[Seite 98↓]

6  Zusammenfassung

Ziel des ersten Teils der vorliegenden Arbeit war es, intraepitheliale Lymphozyten bei verschiedenen gastrointestinalen Erkrankungen zu charakterisieren. Dazu wurden Phänotyp und Funktion der IEL nach Dünndarmtransplantation, bei akuter Graft-versus-Host-Reaktion, bei LPS-induzierter Sepsis und bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen charakterisiert.

Neben der immunologischen Aktivierung kommt es bei gastrointestinalen Erkrankungen aber auch zu einer Störung der mukosalen Integrität, wobei oxidativem Streß als pathogenetischem Faktor eine wichtige Rolle zugeschrieben wird. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daher in einem Ischämie/Reperfusionsmodell, einem Modell ohne allogene oder infektiöse Genese der Gewebeschädigung, das Ausmaß des oxidativen Streß und die Expression endogener Schutzmechanismen analysiert.

Nach allogener Dünndarmtransplantation war eine Infiltration der Darmschleimhaut mit Empfängerzellen und nach GvHR eine Infiltration der Darmschleimhaut mit Spenderzellen zu beobachten. Dabei wiesen die infiltrierenden Zellen unabhängig von Immunsuppression, akuter Abstoßung oder Schweregrad der GvHR einen Phänotyp auf, der identisch war mit dem nativer IEL. Im Verlauf der Erkrankung kam es zu einer weiteren phänotypischen Übereinstimmung von infiltrierenden Lymphozyten und IEL, so daß mehrere Monate nach Erkrankungsbeginn auch Subpopulationen der infiltrierenden Zellen nachgewiesen werden konnten, die typisch für IEL sind, aber im peripheren Immunsystem nicht vorkommen. Nach Dünndarmtransplantation oder GvHR migrieren selektiv bestimmte T-Zell Subpopulationen in die Darmschleimhaut, bzw. reifen infiltrierende Vorläuferzellen dort zu „IEL-ähnlicher“ Lymphozyten.

Sowohl bei akuter Abstoßung nach Dünndarmtransplantation als auch bei akuter intestinaler GvHR trat eine Gewebezerstörung im Gastrointestinaltrakt auf, für die infiltrierende, spezifische zytotoxische T-Zellen verantwortlich gemacht werden.

In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnte bei akuter Abstoßung nach allogener Dünndarmtransplantation eine gesteigerte spezifische zytolytische Aktivität isolierter IEL gegenüber Spenderantigenen nachgewiesen werden. Die [Seite 99↓]Herabsetzung dieser anti-Spender-Aktivität durch die immunsuppressive Therapie mit Tacrolimus unterstützt die Annahme einer Beteiligung spezifischer anti-Spender T-Zellen an der Gewebezerstörung bei akuter Abstoßung.

Eine spezifische zytolytische Aktivität der isolierten IEL konnte auch bei akuter GvHR nachgewiesen werden. Zusätzlich fand sich nach GvHR eine Steigerung der unspezifischen zytolytischen Aktivität der IEL. Dabei bleibt unklar, ob diese unspezifische zytolytische Aktivität tatsächlich zu einer Zunahme des Gewebeschadens bei GvHR geführt hat, oder ob die Aktivitätssteigerung nicht vielmehr Ausdruck der Überwachungsfunktion der IEL und damit notwendiger Bestandteil bei der Aufrechterhaltung der intestinalen Barrierefunktion war.

Als Modell einer gram-negativen Infektion diente die intravenöse Gabe von LPS, das in der verwendeten Dosis bei Mäusen zu einem nicht-letalen septischen Krankheitsbild führte. In diesem Modell war eine Aktivitätszunahme der IEL mit Steigerung sowohl der zytolytischen als auch der proliferativen Aktivität, und einer Zunahme der Zytokinproduktion der isolierten Lymphozyten zu beobachten.

Die gesteigerte zytolytische Aktivität der IEL war Resultat einer funktionellen Aktivierung der Zellen und nicht auf die Expansion einer Subpopulation zurückzuführen. Die Zunahme der zytolytischen und proliferativen Aktivität der IEL nach Sepsis könnte aber auch autokrin durch die gesteigerte IFN-γ Freisetzung in der Frühphase nach Endotoxinämie unterstützt worden sein.

Denkbar ist folgendes vereinfachtes Szenario: Die Translokation von Bakterien führt zur Endotoxinämie und induziert einen frühen Anstieg der IFN-γ Produktion durch IEL. Die IFN-γ Freisetzung löst über eine autokrine Aktivierung eine Steigerung der zytolytischen und proliferativen Aktivität der IEL aus. Als Resultat dieser Aktivierung ergbt sich die Beseitigung infizierter oder alterierter Epithelzellen durch die aktivierten IEL. Schließlich führt die Freisetzung von IFN-γ durch IEL zu einer gesteigerten NO-Produktion aufgrund der Induktion der NOS-2 in den Epithelzellen, wie sie auch in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden konnte.

Zusammengefaßt kommt es nach Endotoxinämie zu einer sequentiellen Aktivierung verschiedener Abwehrmechanismen in der Darmschleimhaut. LPS [Seite 100↓]führte zur funktionellen Aktivierung der IEL mit einer frühzeitig gesteigerten IFN-γ Produktion, sowie einer nachfolgenden Steigerung der zytolytischen und proliferativen Aktivität. Die gesteigerte NOS-2 Expression beruhte vermutlich u.a. auf der gesteigerten Zytokinproduktion der IEL. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß IEL während Septikämie nicht nur als zytolytische Effektorzellen zur Barrierefunktion beitragen, sondern auch als regulierende Zellen Effekte auf weitere Abwehrmechanismen wie der Expression der NOS-2 entfalten.

Immunologische Dysregulation kristalliert sich zunehmend als entscheidender pathogenetischer Faktor der entzündlichen Darmerkrankung heraus. Dabei scheint die überschießende und unverhältnismäßige Aktivierung intestinaler Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen, wenngleich die auslösenden Momente für diese Aktivierung noch ungeklärt sind.

Auch in der vorliegenden Arbeit konnte eine Aktivierung intestinaler Lymphozyten bei Patienten mit Morbus Crohn nachgewiesen werden. Dabei zeigten die isolierten Zellen eine gesteigerte zytolytische Aktivität gegenüber Tumorzellen epithelialen Ursprungs. Diese gesteigerte Aktivität beruhte weder auf NK-Aktivität, noch war sie MHC-restringiert, beschränkte sich auf intestinale Lymphozyten und konnte bei peripheren Lymphozyten nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte bei diesen Patienten eine Zunahme der CD8+ T-Zellen in der Darmschleimhaut nachgewiesen werden. Diese Zunahme hat vermutlich auch zur Steigerung der zytolytische Aktivität der IEL beigetragen.

Die beobachteten phänotypischen und funktionellen Veränderungen fanden sich nur bei intestinalen Lymphozyten. Demgegenüber konnten wir weder phänotypische noch funktionelle Unterschiede zwischen peripheren Blutlymphozyten von Patienten mit Morbus Crohn und Lymphozyten von Kontrollpatienten nachweisen. Allerdings fand sich bei Patienten mit Morbus Crohn ein im Vergleich zu Kontrollpatienten signifikant geringerer Anteil von CD3-CD16+ NK-Zellen im peripheren Blut. Die prognostische Signifikanz und mögliche therapeutische Konsequenzen dieses NK-Zell Abfalls müssen noch definiert werden.

Nach intestinaler Ischämie/Reperfusion (I/R) konnte eine schwere Gewebeschädigung des Darmes beobachtet werden. I/R führte aber nicht nur zur [Seite 101↓]Schädigung des Darmes, sondern bewirkte auch eine Gewebeschädigung in der Leber. Daran beteiligt waren waren vermutlich reaktive Sauerstoffradikale (ROS), deren Freisetzung in der Frühphase nach I/R durch den Konzentrationsabfall des reduzierten GSH sowohl im Darm als auch in der Leber nachgewiesen werden konnte.

Neben der Freisetzung von ROS kommt es im Rahmen des I/RS auch zu einer systemischen inflammatorischen Reaktion. Unklar ist bislang jedoch, ob sich eine Hemmung oder Stimulation der inflammatorischen Antwort günstig auf den Gewebeschaden nach I/RS auswirkt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher versucht, den I/RS durch Gabe des pro-inflammatorischen IL-2 und durch Gabe des anti-inflammatorischen IL-10 zu modulieren.

Dabei konnte gezeigt werden, daß die Gabe von IL-10 zur Zunahme des Gewebeschadens in beiden Organen führte, aber nur im Darm mit einer Zunahme des oxidativen Streß verbunden war. Die Gabe von IL-2 führte hingegen vor allem in der Leber zu einer Verbesserung des I/RS, was jedoch nicht auf einer Verminderung des oxidativen Streß beruhte.

Die Zunahme der Gewebeschädigung nach IL-10, bzw. der Verbesserung nach IL-2 läßt sich möglicherweise auf eine durch die Zytokingabe veränderte Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) zurückführen. So war der positive Effekt der IL-2-Gabe von einer verstärkten und verlängerten NOS-2 mRNA-Expression und einer gesteigerten NO-Freisetzung begleitet. Im Gegensatz dazu fehlte nach IL-10-Gabe ein Anstieg der NO-Metabolite im Serum.

Wir schließen daraus, daß die Zunahme der Gewebeschädigung nach IL-10-Gabe u.a. auf der verminderten NO-Freisetzung beruhte. Mit dieser reduzierten NO-Freisetzung könnte auch eine verminderte Neutralisation von ROS verbunden gewesen sein, was wiederum die Zunahme des oxidativen Streß im Darm nach IL-10-Gabe erklären helfen könnte.

Zur Klärung der Frage, ob noch andere Faktoren als oxidativer Streß und verminderte NO-Freisetzung zur Zunahme der Gewebeschädigung nach IL-10 beigetragen haben, wurde die Expression der induzierbaren Hämoxygenase-1 analysiert. In der vorliegenden Studie führte I/R zu einer gesteigerten HO-1 mRNA-Expression in beiden Organen. Nach Zytokingabe fanden sich [Seite 102↓]unterschiedliche Effekte in Darm und Leber. In der Leber zeigte sich weder nach IL-2- noch nach IL-10-Gabe eine Veränderung der HO-1 Expression, so daß weder der positive Effekt von IL-2 noch der negative Effekt von IL-10 auf einer veränderte Expression der HO-1 zurückzuführen war. Im Darm hingegen, zeigte sich eine deutliche Überexpression der HO-1 nach IL-2 Gabe und eine diskrete Verminderung der HO-1 mRNA-Expression nach IL-10 Gabe. Die Überexpression der HO-1 mRNA im Darm könnte sich negativ auf den Ischämie/Reperfusionschaden ausgewirkt haben, und damit einen möglichen positiven Effekt der IL-2-Gabe im Darm egalisiert haben.

Zusammenfassend führt die selektive intestinale Ischämie zu einer Gewebeschädigung in Darm und Leber. Die Hemmung der inflammatorischen Antwort ist von einer Zunahme der Gewebeschädigung begleitet, die möglicherweise auf einer Zunahme des oxidativen Streß, als auch auf der verminderten NO-Produktion beruhte.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
01.10.2004