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2.  Eigene Arbeiten

Die eigenen Untersuchungen beschäftigen sich mit unterschiedlichen Aspekten der Aetiologie und Pathogenese der chronischen Pankreatitis und des Pankreaskarzinomes. Initial stellten wir uns die Frage, inwieweit immunologische Veränderungen an der Entstehung einer chronischen Pankreatitis beteiligt sind und ob immunologischen Vorgängen eine besondere Rolle bei der idiopathischen Pankreatitis zukommt. Der Vergleich von Patienten mit alkoholischer Genese der Erkrankung versus einer ‚idiopathischen’ Pankreatitis erbrachte für beide Gruppen gleichermaßen Zeichen einer zelluären Immunstimulation.
Vor dem Hintergrund des wachsenden molekularbiologischen Wissens dehnten wir unsere Untersuchungen auf die Beziehungen zwischen Genotyp und – Phänotyp aus. Für genetische Untersuchungen sind besonders familiäre Erkrankungen wie die hereditäre Pankreatitis geeignet. Nach der Entdeckung der Mutationen (N29I, R122H) des kationischen Trypsinogen Gen (PRSS1) als Ursache der hereditären Pankreatitis (17), wurde schnell deutlich, dass diese beiden Mutationen im PRSS1 nur einen Teil der hereditären Pankreatitiden erklären. Wir konnten eine neue Mutation im kationischen Trypsinogen Gen bei einer von uns identifizierten Familie mit familiärer Pankreatitis nachweisen. Zusätzlich haben wir erstmals in einem in vitro Modell einen möglichen Wirkmechanismus der von uns entdeckten Mutationen D22G sowie einer weiteren Mutation K23R erarbeitet.
Neben der seltenen genetischen Modellerkrankung der hereditären Pankreatitis blieb aber weiterhin die Frage offen, inwieweit genetische Prädispositionen an der Entstehung von nicht familiären akuten und chronischen Pankreatitiden beteiligt sind. Daher konzipierten wir weitere Studien unter Berücksichtigung verschiedener Kandidatengene bei Patienten mit sogenannter idiopathischer chronischer Pankreatitis oder rezidivierenden Pankreatitiden unklarer Genese. Hierzu führten wir ein Screening bei den Patienten auf das Vorliegen von Mutationen des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Gens durch.


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Neben der exakten Erfassung des Phänotyps koppelten wir die genetischen Untersuchungen mit elektrophysiologischen in-vitro Untersuchungen um die funktionelle Relevanz der entdeckten Mutationen zu charakterisieren. Neben dem CFTR Gen wurde in einer weiteren Untersuchungen die Prävalenz und der Einfluss von Mutationen im Serineproteasen Inhibitor SPINK1 bei Patienten mit chronischer idiopathischer Pankreatitis evaluiert. Hierbei charakterisierten wir den bisher unbekannten Polymorphismus R65Q. Wir beobachteten in dieser Studie eine bisher nicht beschriebene compound Heterozygotie von CFTR und SPINK1 Mutation bei einem Patienten mit unklarer Pankreatitis.
Unter Berücksichtigung der Interaktionen zwischen genetischer Prädisposition und Umwelteinflüssen suchten wir nach weiteren Kandidatengenen, die an der Entstehung von Pankreaserkrankungen beteiligt sind. In diesen Untersuchungen bezogen wir auch Patienten mit Pankreaskarzinom ein. Hier wandten wir unserer Aufmerksamkeit der UDP-Glukuronosyltransferases (UGT) zu, welche als Phase II Enzym an der Zyto- und Genoprotektion beteiligt ist. Diese Arbeit zeigt erstmalig, dass UGT1A7*3 Polymorphismen, welche ein Enzym mit erniedrigter katalytischer Aktivität kodieren, in Verbindung mit einem Risikoverhalten das Auftreten von entzündlichen und malignen Pankreaserkrankungen beeinflusst. Darüber hinaus konnten wir darstellen, dass UGT1A7 in den Epithelien des oberen Gastrointestinaltraktes aber auch dominierend im Pankreasgewebe nachweisbar ist. Unsere Daten untermauern die protektive Rolle gegenüber Umweltfaktoren (Ernährung, Xenobiotika, Benzpyrene etc.) dieses Phase II Enzym am sogenannten „point of entry“ aber auch im Zielgewebe (Pankreas). Die Ergebnisse aus der UGT1A7 Studie haben vermuten lassen, dass eine antioxidative Therapie den Verlauf einer Pankreatitis verbessern könnte. Unsere positiven Ergebnisse der bisher einzigen Studie zum Effekt einer immunmodulierenden und antioxidativ wirksamen Supplementation mit Glutamin bei Patienten mit akuter Pankreatitis, die einer parenteralen Ernährung bedürfen, bestätigt diese Hypothese.


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2.1.  Untersuchungen zur zellulären Immunantwort bei Patienten mit chronischer Pankreatitis

(Ockenga J , Jacobs R, Kemper A, Benschop RJ, Schmidt RE, Manns MP. Lymphocyte subsets and cellular immunity in patients with chronic pancreatitis. Digestion 2000; 62:14-21). Histologische Untersuchungen zeigen eine lymphozytäre Inflitration mit aktivierten T-Zellen im Pankreasgewebe von Patienten mit langjähriger chronischer Pankreatitis. Daher stellte sich die Frage, inwieweit an einer chronischen Pankreatitis auch eine autoimmune Komponente beteiligt ist. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Patienten mit chronischer Pankreatitis auch in klinisch stabilen Krankheitsphasen eine aktivierte zelluläre Immunantwort aufweisen; unter anderem fand sich eine stimulierte Zytokinausschüttung in vitro. Hierbei sahen wir keinen Unterschied ob die chronische Pankreatitis auf dem Boden eines Alkoholabusus entstanden war oder eine idiopathische chronische Pankreatitis vorlag . Diese Ergebnisse unterstützen die Ansicht, dass eine zellulär vermittelte Immunantwort in der Pathogenese der chronischen Pankreatitis eine Rolle spielt.

2.2. Mutation des kationischen Trypsionogen (D22G, K23R): Erleichterte Trypsin Aktivierung durch veränderte Aktivierungspeptide.

(Teich N, Ockenga J, Hoffmeister A, Manns M, Mossner J, Keim V. Chronic pancreatitis associated with an activation peptide mutation that facilitates trypsin activation. Gastroenterology 2000; 119:461-465). Nach der Entdeckung der Mutationen des kationischen Trypsinogen Gen (R122I, N29I, A16V, K23R) als Ursache der hereditären Pankreatitis bei einem Teil der Indexpatienten war klar, dass hiermit nicht alle Fälle einer familiären Pankreatitis erklärt werden können. Darüber hinaus stand der funktionelle Nachweis dieser Mutationen aus. Der genaue Mechanismus der Pankreatitisentstehung bei Vorliegen der


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Mutationen blieb spekulativ. In dieser Arbeit konnten wir eine neue missense Mutation D22G in einer von uns identifizierten Familie mit chronischer Pankreatitis beschreiben. D22G führt zu einem Aminosäurenaustausch im Bereich des Aktivierungspeptides des Trypsinogens. Anhand dieser und einer weiteren Mutation (K23R), die auch zu einem Aminosäurenaustausch im Aktivierungspeptid führt, wurde ein in vitro Modell entwickelt, in dem zu den Mutationen korrespondierende synthetische N-terminale Peptide hergestellt wurden. Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zeigten die beiden zu den Mutationen korrespondierenden synthetischen Peptiden erhöhte Hydrolisierungsraten und lassen damit eine höhere Freisetzung bzw. Aktivierung von Trypsin in vivo vermuten. Es gelang in einem in vitro Modell eine mögliche funktionelle Bedeutung von Mutationen im PRSS1 Gen nachzuweisen.

2.3. Mutationen des CFTR Gen aber nicht des kationischen Trypsinogen Gens sind assoziiert mit idiopathischer oder rezidivierender Pankreatitis.

(Ockenga J , Stuhrmann M, Ballmann M, Teich N, Keim V, Dork T, Manns MP. Mutations of the cystic fibrosis gene, but not cationic trypsinogen gene, are associated with recurrent or chronic idiopathic pancreatitis. Am J Gastroenterol 2000; 95:2061-2067). In 10 – 20% der Patienten mit rezidivierender oder chronischer Pankreatitis kann eine Ursache nicht eruiert werden und diese werden als idiopathisch definiert. Es finden sich in dieser Gruppe zwei Altersgipfel. In einem klinisch eng definiertem Patientengut mit Erstdiagnose der idiopathischen chronischen oder rezidivierenden Pankreatitis nach der Adoleszenz (> 18 Jahre) und vor der vierten Lebensdekade zeigte sich, dass in etwa einem Drittel der Patienten mindesten ein abnormales Allele des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Gens nachweisbar ist. Die erwartete Häufigkeit in der Normalbevölkerung liegt bei 4-6%. Veränderungen des kationischen Trypsinogen Gens, welches sich bei hereditärer


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Pankreatitis findet, spielen hier keine Rolle. Elektrophysiologische Messungen in vitro an Rektum Biopsien in einer Ussing Kammer erbrachten entgegen unseren Erwartungen keine nachweisbaren CF typischen funktionellen Veränderungen. Weitere Familienuntersuchungen lassen vermuten, dass für eine Prädisposition der Pankreatitis eine compound Heterozygotie notwendig ist. Unsere Daten bestätigen und erweitern zum ersten Mal in einer deutschen Studie die kurz zuvor publizierten Ergebnisse aus dem englischem und amerikanischem Sprachraum. Darüber hinaus konnten wir Mutationen des kationischen Trypsinogen Gens als einen den Phänotyp modifizierenden Faktor ausschließen.

2.4. Niedrige Prävalenz von Mutationen des Serine Proteinase Inhibitor Kazal Type I (SPINK1) Gen bei adulten Patienten mit idiopathischer Pankreatitis.

(Ockenga J, Dork T, Stuhrmann M. Low prevalence of SPINK1 gene mutations in adult patients with chronic idiopathic pancreatitis. J Med Genet 2001; 38:243-244). Unsere eigenen wie auch andere Arbeiten deuten zunehmend dahin, dass bei einem signifikantem Anteil der Patienten mit idiopathischer chronischer Pankreatitis eine genetische Prädisposition für Pankreaserkrankungen vorliegt. In dieser Arbeit haben wir unser Kollektiv an Patienten auf das Vorliegen von Mutationen in dem Serine Proteinase Inhibitor Kazal Type I (SPINK1) Gen untersucht. Hierbei haben wir eine neue bisher nicht beschriebene Veränderung des Gens (G->A, Nukleotidposition 194) entdeckt, die zu einer Missence Mutation R65Q führt. Eine weitere RNA Analyse aus der Rektumschleimhaut zeigte, dass das Splicing durch diese Veränderung nicht betroffen ist. Darüber hinaus fand sich bei demselben Patienten ein Nonsense-Mutation des CFTR Gen (Y1092X) in Exon 17b, so daß die Rolle einer doppelten Heterozygotie diskutiert wird.



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2.5.  Genetische Risikofaktoren bei chronischer Pankreatitis

(Teich N, Ockenga J , Keim V, Mössner J. Genetic risk factors in chronic pancreatitis. J Gastroenterology 2002; 37:1-9) In der zweiten Hälfte der Neunziger Jahre gab es wesentliche Erkenntnisse zu dem molekularbiologischen Hintergrund von Pankreaserkrankungen. Zu nennen sind hier die PRSS1 Mutationen, SPINK 1 Mutationen und die Assoziation zwischen CFTR Mutationen und Pankreaserkrankungen. In dem Review wird der Wissensstand dargestellt und ein Algorithmus zur klinischen Anwendung der genetischen Untersuchungen bei Patienten mit chronischer Pankreatitis vorgeschlagen.

2.6. Polymorphismen der UDP-Glukuronosyltransferase UGT1A7 als Risikofaktor der chronischen Pankreatitis und des Pankreaskarzinomes.

(Ockenga J , Vogel A, Teich N, Keim V, Manns MP, Strassburg CP. Polymorphisms of the UDP-glucuronosyltransferase UGT1A7 are a risk factor of chronic pancreatitis and pancreatic cancer (Gastroenterology, in Druck). Alkohol und Nikotinabusus sind etablierte Risikofaktoren für die Entwicklung einer chronischen Pankreatitis, wobei aber nur ca. 10 % der Patienten mit deutlichem Alkoholabusus eine chronische Pankreatitis entwickeln. Dieses lässt weitere – genetische – Einflußgrößen vermuten. Der Nikotinabusus ist darüber hinaus der stärkste Risikofaktor für das Pankreaskarzinom. Die UDP-Glukuronosyltransferase UGT1A7 ist ein Metabolisierungsenzym, das z.B. Tabakrauchkarzinogene inaktivieren kann und zyto- und genoprotektiv z.B. gegenüber oxidativem Stress wirkt. Wir konnten nachweisen, dass von den bisher bekannten 17 UGT Isoenzymen fast ausschließlich nur UGT1A7 im humanen Pankreas exprimiert wird. Wir demonstrieren weiter in dieser Arbeit, dass der Polymorphismus des UGT - UGT1A7*3, welches ein Protein mit niedriger katalytischer Entgiftungsaktivität kodiert, signifikant mit einer chronischen alkoholischen


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Pankreatitis und dem Pankreaskarzinom assoziiert ist. Die Assoziation zum Karzinom ist besonders stark, wenn ein Pankreaskarzinom früh (< 55 Lebensjahr) aufgetreten ist. Hiermit ergibt sich ein Zusammenhang zwischen genetischer Prädisposition und exogenen Faktoren in der Entstehung von entzündlichen und malignen Pankreaserkrankungen.

2.7. Rolle von Polymorphismen der Karzinogen entgiftenden UDP-Glukuronosyltransferase UGT1A7 bei Tumoren des proximalen Verdauungstraktes.

(Vogel A, Ockenga J , Ehmer U, Barut A, Kneipp S, Tukey R, Manns M, Strassburg C. Polymorphisms of the carcinogen detoxifying UDP-glucuronosyltransferase UGT1A7 in cancers of the proximal gastrointestinal tract. Z Gastroenterologie 2002;40:497-502). Auch die Karzinome des proximalen Verdauungstraktes sind mit Tabakrauch und Ethanolexposition assoziiert. In Ergänzung zu der vorangegangenen Untersuchung an Patienten mit Pankreaserkrankungen demonstrieren wir in dieser Arbeit die Expression des UGT1A7 in der Mukosa des Mundes, des Ösophagus und des Magens. Es findet sich eine Assoziation zwischen dem UGT1A7*3 Allele und Karzinomen des proximalen Verdauungstraktes. Diese Daten stützen unsere Beobachtungen an Patienten mit Pankreaserkrankungen und lassen vermuten, dass der Einfluss von karzinogenen Substanzen nicht nur abhängig ist von der zyto- und genoprotektiven Kompetenz in den ‚Endorganen’, sondern auch von der protektiven Kompetenz der Grenzfläche zwischen Aussenwelt und Organismus (proximaler Verdauungstrakt).

2.8. Effekt einer mit Glutamin angereicherten parenteralen Ernährung bei Patienten mit akuter Pankreatitis.

(Ockenga J , Borchert K, Rifai K, Bischoff SC, Manns MP. Effect of Glutamine supplementation in patients with acute pancreatitis. Clincal Nutrition 2002 (in press)). Im


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Rahmen einer akuten Pankreatitis wird der oxidative Stress als ein zytotoxischer Mechanismus der Zellschädigung angesehen. Glutamin ist ein wesentlicher Prekursor für das Gluthation, welchem eine wesentliche Rolle im Schutz der Zellen gegenüber oxidativen Stress zukommt. Darüberhinaus wird dem Glutamin ein positiver Effekt in der Immunmodulation und der Erhaltung der intestinalen Integrität zugeschrieben. In dieser prospektiven, randomisierten Studie fanden wir Hinweise auf einen positiven Einfluß einer Glutamin (Glutamin-Dipeptid) Substitution auf den klinischen Verlauf bei Patienten mit akuter Pankreatitis, die einer parenteralen Ernährung bedurften.


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23.02.2004