Obrig, Hellmuth : Nahinfrarotspektroskopie des Gehirns

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Teil A
Methodik und Validierung der Meßparameter

Der erste Teil der Arbeit faßt Studien der Gruppe zusammen, die sich mit methodischen Grundlagen beschäftigen. Die übergeordnete Frage lautet ‚Wo und Was kann die Nahinfrarotspektroskopie messen?’. Anhand einer sehr groben Einführung in die Grundlagen der NIRS werden vier Fragestellungen aufgezeigt. In den folgenden vier Abschnitten wird unsere Arbeit (1) zur Validität der Cytochrom-oxidase, (2) zur Nachweisbarkeit schneller optischer Signale, (3) zur Modellierung und Differenzierung oberflächlicher und tiefer Kompartimente und (4) die Entwicklung eines bildgebenden Monitors behandelt. Der eingeschobene Exkurs 1 zu den Grundlagen der NIRS bietet eine etwas detailliertere biophysikalische Propädeutik der Methodik.

Methodische Grundlagen

Die Nahinfrarot-Spektroskopie basiert auf drei biophysikalischen Gegebenheiten. (i) Biologisches Gewebe ist für Licht im Bereich von ~ 600-1000 nm relativ transparent, (ii) oxygeniertes und deoxygeniertes Hämoglobin (oxy-Hb, deoxy-Hb) haben in diesem Spektralbereich charakteristische Absorptionsspektren, die eine spektroskopische Differenzierung erlauben, und (iii) Zustandsänderungen des cerebralen Gewebes führen zu nur geringen Änderungen der Streueigenschaften. Aufbauend auf diesen Gegebenheiten lassen sich mit einer Modifikation des Lambert-Beer‘schen Gesetzes Änderungen der Konzentration des oxygenierten und deoxygenierten Hämoglobin bestimmen (Jobsis, 1977; Cope and Delpy, 1988; Chance, 1991). Die Summe dieser Parameter, das Gesamt-Hämoglobin, kann als Maß des korpuskulären Blutvolumens berechnet werden ([oxy-Hb] + [deoxy-Hb] = [tot-Hb]). Aus unserer Arbeit bezüglich der Methodik sollen hier 4 Fragestellungen thematisiert werden:

(A.1.) Lassen sich Änderungen des Redoxzustandes des terminalen Enzyms der Atmungskette, der Cytochrom-oxidase ([Cyt-ox]), bestimmen? Diese Fragestellung ergibt sich aus dem Absorptionsspektrum des Enzyms, das im genutzten Spektralbereich ähnlich den Hämoglobinen ein redoxabhängiges differentielles Absorptionsverhalten aufweist (Wray et al. 1988a). Die potentielle Relevanz ist evident, bedenkt man, daß mit einem zellständigen Marker des Sauerstoffmetabolismus eine gleichzeitige Messung der vaskulären und der metabolischen Antwort auf physiologische Zustandsänderungen zur Verfügung stünden. Der Nachweis einer Störung des Sauerstofftransportes vom cerebralen Gefäß in die Zelle wäre pathophysiologisch, die physiologische Relation der vaskulären zur metabolischen Antwort ist für die Frage nach den Mechanismen der neuro-vaskulären Kopplung auch als Basis bildgebender Techniken von eminentem Interesse.


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(A.2.) Ebenfalls auf der methodischen Ebene ergibt sich die Frage bezüglich eines weiteren Parameters der NIRS. In der Literatur wurde über ‚fast optical signals’ (FOS), als Korrelat optischer Veränderungen, die fast zeitgleich (Salzberg, 1989) mit Potentialänderungen an der Membran isolierter Neurone auftreten, berichtet. Die Existenz und die enge zeitliche Korrelation zwischen elektrophysiologischen und optischen Änderungen ist am isolierten Neuron (Cohen et al. 1978; Stepnoski et al. 1991) und am freigelegten Cortex (Rector et al. 1997a) belegt. Unsere Fragestellung bezieht sich auf die nicht-invasive Nachweisbarkeit solcher optischer Signale beim Erwachsenen, wie sie in den letzten Jahren berichtet wurde (Gratton et al. 1995b). Unsere Gruppe konnte mit verschiedenen Techniken diese Signale nicht sicher reproduzieren. Wir erachten die Fragestellung dennoch für ausreichend relevant, um auch diese Studien in der vorliegenden Darstellung zusammenzufassen.

(A.3.) Eine grundlegende Fragestellung bezüglich der Methodik ist weiterhin die nach der Definition des Meßvolumens. Kritisch für die Relevanz aller dargestellten Änderungen der optischen Eigenschaften ist die Frage, ob sie auf Zustandsänderungen des cerebralen Cortex zu beziehen sind und wie groß der Beitrag des extracerebralen Gewebes ist. Zu dieser Fragestellung gibt es eine Reihe von Studien, die unterschiedliche Ansätze nutzen, um zwischen den Kompartimenten zu differenzieren (Kirkpatrick et al. 1998b; Okada et al. 1995; Steinbrink et al. 2001b)*. In einem zeitaufgelösten Ansatz wird in einer Arbeit unserer Gruppe eine genauere Tiefenauflösung in einem Schichtmodell des Kopfes modelliert (Steinbrink et al. 2001b)*. Eine ähnliche methodische Erweiterung, die neben der Abschwächung des Lichtes auch dessen mittlere Verweildauer im Gewebe mißt, wird in Kombination mit einem optischen Kontrastmittel genutzt. Anhand der Boluslatenz und -form wird untersucht, ob so ein einfacher Marker für die extra- und intracerebrale Perfusion beschrieben werden kann (Kohl et al. 2001).

(A.4.) Neben der Tiefenauflösung ist eine Zuordnung der gemessenen Parameter zu verschiedenen Arealen bei funktionellen Aktivierungsstudien aber auch bei fokalen pathologischen Prozessen wichtig. Die meisten der vorgestellten Studien nutzen zur Lokalisation externe Referenzsysteme. Einerseits wird das für das Oberflächen EEG beschriebene 10-20-System genutzt, zum Teil erfolgt eine anatomische Referenz durch den Vergleich zu simultan oder vor der NIRS Untersuchung erhobenen anatomischen MRT-Aufnahmen. Mit einem Array von Emitter-Detektor-Paaren lassen sich aber auch mit der NIRS Bilder der gemessenen Oxygenierungsänderungen erstellen, die einer groben Kartographie des cerebralen Cortex entsprechen. Methodisch ist dieser Ansatz vergleichsweise einfach. Er bietet jedoch die Möglichkeit, aufgrund der Fokalität einer Änderung, Aussagen über die Plausibilität eines cerebral-cortikalen Ursprungs zu erhalten. Bei pathophysiologischen Untersuchungen erlaubt der bildgebende Ansatz den Vergleich mit umgebendem, nicht pathologisch alteriertem Gewebe beim Patienten. Ergebnisse mit dem in unserer Gruppe entwickelten bildgebenden System werden demonstriert. (Eine Anwendung des bildgebenden Systems zur


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kontrastmittelgestützten cerebralen Perfusionsmessung bei Schlaganfallpatienten findet sich im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit).

Exkurs 1:
Prinzipien und Methodik der NIRS

Modifikation des Lambert-Beer‘schen Gesetzes

Licht und biologisches Gewebe interagieren hauptsächlich<1> in zwei Formen. Absorption und Streuung führen zur Lichtabschwächung (A) bei Durchstrahlung von Gewebe, das optisch durch die Kenngrößen des Absorptionskoeffizienten (µa) und des Streukoeffizienten (µs) charakterisiert wird. Im idealisierten Küvettenmodell kann unter der Annahme, daß keine Streuung stattfindet, die Konzentration eines Stoffes über den Absorptionskoeffizienten bestimmt werden. Unter der Annahme fehlender Absorption läßt sich umgekehrt die Konzentration über den Streukoeffizienten bestimmen (Lambert-Beer‘sches Gesetz). In biologischem Gewebe lassen sich jedoch Streuung und Absorption nicht einfach trennen. Um dennoch eine Konzentrationsbestimmung von Chromophoren durchzuführen, wird meist eine konstante Streuung angenommen (Cope and Delpy, 1988). Die Annahme einer konstanten Streuung ist nicht willkürlich, sondern basiert auf der Tatsache, daß Änderungen des cerebralen Blutflusses die Streuung (dominiert durch die Zelldichte) nur gering, die Absorption (dominiert durch die Konzentration von [oxy-Hb] und [deoxy-Hb]) jedoch stark beeinflussen. Diese Annahme ist nur eine Näherung und ganz auf den Nachweis hämodynamischer und metabolischer Parameter gerichtet <2>.


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Die Herleitung der modifizierten Form des Lambert-Beer’schen Gesetzes als Grundlage der NIRS ist:

(Gleichung 1)

mit: A, Lichtabschwächung; µa, Absorptionskoeffizient des Gewebes; µs, Streukoeffizient des Gewebes; d, geometrischer Abstand zwischen Quelle und Detektor; c, Konzentration eines Chromophors; epsilon, spezifischer Extinktionskoeffizient des Chromophors; rho, Anzahl der streuenden Partikel; sigmas, Gesamtquerschnitt aller streuenden Partikel; G, Geometriefaktor und DPF, differentieller Pfadlängenfaktor.

Die Modifikation besteht in der Berücksichtigung einer konstant angenommenen Streuung. Photonen, die durch Streuung das Meßvolumen verlassen, werden durch den Term G berücksichtigt, während der Faktor DPF der Tatsache Rechnung trägt, daß durch multiple Streuereignisse der mittlere zurückgelegte Weg zwischen der Lichtquelle und dem Detektor größer als ihr geometrischer Abstand d ist. Ohne Kenntnis der Größe G ist eine absolute Quantifizierung der Konzentration eines Stoffes nicht möglich. Durch Differenzbildung über die Zeit, delta A(t), entfällt dieser Term. Ist der DPF bekannt, so kann die Konzentrationsänderung quantifiziert werden (Duncan et al. 1995).


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Abb. 2: Absorption und Streuung im Küvettenmodell. Gemessen wird die Abschwächung der Lichtintensität zwischen Quelle (I0) und Detektor (Ix). Es resultiert die optische Dichte (OD) des Mediums, das durch µa und µs charakterisiert ist. Im obersten Szenario ist µs=0, d.h. Photonen, die nicht den Detektor erreichen, sind absorbiert worden (Photon 4). Erhöht sich die Konzentration des gelösten Stoffes, so erreichen weniger Photonen den Detektor, die Konzentration des Absorbers läßt sich also aus der Lichtabschwächung bestimmen. Eine Voraussetzung des Lambert-Beer‘schen Gesetzes ist ebenfalls skizziert: die Lösung muß unendlich verdünnt sein. Anderenfalls kann es sein, daß ein Absorber im ‚Schatten’ eines anderen liegt (gestrichelter, grauer Partikel) und so die Konzentration des Stoffes zu niedrig bestimmt wird. Im zweiten Szenario ist µa=0. Verluste können so ganz der Konzentration des streuenden, gelösten Stoffes zugeordnet werden. Die Voraussetzung der Verdünnung gilt hier genau wie oben. Im dritten Szenario sind im Medium streuende und absorbierende Stoffe gelöst. Am Detektor kann nicht differenziert werden, ob ein Photon nicht detektiert wird, weil es absorbiert (Photon 1), gestreut (Photon 4) oder beides wurde (Photon 3). Für die detektierten Photonen ist weiterhin am Detektor nicht ohne zusätzliche Information festzustellen, ob sie den direkten Weg (sogenanntes ‚ballistisches’ Photon 5), oder einen längeren Weg (Photon 2) über multiple Streuereignisse zurückgelegt haben. Das unterste Szenario entspricht biologischem Gewebe; die Modifikationen des Lambert-Beer‘schen Gesetzes, die notwendig sind, um dennoch Konzentrationsbestimmungen in einem solchen Medium vorzunehmen, werden im Text hergeleitet.


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Quantifizierung der Meßparameter

Für Anwendungen am adulten Kopf ist der Term G nicht exakt bestimmbar. Einerseits ist die Meßgeometrie komplex, andererseits gilt die Bestimmung der Streuung nach dem Koeffizienten µs nur bei einzelnen Streuereignissen. Im Gewebe entspricht das eingestrahlte Licht bereits in geringer Tiefe eher einer diffusen Photonenwolke als einem Lichtstrahl. Die Lösungsansätze auf der Basis der Diffusionstheorie mit Hilfe stochastischer Verfahren (Hiraoka et al. 1993; Arridge et al. 1995) sind bezüglich der Abschätzung des Fehlers durch die Annahme eines über die Zeit konstanten Terms G hilfreich. Für eine Anwendung am Kopf des Erwachsenen sind jedoch derzeit absolute Quantifizierungen der Chromophorkonzentrationen wenig reliabel, so daß in der vorliegenden Arbeit nur über Änderungen der Chromophor-Konzentrationen berichtet wird (Delta[oxy-Hb], Delta[deoxy-Hb], Delta[Cyt-ox]<3>). Wenn in der Arbeit für die Studien, die mit nicht-zeitaufgelösten Verfahren durchgeführt wurden, die Änderungen in µM angegeben werden, so beruht diese Quantifizierung der Konzentrationsänderungen auf der Annahme eines DPF von 6,26 für den Kopf des Erwachsenen bei einem Probenabstand >2,5 cm nach Duncan und Mitarbeitern (Duncan et al. 1996). Wird die mittlere Flugzeit der Photonen in zeitaufgelösten Ansätzen bestimmt, so kann aus ihr der Faktor DPF berechnet werden. Der DPF errechnet sich nach:

(Gleichung 2 )

mit c, Lichtgeschwindigkeit; n, Brechungsindex des Gewebes; DP, Weglänge; <t>, mittlere Laufzeit der Photonen.

Mit zeitaufgelösten Messungen läßt sich also die mittlere Laufzeit der Photonen durch das Gewebe bestimmen und unter Kenntnis der Lichtgeschwindigkeit im Gewebe daher auch der zurückgelegte


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mittlere Weg. Weiterhin wurde gezeigt, daß der Faktor proportional dem Verhältnis der Änderung der optischen Dichte (delta A) und der Änderung des Absorptionskoeffizienten (delta µa) ist (Arridge et al. 1992). Dieser Ansatz wurde in einer unserer Studien zur Bestimmung der Wellenlängenabhängigkeit des DPF genutzt. Da die Wellenlängenabhängigkeit relevant ist für die Frage der spektroskopischen Bestimmung der Cytochrom-oxidase, wird die Studie unter A.1. dargestellt.

In Zusammenfassung des bisher Erläuterten lassen sich Konzentrationsänderungen von Chromophoren unter Annahme einer konstanten Streuung in einem stark streuenden Medium nach dem modifizierten Lambert-Beer’schen Gesetz bestimmen. Bisher wurde die Wellenlängenabhängigkeit des Meßparameters, A, nicht berücksichtigt. Diese ist jedoch Grundlage der spektroskopischen Differenzierung unterschiedlicher Chromophore im biologischen Gewebe und wird in der Folge skizziert.

Spektroskopische Differenzierung oxygenierungsabhängiger Chromophore <4>

Arterielles und venöses Blut haben unterschiedliche Farben. Physikalisch beruht dies auf unterschiedlichen Absorptionsspektren von oxy-Hb und deoxy-Hb, also der Wellenlängenabhängigkeit des Extinktionskoeffizienten beider Stoffe (Cope, 1991). Für den nicht sichtbaren, nahinfraroten Wellenlängenbereich ist in Abb. 2 die ‚Farbe’ einiger Stoffe dargestellt. Das spektrale Fenster, in dem Gewebespektroskopie auch in größerer Tiefe möglich ist, wird durch die hohe Absorption der Hämoglobine unterhalb ~ 600 nm und von Wasser oberhalb ~ 950 nm begrenzt. Zwei Ansätze werden im Rahmen dieser Arbeit genutzt. Die beiden kommerziellen Monitore<5> nutzen 4 Laserdioden mit diskreten Wellenlängen und errechnen die Konzentrationsänderungen durch Lösung des resultierenden Gleichungssystems:


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(Gleichung 3)

mit Index 1 bis i für die unterschiedlichen Chromophorenkonzentrationen c und die jeweiligen spezifischen Extinktionskoeffizienten epsilon; der Index 1 bis j steht für die unterschiedlichen Wellenlängen lambda.

Es folgt, daß die maximale Zahl zu differenzierender Chromophore der Anzahl der diskreten Wellenlängen, bei denen gemessen wird, entspricht. Eine Überbestimmung (etwa 3 Chromophore bei 4 Wellenlängen) kann zur Korrektur genutzt werden. Der unter A.4. beschriebene, von unserer Gruppe entwickelte Monitor nutzt den gleichen Ansatz, mißt jedoch nur bei 2 Wellenlängen und erlaubt daher nur die Differenzierung von Delta[oxy-Hb] und Delta[deoxy-Hb] unter Vernachlässigung des Beitrages durch eine Redoxverschiebung der Cytochrom-Oxidase.

Eine höhere spektroskopische Auflösung wird durch die Registrierung des gesamten Spektralbereichs von 700-1000 nm möglich (Matcher et al. 1995). Als Lichtquelle dient eine Halogenlampe. Das reflektierte Licht wird in einem Gitter-Spektrographen, ähnlich einem Prisma, spektral aufgelöst und mit einer CCD-Kamera detektiert <6>. Die Konzentrationsänderungen der interessierenden Chromphore ermitteln sich als Multikomponenten-Regression (least square fitting) der bekannten Extinktionsspektren, epsilon(lambda?-lambda?), auf die gemessenen Attenuationsspektren, A(lambda?-lambda?). In den mit diesem Aufbau durchgeführten Experimenten wurde von uns typischerweise der Spektralbereich von 720-920 nm mit einer effektiven spektralen Auflösung von 20 nm (spektrale Verschmierungseffekte durch Blende und Digitalisierung der Kamera) analysiert (Kohl et al. 1997).


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Abb. 3: Absorptionsspektren von oxy-Hb (offen), deoxy-Hb (gefüllt) und Cyt-ox (grau) im sichtbaren und im nahinfraroten Wellenlängenbereich. Im sichtbaren Bereich (linker Teil) ist die Absorption der Hämoglobine so hoch, daß Licht kaum ins Gewebe eindringt. Im Nahinfraroten ist die Gesamtabsorption um den Faktor 20 geringer (N.B.: andere Skalierung der Spektren ab 650 nm), so daß Gewebespektroskopie auch in der Tiefe möglich ist. Ab ~ 950 nm steigt die Absorption durch Wasser so deutlich an (nicht dargestellt), daß auch hier das Licht nicht ausreichend ins Gewebe eindringt. Die Stützwellenlängen für die genutzten kommerziellen Monitore (NIRO-500 und ISS-oxymeter) sowie das typischerweise genutzte Spektrum bei Nutzung des CCD-basierten Spektrometers sind dargestellt.

Bei den Messungen der Attenuationsänderungen über den Wellenlängenbereich von 720-920 nm lassen sich auch Änderungen der Streuung im Meßvolumen approximieren. Der Ansatz basiert auf der Wellenlängenabhängigkeit von µs. Wird bei der Multikomponenten-Regression neben den Extinktionsspektren von oxy-Hb, deoxy-Hb und Cyt-ox diese Wellenlängenabhängigkeit als vierte Komponente eingeführt, läßt sich delta µs bestimmen. In einem tierexperimentellen Ansatz ließ sich so zeigen, daß µs Änderungen parallel zu den Änderungen des elektrischen Potentials im Rahmen einer Cortical Spreading Depression (CSD) auftreten (Kohl et al. 1997). Zur Differenzierung von dem Signalbeitrag durch die Redoxänderungen der Cytochrom-Oxidase ist allerdings ein Referenzwert notwendig. In den tierexperimentellen Daten diente die vollständige Reduktion des Enzyms bei Tod des Versuchstiers als Referenz. Für nicht-invasive Messungen beim Erwachsenen ist eine Trennung von Änderungen, die durch Cyt-ox Redoxverschiebungen und Änderungen von µs, die durch elektrische Potentialverschiebungen hervorgerufen werden, bisher nicht sicher gelungen.


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Abb. 4: Zweites Differential der Absorbtionsspektren von oxy-Hb (40 µM), deoxy-Hb (20 µM) und Wasser (100%). Wasser (H2O) und deoxy-Hb zeigen im NIR Bereich charakteristische Spitzen des zweiten Differentials, während das Spektrum des oxy-Hb flach ist. Aus dem Verhältnis der ‚peaks’ kann bei Kenntnis (bzw. Annahme) des Wassergehaltes des Gewebes die absolute Konzentration des deoxy-Hb ermittelt werden. Abbildung modifiziert nach Matcher et al. (Matcher et al. 1994) .

Ein weiterer Analyseansatz auf der Basis der nicht-zeitaufgelösten, kontinuierlichen Spektroskopie wurde von Matcher vorgeschlagen und beruht auf der Analyse des zweiten Differentials des gemessenen Absorptionsspektrums (Matcher et al. 1994). Eine zweifache Differentialbildung über das Spektrum zeigt nur noch für das Spektrum von deoxy-Hb und H2O charakteristische Züge. Unter Annahme einer bestimmten, konstanten Wasserkonzentration des Gewebes kann durch das Verhältnis zwischen der Größe des zweiten Differentials bei 760 nm (deoxy-Hb) und bei 820 nm (H2O) die Konzentration des deoxy-Hb quantifiziert werden. Umgekehrt lassen sich bei angenommener Konstanz der deoxy-Hb Konzentration die Änderungen der Wasserkonzentration (etwa im Rahmen ödematöser Prozesse) prinzipiell bestimmen.

Im bisher Dargestellten wurde die Abschwächung des Lichtes (A) als alleiniger Meßparameter vorgestellt. Im Zusammenhang mit der Bestimmung des DPF ist jedoch bereits darauf hingewiesen worden, daß auch die Verweildauer der Photonen im Gewebe mit bestimmten NIRS-Ansätzen gemessen werden kann. Hier werden zwei Ansätze kurz erläutert, die im Rahmen der zusammengefaßten Studien genutzt wurden.


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Zeitaufgelöste Messungen: TCSPC (time correlated single photon counting) und intensitätsmodulierter Ansatz (frequency domain).

Wird ein sehr kurzer Lichtimpuls von wenigen Picosekunden Dauer ins Gewebe eingestrahlt, und die zeitliche Verteilung der reflektierten Photonen gemessen, läßt sich über die mittlere Laufzeit <t> der Photonen die mittlere Weglänge bestimmen (Gleichung 2). Der DPF kann damit individuell bestimmt werden. Die Laufzeitverteilung läßt aber noch eine weitere Differenzierung zu, die im Zusammenhang mit der Tiefenauflösung der NIRS steht. Dazu ist zu bedenken, daß in den bisher dargestellten Ansätzen immer eine Änderung der optischen Eigenschaften im gesamten, homogen absorbierenden und streuenden Meßvolumen angenommen wurde. Dies trifft für den Kopf des Erwachsenen nicht zu. Haut, Kalotte, Liquorraum, graue und weiße Substanz unterscheiden sich bezüglich ihrer optischen Eigenschaften erheblich. Auch sind bei verschiedenen physiologischen Prozessen verschiedene Änderungen der optischen Eigenschaften in unterschiedlichen Kompartimenten (Cortex, Kalotte, Haut) zu erwarten. Physikalisch entspricht diese Erweiterung einem Schichtmodell, bei dem Schichtdicke und -anzahl, sowie µa und µs der einzelnen Schicht variiert werden können. Dies ist hier von Relevanz, da die Laufzeitmessung eine grobe Differenzierung der Schichten, im Sinne einer Tiefenauflösung ermöglicht. Photonen mit einer kurzen Laufzeit und somit kurzem Weg können nur bis zu einer bestimmten Gewebetiefe eingedrungen sein (’frühe‘ Photonen). Umgekehrt haben ’späte‘ Photonen mit einer höheren Wahrscheinlichkeit tiefe Gewebsschichten erreicht und spiegeln so eher intracerebrale Prozesse wieder <7>. Unter A.3. sind die Ergebnisse solcher zeitaufgelösten Messungen dargestellt.

Ein zweites Verfahren zur Messung der mittleren Laufzeit ist der intensitätsmodulierte Ansatz (frequency-domain). Für diesen Ansatz wird die Intensität des eingestrahlten Lichtes mit einer festen Frequenz, typischerweise um 100-150 MHz<8>, sinusförmig moduliert. Bei Durchwandern des Gewebes verschiebt sich einerseits die Phase (delta phi-gr) der Modulationswelle. Weitere Meßparameter sind die


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Änderung der Modulationstiefe (delta AC) sowie auch die Gesamtintensität (delta DC). Über die Phasenverschiebung läßt sich die mittlere Laufzeit <t> bestimmen, während der Parameter delta DC der Abschwächung der Lichtintensität (A) entspricht.

(Gleichung 4)

mit delta phi-gr, Phasenverschiebung; fmod, Modulationsfrequenz.

Da nur die Änderung der mittleren Laufzeit ermittelt wird, können im Gegensatz zur TCSPC maximal zwei Schichten differenziert werden. Unter A.3.2. sind Ergebnisse zur Trennung der Transitzeit des Bolus eines optischen Kontrastmittels (ICG, IndoCyanin-Grün, Pulsion®) durch ein oberflächliches und ein tiefes Kompartiment dargestellt (Kohl et al. 2002). Der Parameter der Modulationstiefe (delta AC) beschreibt die ‚Abflachung’ der Modulationswelle beim Durchwandern des Gewebes. Der Parameter wird in den in dieser Arbeit dargestellten Studien nicht zur weiteren Analyse genutzt.

Abb. 5: (vorangehende Seite) Intensitätsmodulierter (a) und zeitaufgelöster Ansatz (b) zur Bestimmung der Verweildauer der Photonen im Gewebe. Für die Bestimmung der Phasenverschiebung (delta phi-gr), wird das eingestrahlte Licht mit einer bestimmten Frequenz intensitätsmoduliert. Das detektierte Licht zeigt dieselbe Modulation allerdings mit einer Phasenverschiebung (delta phi-gr), die der mittleren Laufzeit (<t>) proportional ist. Weitere Meßparameter sind die Abflachung der Modulationswelle (delta AC) und die Abschwächung der Gesamtintensität (delta DC). Beim zeitaufgelösten TCSPC wird ein ultrakurzer Lichtimpuls (wenige ps) ins Gewebe eingestrahlt, die gemessene Verteilung der Laufzeit läßt die mittlere Laufzeit aber auch eine genauere Differenzierung ‚später’ und ‚früher’ Photonen zu. (schwarz = eingestrahltes, grau = detektiertes Licht)


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Grundsätze der Meßanordnung

Prinzipiell werden die Transmissions- und die Reflektionsmethode unterschieden. Beim Erwachsenen ist die Transmissionsmethode aufgrund der geringen Photonenausbeute nicht durchführbar. Damit beschränkt sich die Darstellung tiefer gelegener Strukturen (Ventrikel) auf Anwendungen beim Neugeborenen, wobei auch in diesem Fall, die Meßzeit lang und die räumliche Auflösung sehr begrenzt ist. Ein bildgebendes System, das nach einem CT-basierten Ansatz tomographische Bilder der oberen Schichten generiert, wurde in einer der hier zusammengefaßten Arbeiten (Benaron et al. 2000) genutzt, um die hämodynamische Antwort bei motorischer Aktivierung beim Erwachsenen zu untersuchen. Die Meßzeiten lagen für eine solche Darstellung des gesamten Kopfumfangs bei mehr als 6 Stunden und erforderten mehrere experimentelle Durchgänge.

Mit der derzeitigen Technologie ist beim Erwachsenen eine Routineanwendung nur im Reflektionsmodus möglich und wird in allen hier dargestellten Studien genutzt. Bei diesem Ansatz wird das Meßvolumen sichelförmig angenommen. Diese Annahme läßt auch eine grobe Tiefendifferenzierung bei Messungen mit verschiedenen Sender-Detektor Abständen ohne zusätzliche Information zur Verweildauer der Photonen im Gewebe zu. Bei kleinen Abständen ist der Beitrag der oberflächlichen Schichten zur gemessenen Gesamtattenuation größer als dies bei größeren Abständen der Fall ist. Die Annahme eines sichelförmigen Meßvolumens wurde allerdings vor allem durch Simulationen im Schichtmodell des Kopfes modifiziert (Okada et al. 1995; Firbank et al. 1998). Das Meßvolumen hat nach den Ergebnissen dieser Studien eher eine flachovale Ausdehnung, bei dessen Geometrie der Liquorspalt als Inhomogenität des Meßvolumens und ‚Lichtkanal’ für die translationale Ausbreitung der Photonenwolke ein hohe Bedeutung hat (s. Abb. 6). In den hier dargestellten Studien, die mit dem cw-Ansatz (continuous wave, also ohne Zeitauflösung) durchgeführt wurden, wurde ein Probenabstand von 2,5 bis 4 cm genutzt. Die gemessenen Änderungen werden auf den Mittelpunkt zwischen der Emitter und Detektor-Probe bezogen. Dies gilt auch für die Berechnung der Bilder des unter A.4. dargestellten bildgebenden Systems. Zur Frage, ob die Änderungen extra- oder intracerebral stattfinden werden auch physiologische Annahmen herangezogen.


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Abb. 6: (a) Skizze der Meßanordnung im Reflektionsmodus am Kopf des Erwachsenen. Das idealisierte Meßvolumen ist grau ‚bananenförmig’ dargestellt. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein detektiertes Photon (Photon 1) einen Weg durch dieses Volumen zurückgelegt hat, ist größer als andere Photonenpfade (Photon 2 oder 3). Die Abbildung (b) skizziert, daß aufgrund unterschiedlicher Abstände zwischen Quelle und Detektor, eine grobe Zuordnung zu verschiedenen Meßvolumina möglich ist. Bei einem kleinen Abstand (0,5 cm) dominieren die Veränderungen der oberflächlichen Schichten die gemessenen Änderungen der optischen Dichte, während bei einem größeren Abstand (2,5 cm und mehr) auch die tieferen Schichten zu den gemessenen Änderungen beitragen. Abbildung (c) zeigt ein realistischeres Kopfmodell mit unterschiedlichen Kompartimenten (Kalotte, Liquorspalt, graue und weiße Substanz). In diesem Modell wurden mit Monte-Carlo-Simulationen die Sensitivitäten für Intensitäts- und zeitaufglöste Messungen ermittelt. Die Abbildung (d) zeigt die Änderungen der Parameter (Intensität links und <t> rechts) bei einem Anstieg von µa in verschiedenen Regionen des Meßvolumens. Schwarz bedeutet hohe, weiß geringe Sensitivität ((c) und (d) nach Firbank et al. (Firbank et al. 1998)).


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Zusammenfassung der methodischen Ansätze

Mit der NIRS werden Änderungen der optischen Eigenschaften des Gewebes über die Zeit gemessen. Idealerweise ließen sich Streuung (µs) und Absorption (µa) in verschiedenen Schichten ermitteln. Da eine Trennung beider Parameter im biologischen Gewebe jedoch schwierig ist, basieren die unterschiedlichen Ansätze auf vereinfachenden Annahmen.

Der nicht-zeitaufgelöste Ansatz (continuous wave, cw) nimmt eine konstante Streuung an und bezieht die gemessenen Änderungen der Lichtabschwächung auf Konzentrationsänderungen der Chromophore oxy-Hb, deoxy-Hb und Redoxverschiebungen der Cyt-ox. Die so ermittelten Konzentrationsänderungen werden auf ein homogenes Meßvolumen bezogen, das durch die angenommene Eindringtiefe und die Position der Proben relativ unscharf begrenzt wird.

Die zeitaufgelösten Methoden (time-domain und frequency-domain) liefern neben der Lichtabschwächung Meßwerte zur Verweildauer des Lichtes im Gewebe. Diese wird ähnlich der Lichtabschwächung von Absorption und Streuung beeinflußt. Aufgrund der zusätzlichen Information lassen diese Ansätze aber eine grobe Tiefenauflösung in oberflächliche und tiefe Schichten zu.

Wird bei mehreren Wellenlängen gemessen, kann eine spektroskopische Differenzierung der verschiedenen Chromophore erfolgen. Dabei ist zu berücksichtigen, daß die Annahmen einer konstanten Streuung und eines homogenen Meßvolumens Fehler bezüglich der Quantifizierung der Konzentrationsänderungen und einen Cross-talk zwischen den einzelnen Chromophoren hervorrufen kann.

A.1. Validierung der Cytochrom-oxidase

Spektroskopisch können Änderungen von [oxy-Hb] und [deoxy-Hb] als ‚robuste’ Parameter eingeschätzt werden, deren Differenzierung bereits bei geeigneter Wahl zweier diskreter Wellenlängen mit einem geringen prozentualen Fehler gelingt (siehe auch Entwicklung des bildgebenden Systems unter A.4.). Der Nachweis von Änderungen des Redoxzustandes der Cytochrom-oxidase ist hingegen bis heute kontrovers (Cooper et al. 1997; Cooper et al. 1994; Skov and Greisen, 1994; Wickramasinghe et al. 1995). Dies hat eine Reihe von Gründen: (1) Das Differenzspektrum des Enzyms ist im NIR Spektralbereich in vivo im blutfreien Tier bestimmt worden. Trotz einer Ähnlichkeit der Spektren in verschiedenen Spezies (Wray et al. 1988b; Ferrari et al. 1995; Miyake et al. 1991) ist die Übertragung auf den Menschen zunächst hypothetisch. (2) Im NIR Bereich dominiert eines der 4 Redoxzentren des Enzyms, das CuA, die redoxabhängigen Absorptionsdifferenzen, während Redoxänderungen am zweiten Kupferzentrum CuB und an den Häm-a/a3-Zentren nicht erfaßt werden (Boelens et al. 1982). (3) Die Konzentration des Enzyms ist im Gehirn um einen Faktor


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10 geringer als die der Hämoglobine. (4) Als ‚Referenzverfahren’ zur Plausibilisierung gefundener Redoxänderungen kann derzeit nur die NMR-Spektroskopie Aussagen zur ATP/Pi Relation als Maß für die Stöchiometrie der gesamten oxidativen Phosphorylierung geben (Tsuji et al. 1995; Delpy et al. 1987). (5) Sichere Änderungen des Redoxzustandes sind nur tierexperimentell für pathophysiologisch große Änderungen des O2-Angebotes im Gewebe beschrieben worden (Springett et al. 2000). Bei physiologischer Aktivierung oder mäßiger pathologischer Alteration, wie sie im Rahmen neurologischer Erkrankungen <9> zu erwarten ist, muß eher eine Änderung des elektrochemischen Potentials an der Mitochondrienmembran als Ursache der Redoxverschiebung angesehen werden (Brown, 1992; Balaban, 1990). Es liegen jedoch kaum Daten zu dieser Fragestellung vor (LaManna et al. 1987). Gegen diese Schwierigkeiten der sicheren Bestimmung steht der hohe Stellenwert, den ein Parameter des intrazellulären Energiemetabolismus für die Methodik <10> und als Bindeglied zwischen elektrophysiologischer, neuronaler Aktivität und vaskulärer Antwort hat.

Aus den biophysikalischen Gegebenheiten ergibt sich bei der spektroskopischen Bestimmung die Möglichkeit des ‚cross-talks’. Cross-talk bezeichnet die Tatsache, daß bei falschen Annahmen zur Wellenlängenabhängigkeit des DPF die Änderung in einem Chromophor eine Änderung in einem


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anderen Chromophor vortäuschen kann. Für die Cytochrom-oxidase besteht also die Frage, ob Änderungen der oxy-Hb und deoxy-Hb Konzentrationen in der spektroskopischen Analyse fälschlich eine Änderung des Cyt-Ox Redoxzustandes als spektroskopischen Fehler hervorrufen (Matcher et al. 1995). Diese Frage ist essentiell mit der Bestimmung der Pfadlänge der Photonen im Gewebe verbunden. Der in der Modifikation des Lambert-Beer‘schen Gesetzes eingeführte Faktor DPF ist wellenlängenabhängig (Essenpreis et al. 1993). Entspricht die zur Berechnung angenommene Größe des Faktors im gemessenen Spektralbereich nicht dem realen, individuell variablen DPF, so entsteht eine Verzerrung des bestimmten Attenuationsspektrums. Eine solche Verzerrung führt bei dem Chromophor mit der geringsten Konzentration zu dem größten Fehler. Da die Hypothese einer Änderung des Redoxzustandes der Cytochrom-Oxidase im Rahmen physiologischer Prozesse kontrovers ist, besteht die Möglichkeit, daß der Parameter ein spektroskopisches Artefakt darstellt.

Die ersten zwei dargestellten Studien stellen Advokaten des spektroskopischen Diabolus dar.

A.1.1. Bestimmung der individuellen Wellenlängenabhängigkeit des DPF aus pulskorrelierten Attenuationsänderungen

(Kohl et al. 1998)*

Wie oben dargestellt, läßt sich der DPF individuell anhand zeitaufgelöster Messungen bestimmen (Duncan et al. 1995). Die zeitaufgelösten Verfahren sind allerdings technisch aufwendiger und erlauben insbesondere keine kontinuierliche Spektroskopie. In den meisten cw-Ansätzen wird daher ein Korrekturfaktor für die Wellenlängenabhängigkeit des DPF angenommen. Eine Differenz zwischen dem angenommenen und dem individuellen DPF bei einer bestimmten Wellenlänge führt zur spektroskopischen Verzerrung und damit potentiell einer Fehlbestimmung der Redoxänderungen der Cytochrom-Oxidase. Die Studie nutzt die durch den Pulsschlag hervorgerufenen Änderungen der Lichtabschwächung und berechnet das individuelle DPF-Spektrum anhand des auch analytisch hergeleiteten (Arridge et al. 1992) Verhältnisses zwischen delta A und delta µa:

(Gleichung 5)


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mit Index p für die Puls-induzierten Änderungen und Sa als angenommener Sättigung des arteriellen Blutes.

Als physiologische Annahme basieren die Ergebnisse darauf, daß die Attenuationsänderungen im Puls durch den Zustrom arteriellen Blutes hervorgerufen werden. Weiter ist für die Ergebnisse relevant, daß der Pulsschlag keine Änderungen im Redoxstatus der Cyt-ox hervorrufen sollte. Unter diesen Annahmen wird gezeigt, daß (1) die Wellenlängenabhängigkeit des DPF individuell streut, (2) die Berechnung der Konzentrationsänderungen der Chromophore unter Berücksichtigung der individuell berechneten DPF-Abhängigkeit weniger von dem zur Berechnung gewählten Spektralbereich abhängt, (3) daß die berechneten pulskorrelierten Änderungen der Cytochrom-Oxidase unter Berücksichtigung des individuellen DPF-Spektrums kleiner sind als bei herkömmlichen Algorithmen.

Dieses Ergebnis ist für die Frage nach der Validität der [Cyt-ox]-Änderungen wichtig, da die Ergebnisse die Möglichkeit betonen, daß ein spektroskopischer Fehler [Cyt-ox]-Änderungen vortäuscht. Gleichzeitig wird eine Option aufgezeigt <11>, diesen spektroskopischen Fehler zu minimieren. Bezüglich der physiologischen Annahmen muß die des rein arteriellen Beitrages zum Pulssignal kritisch gesehen werden. Jedoch wird demonstriert, daß in einem Wellenlängenbereich >790 nm die Annahme der Sättigung des einströmenden Blutes kaum Auswirkungen auf das DPF-Spektrum haben.

A.1.2. Cross-talk im Schichtmodell (Monte Carlo Simulationen)

(Uludag et al. 2001)*

Neben der Wellenlängenabhängigkeit des DPF wurde in einer zweiten Studie eine weitere potentielle Ursache für cross-talk zwischen den Chromophoren untersucht. Die Problemstellung resultiert aus der unphysiologischen Annahme eines homogenen Meßvolumens. Eine solche homogene Änderung der Chromophorenkonzentrationen kann jedoch bestenfalls für systemische Änderungen der Sauerstoffsättigung angenommen werden. Im Rahmen physiologischer oder neurologisch-pathologischer Prozesse interessieren hingegen Änderungen der cerebralen Hämodynamik und des cerebralen Metabolismus. Der Beitrag extracerebraler Änderungen wird in den meisten Untersuchungen als Kontamination der interessierenden Parameter behandelt (siehe auch A.3. zum


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Thema Tiefenauflösung). Die grob vereinfachende Annahme hat zwei Konsequenzen. Zum einen werden selektiv cerebrale Konzentrationsänderungen unterschätzt (partial-volume Effekt). Weitaus wichtiger für die Frage nach der Validität des Parameters Delta[Cyt-ox] ist jedoch das Phänomen des cross-talks.

Das Vorgehen der Studie bestand darin, zunächst in einer Monte Carlo Simulation die Abhängigkeit des partiellen Pfadlängenfaktors in unterschiedlich tiefen Schichten (bis 18 mm, Schichtdicke 2 mm) von µa zu berechnen. Im Schichtmodell wurden dann Änderungen von einzelnen Chromophoren in nur einer Schicht angenommen und mit den im Modell berechneten verglichen. Der so erhaltene cross-talk zwischen den verschiedenen Chromophoren kann prozentual zur induzierten Änderung angegeben werden. Die Studie untersucht verschiedene Modelle mit unterschiedlichen Annahmen zu den optischen Eigenschaften der verschiedenen Schichten. In der Zusammenschau der Ergebnisse resultiert als wichtigstes Ergebnis eine relative ‚Robustheit’ der beiden vaskulären Parameter Delta[oxy-Hb] und Delta[deoxy-Hb] gegenüber potentiellem cross-talk (bis maximal 10%). Für den Parameter [Cyt-ox] jedoch lassen sich Änderungen durch cross-talk modellieren, die in der Größenordnung den aus experimentellen Daten beim Erwachsenen berechneten entsprechen. Es ist wichtig zu betonen, daß die Ergebnisse keinen Beweis für das Fehlen von Redox Änderungen des Enzyms bei physiologischen oder lokalisierten cerebralen Prozessen darstellen. Die Argumentation erlaubt nur unter der Annahme, daß physiologisch keine Änderungen auftreten, diese als cross-talk zu modellieren. Unter der Annahme einer real-existierenden Änderung sind die Modellierungen ein Hinweis auf einen Quantifizierungsfehler, der, in je unterschiedlichem Ausmaß, alle bestimmten Konzentrationsänderungen betrifft.

Die beiden vorangehend berichteten Studien zeigen, daß aus biophysikalischer Sicht ein spektroskopischer Fehler den Parameter [Cyt-ox] potentiell als Auffangbecken der nicht erklärten residualen Lichtabschwächung im modifizierten Lambert-Beer Ansatz demaskiert, wenn eine homogene Änderung der optischen Parameter in einem semi-infiniten, homogenen Medium angenommen wird. Die Kontroverse bezüglich der Validität des NIRS Parameters ([Cyt-ox]) bezieht sich insbesondere auf die Frage, ob das Enzym bei kleinen Änderungen des Zellmetabolismus und der Hämodynamik bereits Redoxänderungen zeigt (Balaban, 1990; Cooper and Springett, 1997). Bezüglich großer Änderungen, etwa bei hypoxischen Zuständen, ist auch der Nachweis einer Korrelation zum ATP/Pi Metabolismus erbracht worden (Tsuji et al. 1995). Die meisten dieser Studien zeigen also eine Reduktion des Enzyms aufgrund eines O2-Mangels im Gewebe. Es wurde argumentiert, daß unter physiologischen Umständen ein solcher O2-Mangel nicht auftritt und daher die Cyt-ox vollständig oxidiert sei. Andererseits wurde tierexperimentell nachgewiesen, daß ein Teil der Cytochrom-oxidase in reduzierter Form vorliegt (LaManna et al. 1987; Lockwood et al. 1984) und sich das Redox-Gleichgewicht unter elektrischer Stimulation zur Oxidierung hin verschiebt. Auch gibt es eine Reihe von Studien, die im Tier spontane Änderungen des Redoxverhältnisses von NADH


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(Dora and Kovach, 1981; Mayevsky and Ziv, 1991) und Cytochrom-oxidase (Vern et al. 1998; Mayhew et al. 1999) untersuchen <12>. Ohne den Beweis für eine Änderung des Redoxzustandes bei funktioneller Aktivierung zu erbringen, zeigen die Studien doch, daß auch unter physiologischen, nicht hypoxischen Bedingungen Änderungen im Redox Zustand des Enzyms plausibel sind. Unter Annahme eines ausreichenden O2-Angebotes im Gewebe sind elektrochemische Potentialverschiebungen bei unterschiedlichen Aktivierungszuständen der Atmungskette als Ursache der Änderung des Redox-Zusatndes am CuA Zentrum des Enzyms anzunehmen (Cooper et al. 1994).

Die beiden folgenden Studien untersuchen in zwei Ansätzen zur funktionellen Aktivierung des visuellen Cortex, die Frage nach dem potentiellen Beitrag der Cyt-ox zu den gemessenen Änderungen der optischen Eigenschaften im cerebralen Gewebe. Diese beiden Studien verfolgen damit einen umgekehrten Ansatz zu den vorangehend beschriebenen theoretischen Ansätzen. Zur Erklärung der bei funktioneller Aktivierung gemessenen Änderung der optischen Eigenschaften wird das Ergebnis der spektroskopischen Analyse unter Annahme einer Cytochrom-Oxidase Redoxänderung verglichen mit der Annahme, daß der Cytochrom-oxidase Redoxzustand nicht zu den gemessenen Änderungen beiträgt. Die zweite Studie vergleicht die unter der Annahme einer Cytochrom-Oxidase Redoxverschiebung berechneten Werte, mit den nach dem oben beschriebenen cross-talk Modell berechneten Werte als cross-talk durch Änderungen von [oxy-Hb] und [deoxy-Hb]. Es ist erneut zu betonen, daß es sich nicht um einen Beweis handelt, da die jeweilige Modellierung der Antworten aus den Änderungen der gemessenen Parameter immer von einer Grundannahme ausgeht (Existenz / Nichtexistenz der Änderung). Eine Lösung der Kontroverse wird sich nicht allein auf die NIRS bei funktionellen Studien beim Menschen stützen. Invasive Ansätze im Tiermodell sind auch weiterhin notwendig, um spektroskopische Differenzierungen zu validieren.


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A.1.3. Änderungen des Cytochrom-Oxidase Redoxzustandes bei visueller Stimulation des Erwachsenen.

(Heekeren et al. 1999)*

In dieser Studie wurden Probanden mit einem Schachbrettmuster visuell stimuliert (10 Hz, rot-grünes Schachbrett, 10 s Stimulation alternierend mit 30 s Ruhe, 12-30 Durchgänge). Die mit der kontinuierlichen Spektroskopie aufgenommenen Spektren während der Stimulation und während der Ruhephasen wurden gemittelt. Die Differenz stellt die Änderungen der optischen Eigenschaften des Gewebes durch die Aktivierung des visuellen Cortex dar. Anhand des so erhaltenen Spektrums lassen sich nun die Hypothesen zur Frage einer Redoxverschiebung der Cyt-ox prüfen. Dazu wurden mit unterschiedlichen Algorithmen die Konzentrationsänderungen der Chromophore berechnet. Untersucht wurde der Einfluß einer Berücksichtigung verschiedener spektraler Fenster oder diskreter Wellenlängen, die zur Berechnung herangezogen wurden. Weiterhin wurden die unterschiedlichen Algorithmen jeweils unter Berücksichtigung allein der Hämoglobine (2-Komponenten fit) oder unter zusätzlicher Berücksichtigung des Cyt-ox Differenzspektrums (3-Komponenten fit) geprüft. Das wichtigste Ergebnis bezüglich der Validität der Cyt-ox ist, daß die Berücksichtigung des Differenzspektrum im 3-Komponenten fit zu einer deutlichen Reduktion der im 2-Komponenten fit nicht-erklärten, residualen Attenuationsänderungen führt. Da eine Verringerung des Residuals bei einer Erhöhung der Komponentenanzahl von 2 auf 3 mathematisch bedingt sein kann, ist weiterhin wichtig, daß beim 2-Komponenten fit das Residual spektral dem Cyt-ox Differenzspektrum ähnelt, während das Residual bei Berücksichtigung aller 3 Chromophore keine Charakteristika über das Spektrum aufweist. Weitere Argumente für die Zunahme der Oxidierung des Enzyms unter funktioneller Stimulation sind (1) die Tatsache, daß im 2-Komponenten fit bei Analyse des spektralen Fensters von 780-900 nm die deoxy-Hb Konzentration ansteigt, wie es im Rahmen einer funktionellen Stimulation nicht zu erwarten ist (siehe Teil B: Physiologie) (2) der Zeitverlauf der Cyt-ox Redoxänderungen sich von dem der Hämoglobine unterscheidet. Der zweite Punkt wird durch Beobachtungen im Rahmen der Studie zu Oszillationen der cerebralen Oxygenierung ((Obrig et al. 2000a)*, siehe B.3.1.) unterstützt, bei der die berechneten Cyt-ox Veränderungen ein sehr stabiles Baseline- und Antwortverhalten zeigten. Ohne einen letztendlichen Validitätsbeweis darzustellen, läßt sich diese Beobachtung gut mit einer gegenüber systemischen Änderungen der Blutflußparameter (arterieller Blutdruck / Atmung) und Drifts robusten, da konstanten Konzentration des Enzyms im Meßvolumen erklären.


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Abb. 7: Vergleich zwischen einem ‚blob’ (weißer Balken) und ‚interblob’ (grauer Balken) Stimulus. Während [oxy-Hb] und [deoxy-Hb] keine klare Differenz zwischen den beiden Stimulusmodalitäten zeigen (links), ist die [Cyt-ox] bei Aktivierung durch den ‚blob’-Stimulus stärker oxidiert. Dies kann nicht einem spektroskopischen ‚cross talk’ entsprechen, der in der rechten Abbildung zum Vergleich dargestellt ist (gestrichelt). Skalierung für [Cyt-ox] und ‚cross-talk’ um Faktor 10 vergrößert.

A.1.4. Differentielle Aktivierung der ‚blob-/interblob’ Areale im visuellen Cortex des Erwachsenen.

Zur Zeit führen wir eine weitere Studie zur Validierung des Parameters als Indikator funktionell evozierter Änderungen des mitochondralen Energiemetabolismus durch. Dazu dient erneut ein physiologisches Modell, das auf der im Makaken beschriebenen Unterscheidung in Cytochrom-reiche ‚blobs’ und Cytochrom-arme ‚interblobs’ fußt (Livingstone and Hubel, 1984; Born and Tootell, 1991; Yabuta and Callaway, 1998). Es wurde gezeigt, daß in der Area striata die Cyt-ox-reichen blobs insbesondere Farbinformation (M- und P-pathway), die umgebenden Zellpopulationen (interblobs) jedoch stärker Information zur Form des Stimulus (hauptsächlicher input über den P-pathway) prozessieren. Unsere Hypothese ist, daß bei differentieller Aktivierung der blobs bzw. interblobs unterschiedlich starke Änderungen der Cyt-ox hervorgerufen werden können. Den Versuchspersonen wurden im Wechsel je 30s ein langsam rotierender Stimulus mit hohem Farb-, aber fehlendem Luminanz-Kontrast (blob-Stimulus) und ein schwarz-weißes Schachbrettmuster (interblob-Stimulus) präsentiert. Die bisherigen Ergebnisse lassen die Hypothese zu, daß es Antwortmuster der drei Parameter oxy-Hb, deoxy-Hb und Cyt-ox gibt, die mit einem reinen cross-talk als Ursache der Cyt-ox Änderungen nicht vereinbar sind. Die Abbildung 7 zeigt die beiden Stimuli und das Beispiel einer


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Messung, bei der die vaskulären Parameter keine sichere Konzentrationsänderung zeigen, die Cytochrom-Oxidase aber unterschiedlich stark oxidiert ist. Derzeit untersuchen wir, inwiefern sich anhand der Daten und der Ergebnisse der Simulationen (vergleiche A.1.2.) Muster der realen Cytochrom-Oxidase Redoxverschiebungen von cross-talk induzierten Änderungen differenzieren lassen.

A.2. Fast Optical Signals

Änderungen der optischen Eigenschaften im Gewebe umfassen neben dem Absorptionsverhalten der Chromophore auch Änderungen der Streuung. Solche Änderungen wurden in den bisherigen Ansätzen als Fehlerquelle betrachtet, da die spektroskopische Konzentrationsbestimmung von einer konstanten Streuung ausgeht. Wie bereits erwähnt, sind die Änderungen von µs bei einem Anstieg des lokalen Blutfluß wesentlich kleiner als die gleichzeitig auftretenden Änderungen von µa. Bei großen Änderungen der Streuung, wie im Rahmen einer ‚cortical spreading depression’ (CSD) im Tierexperiment gezeigt, sind Attenuationsänderungen jedoch nur dann physiologisch sinnvoll zu erklären, wenn die Streuung berücksichtigt wird. Da µs wellenlängenabhängig ist, wurde die Streuung als viertes ‚Chromophor’ in den Regressionsalgorithmus eingeführt. Das Ergebnis zeigt, daß die Streuänderungen parallel zu den elektrocortikalen Potentialverschiebungen (DC) auftreten (Kohl et al. 1997) (Abbildung 8). Es ist zu betonen, daß in diesem Ansatz nur dann eine verläßliche Zuordnung der Attenuationsänderungen zu Änderungen der Streueigenschaften gelingt, wenn die ‚Chromophore’ anhand physiologischer Annahmen kalibriert werden (Tod des Versuchtiers im angegebenen Beispiel). Kleine Änderungen, wie sie in vivo beim Erwachsenen unter funktioneller Stimulation zu erwarten sind, potenzieren ähnlich wie im Abschnitt zur Validierung der Cytochrom-Oxidase erläutert das Problem des cross-talks, da nun zwei ‚Chromophore’ niedriger Konzentration (Cyt-ox und Streuung) in den Algorithmus eingehen.


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Abb. 8: Die Abbildung zeigt den parallelen Verlauf der Änderungen im Streuverhalten (µs’) und den gleichzeitig gemessenen DC-Potentialänderungen während einer Cortical Spreading Depression (unten). Die oberen Spuren geben den Verlauf der ‚üblichen’ NIRS-Parameter wieder ([oxy-Hb], [deoxy-Hb] und [Cyt-ox]). Die Kalibrierung der Meßparameter erfolgt nach physiologischen Annahmen beim Tod des Versuchstiers. Ohne diese Kalibrierung lassen sich die Änderungen des Cyt-ox Redoxzustandes und den berechneten Änderungen von µs’ nicht sicher trennen. (Kraniales Fenster im Rattenmodell der cortical spreading depression (CSD) (Kohl et al. 1997))

Zur Differenzierung elektrophysiologisch und vaskulär induzierter optischer Änderungen kann jedoch die zeitliche Latenz zum Stimulus genutzt werden. Während die ersten Komponenten evozierter Potentiale Latenzen von 30-100 ms aufweisen, ist die vaskuläre Antwort träger <13>. Für optische Änderungen zeitgleich zu elektrischen Potentialverschiebungen gibt es in der Zelle (Stepnoski et al. 1991), im blutlosen ‚brain-slice’ (MacVicar and Hochman, 1991) bis hin zur in vivo Darstellung (Rector et al. 1995; Rector et al. 1997b) Evidenz, die unzweifelhaft die Existenz solcher raschen optischen Signale belegt. In diesem Zusammenhang werden Fragen einerseits zum biophysikalischen Ursprung dieser Änderungen und auch zur Differenzierung der in Folge auftretenden Komponenten


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diskutiert. So wurden in einer jüngst erschienenen Studie am Hirnstamm der Ratte bildgebend optische Signale (780 nm in Reflektion) unterschieden: (1) zwei schnelle Komponenten, die zeitlich parallel zum gleichzeitig erhobenen event related potential (ERP) auftreten, (2) eine langsamere, nicht ERP korrelierte Komponente entsprechend der frühen metabolisch-vaskulären Antwort (‚dip’) oder der langsamen Streuänderung (‚intrinsic optical signal’) (3) eine tonische, spät auftretende Komponente, die der fokalen Hyperoxygenierung als Basis der Parameter von funktioneller MRT und PET entspricht (Rector et al. 2001).

Das Interesse an den ‚fast optical signals’ bezüglich nicht-invasiver NIRS Ansätze beim Erwachsenen wurde jedoch durch eine Arbeit der Arbeitsgruppe um G. Gratton geweckt, die die Nachweisbarkeit der event related optical signals (EROS) beim Erwachsenen durch die intakte Kalotte 1995 erstmals beschrieb (Gratton et al. 1995b). Unsere Arbeitsgruppe begleitete die Reihe der aus dieser Arbeitsgruppe folgenden Publikationen (letzte Publikation: (Gratton and Fabiani, 2001)) mit einer Reihe von Versuchen, die diese Ergebnisse reproduzieren sollten. Dies ist bisher mit unterschiedlichsten Ansätzen inklusive des von Gratton und Mitarbeitern genutzten nicht gelungen. In den folgenden Abschnitten werden statt der - negativen - Ergebnisse der physiologisch basalen Stimulationsmodelle (visuell und somatosensorisch evozierte Potentiale) die potentiellen Gründe für die fehlende Bestätigung der EROS durch unsere, und andere Gruppen dargestellt. Es ist erneut zu betonen, daß dies eine Diskussion des Signal-Rausch-Verhältnisses ist und nicht die Existenz rascher optischer Veränderungen parallel zu elektrophysiologischen Potentialverschiebungen im neuronalen Gewebe tangiert.


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Abb. 9: Abb. 9a: Rector und Ko-Autoren (Rector et al. 2001) demonstrieren in einem rezenten Papier eindrucksvoll die Lokalisation und Differenzierung unterschiedlicher früher Komponenten der optischen Änderungen in einem stimulierten Areal (Auflicht, 780nm, CCD-Kamera. Dargestellt ist der Tractus solitarius im Hirnstamm der Ratte bei N. vagus-Stimulation). Im Average (AVG) zeigen sich unterschiedliche Komponenten, die in einer Principal Component Analyse (PCA) in Komponenten der mutmaßlich neuronalen (C1=N80) und mutmaßlich vaskulär-metabolischen (C2=N300) Antwort auch räumlich getrennt werden konnten. Die späteste Deflektion im AVG (P800) entspricht dem Beginn der ‚klassischen’ vaskulären Hyperoxygenierung.
Abb.9b: Daß die frühen optischen Signale im eröffneten Cortex Änderungen der elektrophysiologischen Änderungen entsprechen, gründet sich auch auf die Untersuchungen am isolierten Neuron. Stepnoski und Ko-Autoren beschreiben solche Änderungen am isolierten Neuron der Meeresschnecke Aplysia (Stepnoski et al. 1991). (Dunkelfeldmikroskopie; DeltaV, Änderung des Potentials; DeltaS, Änderung der Streueigenschaften, Skizze oben zeigt die Messung der elektrophysiologischen und optischen Änderungen)
Abb.9c: Schnelles optisches Signal, nicht-invasiv beim Erwachsenen gemessen (Gratton et al. 1995b). Die gemessene Änderung der Phasenverschiebung wurde in die mittlere Laufzeit der Photonen in ps umgerechnet. Bei visueller Quadranten-Stimulation zeigen sich über dem contralateralen Occipitalpol Änderungen von <t>, die in der Latenz, denen des VEP entsprechen (P100-Komponente).


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A.2.1. Abschätzung der Effektgröße

(Syré et al. 2000)

Ausgehend von den in einer Publikation von Rector et al. (Rector et al. 1997a) beschriebenen Änderungen der Reflektion wurde in einer Monte Carlo Simulation die korrespondierende Änderung von µs approximiert. Aus dieser Abschätzung resultiert eine Änderung von 0,1 % im neuronal aktivierten Areal. Der so erhaltene Wert diente als Annahme für eine weitere MC-Simulation im Schichtmodell des Kopfes nach Okada et al. (Okada et al. 1997). Bei Annahme einer Änderung von µs um 0,1% im Cortex und einem Probenabstand von 3 cm an der Kopfoberfläche, resultiert eine Änderung der mittleren Photonenlaufzeit von 0,01 ps. In der Simulation läßt sich neben der Änderung der mittleren Laufzeit (delta <t>) auch die erwartete Änderung der Intensität abschätzen, die für die genannten Annahmen bei 0,02 % resultiert. Damit liegen die aus der Approximation erwarteten Werte der mittleren Laufzeitänderung um 3 Größenordnungen unter den in den ersten Publikationen von Gratton et al. angegebenen (Gratton et al. 1995), in denen Änderungen von 10 ps berichtet werden. Auch liegen sie unterhalb der Sensitivität des genutzten Gerätes und erklären damit potentiell, warum der Nachweis im analogen Aufbau nicht gelang.

A.2.2. Parameter-Selektion: Intensität versus Phase

(Steinbrink et al. 2001a)*

Die Publikationen aus der Gruppe von G. Gratton beschreiben die Änderungen allein in der mittleren Laufzeit bzw. Phase (konvertierbar nach Gleichung 4) (Gratton et al. 1995b; Gratton and Fabiani, 2001; Gratton et al. 1997a; Gratton et al. 1997b; Gratton et al. 1997c; Gratton et al. 1995; Gratton et al. 1994; Gratton et al. 2000). Eine Änderung von µs in einer tieferen Schicht führt jedoch auch zu einer Änderung der an der Kopfoberfläche gemessenen Intensität (siehe auch Abbildung 6c & 6d). Bei der oben beschriebenen Simulation ergab sich eine erwartete Änderung um 0,02 % der Gesamtintensität unter Annahme einer µs-Änderung von 0,1% im Cortex. Die Frage, welcher der beiden Parameter sensitiver ist, muß berücksichtigen, daß die Laufzeit sensitiver für Änderungen in tieferen Gewebeschichten ist (Abb. 6c & 6d) (Firbank et al. 1998). Andererseits ist das technisch bedingte Rauschen für den Parameter delta <t> höher. Schließlich läßt sich für eine nicht intensitätsmodulierte Lichtquelle das Signal-Rausch-Verhältnis relativ gut durch eine höhere eingestrahlte Intensität steigern. Für eine Abschätzung sind auch physiologische Rauschquellen zu berücksichtigen, da sowohl Puls-korrelierte Änderungen als auch Bewegungsartefakte, jeweils unterschiedlich stark, die beiden Parameter beeinflussen. Ein Modell zur Abschätzung dieser Einflußgrößen muß sehr viele Annahmen machen, daher wurde von unserer Gruppe ein set-up


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experimentell geprüft, das eine sehr starke Lichtquelle im cw-Modus nutzt, um Änderungen der Intensität bei sehr geringem technisch bedingten Rauschen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten bei somatosensorischer Stimulation (analog zur klinischen Routine der Medianus SSEPs) eine Änderung der Intensität um 0,07 % mit Latenzen von 40-160 ms nach dem Reiz. Diese Antwort ließ sich lokalisiert und reproduzierbar über der Zentralregion (C3 nach dem 10-20 System) in 6 Probanden nachweisen. Ein Nachweis über der Occipitalregion bei visueller Stimulation (analog zum klinisch bekannten VEP) gelang nicht.

A.2.3. Pulsschlagartefakte / Bewegungsartefakte

In der Folge entwickelten wir eine Reihe unterschiedlicher methodischer Aufbauten, die auf diesen Ergebnissen basieren, hohe Intensitäten und zum Teil mehrere Detektoren nutzen, und wandten sie bei verschiedenen Stimulationsmodellen an. Ziel war es, ein lokalisiertes Signal mit kurzer Latenz zum Stimulus darzustellen, das nach physiologischen Kriterien sicher von Bewegungsartefakten und Pulsartefakten zu trennen ist. Bezüglich der somatosensorischen Stimulation ergab sich hierbei eine Skepsis bezüglich der oben geschilderten positiven Ergebnisse, da bei vergleichender ipsi- und contralateraler Reizung keine sichere Differenz über der lateralen Zentralregion gefunden werden konnte, und die Stimulation einzelner Finger zu keiner reproduzierbaren Antwort führte. Ein Bewegungsartefakt kann somit in einem Teil der Messungen nicht sicher ausgeschlossen werden. Bei visueller Stimulation ließen sich in einigen Probanden Änderungen mit der erwarteten Latenz nachweisen, die jedoch entweder auch während der Ruhephasen, teils aber auch unter allen Detektoren mit gleicher Größe zu detektieren waren. Bei Analyse des Frequenzspektrums der gemessenen Daten zeigt sich, daß der Puls bis zur 4. Harmonischen (um 4Hz) deutlich das Signal beeinflußt. Ein Pulsartefakt ist so eine plausible Erklärung für die gefundenen ‚Antworten’, die einer kritischen Prüfung anhand physiologischer Plausibilität nicht standhalten. Die Reduktion des Pulssignals durch Filter in Analogie zu dem durch Gratton und Corballis (Gratton and Corballis, 1995a) vorgeschlagenen und Erweiterungen dieses Ansatzes führten ebenfalls nicht zu einer verläßlichen Detektion einer Signaländerung, die als ereignis- und potential-korreliertes, schnelles optisches Signal gewertet werden kann.

Zusammenfassung

Unsere derzeitige Einschätzung bezüglich der Validität nicht-invasiv gemessener ereignis- und potential-korrelierter, schneller optischer Signale ist, daß allenfalls bei deutlicher Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses ein solches ‚fast optical signal’ nachgewiesen werden kann. Bei bisher fehlender Reproduktion der Ergebnisse, die von der Gruppe um G. Gratton publiziert wurden, durch unsere und auch durch andere Gruppen, resultiert eine deutliche Skepsis. Es sollte betont werden, daß nicht die Existenz der ‚fast optical signals’, sondern allein deren transkranielle Nachweisbarkeit beim


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Erwachsenen mit den derzeitigen Verfahren bezweifelt wird. Aufgrund der Befunde mit den verschiedenen methodischen Ansätze halten wir einen entscheidenden Schritt in der technologischen Weiterentwicklung für die wichtigste Voraussetzung, um die schnellen optischen Signale auch für die nicht invasive NIRS reliabel und in einem relevanten Anteil der untersuchten Probanden zugänglich zu machen. Derzeit erscheint uns zur Untersuchung der neurovaskulären Kopplung der unten beschriebene Ansatz mit einer Kombination von NIRS und EEG der sinnvollere Ansatz.

A.3. Tiefenauflösung

Wie bereits mehrfach erwähnt, ist bei der Anwendung der NIRS am adulten Kopf die Frage nach der Differenzierung extra- und intrakranieller Beiträge zu den gemessenen optischen Änderungen von essentieller Bedeutung. Es liegen eine Reihe theoretischer Approximationen der Eindringtiefe, sowie Abschätzungen der Sensitivität für verschiedene Kompartimente vor (Firbank et al. 1998; Okada et al. 1995; Okada et al. 1997; Liu et al. 1995). Während die Ergebnisse der Studien zeigen, daß bei genügend großem Probenabstand cerebrale Änderungen der optischen Eigenschaften detektiert werden, kann der umgekehrte Schluß, daß alle gemessenen Änderungen cerebralen Ursprungs sind, nicht gezogen werden. Stimulationskorrelierte Änderungen der systemischen Hämodynamik (Puls / Blutdruck) bilden sich in der NIRS ab, ohne daß eine Zuordnung zum extra- bzw. intracerebralen Anteil des Meßvolumens a priori möglich ist. In Teil B der vorliegenden Arbeit wird geschildert, wie das experimentelle Protokoll und die gefundenen Muster der Oxygenierungsänderungen zu einer Zuordnung zu lokalen cortikalen Blutflußänderungen beitragen. In den folgenden zwei Studien wird gezeigt, wie eine Tiefenauflösung mit zeitaufgelösten Verfahren erreicht werden kann und so eine grobe Trennung der intra- und extracerebralen hämodynamischen Änderungen erlaubt.

A.3.1. Bestimmung der Absorptionsänderungen in einem Schichtmodell des Kopfes

(Steinbrink et al. 2001b)*

Photonen mit sehr kurzer Flugzeit zwischen Lichtquelle und Detektor können maximal bis in eine bestimmte Tiefe vorgedrungen sein, während für ‚späte Photonen’ die Wahrscheinlichkeit steigt, einen Teil des Pfades in tieferen Schichten des Gewebes zurückgelegt zu haben. Aus dieser Gegebenheit leitet sich die Frage ab, inwiefern zeitaufgelöste Messungen (TCSPC, siehe Exkurs 1) die Differenzierung kleiner Absorptionsänderungen in oberflächlichen und tieferen Schichten zulassen. Ausgehend vom Konzept einer zeitabhängigen mittleren partiellen Pfadlänge (TMPP) wurden in einer Monte Carlo Simulation diese Werte für ein Schichtmodell berechnet. Es zeigt sich, daß Änderungen der Absorption in oberflächlichen Schichten zu keiner wesentlichen Änderung des TMPP für ‚frühe’


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und ‚späte’ Photonen führt. Findet die Änderung jedoch in tiefen Schichten statt, so werden die späten Photonen deutlicher attenuiert als die frühen, was in einer Zunahme des TMPP für die späten Photonen resultiert. Im Phantom ließ sich zeigen, daß bei Änderung von µa in der unteren Schicht mit diesem Modell die Stärke der oberen Schicht bestimmt werden kann. Werden 3 Schichten angenommen, lassen sich im Modell nur dann µa Änderungen berechnen, wenn die Stärken der Schichten bekannt sind. Zur Frage der Anwendung am Kopf des Erwachsenen wurden Messungen über der lateralen Zentralregion bei contralateraler motorischer Stimulation mit Messungen bei einem Valsalva-Manöver verglichen. Die Änderungen durch das Valsalva-Manöver lassen sich im Modell auf die Änderungen in oberflächlichen Schichten beziehen, während für die Änderungen im Rahmen der motorischen Stimulation in einer Schicht von etwa 10 mm Tiefe am größten sind. Diese Zuordnung entspricht den in den beiden physiologischen Modellen erwarteten Änderungen und liefert die Validierung der theoretisch hergeleiteten Tiefenauflösung. Da bei 805 nm, nahe dem isobestischen Punkt der Hämoglobine, gemessen wurde, läßt sich die Gesamt-Hämoglobin Konzentrationsänderung quantifizieren. Diese berechnet sich in der Schicht der größten Veränderung zu 1,1 µM, während unter Annahme einer homogenen Änderung ein Delta[tot-Hb] von 0,46 µM resultiert. Dies illustriert den ‚partial volume effect’ bei Messungen ohne Tiefenauflösung.

A.3.2. Differenzierung des extra- und intracerebralen Blutflusses anhand eines Farbstoff- Bolus.

(Kohl et al. 2002)

Wie in der vorangehenden Untersuchung gezeigt, erlauben zeitaufgelöste Messungen eine grobe Tiefenauflösung. Nachteile sind die aufwendige Technik, die zwar grundsätzlich in portablem Format herstellbar ist, aber technisch aufgrund der Laserinstabilität relativ störanfällig ist. Eine einfache, kommerziell erhältliche Alternative bietet der intensitätsmodulierte Ansatz, der neben der Attenuation (delta DC entsprechend delta OD) über die Phasenverschiebung der Modulationswelle (delta phi-gr) auch einen Meßwert für die mittlere Laufzeit <t> liefert (siehe Exkurs 1). Analog zum zeitaufgelösten Ansatz erfolgt die Differenzierung in eine oberflächliche und eine tiefere Schicht über die unterschiedliche Tiefensensitivität der Intensitäts- und der Phasenänderungen im Schichtmodell. Unter Annahme unterschiedlicher Sensitivitätsfaktoren für die obere (l up, m up) und die tiefere Schicht (l low, m low) bezüglich der beiden Meßparameter läßt sich das Gleichungssystem:

(Gleichung 6)


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nach Absorptionsänderungen in der oberen (delta µ a,up) und tieferen Schicht (delta µ a,low) lösen. Die Sensitivitätsprofile lassen sich in einer MC-Simulation (siehe A.1.2. zum Thema cross-talk) für verschiedene Schichtdicken der oberen Schicht berechnen. Wird nun ein Bolus des NIRS-Kontrastmittels IndoCyaninGrün (ICG, Pulsion®) gegeben, so läßt sich die Passage des Bolus durch ein oberes und ein unteres Kompartiment modellieren. Die Latenz und Form der Boli sind vom extra- und intracerebralen Blutfluß abhängig. Im Experiment konnte gezeigt werden, daß (1) die Variation der angenommenen oberflächlichen Schichtdicke quantitativ, nicht aber qualitativ die Ergebnisse beeinflußt; (2) der intracerebrale Bolus früher das Meßvolumen erreicht und rascher ausgewaschen wird; (3) diese Unterschiede in der Form des Bolus gut mit dem Durchgang eines Gadolinium-Bolus in der MRT korrelieren, wenn cerebrale und extracerebrale Pixel im Zeitverlauf dargestellt werden.

Die Ergebnisse zeigen, daß mit der NIRS mit einem kommerziell erhältlichen Monitor am Krankenbett ein der MTT (mean transit time) vergleichbarer Parameter erhoben werden kann. Die Latenz des extracerebralen Bolus kann hier als Referenz bei Alterationen der cerebralen Durchblutung genutzt werden. Im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wird eine potentielle klinische Anwendung des ICG-Bolus-Ansatzes bei Patienten mit einer cerebralen Ischämie skizziert, der statt des frequency-domain monitors das in der Gruppe entwickelte bildgebende System nutzt. Da sich eine Korrelation mit einer - etwa bei Aufnahme eines Patienten durchgeführten - Perfusionsmessung in der MRT erlaubt, kann die NIRS den Stellenwert eines kontinuierlichen follow-up Monitorings am Krankenbett erlangen. Dies erscheint eine aussichtsreiche Anwendung im Rahmen akuter cerebraler Ischämien.

A.4. Bildgebung

Soll die cerebrale vaskulär-metabolische Antwort auf eine funktionelle Stimulation dargestellt werden, ist neben der Differenzierung intra- und extracerebraler Änderungen der gemessenen Parameter eine lokalisierte Antwort zu erwarten. Physiologisch ist die hohe räumliche Korrelation zwischen der neuronalen und vaskulären Antwort als ein Aspekt der neuro-vaskulären Kopplung die Basis aller vaskulär-basierten, funktionell bildgebenden Techniken. In den vorangehend dargestellten Studien bezogen wir uns jedoch meist auf Messungen der optischen Parameter im Meßvolumen zwischen nur einer Quell- und einer Detektor-Probe. Um auch mit der NIRS cortikal topographische Information über die Lokalisation der gemessenen Änderungen zu erzielen, läßt sich dieser Ansatz multiplizieren. Im Rahmen des CCD-Ansatzes werden in den in Teil B dargestellten physiologischen Experimenten bis zu vier Kanäle gleichzeitig genutzt (Obrig et al. 2000b)*. Der Schritt zur ‚Bildgebung’ ist analog zum Oberflächen-EEG zunächst ein quantitativer. Durch entsprechende Wahl des Proben-Arrays und bei geeigneter Datenanalyse lassen sich Bilder potentiell der gesamten Kopfoberfläche generieren. Jedoch sind auch die Erweiterungen der Technologie (frequency-domain oder time-domain), aber auch


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komplexere Bildrekonstruktionsalgorithmen anwendbar. Spektrale Auflösung, Anzahl der Proben, die Registrierung zusätzlicher Laufzeit-Parameter, sowie die Intensität der Quellen und Sensitivität der Detektoren bestimmen die Qualität eines bildgebenden Systems (Watanabe et al. 1998; Nioka et al. 1997; Miyai et al. 2001; Hintz et al. 2001). Sollen in einem Auswertealgorithmus mehr als die Informationen aus einfach benachbarten Quell-Detektorpaaren eingehen, erhöht sich auch die Meßzeit, um ein ausreichendes Signal-Rausch Verhältnis zu erreichen (Benaron et al. 2000). Alternativen zum modifizierten Lambert-Beer Ansatz wurden vorgeschlagen, die auf der Grundlage von komplexeren Rekonstruktionsalgorithmen Änderungen der cortikalen Oxygenierung darstellen (Boas et al. 2001). Die erste Generation der Systeme hat bewiesen, daß mit der topographischen Information lokalisierte Änderungen der cortikalen Oxygenierung in primären und sekundären cortikalen Arealen verschiedener funktioneller Systeme nachgewiesen werden können. Auch bietet bei der Anwendung bei Patienten die Fokalität einer pathologischen Alteration der Parameter die Möglichkeit, diese mit erhobenen morphologischen Veränderungen im cCT oder der cMRT grob zu korrelieren. Bei ausreichendem finanziellem und technischem Aufwand ist es realistisch, in den nächsten Jahren portable Systeme zu erwarten, die ein Bild der cortikalen Oxygenierungsänderungen mit einer groben Tiefenauflösung (extra- vs. intrakraniell) liefern.

Das in unserer Gruppe entwickelte System besteht aus 8 Quell- und 7 Detektor-Proben. Zur Differenzierung der zwei Wellenlängen und der unterschiedlichen Meßpositionen werden die einzelnen Quellpositionen und die beiden Wellenlängen nacheinander geschaltet. Die maximale Sampling-Frequenz (f) errechnet sich daher aus der Anzahl der Quellen (nQ) und Wellenlängen (n?) sowie der Anschaltzeit der Quellen (T):

(Gleichung 7)

Die Frequenz kann erhöht werden, wenn davon ausgegangen wird, daß ein Detektor, der mehr als den doppelten Abstand (also 5 cm bei einem Probenabstand von 2,5 cm) zu einer Quelle hat, kaum Photonen von dieser Quelle detektiert. Das System läßt sich über die Steuerungs-Software flexibel verschiedenen Meßanordnungen anpassen. Eine typische Meßanordnung über einem 5 x 10 cm großen Areal zeigt die Abbildung 10. Die Auswertung erfolgt nach dem modifizierten Lambert-Beer Ansatz, zur weiteren Daten-Analyse wurden verschiedene statistische Verfahren in einem Auswertepaket zusammengestellt. Abb. 10 zeigt auch die Ergebnisse bei einer contralateralen motorischen Stimulation (Opposition des Daumens mit den anderen Fingern der Hand). Das Bild demonstriert die Fokalität der Antwort, während der Zeitverlauf im Fokus einen Anstieg des [oxy-Hb] bei gleichzeitigem Abfall des [deoxy-Hb] zeigt. Wie in Teil B der vorliegenden Arbeit hergeleitet wird, ist dies das typische Muster der NIRS-Parameter als Korrelat einer cortikalen vaskulären Antwort. Bisher


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wurden visuelle und motorische Paradigmen untersucht. Zur Perfusionsmessung bei akuten Ischämie-Patienten wurde das bildgebende System weiterhin bei Gabe eines Kontrastmittel-Bolus (ICG-Pulsion®) angewandt. Die räumliche Auflösung erlaubt eine grobe topographische Differenzierung der Perfusion: unter der Annahme einer relativ homogenen Perfusion des extracerebralen Gewebes können fokale Differenzen der Bolus-Form und Bolus-Latenz auf fokale Differenzen der cerebralen Perfusion bezogen werden. (In Analogie zu dem unter A.3.2. dargestellten Ansatz dient hier der Vergleich unterschiedlicher Areale als Referenz, während der oben geschilderte Ansatz die oberflächlichen Schichten als Referenz nutzen kann. Eine Kombination des intensitätsmodulierten und bildgebenden Ansatzes wird angestrebt.)

Abb. 10: Bildgebendes cw-System, das in unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde. Unten rechts: Abbildung der Sender und Detektor-Module sowie des Probenkopfes. Die Schaltung und Anordnung der 8 Quell- und 7 Detektor Proben ist flexibel. Eine Anordnung in einem 5*10 cm großen Pad ist oben rechts dargestellt; es ergeben sich 22 mögliche Quell-Detektor-Kombinationen, denen je ein Meßvolumen zugeordnet ist. Die farbige Darstellung zeigt die Änderungen des [deoxy-Hb] und [oxy-Hb] im Verlauf einer 30 s dauernden Fingeroppositionsaufgabe. Das Pad wurde über der contralateralen Zentralregion angebracht. Die [deoxy-Hb] Werte wurden mit -5 multipliziert, Rottöne zeigen somit einen Anstieg des [oxy-Hb] und einen Abfall des [deoxy-Hb], entsprechend der erwarteten Antwort über einem funktionell aktivierten cortikalen Areal.


Fußnoten:

<1>

Phänomene der Fluoreszenz und des Laser-Doppler-Shifts, wie sie für weitere optische Methoden in der neurophysiologischen Forschung genutzt werden, sind im Rahmen der hier vorgestellten Methodik nicht von Relevanz. Im Rahmen unserer Arbeit haben wir ein von Prof. Soelkner und Dr. Lohwasser entwickeltes Gerät zur nicht-invasiven Anwendung der Laser-Doppler Flußmessung beim Erwachsenen evaluiert. Die Ergebnisse ließen eine sichere Anwendbarkeit bei einem größeren Kollektiv von Probanden nicht zu. Für eine Darstellung des methodischen Ansatzes des Verfahrens sei deshalb auf die Promotionsarbeit von Herrn Dr. Lohwasser verwiesen.

<2>

Das Streuverhalten des durchstrahlten Gewebes ist jedoch nicht nur zur Berechnung der mittleren Pfadlänge anhand des differentiellen Pfadlängenfaktors (DPF) zur Quantifizierung der Konzentrationsänderungen von Interesse. Es gibt eine Reihe physiologischer und pathophysiologischer Prozesse, die primär die Änderung des Streuverhaltens beeinflussen und damit potentiell auch zu detektieren sind. Hierzu gehören ödematöse Änderungen des Hirngewebes, Änderungen der Größe des Liquorraumes aber auch Refraktionsänderungen der Nervenzellmembranen, wie sie an isolierten Neuronen nahezu gleichzeitig mit Aktionspotentialen nachgewiesen wurden. Das physiologische Problem besteht darin, daß in vivo keine dieser Änderungen sicher isoliert auftritt, sondern fast immer mit einer Änderung auch der Hämodynamik oder des Metabolismus einhergeht. Das physikalische Problem besteht darin, daß schon im einfachen Küvettenmodell die Abschwächung aufgrund von Absorption und Streuung nur unter bestimmten Annahmen zu trennen sind.

<3>

Die Angabe D[Cyt-ox] ist keine echte Angabe für die Änderung der Gesamtkonzentration des Enzyms, sondern bezieht sich auf eine Änderung des Redox-Zustandes des mitochondrialen Enzyms: D[Cyt-ox]= D([Cytoxidiert]- [Cytreduziert]). Dies beruht darauf, daß die Gesamtkonzentration des zellständigen Enzyms sich über den Meßzeitraum, im Gegensatz zu den Hämoglobinen, nicht ändert. Zur Berechnung des Parameters wird deshalb das Differenzspektrum zwischen der oxidierten und reduzierten Form des Enzyms genutzt. Die Analogie in der Bezeichnung zu den Änderungen der Hämoglobin-Konzentrationen unterstreicht den analogen spektroskopischen Ansatz.

<4>

Grundsätzlich ist im Rahmen der Methodik zwischen fixen und dynamischen Absorbern zu unterscheiden. Fixe Absorber sind Stoffe, die zur Absorption (µa), nicht aber zu Absorptionsänderungen (d ma) über die Zeit beitragen. Hierzu gehört etwa das Melanin der Haut. Als dynamische Absorber werden alle Stoffe verstanden, die über den Meßzeitraum ihre Konzentration oder/und ihre ‚Farbe’ ändern. Neben den hier interessierenden Chromophoren Hämoglobin und Cytochrom-Oxidase sind dies auch die weiteren Cytochrome (Farbe) und in geringem Maße auch Wasser (Konzentration). Im gemessenen Spektralbereich sind die Änderungen jedoch vernachlässigbar.

<5>

NIRO-500, Hamamatsu, Germany: 775, 825, 850 und 904 nm ; ISS-Oxymeter, ISS Inc., USA: 750, 780, 810 und 830 nm .

<6>

CCD-Kamera: Princeton Instruments, SI, Germany; Spektrograph: Acton-Research, SP-275.

<7>

Für die ‚frühen’ Photonen kann aufgrund der Meßgeometrie eine maximale Eindringtiefe angenommen werden. So kann etwa ein Photon, das nach der Zeit t = c / n*d den Detektor erreicht, nicht gestreut worden sein. Es kann in der gemessenen Zeit nur den direkten Weg d zwischen Lichtquelle und Detektor zurückgelegt haben (sogenannte ballistische Photonen). Ballistische Photonen stellen im biologischen Gewebe eine für die Messungen irrelevante Ausnahme dar. Während die maximale Eindringtiefe einen oberen Grenzwert darstellt, ist bei den ‚späteren’ Photonen nur die Wahrscheinlichkeit höher, daß sie auch tiefe Gewebsschichten erreicht haben. Multiple Streuereignisse in den oberen Gewebsschichten oder mehrfache Reflektionen an den makro-anatomischen Strukturen (zum Beispiel im Liquorspalt) können ebenfalls zu einer längeren Verweildauer im Gewebe führen.

<8>

Bei den im Text zusammengefaßten Studien wurde das ISS-Oxymeter (l : 750, 780, 810 & 830 nm) mit einer Modulationsfrequenz von 110 MHz genutzt.

<9>

Die Arbeiten bei cardialen Bypass-Operationen dokumentieren sicherlich auch Änderungen, die eine Redoxänderung aufgrund des vaskulären O2-Angebotes plausibel machen. Die Studien zeigen allerdings, daß die Änderungen des Cyt-ox Redoxzustandes besser mit dem klinisch-neuropsychologischen Outcome der Pateineten korrelieren als die vaskulären Parameter der NIRS. Dieses Ergebnis ist für eine potentielle Anwendung des metabolisch-zellulären Parameters von hoher Relevanz. Ohne die Studie in ihrer Wertigkeit zu mindern muß bezüglich der sicheren Zuordnung des Parameters zu den Redoxänderungen der Cyt-ox jedoch angemerkt werden, daß bei globalen Änderungen des Sauerstoffangebotes auch hämodynamische Änderungen auftreten, die das weiter unten thematisiserte Phänomen des cross-talks nicht a priori ausschließen. Physikalisch ist weiterhin zu bedenken, daß bei hypoxischen Zuständen davon ausgegangen werden muß, daß die Annahme einer konstanten Streuung aufgrund des Ödems nicht mehr zutrifft. Die Zuordnung gemessener Cyt-Ox Änderungen zu allein zellulär-metabolischen Prozessen bedarf hier einer kritischen Prüfung. Die Studie ist aber ohne Zweifel mit Hinblick auf die potentielle Wertigkeit der Methode für anästhesiologisch-neurologische Fragen des Monitorings ein sehr gutes Beispiel für eine klinisch orientierte Anwendung.

<10>

Das Fehlen einer Referenzmethode ist also gleichzeitig eine Chance. Bei der Etablierung der NIRS in der neurophysiologischen Forschung muß methodenkritisch auch die Frage geäußert werden, welchen neuen, zusätzlichen Aspekt die Methode beleuchtet. Im Abschnitt ‚Physiologie’ zeigen wir, daß eine Reihe essentieller Fragen der neurovaskulären Kopplung mit der Methode untersucht werden können, die der methodisch unabhängigen Prüfung physiologischer Modelle der vaskulär-basierten funktionellen Bildgebungstechniken dienen. Bezüglich funktionell anatomischer Fragestellungen ist die derzeitige räumliche Auflösung jedoch limitierend. Hinweise, daß frühe Komponenten der metabolisch-vaskulären Antwort auch eine lokalisiertere Antwort des Stimulus abbilden sind in der Literatur dargestellt worden . Ähnliche Hinweise auf eine besser lokalisierende Cytochrom-oxidase Antwort im Vergleich zur vaskulären Antwort ([oxy-Hb] & [deoxyHb]) zeigten sich in einer unserer Studien mit dem mehrkanaligen CCD-Ansatz . Die Etablierung eines nur mit der NIRS darstellbaren, metabolischen Parameters ist also auch für eine Behauptung der Methode von hoher Relevanz.

<11>

Eine andere Möglichkeit besteht über die Analyse des 2. Differentials wie sie von Matcher et al. vorgeschlagen wurde und in Exkurs 1 kurz skizziert ist. Um den Wasser- und den deoxy-Hb- ‚peak’ im zweiten Differential des Spektrums gut beurteilen zu können, ist eine hohe spektroskopische Auflösung notwendig. Die effektive spektrale Auflösung von ~ 20 nm, die sich in unserem CCD-Ansatz als Kompromiß zwischen Signal-Rausch-Verhältnis und Blendenöffnung ergab, beeinträchtigt die Genauigkeit dieses Ansatzes.

<12>

Diese Untersuchungen wurden mit ‚dual-wavelengths’ Ansätzen durchgeführt, die im sichtbaren Bereich liegen und damit andere Redoxzentren des Enzyms untersuchen. Die spektroskopische Differenzierung der vaskulären und metabolischen Parameter ist auch in diesen Studien kontrovers.

<13>

Die Frage nach der Latenz der frühesten Komponenten der metabolisch-vaskulären Antwort wird in der Literatur unter dem Stichwort ‚initial dip’ diskutiert. Initiale Anstiege der deoxy-Hb Konzentration werden von der Arbeitsgruppe um A. Grinvald berichtet. Eine initiale hochlokalisierte ‚Sauerstoffschuld’ im aktivierten Areal vor Beginn der hämodynamischen Reaktion, anders formuliert, ein kurzzeitiger ‚mismatch’ zwischen der Latenz des metabolischen O2-Bedarfs und der folgenden, überschießenden Hyperoxygenierung, werden postuliert. In unserer Arbeitsgruppe konnten die Ergebnisse zumindest im Modell der somatosensorischen Stimulation der Ratte nicht reproduziert werden . Die Crux steckt erneut in der Spektroskopie und der Frage nach dem DPF bzw. Streuänderungen kurz nach Beginn der Stimulation. Interessanterweise gibt es auch in der Literatur zu frühen Änderungen des BOLD-Kontrastes kontroverse Befunde, hier werden zum Teil ebenfalls ein früher Abfall des BOLD-Kontrastes - entsprechend einem transienten Anstieg des [deoxy-Hb] - berichtet .


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Fri Jan 10 11:15:00 2003