1. Einleitung

1.1 Tumorvakzinierung

Die in den letzten Jahren erfolgte Entwicklung im hämatologisch / onkologischen Grundlagenwissen hat die Sichtweise auf die Behandlungsmöglichkeiten fundamental geändert. Das zunehmende Verständnis der regulierenden Funktion des Immunsystems bei der Tumorabwehr, die Identifizierung von Tumorantigenen (1, 2, 3), die Kenntnisse der Rolle von Antigen präsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen (4, 5), haben neue Wege z.B. für die Entwicklung von Tumorvakzinen eröffnet. Die Vakzinen sind darauf ausgerichtet, eine zytotoxische T-Zellantwort und / oder eine Antigen-spezifische Antikörperantwort zu induzieren um das Immunsystem so zu aktivieren, dass Tumore und Metastasen spezifisch bekämpft werden.

Voraussetzung für eine erfolgreiche spezifische Vakzinierung ist das Vorhandensein


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eines Tumorantigens. Zahlreiche Antigene wurden identifiziert (2), u.a. mittels der SEREX-Methode (6, 7). Tumorantigene sind häufig Autoantigene, die auf Tumorzellen überexprimiert werden. T-Zellen erkennen Peptidfragmente (Epitope) dieser Antigene klassischerweise auf der Oberfläche der Zellen in Verbindung mit genetisch determinierten MHC-Molekülen (8). Die meisten Epitope sind neun Aminosäuren lange Peptide und wurden bisher für HLA-Klasse II identifiziert (2). T-Zellen benötigen zur vollen Aktivierung jedoch mindestens zwei Signale: neben der Erkennung der Epitope einerseits sind als zweites Signal kostimulatorische Moleküle wie z. B. B7.1 (DC80) bzw. B7.2. (CD 86) notwendig (9, 10). Tumorzellen verfügen nicht über diese kostimulatorischen Moleküle. Das ist wahrscheinlich auch der Grund, warum Tumorzellen, auch wenn sie Tumorantigene präsentieren, bei Patienten keine effiziente T-Zellantwort aktivieren. Tumorvakzinen sollen dieses Problem lösen helfen.

An der Entwicklung von Tumorimpfstoffen wird mit verschiedenen Ansätzen, u.a. unter Verwendung von genmodifizierten Tumorzellen (11), Peptiden/ Proteinen (12), dendritischen Zellen (13), DNA-Vakzinen (14, 15, 16) oder rekombinanten Viren (17, 18), gearbeitet.

1.1.1 Genmodifizierte Tumorzell-Vakzinen

Eine Möglichkeit der Konstruktion einer Vakzine besteht darin, Tumorzellen mit den für die T-Zell-Aktivierung notwendigen kostimulatorischen Molekülen per ex vivo Gentransfer auszustatten. Um die Effizienz der Vakzinen zu erhöhen, können Tumorzellen ex vivo zusätzlich mit Zytokingenen transfiziert werden. Die so modifizierten Tumorzellen werden im autologen System als Vakzine mit dem Ziel eingesetzt, das zelluläre Immunsystem tumorspezifisch zu aktivieren. Über einen erfolgreichen retroviralen Gentransfer von Lymphokingenen in humane Nierenzell-Karzinomzellen berichteten u.a. Gastl G. et al. (19). Klinische Studien mit retroviral transfizierten Tumorzellen wurden durchgeführt, z.B. mit bestrahlten autologen Prostata-Karzinomzellen, die nach Transduktion GM-CSF sezernierten (11). B- und T-Zellantworten sowie Delayed Type Hypersensitivity (DTH) - Reaktionen wurden dabei induziert (11).


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Vorteile dieser Vakzinen liegen darin, dass das Tumorantigen nicht identifiziert und charakterisiert werden muß und die Vakzine alle relevanten, auch individuelle Tumorantige, enthalten sollte. Ein Nachteil ist das möglicherweise noch vorhandene Metastasierungspotential und die Produktion von immunsupressorischen Faktoren durch die Tumorzellen. Schwierigkeiten stellen darüberhinaus das Erreichen einer ausreichenden Transfektionseffizienz und die aufwendige und zeitintensive Herstellung sowie die ausreichende Expansion der autologen Tumorzellen dar.

1.1.2 Peptid- und Proteinvakzinen

Voraussetzung für diesen Vakzinierungsansatz ist das Vorhandensein und die Kenntnis von immunogenen Peptiden bzw. Proteinen. Ein Vorteil ist die einfache technische Herstellung, nachteilig ist die Restriktion auf bestimmte HLA-Typen. Auch die Fokussierung auf ein einzelnes Epitop ist möglicherweise nicht ausreichend, um eine effektive Immunantwort zu induzieren. Unter dem Selektionsdruck kann es zu Verlusten der Epitope auf den Tumorzellen kommen und damit zur Ineffizienz der Immunisierung. Außerdem müssen die Peptide von APC präsentiert werden. Die Applikation erfolgt z. B. in die Haut in die Nähe von drainierenden Lymphknoten mit dem Ziel der Aufnahme durch dendritische Zellen. Dieser Weg ist aber nur schwer kalkulierbar. Weiterhin müssen kostimulatorische Substanzen bzw. Adjuvantien zusätzlich verabreicht werden, um eine volle T-Zellaktivierung zu erreichen.

Klinische Studien wurden hauptsächlich bei Patienten mit malignem Melanom, bei dem die meisten Epitope identifiziert wurden, durchgeführt (20, 21). Scheibenbogen C. et al. berichten über eine klinische Phase 2-Studie, bei der Tyrosinase-Peptide als Vakzine in Kombination mit GM-CSF bei 18 Patienten mit Malignem Melanom eingesetzt wurden (21). Ein Patient zeigte eine Regression der Lungenmetastasen, zwei Patienten mit vor der Immunisierung progredienter Erkrankung blieben stabil (21).

Als Adjuvantien wurden auch dendritische Zellen verwendet (20), z. B. auch in einer Vakzine gegen Human-Papillomavirus-Type 16 (HPV16)-induzierte Tumore (12). Ein 105 Aminosäuren langes, synthetisch hergestelltes Muzin-Peptid mit BCG als Adjuvants wurde in einer klinischen Phase I-Studie bei 63 Patienten verwendet und zeigte die Sicherheit dieser Vakzine sowie positive DTH-Reaktionen in einigen Fällen (22).


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1.1.3  Verwendung von dendritischen Zellen

Dendritische Zellen als "professionelle" Antigen präsentierende Zellen (APC) spielen eine zentrale Rolle bei der Induktion einer Immunantwort (Abb. 1). Sie verfügen über zur T-Zellaktivierung notwendige kostimulatorische Moleküle und haben die Fähigkeit, Antigene aufzunehmen, diese innerhalb der Zelle zu prozessieren und in die Lymphknoten zu wandern (4). Dort werden die Antigene unter Anwesenheit der kostimulatorischen Moleküle den T-Zellen präsentiert. Diejenigen T-Zellen, die das Antigen auf den dendritischen Zellen erkannt haben, vermehren sich, werden aus den Lymphknoten ausgeschwemmt und erreichen über die Zirkulation ihre Zielzellen und lysieren diese (4).

Abb. 1 : Rolle der dendritischen Zellen bei der Induktion einer Immunantwort

Insbesondere Verfahren zur Differenzierung dendritischer Zellen aus Monozyten unter Verwendung von Zytokincocktails wie Interleukin 4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-kolonienstimulierender Faktor (GM-CSF) (5) werden in ersten klinischen Studien genutzt.


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Autologe dendritische Zellen, gepulst mit Antigenen, wurden erstmals 1995 in einer klinischen Studie von Hsu F. J. et al. (23) zur Therapie bei Patienten mit B-Zell-Lymphomen eingesetzt. Das Verfahren erwies sich als nicht toxisch und wurde von den Patienten gut toleriert. Ein klinisches Ansprechen wurde beobachtet.

Eine weitere Möglichkeit der Nutzung als Vakzine besteht in der ex vivo Beladung ("pulsen") von dendritischen Zellen mit Peptiden oder Proteinen. Auch hier erfolgten die ersten Studien mit gutem Erfolg beim Malignen Melanom (20).

In der Gruppe Finn wurden präklinische Studien mit Muzin-Peptid gepulsten autologen dendritischen Zellen an Schimpansen durchgeführt (24). Dabei konnte gezeigt werden, daß subkutan applizierte dendritische Zellen in den drainierenden Lymphknoten wandern (24).

Ebenfalls praktikabel scheint die Fusion von dendritischen Zellen mit Tumorzellen zu sein, bei der Anti-Tumor-Immunantworten beobachtet wurden (25).

Ein Gentransfer in dendritische Zellen stellt einen weiteren Ansatz dar, Tumorvakzinen zu konstruieren. Beschrieben sind der retrovirale (26, 27, 28), der adenovirale (29, 30, 31, 32, 33), der Rezeptor-vermittelte (34) Gentransfer sowie die Verwendung von Liposomen (33, 35, 36, 37).

Es ist derzeit nicht abzusehen, welcher Weg sich in der klinischen Anwendung durchsetzen wird. Entscheidend werden hierbei auch Praktikabilität unter Good Manufacturing Practice (GMP)- und Good Clinical Practice (GCP)-Bedingungen, Kosten und Standardisierbarkeit sein.

1.1.4 Verwendung von aktivierten B-Zellen

Anstelle von dendritischen Zellen können auch aktivierte B-Zellen als APC verwendet werden (38, 39, 40, 41, 42). Epstein-Barr-Virus (EBV)-immortalisierte B-Zellen exprimieren kostimulatorische Moleküle wie B7.1 und B7.2 und wurden als Vakzine in Schimpansen verwendet (42). Für klinische Anwendungen müßte sichergestellt sein, dass von der Vakzine kein Virus produziert wird. Bei dendritische Zellen stellt sich dieses Problem nicht und sie sind im Vergleich zu aktivierten B-Zellen potentere APC bei der Initiation einer zellulären Immunantwort bzw. dem "primen" von "naiven" T-Zellen.


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Über eine klinische Studie, bei der spontane lymphoblastoide Zelllinien von latent mit EBV infizierten Tumorpatienten mit mutiertem p21 ras bei Patienten mit Pankreaskarzinom als Vakzine verwendet wurde, wird berichtet (43). Bei den Patienten mit weit fortgeschrittener Erkrankung war jedoch kein Tumoransprechen zu verzeichnen.

1.1.5 Rekombinante Viren

Neben der beschriebenen Verwendung von dendritischen Zellen als Vakzine wird auf die Entwicklung neuer, nicht zellulärer Vakzinen fokussiert, die kostengünstiger und nicht mit der Problematik der individuellen Herstellung von Zellen behaftet sind. Hier kommen neben "nackten" DNA-Vakzinen (s. 1.1.6) rekombinante Vaccinia- und adenovirale Vektoren in Betracht (17, 18, 44, 45). Vaccinia-Viren wurden als Vakzine erfolgreich zur Beseitigung der Pockeninfektion eingesetzt und stellen eines der effizientesten Expressionssysteme, die in der Biotechnologie verwendet werden, dar. Rekombinante Vaccinia-Viren, die HIV-ProteinV exprimieren, waren in der Lage, Rhesusaffen gegen ein HIV-"challenge" zu schützen (46). Ein erfolgreicher Einsatz in der Tumortherapie unter Verwendung von Epitopen des Tumorantigens Carcinoembryonales Antigen (CEA) wurde von Kass E. et al. beschrieben (43).

Rekombinante humane Adenoviren sind auf Grund ihrer hohen Proteinproduktion attraktiv für die Verwendung als Vektoren in der Gentherapie (47, 48). Adenoviren infizieren proliferierende und ruhende Zellen. Meistens werden replikationsdefiziente Viren, bei denen die E1-Region des Genoms fehlt, verwendet (48). Die starke Immunogenität der viralen Proteine könnte die Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort ergänzen, Wechselwirkungen sind jedoch noch zu eruieren. Über eine erste klinische Studie bei Patienten mit Malignem Melanom wird von Rosenberg S.A. et al. (45) berichtet.

1.1.6 "Nackte" DNA-Vakzinen

Im Gegensatz zu viralen Vektorsystemen sind nicht-virale Systeme einfacher und sicherer anzuwenden und benötigen einen geringeren präparativen Aufwand. DNA-


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Vakzinen verwenden Gene, die für Proteine kodieren, die von Antigenen stammen. "Nackte" -Vakzinen bestehen aus einem Plasmid mit einem starken Promotor, in dem das Gen von Interesse (z.B. für ein Antigen) integriert ist sowie Sequenzen zur Transkriptionsinitiation und -termination (49). Die Plasmide werden in Bakterien (E. coli) vermehrt, gereinigt, in Flüssigkeit aufgenommen und können dann direkt appliziert werden. Die Plasmide werden von den Muskelzellen oder dendritischen Zellen aufgenommen, in entsprechende Boten-RNA transkribiert und in Proteinantigene übersetzt.

Abb. 2 : Wirkungweise einer "nackten" DNA-Vakzine (aus: Pecher G. 2002.
DNA basierte Tumorvakzinierung. Symp. Medical. 2: 30-31)

"Nackte" DNA-Vakzinen haben bereits erfolgreich eine protektive Immunität gegen ein breites Spektrum infektiöser Agentien (z.B. Hepatitis B, Malaria) im Tierversuch bewiesen (50, 51). In den Muskel injiziert führten sie zu einer antigenspezifischen T-Zell- und Antikörperantwort (Abb. 2).

Die Effektivität dieser Vakzinen kann gesteigert werden durch die Verwendung von CpG-Oligonukleotiden in den Vektoren (52, 53, 54). CpG-Motive sind nichtmethylierte


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Cytidin-Guanosin-Dinukleotide mit bestimmten flankierenden Basensequenzen. Synthetische Oligonukleotide, die solche CpG-Motive enthalten, imitieren die Anwesenheit von mikrobieller DNA und induzieren eine zusätzliche immunstimulatorische Wirkung, die u.a. auch für die Aktivierung und Reifung dendritischer Zellen genutzt werden kann (55).

Interessant sind Ansätze, die Plasmide verwenden, die zusätzlich zu der Antigen-DNA die cDNA von beispielsweise GM-CSF (56) oder Hitzeschockproteinen (57) mit dem Ziel der Verstärkung der induzierten Immunantwort enthalten und virale und "nackte" DNA-Vakzinen kombinieren (56).

1.2 Das Tumorantigen Muzin

Pankreas- und Mammakarzinome entstehen durch maligne Transformation von normalen epithelialen Zellen. Beide, normale und maligne transformierte Zellen, exprimieren auf ihrer Oberfläche das Glykoprotein Muzin, bekannt auch als "Polymorphic epihelial mucin" (PEM) oder Episialin und kodiert durch das Gen MUC1 [kloniert von S. Gendler (58, 59) und S. M. Lan (60) ]. Die Besonderheit von MUC1, exprimiert in Pankreas- und Mammageweben, liegt darin, dass es 40 bis 100 "Tandem Nucleotid Repeats" enthält. Ein Repeat besteht aus 20 Aminosäuren einer bestimmten Sequenz (Abb. 3).

Abb. 3 : Muzin-"Tandem Nucleotid Repeat"-Sequenz


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Muzin zeigt auf Tumorzellen ein anderes Glykosylierungsmuster als auf gesunden Zellen (61). Es ist auf Grund einer gesteigerten Proliferationsrate oder einer aberranten Glykosyltransferase weniger glykosyliert (62, 63). Infolge dieser aberranten Glykosylierung werden auf dem Muzinmolekül von Karzinomzellen Peptid-Epitope "freigelegt", die vorher (auf normalen Zellen) von Kohlenhydraten maskiert waren (64) (Abb. 4). Diese Peptid-Epitope können vom Immunsystem als fremd erkannt werden (65, 66).

Von der Arbeitsgruppe O. J. Finn (67) und weiteren Gruppen (C. G. Ionnides, T. Takahashi) (68, 69) konnten tumorspezifische zytotoxische T-Zellen (CTL) aus Lymphknoten von Pankreas-und Mammakarzinompatienten gewonnen und kloniert werden, die das aberrant glykosylierte Muzinmolekül als Tumorantigen erkennen (70).

Abb. 4 : Muzin auf normalen Zellen und auf Tumorzellen

Das Peptid-Epitop mit der Aminosäuresequenz Pro Asp Thr Arg Pro auf diesem Molekül, das auf Tumorzellen nicht glykosyliert ist, wurde als wahrscheinliches Target für diese tumorspezifischen CTL identifiziert (71). Das gleiche Epitop wird auch von tumorspezifischen monoklonalen Antikörpern (SM3, deshalb als SM3 Epitop bezeichnet,) erkannt (72, 73, 74, 75, 76). Die CTL lysierten mehrere Muzin exprimierende Tumor-Zellinien unabhängig vom MHC-Typ, jedoch nicht Muzin negative Tumor-Zellinien und normale Muzin produzierende Zellen (71, 77, 78). Die MHC-unabhängige Erkennung dieser Muzinepitope wird mit der besonderen Struktur des Moleküls ("Tandem Nukleotid Repeat") sowie der hohen Dichte des Antigens auf der präsentierenden Zelle erklärt. Die mehrfache Wiederholung des immunogenen Peptid-


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Motivs kann möglicherweise zu einer Aktivierung der T-Zellen durch ein "Crosslinking" des T-Zell-Rezeptors führen, ohne dass der MCH-Komplex vorhanden sein muß (79). Darin liegt eine Besonderheit des Muzinmoleküls als Antigen, das als ganzes Molekül auf der Zelloberfläche erkannt werden kann. SM3 Epitope finden sich immunhistochemisch auf Pankreas- und Mammakarzinomgewebe in allen untersuchten Fällen unabhängig vom histologischen Typ, ebenso auch auf Metastasen der entsprechenden Karzinome (73).

Neben dieser MHC-unabhängigen Erkennung des Muzinmoleküls existiert auch der klassische Weg der Epitoperkennung und der Antigenpräsentation in Verbindung mit dem HLA-A2-Komplex (80, 81, 82).

Muzin-spezifischen CTL-precursor-Frequenzen bei Patienten wurden mittels Limiting Dilution Assay (LDA) bestimmt (83). Bei Anwendung des Assays, zunächst für Tumorpatienten verglichen mit gesunden Probanden, zeigte sich, dass einige Tumorpatienten im Vergleich zu Gesunden höhere CTL-precursor-Frequenzen für Muzin-Epitope im peripheren Blut haben (83). Es ist jedoch festzustellen, dass die Tumorpatienten nur eine relativ niedrige Mucin-Epitop-spezifische CTL-precursor-Frequenz aufweisen, was u. a. darauf hinweist, daß Tumorzellen keine optimalen Antigen präsentierenden Zellen für die T-Zellaktivierung sind.

Die Verwendung von Muzin-Epitopen zur Konstruktion einer Vakzine mit dem Ziel der Stimulierung autologer Tumor-spezifischer-CTL stellt einen vielversprechenden Immuntherapieansatz insbesondere bei Patienten mit Muzin-exprimierenden Mamma- und Pankreaskarzinomen dar.

Das Mammakarzinom ist der am häufigsten auftretende Tumor bei Frauen. Das Risiko, ein Mammakarzinom zu entwickeln, beträgt ca. 10%. Das metastasierte Mammakarzinom ist zur Zeit immer noch eine unheilbare Krankheit. Die mediane Überlebenszeit von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom beträgt 18-24 Monate. Das Pankreaskarzinom stellt die vierthäufigste Todesursache bei Tumorerkrankungen in westlichen Industrieländern dar. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung haben 75-85% der Patienten einen nicht mehr resezierbaren Tumor. Konservative onkologische Strategien wie Chemo- oder Strahlentherapie haben nicht zu einer Verbesserung der Prognose geführt. Die Mehrheit der Patienten verstirbt innerhalb von 3-6 Monaten.


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Die Suche nach neuen Therapiekonzepten sowohl beim metastasierten Mammakarzinom als auch beim Pankreaskarzinom ist somit angezeigt.


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21.10.2003