestellt werden. Diese Infiltration mit Spenderzellen war bei akuter GvHR nicht auf den Darm beschränkt, sondern konnte auch in anderen Organen, wie z.B. der Milz beobachtet werden. (Abb. 3).

Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Organen bezüglich des Ausmaßes der Spenderzellinfiltration war nur in der ersten Woche nach Induktion der GvHR nachweisbar. Zu diesem Zeitpunkt waren deutlich weniger Spenderzellen im [Seite 45↓]Dünndarm als in der Milz zu beobachten (p<0,01). Im weiteren Verlauf der Erkrankung verschwand dieser Unterschied und in beiden Organen zeigte sich ein kontinuierlich steigender Anteil an Spenderzellen (Abb.3).

Abbildung 3: Prozentualer Anteil der Spenderlymphozyten in Dünndarm und Milz während akuter GvHR.

Wöchentlich nach GvHR Induktion wurde die Expression von Spender (H-2b) und Empfänger
(H-2b,d) MHC durchflußzytometrisch auf isolierten Lymphozyten aus Milz (weiße Balken) und Dünndarm (graue Balken) bestimmt. Als Spenderzellen wurden H-2d-b+ Lymphozyten angesehen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM von vier verschiedenen Experimenten mit jeweils 5 Tieren dargestellt. * p<0,01 vs. Milz.

Die nächsten Experimente dienten der phänotypischen Analyse der infiltrierenden Spenderzellen in der Darmschleimhaut. Dabei konnte gezeigt werden, daß sich die Spenderzellen in der Darmschleimhaut erheblich von der ursprünglich injizierten Lymphozytenpopulation unterschieden (Tabelle 3).

Während von den ursprünglich injizierten Milzlymphozyten über 50% B-Zellen und nur 40% T-Zellen gewesen waren, bestanden die Spenderzellen im Darm zu jedem Zeitpunkt nur aus CD3+ T-Zellen. Diese T-Zellen waren überwiegend CD4-CD8+, während in der ursprünglich injzierten Zellsuspension CD4+CD8- Zellen überwogen hatten.


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Tabelle 3: Phänotyp der Spenderzellen in der Dünndarmmukosa bei akuter Graft versus Host Reaktion.

 

% Spenderlymphozyten

Kontrolle

 

1. Woche

2. Woche

3. Woche

>3 Monate

IEL

Milz

CD3+

91,1 ± 4,9

94,4 ± 2,4

97,1 ± 0,7

97,4 ± 1,2

92,0 ± 1,0

40,1 ± 2,8

CD4+

12,7 ± 4,2

8,1 ± 3,4

7,8 ± 0,5

15,5 ± 4,3

15,1 ± 2,8

22,3 ± 0,5

CD8+

85,2 ± 6,2

92,1 ± 1,9

91,6 ± 1,9

86,1 ± 2,3

78,6 ± 1,4

14,7 ± 1,4

CD20+

0,6 ± 0,3

0,4 ± 0,4

0,6 ± 0,2

0,5 ± 0,1

0,5 ± 0,2

52,0 ± 1,5

α/βTCR+

94,2 ± 1,6

95,3 ± 1,9

94,3 ± 1,6

43,2 ± 7,9

35,7 ± 3,5

95,7 ± 3,2

γ/δTCR+

2,9 ± 1,4

1,9 ± 0,7

1,7 ± 0,7

39,3 ± 9,2

54,8 ± 2,2

3,8 ± 2,0

Wöchentlich nach GvHR Induktion wurde die Expression der T-Zell Antigene, sowie von Spender (H-2b) und Empfänger (H-2b,d) MHC durchflußzytometrisch auf isolierten IEL bestimmt. Angegeben ist der prozentuale Anteil der Spenderzellen (H-2b+ H-2d-), die das jeweilige Oberflächenantigen aufweisen. Die Meßwerte sind als Mittelwert ± SEM von mindestens je 3 Experimenten dargestellt. Als Kontrolle dienten IEL von unbehandelten F1 Tieren, sowie Milzzellen von C57BL/6 Spendertieren.

Bei der Analyse der TCR-Expression fanden sich unterschiedliche Ergebnisse im frühen und späten Stadium der Erkrankung.

Während des ersten Monats nach GvHR-Induktion waren fast ausschließlich αβTCR+ Spenderzellen im Darm nachweisbar.Dies entsprach der ursprünglich injizierten Zellsuspension, die überwiegend αβTCR+ T-Zellen enthalten hatte. Drei Monate nach GvHR-Induktion waren jedoch nur noch knapp die Hälfte der Spenderzellen αβTCR+ und es fand sich ein Anteil von fast 40% γδTCR+ Spenderzellen im Darm (Tabelle 3).

Im Verlauf von mehreren Monaten hatten die infiltrierenden Spenderzellen sich somit nicht nur hinsichtlich der Verteilung der CD4+ und CD8+ Zellen dem Phänotyp der IEL angeglichen, sondern ähnelten IEL auch in der Verteilung von [Seite 47↓]γδTCR (Tab. 3). Der Phänotyp der Empfänger IEL blieb hingegen über den gesamten Untersuchungszeitraum unverändert (Daten nicht aufgeführt).

Eine Besonderheit der IEL ist ihr hoher Anteil an CD8αα Lymphozyten (4,18). Im Gegensatz dazu sind CD8+ Zellen anderer peripherer Lymphozytenpopulationen überwiegend als CD8αβ charakterisiert.

Abbildung 4: Prozentualer Anteil von CD8αα und CD8αβ Spender und Empfänger IEL bei akuter GvHR.

3 Wochen (oben) und 8 Wochen (unten) nach GvHR Induktion wurde die Expression von CD8α, CD8β, sowie Empfänger (H-2d) MHC auf isolierten IEL mittels Dreifarbendurchflußzytometrie bestimmt. Angegeben ist der prozentuale Anteil der H-2d- Spenderzellen (links), bzw. H-2d+ Empfängerzellen (rechts), die CD8α oder CD8β exprimieren. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment. Als Kontrollen dienten IEL von unbehandelten F1 Tieren, sowie Milzzellen von C57BL/6 Spendertieren.

Um zu klären, ob die Spenderzellen im Darm bei akuter GvHR den homodimeren CD8αα Rezeptor oder den heterodimeren CD8αβ Rezeptor aufwiesen, wurde mittels Dreifarben-Durchflußzytometrie der Anteil von Spender (H-2d-) und Empfänger (H-2d+) IEL, die CD8αα oder CD8αβ exprimierten, ermittelt (Abb. 4).


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Drei Wochen nach Induktion der GvHR bestanden die Spenderzellen überwiegend aus CD8αβ Zellen und entsprachen damit dem Verhältnis von CD8αα und CD8αβ der ursprünglich injizierten Zellpopulation.

Acht Wochen nach GvHR Induktion zeigte sich hingegen eine Zunahme der CD8αα Zellen innerhalb der Spender IEL. Die Spenderzellen wiesen zu diesem Zeitpunkt somit eine Verteilung von CD8αα und CD8αβ auf, wie IEL von unbehandelten IEL.

Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese einer selektiven Migration von Lymphozyten mit einem „IEL-ähnlichen“ Phänotyp in die Darmschleimhaut nach Dünndarmtransplantation oder akuter GvHR

Zur weiteren Charakterisierung der Spenderzellen in der Darmschleimhaut bei akuter GvHR wurde die Häufigkeit verschiedener Vβ — Populationen durchflußzytometrisch analysiert. (Tabelle 4). Da die Spenderzellen im Darm überwiegend vom Typ CD8+αβTCR+ waren (siehe Tabelle 3) wurden CD8+ Milzzellen und αβTCR+ IEL von unbehandelten C57BL/6J Spendertieren als Kontrollen verwendet.

In Übereinstimmung mit in der Literatur veröffentlichen Ergebnissen (6) waren im Darm von normalen C57BL/6 Mäusen Vβ5, Vβ6 und Vβ11 positive T-Zellen seltener anzutreffen als in der Milz dieser Tiere (Tabelle 4). Derartige Unterschiede zwischen den beiden Organen waren hingegen bei der Analyse von Vβ7, Vβ8, Vβ9 und Vβ14 positiven Lymphozyten nicht nachzuweisen.

Im Verlauf der akuten GvHR enthielten die Spenderzellen im Dünndarm signifikant weniger Vβ5, Vβ6 und Vβ11 positive Zellen als die CD8+ Milzzellen der Kontrolltiere. Im Gegensatz dazu war die Verteilung der verschiedenen Vβ der Spenderzellen identisch mit der Vβ Verteilung der IEL von Kontrolltieren (Tabelle 4). Somit unterschieden sich die Spenderzellen im Dünndarm hinsichtlich ihrer Vβ Verteilung von der ursprünglich injizierten Zellpopulation. Gleichzeitig glichen die Spenderzellen in ihrer Vβ Verteilung „normalen“ IEL.


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Tabelle 4:Vβ Repertoire der Spenderzellen im Dünndarm bei akuter GvHR.

 

Kontrollen

GvHR Spender IEL (%)

 

CD8+ Milzzellen

αβTCR+ IEL

Woche 2

Woche 3

Vβ5

10,8 ± 2,8

5,0 ± 0,6*

3,0 ± 1,5*

4,7 ± 1,5*

Vβ6

7,1 ± 0,1

3,3 ± 0,6**

4,7 ± 0,6*

3,7 ± 0,4**

Vβ7

6,0 ± 0,7

4,9 ± 0,4

5,8 ± 2,7

6,8 ± 1,6

Vβ8

13,5 ± 0,8

14,4 ± 0,8

12,1 ± 0,5

14,4 ± 1,9

Vβ9

3,0 ± 0,5

2,9 ± 0,7

3,1 ± 0,7

1,6 ± 0,3

Vβ11

8,6 ± 0,8

5,1 ± 1,2*

4,6 ± 0,6*

5,6 ± 0,8*

Vβ14

2,8 ± 0,1

3,4 ± 0,3

2,8 ± 0,5

3,2 ± 0,7

Lymphozyten wurden - wie in Material und Methoden beschrieben - isoliert, Als Kontrollpopulation dienten CD8+ Milzzellen und αβTCR+ IEL von unbehandelten C57BL/6 Tieren. In den Kontrollen wurde mittels Zweifarben-Durchflußzytometrie der prozentuale Anteil der verschiedenen Vβ Antigene bei CD8+ Milzzellen und αβTCR+ IEL bestimmt. Bei GvHR Tieren wurde der prozentuale Anteil der Spenderlymphozyten (H-2d negativ) bestimmt, die das jeweilige Vβ Antigen exprimieren. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von 4 separaten Experimenten. *p<0,04 vs. CD8+ Milzzellen, **p<0,001 vs. CD8+ Milzzellen.

Diese Ergebnisse deuten entweder auf eine bevorzugte Migration bestimmter T-Zellsubpopulationen in den Darm bei akuter GvHR oder auf ein verbessertes Überleben dieser Spendersubpopulationen. Gegen die dritte Möglichkeit der Expansion einzelner Vβ Subpopulationen der Spenderzellen bei akuter GvHR spricht, daß zwischen der zweiten und dritten Woche nach GvHR Induktion keine Veränderung in der Vβ Verteilung der Spenderzellen zu beobachten war (Tabelle 4).

Wie auch bei den vorangegangenen Untersuchungen waren zu keinem Untersuchungszeitpunkt Veränderung der Empfänger IEL hinsichtlich ihrer Vβ[Seite 50↓]Verteilung nachzuweisen (Daten nicht aufgeführt).

Zusammengefaßt zeigte sich bei der phänotypischen Analyse isolierter Lymphozyten bei akuter Graft-versus-Host-Reaktion eine kontinuierliche Zunahme der Spenderzellen in den untersuchten lymphatischen Organen. Im Dünndarm wiesen die Spenderzellen einen „organ-spezifischen“ Phänotyp auf, d.h. sie zeigten eine Verteilung der Subpopulationen wie native IEL und unterschieden sich somit erheblich von den injizierten Milzzellen. Die infiltrierenden Spenderzellen im Dünndarm bestanden ausschließlich aus CD3+ T-Zellen mit einem dominanten CD8+ Phänotyp. Zusätzlich stimmten die Spenderzellen auch in der Verteilung verschiedener Vβ Subtypen mit IEL überein. Im Verlauf der Erkrankung zeigten sich außerdem innerhalb der Spenderpopulation eine Zunahme der für IEL typischen γδTCR+ T-Zellen sowie CD8αα+ Lymphozyten.

4.2.2 Zytotoxizität

Als Motor der Gewebezerstörung in den verschiedenen Zielorganen der Graft-versus-Host-Reaktion werden infiltrierende Spenderzellen mit spezifischer anti-Host- (=anti-Empfänger) Aktivität angesehen (49). Um nachzuweisen, ob IEL während GvHR eine derartige spezifische Zytotoxizität aufweisen, wurden IEL aus dem Dünndarm isoliert und ihre zytolytische Aktivität gegenüber Zellen der Mastozytomzelllinie P815, die Empfänger MHC (H-2d) exprimieren, getestet (Abb. 5).

Wie erwartet wiesen IEL von unbehandelten F1 Kontrolltieren keine spezifische anti-Host-Aktivität gegenüber P815 Zellen auf (Abb. 5A-D).

In der ersten Woche nach GvHR Induktion war keine spezifische anti-Host-Aktivität der isolierten IEL nachweisbar. (Abb. 5A). Zu diesem frühen Zeitpunkt waren allerdings auch noch weniger als 2% der Lymphozyten in der Dünndarmmukosa Spenderzellen. (siehe Abb. 3). Dagegen war zwei Wochen nach Induktion der GvHR eine signifikant gesteigerte (p<0.01 versus Kontrolle bei E:T Ratio 200:1) anti-Host-Aktivität der isolierte IEL nachweisbar (Abb. 5B). Diese Aktivität richtete sich spezifisch gegen die H-2d positiven („Empfänger“) P815 Zellen, wohingegen bei den isolierten Zellen keine zytolytische Aktivität gegenüber [Seite 51↓]H-2b positiven („Spender“) EL-4 Zellen beobachtet wurde (Daten nicht abgebildet).

Abbildung 5: Spezifische zytolytische Aktivität isolierter IEL bei akuter GvHR.

IEL wurden wöchentlich nach GvHR Induktion von unbehandelten F1 Kontrolltieren (weiße Kreise) und von Tieren mit GvHR (schwarze Quadrate) isoliert. Die spezifische zytolytische Aktivität der isolierten IEL wurde gegenüber Zellen der Maus Mastocytomlinie P815 (H-2d = Empfänger) in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Die Ergebnisse sind als % Zielzell Lyse bei verschiedenen Effektor : Zielzell Ratios angegeben (jeweils als Mittelwert ± SEM von drei separaten Experimenten). Die spezifische Aktivität gegenüber Spenderzellen (EL-4 Zellen, H-2b) lag immer <5%. * p<0,05 vs. Kontrolle, ** p<0,01 vs. Kontrolle.

In der dritten Woche nach GvHR-Induktion war ein Abfall der zytolytischen Aktivität nachweisbar, obgleich der Anteil an Spenderzellen im Dünndarm weiter zugenommen hatte. (Abb. 5C). Im Vergleich zur Aktivität der IEL von Kontrolltieren war die zytolytische Aktivität aber noch immer signifikant erhöht (p<0.01, E:T Ratio 200:1).

Vier Wochen nach GvHR-Induktion (Abb. 5D), war kein Unterschied zwischen Kontrolltieren und GvHR-Tieren bezüglich der spezifischen Zytotoxizität mehr [Seite 52↓]nachweisbar (p>0.05). Auch zu einem späteren Zeitpunkt der Erkrankung war keine erhöhte spezifischen Zytotoxizität der isolierten IEL mehr nachweisbar (Daten nicht dargestellt).

Abbildung 6: Unspezifische zytolytische Aktivität isolierter IEL bei akuter GvHR.

IEL wurden wöchentlich nach Induktion der GvHR von unbehandelten F1 Kontrolltieren (weiße Kreise) und von Tieren mit GvHR (schwarze Quadrate) isoliert. Die CD3-vermittelte unspezifische zytolytische Aktivität der isolierten IEL wurde gegenüber Fc-Rezeptor-positiven Zellen der Maus- Mastocytomlinie P815 in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Die Ergebnisse sind als % Zielzell Lyse bei verschiedenen Effektor : Zielzell Ratios angegeben (Mittelwert ± SEM von drei separaten Experimenten). * p<0,05 vs. Kontrolle, ** p<0,01 vs. Kontrolle.

Eine weitere charakteristische Funktion der IEL ist ihre unspezifische zytolytische Aktivität, die durch anti-CD3 vermittelte Koppelung der Lymphozyten an Fc-Rezeptor positive Zielzellen ausgelöst werden kann (21,23,30-32). In Übereinstimmung mit diesen in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen ließ sich eine anti-CD3 vermittelte zytolytische Aktivität auch bei isolierten IEL von Kontrolltieren auslösen (Abb. 6).


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In Tieren mit akuter GvHR war diese unspezifische zytolytische Aktivität ab der zweiten Woche der Erkrankung deutlich erhöht (p<0.01 vs. Kontrolle bei E:T Ratio 200:1) (Abb. 6B) und erreichte Spitzenwerte während der dritten Woche nach GvHR Induktion (Abb. 6C) (p<0.003 vs. Kontrolle, bei E:T Ratio 200:1).

Vier Wochen nach GvHR-Induktion (Abb. 6D) war noch eine gegenüber der Kontrolle signifikant gesteigerte zytolytische Aktivität der IEL nachweisbar, wenngleich diese Aktivität im Vergleich zu Woche 2 und 3 nach GvHR Induktion bereits wieder abgenommen hatte.

Im weiteren Verlauf kam es zu einer stetigen Reduktion der unspezifischen Zytotoxizität der isolierten IEL, und 6 Monate nach GvHR-Induktion war kein Unterschied zwischen GvHR-Tieren und Kontrolltieren mehr nachweisbar (Daten nicht dargestellt).

Zusammengefaßt läßt sich bei akuter GvHR eine kontinuierliche Migration von Spenderzellen in die Dünndarmmukosa nachweisen. Ähnlich wie bei Ratten nach Dünndarmtransplantation weisen die infiltrierenden Zellen einen Phänotyp auf, der identisch ist mit dem nativer IEL. Zusätzlich kommt es im Verlauf der GvHR zu einer vorübergehenden erheblichen Steigerung sowohl der unspezifischen wie auch der spezifischen zytolytischen Aktivität isolierter Lymphozyten.

4.3 IEL bei Sepsis

4.3.1 Zytotoxizität

Septikämie als Modell einer gram-negativen Infektion wurde durch intravenöse Gabe von 2,5 mg/kg E. coli LPS in C57BL/6 Mäusen ausgelöst. In dieser Dosierung führt LPS bei den Tieren zu einem nicht-letalen septischen Krankheitsbild, das durch Fieber, Zytokinfreisetzung, Gewichtsabnahme und reduzierte Nahrungsaufnahme charakterisiert ist. (119,135).

Wie bereits gezeigt (siehe Abb. 6), weisen IEL von Mäusen eine unspezifische zytolytische Aktivität auf, die sich in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch demonstrieren läßt. Nach Injektion von LPS war diese unspezifische zytolytische Aktivität der IEL signifikant gesteigert (Abb. 7).


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Abbildung 7: Unspezifische zytolytische Aktivität isolierter IEL nach Septikämie

IEL wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach Sepsisinduktion von unbehandelten Kontrolltieren (Quadrate) und von Tieren mit Septikämie (Kreise) isoliert. Die CD3-vermittelte unspezifische zytolytische Aktivität der isolierten Zellen wurde gegenüber Fc-Rezeptor-positiven Zellen der Maus Mastocytomlinie P815 in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Inkubationsdauer 4 Stunden Die Ergebnisse sind als % Zielzell Lyse bei verschiedenen Effektor : Zielzell Ratios angegeben (jeweils als Mittelwert ± SEM von drei separaten Experimenten je Gruppe). * p<0,05 vs. Kontrolle, ** p<0,01 vs. Kontrolle.

Eine Erhöhung der zytolytischen Aktivität der IEL war sechs Stunden nach Septikämie noch nicht nachweisbar (Abb. 8A), wohingegen 12 und 24 Stunden nach Septikämie die zytolytische Aktivität der IEL signifikant erhöht war (Abb. 8B,C). 48 Stunden nach Septikämie war die zytolytische Aktivität wieder auf das Ausgangsniveau zurückgekehrt (Abb. 8D).

Eine Erklärung für die gesteigerte zytolytische Aktivität der IEL nach Septikämie basiert entweder auf der Vorstellung einer funktionellen Aktivierung existierender Zellen, oder der Expansion einer oder mehrerer zytolytisch aktiver [Seite 55↓]Subpopulationen der IEL.

4.3.2 Phänotyp

Zur Klärung dieser Fragestellung erfolgte die phänotypische Analyse der IEL zu verschiedenen Zeitpunkten nach Septikämie mittels Zweifarben-Durchflußzytometrie (Tabelle 5).

Tabelle 5: Phänotyp isolierter IEL nach LPS-Injektion.

  

Zeitpunkt nach LPS-Injektion

 

Kontrolle

12 Stunden

24 Stunden

48 Stunden

CD3+

88,9 ± 2,8

89,8 ± 2,7

92,4 ± 1,2

92,7 ± 0,1

CD3+CD4+

4,3 ± 0,5

4,6 ± 1,4

3,0 ± 1,1

3,6 ± 1,0

CD3+CD8α+

80,1 ± 3,6

79,9 ± 3,3

82,1 ± 0,5

84,5 ± 1,8

CD3+αβTCR+

26,0 ± 1,1

27,7 ± 1,0

24,1 ± 1,4

25,8 ± 1,0

CD3+γδTCR+

65,1 ± 3,5

61,7 ± 3,5

67,9 ± 1,6

66,9 ± 1,2

IEL wurden aus der Dünndarmschleimhaut von Mäusen nach Gabe von 2,5 mg/kg LPS und von unbehandelten Kontrolltieren isoliert. Mittels Zweifarbendurchflußzytometrie wurde die Expression verschiedener T-Zell-Antigene analysiert und der prozentuale Anteil der verschiedenen Subpopulationen ermittelt. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von drei separaten Experimenten.

Zu keinem Zeitpunkt nach LPS-Gabe konnte eine phänotypische Veränderung der isolierten IEL nachgewiesen werden. Zu allen untersuchten Zeitpunkten bestanden die IEL fast ausschließlich aus CD3+ T-Zellen mit einem vorherrschenden CD4-CD8+ Phänotyp. Ebensowenig waren Veränderungen im Verhältnis von αβTCR+ und γδTCR+ Zellen der IEL nach LPS-Gabe nachweisbar (Tabelle 5).

Demnach war die Aktivierung der IEL nach Septikämie nicht von einer Expansion einer oder mehrerer Subpopulationen begleitet.


[Seite 56↓]

4.3.3  Zytokinproduktion

Im zeitlichen Verlauf der Zytotoxizität der IEL zeigte sich der Anstieg der zytolytischen Aktivität erst relativ spät, 12 Stunden nach LPS-Injektion. Um festzustellen, ob es bereits zu einem früheren Zeitpunkt nach LPS-Gabe zu einer Aktivierung der IEL kommt, wurde in den nächsten Experimenten die Zytokinproduktion (IFN-γ) der IEL nach Septikämie mittels ELISA analysiert (Abb. 8).

Abbildung 8:IFN-γ Produktion isolierter IEL nach Septikämie

IEL wurden aus der Dünndarmschleimhaut von Kontrolltieren (weiße Säulen) oder von Tieren nach LPS-Injektion (graue Säulen) isoliert und kultiviert wie in Material und Methoden beschrieben. Nach 24 Stunden wurden die Kulturüberstände gesammelt und die IFN-γ Konzentration in den Überständen mittels ELISA bestimmt. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von drei Experimenten zu jedem Zeitpunkt. * p<0,01 vs. Kontrolle, **p<0,001 vs. Kontrolle.

Eine signifikant (p<0.001) gesteigerte Freisetzung von IFN-γ durch die isolierten IEL konnte bereits drei Stunden nach LPS-Injektion beobachtet werden. Diese gesteigerte Zytokinproduktion der IEL war bis zu 24 Stunden nach Septikämie nachweisbar (Abb. 8). Die Steigerung der Zytokinproduktion der IEL nach Septikämie ging somit der Steigerung der zytolytischen Aktivität der IEL nach Septikämie voraus.


[Seite 57↓]

4.3.4  NOS-2 Expression

LPS führt im Darm neben der lymphozytären Aktivierung auch zu einer gesteigerten Expression der induzierbaren Stickstoffmonoxid Synthase (NOS-2) (100,136). Da IEL, möglicherweise über die Produktion von IFN-γ, Anteil an der Regulation der NOS-2 Expression im Darm und der damit verbundene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) haben (28), wurde in den nächsten Experimenten die Expression der NOS-2 mRNA im Darm nach Septikämie mittels Northern Blot Analyse bestimmt (Abb.9).

Dabei zeigte sich zunächst eine „konstitutive“ Expression der NOS-2 mRNA im Darm. Diese konstitutive NOS-2 Expression war auf das Ileum beschränkt und war in verschiedenen Mausarten (C57BL/6, DBA/2J) nachweisbar (Daten nicht dargestellt). Unbeeinflußt war die konstitutive NOS-2 Expression der Darmschleimhaut von der Kompetenz des Immunsystems, da sie auch in Nacktmäusen und Tieren mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID) nachweisbar war. Ebenso blieb die Besiedelung des Gastrointestinaltraktes oder die Nahrungsaufnahme ohne Einfluß auf die NOS-2 Expression (Daten nicht dargestellt, siehe auch 100).

Nach Endotoxinämie zeigte die Northern Blot Analyse eine im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant vermehrte Expression der NOS-2 mRNA in allen Dünndarmabschnitten bereits 3 Stunden nach LPS-Injektion. (Abb. 9). Die gesteigerte NOS-2 mRNA-Expression war bis zu 24 Stunden nach LPS-Injektion im Darm nachweisbar.

Es bestand jedoch ein erheblicher Unterschied in der NOS-2 mRNA-Expression in den verschiedenen Dünndarmabschnitten. Im Jejunum, dem Darmabschnitt ohne konstitutive NOS-2 Expression, war NOS-2 mRNA-Expression nur während der ersten sechs Stunden nach LPS-Injektion nachweisbar. Im Ileum hingegen, war die gesteigerte NOS-2 Expression bis zu 24 Stunden nach LPS-Injektion zu beobachten.


[Seite 58↓]

Abbildung 9: NOS-2 mRNA-Expression im Darm nach Septikämie

Gewebeproben wurden aus Jejunum und Ileum 3, 6, 12 und 24 Stunden nach LPS-Injektion oder von Kontrolltieren gewonnnen. Als Negativ- und Positiv-Kontrollen wurden unbehandelte, bzw. mit LPS stimulierte RAW 264.7 Zellen verwendet. Die Blots wurden mit einer spezifischen NOS-2 Gensequenz und einer 18S RNA-Gensequenz hybridisiert.

Es konnte somit gezeigt werden, daß es nach Septikämie zu einer sequentiellen Aktivierung verschiedener Abwehrmechanismen in der Darmschleimhaut kommt. Bereits wenige Stunden nach der Gabe von LPS konnte eine verstärkte Produktion von IFN-γ durch IEL nachgewiesen werden. Gleichzeitig kam es, möglicherweise induziert durch IFN-γ, zu einer vermehrten Expression der NOS-2 mRNA in der Dünndarmmukosa. Zwölf Stunden nach Septikämie konnte dann eine Steigerung der zytolytischen Aktivität der isolierten IEL beobachtet werden.

Alle Veränderungen waren in dem gewählten nicht-letalen Sepsismodell reversibel und waren 48 Stunden nach der LPS Gabe nicht mehr nachweisbar.

4.4 IEL bei Morbus Crohn

Bei den bislang erörterten Modellen intestinaler Erkrankungen standen entweder die Reaktionen des Immunsystems gegenüber allogenen Antigenen (GvHR und [Seite 59↓]akute Abstoßung) oder gegenüber bakteriellen Antigenen (Sepsis) im Mittelpunkt der Untersuchungen. Gemeinsam war all diesen Modellen ein zumindest anfangs intaktes Immunsystem. Demgegenüber liegt den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen vermutlich eine gestörte Regulation von B-Zell- und T-Zell- Funktion in der Darmschleimhaut zugrunde (71-73,79).

Um mögliche Veränderungen der IEL bei entzündlichen Darmerkrankungen zu analysieren, wurden daher Phänotyp und Funktion der IEL von Patienten mit Morbus Crohn mit Phänotyp und Funktion peripherer Blutlymphozyten derselben Patienten und Lymphozyten gesunder Kontrollpatienten verglichen.

4.4.1 Phänotyp

Bei der phänotypischen Analyse der isolierten IEL mittels Zweifarben-Durchflußzytometrie zeigte sich, daß sowohl IEL von Patienten mit Morbus Crohn, als auch IEL von Kontrollpatienten überwiegend aus CD3+ T-Zellen bestanden und keine B-Zellen enthielten (Tabelle 6). Ferner lag in beiden untersuchten Patientengruppen der Anteil an CD3-CD16+ NK-Zellen unter 2%.

Auffallend war der hohe Anteil (annähernd 20%) sog. „null-cells“ innerhalb der IEL Population (Daten nicht dargestellt). Derartige Zellen, die aufgrund ihrer Größe und Granularität Lymphozyten ähnlich sind, ohne jedoch Lymphozyten- oder NK-Zell-Marker aufzuweisen, sind beschrieben, ihre Funktion ist bislang aber nicht bekannt (27).

Bei den Kontrollpatienten war eine breite Streuung der prozentualen Anteile von CD4+ und CD8+ IEL zu beobachten, so daß die Mittelwerte der Messungen das tatsächliche Überwiegen der CD8+ Zellen bei den einzelnen Patienten nicht überzeugend widerspiegelt.

Im Vergleich zur Kontrollpopulation zeigten IEL von allen Patienten mit Morbus Crohn einen signifikant (p<0,04) gesteigerten Anteil der CD8+ Zellen, was sich in der Reduktion der CD4/CD8 Ratio niederschlug (Tabelle 6). Zusätzlich zeigte sich bei Patienten mit Morbus Crohn ein Anstieg der γδTCR+ Zellen innerhalb der IEL Population. Aufgrund der hohen interindividuellen Variabilität war diese Zunahme der γδ+ Zellen im Vergleich zu Kontrollpopulation aber nicht signifikant [Seite 60↓]unterschiedlich.

Tabelle 6: Phänotyp intestinaler IEL bei Morbus Crohn.

 

IEL

 

Kontrolle

Morbus Crohn

CD3+

62,4 ± 9,4

73,6 ± 11,5

CD3+CD4+

28,8 ± 7,8

17,5 ± 5,4*

CD3+CD8+

31,7 ± 11,4

59,6 ± 10,8*

CD3+αβTCR+

66,5 ± 11,5

67,8 ± 13,2

CD3+γδTCR+

3,6 ± 1,6

7,0 ± 4,2

CD20+

1,1 ± 0,8

0,7 ± 0,4

CD3-CD16+

2,1 ± 0,2

0,8 ± 0,2

CD4/CD8 Ratio

1,0 ± 0,5

0,4 ± 0,2

IEL wurden aus der Darmschleimhaut von Patienten mit Morbus Crohn und von Kontrollpatienten isoliert. Mittels Zweifarbendurchflußzytometrie wurde die Expression verschiedener T-Zell Antigene analysiert und der prozentuale Anteil der verschiedenen Subpopulationen ermittelt. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von 6 Patienten je Gruppe. * p<0,04 vs. Kontrolle

Bei der phänotypischen Analyse der peripheren Blutlymphozyten ließen sich keine Unterschiede in der Expression von CD3, CD4, CD8, CD20, αβTCR und γδTCR zwischen Patienten mit Morbus Crohn und Kontrollpatienten feststellen (Tabelle 7).

Die T-Zellen beider Patientengruppen waren überwiegend CD4+ und ca. 20% der Lymphozyten wiesen den B-Zell-Marker CD20 auf. In beiden Patientenkollektiven waren die T-Zellen überwiegend αβTCR+.


[Seite 61↓]

Tabelle 7: Phänotyp peripherer Blutlymphozyten bei Morbus Crohn.

 

periphere Blutlymphozyten

 

Kontrolle

Morbus Crohn

CD3+

72,1 ± 8,3

72,3 ± 9,8

CD3+CD4+

47,5 ± 7,4

43,6 ± 6,2

CD3+CD8+

22,0 ± 5,9

28,3 ± 7,7

CD3+αβTCR+

70,4 ± 8,0

70,3 ± 9,9

CD3+γδTCR+

2,0 ± 1,2

2,3 ± 1,1

CD20+

14,7 ± 1,0

14,5 ± 5,5

CD3-CD16+

11,3 ± 5,2

4,3 ± 1,6*

CD4/CD8 Ratio

2,1 ± 0,4

1,8 ± 1,0

Mittels Zweifarbendurchflußzytometrie wurde die Expression verschiedener T-Zell Antigene auf peripheren Blutlymphozyten in heparinisierten Blutproben analysiert und der prozentuale Anteil der verschiedenen Subpopulationen ermittelt. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von 6 Patienten je Gruppe. Alle Blutproben von Patienten mit Morbus Crohn und von Kontrollpatienten wurden präoperativ gewonnen. * p<0,01 versus Kontrolle.

Ein signifikanter (p<0,01) Unterschied zwischen Kontrollpatienten und Patienten mit Morbus Crohn bestand im Gehalt an NK-Zellen im peripheren Blut. Im peripheren Blut von Patienten mit Morbus Crohn waren deutlich weniger NK-Zellen als im Blut von Kontrollpatienten nachweisbar. Während bei Kontrollpatienten der Anteil von NK-Zellen zwischen 10,7% und 26,2% schwankte, waren bei Patienten mit Morbus Crohn regelmäßig weniger als 5% der peripheren Blutlymphozyten CD3-CD16+ NK-Zellen (Tabelle 7).


[Seite 62↓]

4.4.2  Zytotoxizität

Der Anstieg von CD8+ Zellen in der Darmschleimhaut von Patienten mit Morbus Crohn war begleitet von einem signifikanten Anstieg der unspezifischen zytolytischen Aktivität der isolierten IEL. (Abb. 10 A).

Abbildung 10: Zytolytische Aktivität isolierter IEL bei Morbus Crohn

Die zytolytische Aktivität isolierter IEL von Patienten mit Morbus Crohn (ν) oder Kontrollpatienten (σ) wurde gegenüber der humanen Adenokarzinomzellinie DLD-1 (A) und der NK-sensitiven humanen Leukämiezellinie K562 (B) in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Inkubationsdauer 16 Stunden. * p<0.05 vs. Kontrolle.

In Übereinstimmung mit den in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen (40,41) richtete sich diese unspezifische zytolytische Aktivität der IEL, die auch bei Kontrollpatienten nachweisbar war, gegen Zellen epithelialen Ursprungs, wie z.B. [Seite 63↓]die humanen Colonkarzinomzellen DLD-1 (Abb. 10 A). Die zytolytische Aktivität war nicht MHC restringiert, da DLD-1 Zellen praktisch kein MHC I exprimieren (40). Ebensowenig handelt es sich bei dieser Aktivität um NK-Aktivität, da weder IEL von Patienten mit Morbus Crohn noch IEL von Kontrollpatienten zytolytische Aktivität gegenüber den NK-sensitiven K562 Zellen entfalteten (Abb. 10 B).

Abbildung 11: Zytolytische Aktivität isolierter Lymphozyten des peripheren Bluts bei Morbus Crohn.

Die zytolytische Aktivität isolierter peripherer Blutlymphozyten von Patienten mit Morbus Crohn (ν) oder Kontrollpatienten (σ) wurde gegenüber der humanen Adenokarzinomzellinie DLD-1 (A) und der NK-sensitiven humanen Leukämiezellinie K562 (B) in einem 51[Cr]-Freisetzungsversuch bestimmt. Inkubationsdauer 16 Stunden. * p<0,05 vs. Kontrolle.

Um festzustellen, ob diese erhöhte zytolytische Aktivität bei Patienten mit Morbus [Seite 64↓]Crohn auf die intestinalen Lymphozyten beschränkt war, oder sich auch bei peripheren Lymphozyten nachweisen ließ, wurden die zytolytische Aktivität von Lymphozyten des peripheren Bluts gegenüber den gleichen Zielzellen analysiert (Abb. 11).

In beiden Patientenkollektiven war nur eine minimale zytolytische Aktivität gegenüber DLD-1 Zellen nachweisbar (Abb. 11A) und es bestand kein Unterschied zwischen Patienten mit Morbus Crohn und Kontrollpatienten. Im Gegensatz zu IEL wiesen periphere Lymphozyten eine zytolytische Aktivität gegenüber den NK-sensitiven K562 Zellen auf, jedoch war auch hier kein Unterschied zwischen Kontrollpatienten und Patienten mit Morbus Crohn festzustellen (Abb. 11B).

Diese Ergebnisse weisen auf eine selektive Aktivierung intestinaler Lymphozyten bei Patienten mit Morbus Crohn hin. Die lymphozytäre Aktivierung war begleitet von einem Anstieg der CD8+ IEL bei Patienten mit Morbus Crohn.

Im Gegensatz zur Aktivierung der intestinalen Lymphozyten war keine funktionelle Aktivierung der peripheren Lymphozyten bei Morbus Crohn zu beobachten. Die Bedeutung der von uns beobachteten Verminderung der NK-Zellen im peripheren Blut bei Patienten mit Morbus Crohn bleibt bislang unklar.

4.5 Intestinale Ischämie/Reperfusion

Gewebeschädigung aufgrund Ischämie und nachfolgender Reperfusion eines Organs treten bei einer Vielzahl chirurgisch relevanter Krankheitsbilder, wie z.B. Mesenterialinfarkt, inkarzerierter Hernie oder Volvulus auf (81,82). Ein etabliertes Modell einer intestinalen Ischämie und Reperfusion (I/R) ist die selektive Unterbrechung des Blutflusses in der Arteria mesenterica superior über einen definierten Zeitraum mit nachfolgender Reperfusion des Darmes (82,83,86,90).

4.5.1 Ausmass der Gewebeschädigung

In dem beschriebenen Modell der selektiven intestinalen Ischämie und Reperfusion wurde zunächst das Ausmaß der intestinalen Schädigung anhand der [Seite 65↓]Steigerung der Hyaluronsäurekonzentration (122) im Serum bestimmt (Tabelle 8). Da im Rahmen des I/RS eine gleichzeitige Schädigung primär nicht ischämischer Organe, wie z.B. Lunge oder Leber beschrieben ist (83-85), wurde außerdem die hepatische Schädigung nach intestinaler I/R anhand des Anstiegs der Aspartat-amino-transferase (AST) im Serum analysiert (Tabelle 8).

Tabelle 8: Intestinale und hepatische Schädigung nach intestinaler Ischämie.

 

Kontrolle

Ischämie/Reperfusion

Hyaluronsäure (IU/ml)

52 ± 7

349 ± 120*

AST (IU/ml)

80 ± 8

198 ± 12*

Alle Blutproben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und nachfolgender 60 min. Reperfusionsphase durch aortale Punktion gewonnen. Kontrolltiere wurden nur laparotomiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von jeweils 5 Ratten je Gruppe. * p<0,01 versus Kontrolle

Wie erwartet zeigte sich nach Ischämie und Reperfusion des Dünndarms nicht nur eine intestinale Schädigung, sichtbar an der signifikanten (p<0,01 versus Kontrolle) Steigerung der Hyaluronsäurekonzentration im Serum, sondern auch ein signifikanter (p<0,01 versus Kontrolle) Anstieg der AST als Hinweis auf eine hepatische Schädigung.

4.5.2 Glutathionhaushalt

Ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung von Organschäden nach I/R ist die Freisetzung von reaktiven Radikalen (83,84). Schutz vor dieser oxidativen Radikalwirkung bieten endogene Antioxidantien, wie z.B. das Glutathionsystem, das u.a. als Protonendonator zum Abbau der Radikale beitragen kann (103,137).

Glutathion liegt in der Zelle zu über 99% in der reduzierten Form (GSH) vor. Der Konzentrationsabfall der reduzierten, bzw. der Anstieg der oxidierten Form (GSSG) wird häufig als Ausdruck der verbrauchten antioxidativen Kapazität der Zelle interpretiert. In dem hier verwendeten Modell diente der Abfall der GSH-Konzentration in Darm und Leber als indirektes Maß des oxidativen Streß nach [Seite 66↓]intestinaler I/R.

Intestinale I/R führte in beiden Organen zu einer Herabsetzung der Gesamt-GSH-Gewebekonzentration (Tabelle 9). Während im Darm dieser GSH-Abfall nur während der ersten Stunde nach I/R zu beobachten war, zeigte sich in der Leber eine deutliche Minderung der GSH-Gewebekonzentration bis zu 4 Stunden nach Reperfusion.

Tabelle 9: GSH-Konzentration in Darm und Leber nach intestinaler I/R

 

GSH-Gewebekonzentration (nmol/mg Protein)

 

Dünndarm

Leber

Kontrolle

28,7 ± 4,2

30 ± 8,3

Ischämie, 1 h Reperfusion

20,8 ± 6,1*

21,5 ± 5,5*

Ischämie, 4 h Reperfusion

28 ± 3,8

11,3 ± 2,9**

Ischämie, 24 h Reperfusion

36 ± 4,2

37,4 ± 5,1

Die Gewebeproben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und der angegebenen nachfolgenden Reperfusionsphase gewonnen und sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von jeweils 5 Ratten je Gruppe. *p<0,05 versus Kontrolle, **p<0,01 versus Kontrolle

In beiden Organen war 24 Stunden nach I/R keine Veränderung der GSH-Gewebekonzentration mehr nachweisbar. Sowohl im Darm als auch in der Leber war zu diesem Zeitpunkt eine diskrete Steigerung der GSH-Gewebekonzentration über das Ausgangsniveau hinaus zu beobachten. Diese Steigerung der GSH-Gewebekonzentration erreichte jedoch keine statistische Signifikanz (p>0,05).

4.5.3 Modulation des I/R-Schadens

Die Bedeutung der inflammatorischen Antwort im Ischämie/Reperfusionsschaden (I/RS) ist noch umstritten. Lane et al. berichten über eine Minderung des I/RS [Seite 67↓]nach Gabe des anti-inflammatorischen Interleukin-10 (98). Um den Effekt anti-inflammatorischer und pro-inflammatorischer Zytokine auf den Gewebeschaden nach intestinaler I/R zu analysieren wurde in den nächsten Versuchen versucht, den I/RS durch Zytokingabe zu modulieren. Dazu wurde den Tieren 5 min. vor Reperfusion entweder das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 (40 µg/kg) oder das pro-inflammatorische Zytokin IL-2 (40 µg/kg) intravenös appliziert. Kontrolltiere erhielten ledigliche isotone Kochsalzlösung.

4.5.3.1 Ausmass des Gewebeschadens

Die Analyse von AST und Hyaluronsäure im Serum nach der Gabe des anti-inflammatorischen IL-10 deutete überraschenderweise nicht auf eine Minderung, sondern auf eine Zunahme des Gewebeschadens sowohl im Dünndarm als auch in der Leber hin (Tabelle 10).

Tabelle 10: Intestinale und hepatische Schädigung nach Modulation des intestinalen I/RS

  

Ischämie / Reperfusion

 

Kontrolle

I/R

I/R + IL-2

I/R + IL-10

Hyaluronsäure (IU/ml)

52 ± 7

349 ± 120*

570 ± 215*

538 ± 110*§

AST (IU/ml)

80 ± 8

198 ± 12*

150 ± 20*§

250 ± 20*§

Alle Blutproben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und nachfolgender 60 min. Reperfusionsphase durch aortale Punktion gewonnen. Kontrolltiere wurden nur laparotomiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von jeweils 5 Ratten je Gruppe. * p<0,05 versus Kontrolle, § p>0,05 versus I/R

Im Gegensatz dazu führte die Gabe von IL-2 zu unterschiedlichen Effekten in Darm und Leber. In der Leber war eine Abnahme der Gewebeschädigung zu beobachten, die sich in einer signifikant verringerten AST-Freisetzung niederschlug.


[Seite 68↓]

Im Darm war eine derartige Minderung der Gewebeschädigung nach IL-2-Gabe hingegen nicht zu beobachten (Tab. 10). Es kam hier zu einer Zunahme der Hyaluronsäurefreisetzung, die jedoch aufgrund der hohen Variabilität der Meßwerte im Vergleich zu Tieren, die einer alleinigen intestinalen Ischämie unterworfen wurden, keine statistische Signifikanz erreichte.

4.5.3.2 Glutathionhaushalt

Es stellte sich nun die Frage, welche Mechanismen den unterschiedlichen Effekten der Modulation des I/RS durch IL-2 und IL-10 zugrunde liegen. Dazu sollten zunächst die Auswirkungen auf den Glutathionhaushalt untersucht werden (Tabelle 11).

Tabelle 11: GSH-Konzentration im Dünndarm nach Modulation des I/RS.

 

GSH-Gewebekonzentration (nmol/mg Protein)

 

I/R

I/R + IL-2

I/R + IL-10

Kontrolle

28,7 ± 4,2

28,7 ± 4,2

28,7 ± 4,2

Ischämie, 1 h Reperfusion

20,8 ± 6,1

16,8 ± 4,2

8,9 ± 6,2*

Ischämie, 4 h Reperfusion

28 ± 3,8

18,7 ± 4,1

15,9 ± 5,5*

Ischämie, 24 h Reperfusion

36 ± 4,2

19,5 ± 3,9*

18,1 ± 3,6*

Die Gewebeproben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und der angegebenen nachfolgenden Reperfusionsphase asserviert und bis zur Analyse in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von jeweils 5 Ratten je Gruppe. *p<0,05 versus I/R

Im Dünndarm kam es nach Modulation des I/RS mit IL-10 zu einer im Vergleich zum alleinigen I/R ausgeprägten Senkung der GSH-Gewebekonzentration eine Stunde nach Reperfusion (Tabelle 11). Im Gegensatz dazu war nach IL-2-Gabe kein Unterschied im GSH-Haushalt von Tieren mit alleinigem I/RS und Tieren [Seite 69↓]nach IL-2-Gabe auszumachen. Sowohl Tiere mit alleinigem I/RS als auch Tiere, die mit IL-2 behandelt worden waren, wiesen einen Abfall der GSH-Gewebekonzentration im Dünndarm auf.

Die bei Tieren nach alleiniger I/R beobachtete Normalisierung der GSH-Konzentration innerhalb 24 Stunden nach Reperfusion war nach Modulation des I/RS nicht zu beobachten. Sowohl nach IL-10-, als auch nach IL-2-Gabe waren die GSH-Konzentrationen im Darm bis 24 Stunden nach Reperfusion noch deutlich vermindert (Tabelle 11).

Abbildung 12: Intestinale GSH-Konzentration und Serumkonzentration der Hyaluronsäure nach Modulation des I/RS.

Die GSH-Konzentration wurde in Gewebeproben und die HA-Konzentration im Serum bestimmt. Alle Proben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und nachfolgender 60 min. Reperfusionsphase gewonnen. Kontrolltiere wurden nur laparotomiert. Angegeben sind Mittelwerte von jeweils 5 Ratten je Gruppe.

Das Ausmaß der Gewebeschädigung im Dünndarm nach Modulation des I/RS mit schwerster Schädigung nach IL-10-Gabe, korrelierte somit mit dem Abfall der GSH-Konzentration, die nach IL-10-Gabe ebenfalls am deutlichsten ausfiel (Abb. 12).

Im Gegensatz zu den Beobachtungen im Dünndarm, korrelierte der Anstieg der Transaminasen nach intestinaler I/R (Tabelle 10) hingegen nicht mit dem Abfall [Seite 70↓]der GSH-Konzentration im Lebergewebe (Tabelle 12).

Die Zunahme der hepatischen Schädigung nach IL-10-Gabe war nicht von einem entsprechendem Abfall der GSH-Konzentration begleitet. So war hinsichtlich der GSH-Gewebekonzentrationen in der Leber kein statistisch signifikanter Unterschied nachweisbar zwischen Tieren die IL-10 erhalten hatten und Tieren, die einer alleinigen I/R unterworfen worden waren (Tabelle 12).

Die Gabe von IL-2, die zur Minderung des hepatischen Schadens nach I/R geführt hatte, war hingegen von einer deutlichen Senkung der hepatischen GSH-Gewebekonzentration eine Stunde nach Reperfusion begleitet.

Tabelle 12: GSH-Gewebekonzentration in der Leber nach Modulation des I/RS

 

GSH-Gewebekonzentration (nmol/mg Protein)

 

I/R

I/R + IL-2

I/R + IL-10

Kontrolle

30 ± 8,3

30 ± 8,3

30 ± 8,3

Ischämie, 1h Reperfusion

21,5 ± 5,5

13,8 ± 4,9

19,1 ± 5,2

Ischämie, 4 h Reperfusion

11,3 ± 2,9

12,7 ± 3,8

13,5 ± 4,6

Ischämie, 24 h Reperfusion

37,4 ± 5,1

39,1 ± 4,7

33,3 ± 6,9

Die Gewebeproben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und der angegebenen nachfolgenden Reperfusionsphase asserviert und bis zur Analyse in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von jeweils 5 Ratten je Gruppe.

Im Gegensatz zum Dünndarm waren Veränderung der hepatischen GSH-Gewebekonzentration nach 24 Stunden nicht mehr nachweisbar. Sowohl Tiere, die einer alleinigen I/R unterworfen worden waren, als auch Tieren mit IL-2- oder IL-10-Vorbehandlung zeigten 24 Stunden nach Reperfusion wieder normalisierte GSH-Gewebekonzentrationen in der Leber.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Gabe des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 nicht zu einer Minderung, sondern vielmehr zu einer Zunahme des Gewebeschadens in Darm und Leber nach intestinaler I/R führen kann. Hingegen [Seite 71↓]bewirkte die Modulation des I/RS mit IL-2 eine Minderung zumindest des hepatischen Schadens. Allerdings korrelierte die Minderung des hepatischen Gewebeschadens, sichtbar an einem Abfall der AST-Serumkonzentration nicht mit einem vermindertem Abfall der GSH-Konzentration, d.h. nicht mit einem verminderten oxidativen Streß (Abb.13).

Abbildung 13: AST-Serumkonzentration und hepatische GSH-Konzentration nach Modulation des I/RS.

Die GSH-Konzentration wurde in Gewebeproben und die HA-Konzentration im Serum bestimmt. Alle Proben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie und nachfolgender 60 min. Reperfusionsphase gewonnen. Kontrolltiere wurden nur laparotomiert. Angegeben sind Mittelwerte von jeweils 5 Ratten je Gruppe.

4.5.4 Endogene Schutzmechanismen

Zur Klärung der Frage, ob weitere endogene Schutzmechanismen zur Minderung des Gewebeschadens nach Modulation des I/RS beigetragen haben, wurde in den folgenden Experimenten die Expression der potentiell protektiv wirkenden induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase (NOS-2) (99-101), sowie der induzierbaren Hämoxygenase-1 (HO-1) analysiert (111,138).

Eine „konstitutive“ Expression der NOS-2 mRNA ließ sich, wie in Kapitel 4.3.4. [Seite 72↓]beschrieben, im Dünndarm von unbehandelten Kontrolltieren nachweisen. Im Gegensatz dazu war in der Leber der Kontrolltiere keine Expression der NOS-2 mRNA nachweisbar (Abb. 14).

Abbildung 14: NOS-2 mRNA-Expression in Darm und Leber nach intestinaler I/R.

Gewebeproben wurden aus Dünndarm und Leber von jeweils 2 Tieren 1 und 24 Stunden nach intestinaler I/R oder von Kontrolltieren gewonnen. Nach Isolation der Gesamt-RNA erfolgte die PCR-Analyse wie in Material und Methoden beschrieben. Als Negativ- und Positiv-Kontrollen wurde RNA von unbehandelten oder mit LPS stimulierten RAW 264.7 Zellen verwendet. Die quantitative Analyse erfolgte mittels Taq-man PCR.

Intestinale Ischämie ohne nachfolgende Reperfusion führte weder in der Leber noch im Darm zu einer Veränderung der NOS-2 mRNA-Expression. Nach intestinaler Ischämie und nachfolgender Reperfusion kam es sowohl im Dünndarm als auch in der Leber innerhalb einer Stunde nach Reperfusion zu einer Zunahme der NOS-2 mRNA-Expression, die innerhalb von 24 Stunden fast wieder auf das Ausgangsniveau absank (Abb. 14). Diese Unterschiede in der NOS-2 Expression [Seite 73↓]war in allen untersuchten Tieren nachweisbar. Die Quantifizierung dieser in der RT-PCR sichtbaren unterschiedlichen NOS-2 Expression erfolgte mittels Taq-man PCR. Dabei konnten die in der RT-PCR beobachteten Veränderungen bestätigt werden (Abb. 14)

Die Modulation des I/RS durch Gabe von IL-2 führte in beiden Organen zu einer signifikanten Steigerung der NOS-2 mRNA-Expression, die bis zu 24 Stunden nach Reperfusion anhielt. Im Gegensatz dazu kam es nach Gabe von IL-10 in beiden Organen lediglich eine Stunde nach Reperfusion zu einer Steigerung der NOS-2 mRNA-Expression. 24 Stunden nach IL-10-Gabe zeigte sich die Expression der NOS-2 mRNA in Dünndarm und Leber wieder deutlich vermindert und war nicht mehr von der NOS-2 mRNA-Expression in Dünndarm und Leber nach alleiniger intestinaler I/R zu unterscheiden.

Dieser Verlauf der NOS-2 mRNA-Expression in beiden Organen nach I/R spiegelte sich auch in einer entsprechenden Steigerung der NOS-2 Proteinexpression wieder (Daten nicht dargestellt)..

Der alleinige Nachweis von NOS-2 mRNA oder NOS-2 Protein erlaubt jedoch keine Schlußfolgerungen bezüglich der biologisch entscheidenden Aktivität des Enzyms. Daher wurde in den nächsten Experimenten die Konzentration der stabilen NO-Derivate Nitrit und Nitrat NO2-/NO3- im Serum bestimmt, durch die auf eine Veränderung der NOS-Enzymaktivität rückgeschlossen werden kann (Tabelle 13) (139).

Die Serumkonzentration von Nitrit und Nitrat lag bei unbehandelten Kontrolltieren regelmäßig unter 20 µmol/l (Tabelle 13).

Intestinale I/R bewirkte 4 Stunden nach Reperfusion eine deutliche Steigerung der Serumkonzentration der NO-Derivate (Tabelle 13). Die Vorbehandlung der Tiere mit IL-2 vor Reperfusion führte zu einer weiteren signifikanten Steigerung der Nitrit/Nitrat-Serumkonzentration.

Diese Ergebnisse deuten auf eine gesteigerte Freisetzung reaktiver Stickstoffradikale nach I/R, möglicherweise als Folge einer gesteigert NOS-2 Aktivität hin. Diese gesteigerte NOS-2 Aktivität könnte Ursache der positiven Wirkung der IL-2-Vorbehandlung auf den I/R Schaden sein.


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Tabelle 13: Serumkonzentration der NO-Derivate NO2 -/NO3 - nach intestinaler I/R

 

Ischämie / Reperfusion

NO2-/NO3- (µmol/l)

I/R

I/R + IL-2

I/R + IL-10

Kontrolle

13,8 ± 2,1

13,8 ± 2,1

13,8 ± 2,1

Ischämie

21,2 ± 4,3

21,2 ± 4,3

21,2 ± 4,3

I/R 1 h

21,0 ± 8,5

28,4 ± 10,8

27,5 ± 8,5

I/R 4 h

46,4 ± 8,5

57,8 ± 5,4*

33,1 ± 5,4*

I/R 24 h

22,4 ± 7,4

26,0 ± 18,1

27,4 ± 12,3

Die Blutproben wurden nach 60 min. intestinaler Ischämie oder nach Ischämie und nachfolgender Reperfusionphase durch aortale Punktion gewonnen. Kontrolltiere wurden nur laparotomiert. Angegeben sind Mittelwert ± SEM von jeweils 5 Ratten je Gruppe. *p<0,05 versus I/R

Im Gegensatz dazu bewirkte die Vorbehandlung mit IL-10 keine Steigerung der Nitrit/Nitratkonzentration im Serum. Im Vergleich zu Tieren mit alleiniger I/R kam es nach IL-10-Gabe sogar zu einer Senkung der NO2 -/NO3 - Serumkonzentration. Der fehlende Anstieg der NO-Derivate im Serum nach Modulation des I/R mit IL-10 deutet wiederum auf eine verminderte NOS-2 Aktivität als Ursache der negativen Wirkung von IL-2 auf den I/RS hin.

In allen Gruppen zeigte sich innerhalb von 24 Stunden nach Reperfusion eine Normalisierung der Nitrit/Nitratkonzentration im Serum. Zu diesem Zeitpunkt entsprachen die Nitrit/Nitratkonzentration im Serum aller Tiere wieder denen der Kontrolltiere.

Ein weiterer möglicher endogener Schutzmechanismus, der auch durch NO induziert werden kann, ist die Hämoxygenase-1 (HO-1 oder auch HSP32) (85,113), ein Enzym, dem eine ausgeprägte anti-oxidative und damit zytoprotektive Wirkung zugeschrieben wird (85,107-109).


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Abbildung 15: HO-1 mRNA-Expression in Darm und Leber nach intestinaler I/R

Gewebeproben wurden aus Dünndarm und Leber von jeweils 2 Tieren 1 und 24 Stunden nach intestinaler I/R oder von Kontrolltieren gewonnen. Nach Isolation der Gesamt-RNA erfolgte die PCR-Analyse wie in Material und Methoden beschrieben. Als Negativ- und Positiv-Kontrollen wurde RNA von unbehandelten oder mit LPS stimulierten RAW 264.7 Zellen verwendet. Die quantitative Analyse erfolgte mittels Taq-man PCR.

In den folgenden Experimenten wurde daher die Expression der HO-1 in Darm und Leber nach intestinaler I/R und nach Modulation des I/RS analysiert (Abb. 15).

Dabei zeigte sich, daß die alleinige Ischämie ohne Reperfusion zwar im Darm, nicht aber in der Leber zu einer diskreten Steigerung der HO-1 mRNA-Expression führte. Die nachfolgenden Reperfusion bewirkte hingegen in beiden Organen eine deutliche Steigerung der HO-1 mRNA Expression, die bis 24 Stunden nach Reperfusion anhielt (Abb. 15).

Da die Veränderungen der HO-1 Expression in der RT-PCR nur gering ausgeprägt waren, wurde zur genaueren Quantifizierung wiederum eine real-time PCR durchgeführt. Mit dieser Methode konnten die in der RT-PCR beobachteten [Seite 76↓]Veränderungen der HO-1 Expression bestätigt werden.

Nach Modulation des I/RS mit IL-2 und IL-10 zeigten sich erhebliche Unterschiede zwischen Darm und Leber. Während in der Leber weder Il-2 noch Il-10 zu einer signifikanten Veränderung der HO-1 Expression führte, war im Darm nach IL-2 Gabe eine Zunahme der HO-1 mRNA-Expression in der ersten Stunde nach Reperfusion zu beobachten. Dagegen führte IL-10 im Darm im Vergleich zu unbehandelten Tieren zu einer geringer und kürzer ausgeprägten Steigerung der HO-1 mRNA-Expression.


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01.10.2004