2. Präklinische und klinische Studien

2.1 Induktion einer Immunantwort in Schimpansen durch Vakzinierung mit Muzin-cDNA-transfizierten autologen Epstein-Barr-Virus (EBV) immortalisierten B-Zellen

Pecher G. and O. J. Finn. 1996. Induction of cellular immunity in chimpanzees to human tumor-associated antigen mucin by vaccination with MUC-1 cDNA transfected EBV-immortalized autologous B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1699-1704

Mit Muzin-cDNA transfizierte Zellen, die eine große Anzahl immunogener Epitope exprimieren, bieten die Chance, eine hohe Dichte der Epitope zu gewährleisten und so ein ausreichendes "Crosslinking" der T-Zell-Rezeptoren zu erreichen. Weiterhin werden zur vollen Aktivierung von CTL und zum "Priming" von naiven T-Zellen kostimulierende Moleküle, wie z. B. B7, benötigt (10). Es liegt also nahe, Muzin-cDNA in "professionelle" autologe Antigen präsentierende Zellen (APC), die diese Liganden exprimieren und im Gegensatz zu Tumorzellen keine immunsuppressiven Substanzen produzieren, zu transfizieren. Solche geeigneten APC sind aktivierte B-Zellen oder dendritische Zellen (s. Abschnitte 1.1.3 und 1.1.4). Eine Vakzine mit dem Ziel der Muzin-Epitop spezifischen T-Zellaktivierung, die autologe APC transfiziert mit Muzin-cDNA enthielt, wurde an Schimpansen getestet. Als aktivierte B-Zellen wurden EBV-immortalisierte B-Zellen, die mittels Elektroporation mit MUC1 (das Plasmid enthielt 22 Wiederholungen der "Tandem Nucleotid-Sequenz") transfiziert wurden, verwendet. Schimpansen besitzen ebenfalls die "Tandem Nucleotid Sequenz" des MUC1. SM3-Epitope wurden durch Anwendung des kompetitiven Glykosylierungsinhibitors Phenyl-N-α -D-Galactosaminid (Phenyl-GalNac) (84) zur Expression gebracht. Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich war, durch diese Vakzinierungsform in den Schimpansen nach Immunisierung CTL spezifisch für Muzin-Tumor-Epitope zu erzeugen (vor Immunisierung waren keine Tumor-Epitop spezifischen CTL im peripheren Blut der Schimpansen nachweisbar). Eine besonders hohe T-Zellfrequenz war nach der Immunisierung im drainierenden Lymphknoten der Vakzinierungsseite zu finden. Ebenso


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wies eine für Muzin spezifische "Delayed Type Hypersensitivity" (DTH) Reaktion auf eine erfolgte T-Zellaktivierung hin. Durch diese Vakzinierung war es möglich, T-Zellen in vivo für Tumor-spezifische Muzinepitope zu "primen". Bei den Schimpansen traten keine Nebenwirkungen, Toxizitäts- oder Autoimmunerscheinungen auf.

2.2 Humorale Immunantwort gegen Muzin

Kotera Y., J. D. Fontenot, G. Pecher, R. S. Metzgar, and O. J. Finn. 1994. Humoral immunity against a tandem repeat epitope of human mucin MUC-1 in sera from breast, pancreatic and colon cancer patients. Cancer Res. 54: 2856-2860

Die Daten in dieser Publikation wurden vorrangig von Y. Kotera erhoben. G. Pecher hat daran mitgearbeitet und die Ergebnisse zur Immunhistologie der Tumorzellen gewonnen.

Tumorspezifische humorale Immunantworten in Patientenseren wurden gegen verschiedene Tumorantigene oder Onkogene, u.a. gegen c-myc bei kolorektalen Karzinomen (85), c-erbB-2/HER-2/neu bei Mammakarzinomen (86, 87) oder gegen p53-Epitope bei Bronchialkarzinomen (88) gefunden. Die therapeutische Bedeutung ist unklar. Auch gegen Muzin-Epitope wurde eine Antikörperantwort ermittelt. Seren von 24 Patienten mit Mammakarzinom, 10 Patienten mit Kolonkarzinom und 12 Patienten mit Pankreaskarzinom wurden mittels ELISA unter Verwendung von 60, 80 und 105 Aminosäuren langen synthetischen Peptiden aus der "Tandem Repeat Region" getestet. 8,3% der Mammakarzinom-Seren, 16,7 % der Pankreaskarzinom-Seren und 10% der Kolonkarzinom-Seren waren positiv. Die höchsten Titer wurden bei Verwendung des 105 Aminosäure langen Muzin-Peptids erreicht. Die Antikörperantworten waren vom IgM-Isotyp. Mit Peptiden, die das Epitop Ala Pro Asp Thr Arg Pro enthielten, konnte im Assay die Antikörperantwort geblockt werden, so dass geschlußfolgert wird, dass die Antikörper dieses Epitop erkennen.

2.3 Zelluläre Immunantwort gegen Muzin

Jerome K. R., A. D. Kirk, G. Pecher, W. W. Ferguson, and O. J. Finn. 1997. A survivor of breast cancer with immunity to MUC-1 mucin, and lactational mastitis. Cancer Immunol. Immunother. 43: 355-360

Die klinische Daten wurden vorrangig von K. R. Jerome ermittelt. G. Pecher hat die Ergebnisse zur Bestimung der zellulären Immunantwort bei der Patientin erhoben.


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Es wird der Fall einer Mammakarzinompatientin beschrieben, die fünf Jahre nach der Mastektomie schwanger wurde und dabei in der verbliebenen Brust eine schwere inflammatorische Mastitis entwickelte. Diese wurde histologisch bestätigt, es fand sich kein Hinweis auf Malignität. Das Mastitis-Gewebe exprimierte wie das Tumorgewebe unglykosylierte Muzinepitope. Die T-Zellantwort bei der Patientin wurde mittels Limiting Dilution Assay (LDA) bestimmt. In drei Experimenten betrug die Muzinspezifische T-Zell-Frequenz jeweils 1 in 3086 , 1 in 673 und 1 in 583. Verglichen mit Gesunden, die eine Frequenz von ca. 1 in 1 Million haben (83), ist das eine sehr hohe Frequenz. Die Patientin blieb über den Beobachtungszeitraum von weiteren fünf Jahren karzinomfrei. Es wird angenommen, dass der primäre Tumor eine zelluläre Immunantwort bei der Patientin induziert hat und, dass die Expression der Epitope auf dem Mastitisgewebe eine zweite Immunantwort ausgelöst hat, die vor dem Auftreten eines Karzinoms bzw. vor Metastasen geschützt hat.

2.4 Muzin exprimierende "Mini"-Epstein-Barr-Virus-immortalisierte B-Zellen zur Erzeugung zytotoxischer T-Zellen

E. Kilger*, Pecher G.*, A. Schwenk and W. Hammerschmidt. 1999. Expression of Mucin (MUC-1) from a Mini-Epstein-Barr Virus in immortalized B-cells to generate tumor antigen specific cytotoxic T cells. J. Gene Med. 1: 84-92, * joined first author

Aktivierte B-Zellen können als APC zur Stimulation spezifischer T-Zellantworten verwendet werden (39, 40). "Mini"-EBV-Plasmide enthalten alle funktionellen Elemente, die zur Immortalisierung von B-Zellen notwendig sind. Es wurde ein "Mini"-EBV-Plasmid mit einer Expressionskassette für Muzin konstruiert. Mit dem "Mini"-EBV-Muzin-Plasmid wurden primäre humane B-Zellen infiziert. Die etablierten B-Zellinien waren frei von Helfer-Viren und Wildtyp-EBV. Die Zellinien wurden mittels Durchflußzytometrie auf die Expression von Muzin und das Vorhandensein kostimulatorischer Moleküle getestet und zur Stimulation von PBMC, die von gesunden Spendern stammten, verwendet. Es gelang, zytotoxische T-Zellen, die die Muzin-exprimierende Mammakarzinom-Zelllinie Cama und die Pankreaskarzinom-Zelllinie Capan2, jedoch nicht die nicht Muzin-exprimierende Zelllinie Raji lysierten, zu generieren. Die Lyse konnte mit einem Muzin-Epitop-erkennenden mAk geblockt werden.


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Virusfreie B-Zelllinien, die Tumorantigene wie z. B. Muzin exprimieren, liefern eine unbegrenzte und sichere Quelle für APC, mit denen ex vivo T-Zellen antigenspezifisch stimuliert und expandiert werden können. Dieser Ansatz könnte für eine adoptive Immuntherapie genutzt werden.

2.5 Herstellung eines immortalisierten humanen CD4+ T-Zell-Klons, der Muzin exprimierende Tumorzellen in vitro und in vivo lysiert

Pecher G., Harnack U., Günther M., Hummel M., Fichtner I., and J. A. Schenk. 2001. Generation of an immortalized human CD4+ T cell clone inhibiting tumor growth in mice. Biochem. Biophys. Res. Comm. 283:738-742

Tumorantigenspezifische T-Zell-Klone sind ein hilfreiches Mittel in der Tumorimmunologie um die Interaktionen zwischen Effektorzellen und Antigen zu studieren. Die Lebensdauer eines solchen Klons in der Zellkultur ist in der Regel jedoch begrenzt. Um einen immortalisierten T-Zell-Klon zu generieren, wurde eine "Mixed Lymphocyte Culture" mittels Herpesvirus saimiri transfomiert. Es konnte ein CD4+ T-Zell-Klon gezüchtet werden. Die Klonalität wurde durch die Analyse des ab T-Zell-Rezeptors bewiesen. Der Rezeptor wurde sequenziert. Der Klon wies eine zytolytische Aktivität gegenüber Muzin-exprimierenden Tumorzellinien auf. Weiterhin wurden in einem NOD/SCID-Mausmodell Muzin-exprimierende Tumorzellen (Panreaskarzinomzellinie Capan-2) durch den Klon im Wachstum gehemmt.

Die Kenntnis des T-Zell-Rezeptors dieses Klons liefert die Grundlage für eine mögliche adoptive Immuntherapie, bei der der Rezeptor z. B. in rekombinanten chimären Konstrukten mittels Gentransfer in Effektorzellen verbracht werden kann, um ein antigenspezifisches Targeting zu erreichen.

2.6 Hemmung des Tumorwachstums im Mausmodell durch eine Muzin-DNA-Plasmid-Vakzine

H. Johnen, H. Kulbe and G. Pecher. 2001. Long-term tumor growth suppression in mice immunized with naked DNA of the human tumor antigen mucin (MUC1) Cancer Immunol. Immunother. 50: 356-360

In einem Mausmodell wurden verschiedene nicht zelluläre Vakzinen als präklinische Studien auf ihre Effektivität hin getestet. C57/BL6-Mäuse wurden mit dem Plasmid pCI-


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MUC1 zweimal, am Tag 1 und Tag 10, immunisiert. Die Applikation erfolgte intramuskulär. Fünf Tage nach der letzten Immunisierung erfolgte ein "Tumor-challenge" mit der murinen Tumorzelllinie MC38, die retroviral mit humanem MUC1 transduziert ist. In 85% der mit pCI-MUC1 immunisierten Mäuse wurde ein "Nichtanwachsen" des Tumors beobachtet, während in der Kontrollgruppe bei allen Mäusen der Tumor anwuchs. Nach drei Monaten erfolgte ein "re-Tumor-challenge". In den mit pCI-MUC1-geimpften Mäusen trat kein Tumorwachstum auf. Diese Mäuse waren offensichtlich durch die Muzin-DNA-Impfung vor einem Tumorwachstum langzeitlich geschützt.

Die "nackte" DNA-Vakzinierung stellt möglicherweise auch für die Immunisierung von Tumorpatienten einen vielversprechendes Verfahren dar.

2.7 Muzingentransfer in humane dendritische Zellen unter Verwendung von kationischen Liposomen und rekombinanten Adenoviren

Pecher G., Spahn G., Schirrmann T., Kulbe H., Ziegner M., Schenk J.A., and V. Sandig. 2001. Mucin gene (MUC1) transfer into human dendritic cells by cationic liposomes and recombinant adenovirus. Anticancer Res. 21: 2591-2596

Als Vorbereitung auf eine klinische Studie wurden Gentransferverfahren in humane dendritische Zellen erprobt. Es konnte gezeigt werden, dass sich dendritische Zellen als APC mittels kationischer Liposomen (LipofectinR ) effizient mit Muzin-cDNA transfizieren lassen. Es wurde das Plasmid pCMV/MUC1 verwendet. Die Transfereffizienz, die mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung von Muzin-Antikörpern ermittelt wurde, lag dabei bei 5 bis 20%. Nach der Transfektion exprimierten die dendritischen Zellen den Reifungsmarker CD83. Das ist ein möglicher Hinweis, dass durch die Antigenaufnahme die dendritischen Zellen ausgereift sind. Muzin-cDNA-transfizierte und mit dem Glykosylierungsinhibitor Phenyl-GalNac behandelte autologe dendritische Zellen erwiesen sich als geeignete Stimulatorzellen für periphere Blutlymphozyten (PBL). Mit einem Muzin-exprimierenden Adenovirus wurde eine Gentransfereffizienz von 20-40% erzielt. Die Stimulierbarkeit von PBL war vergleichbar mit der von liposomal transfizierten dendritischen Zellen.


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2.8  Effiziente Kryokonservierung von Muzin-cDNA-transfizierten humanen dendritischen Zellen für die klinische Anwendung

Pecher G., Schirrmann T., L. Kaiser L. and J.A. Schenk. 2001. Efficient cryopreservation of dendritic cells transfected with cDNA of a tumour antigen for clinical application. Biotechnol. Appl. Biochem. 34:161-166

Als weitere Vorbereitung für klinische Studien wurde eine effiziente Methode des Einfrierens von dendritischen Zellen etabliert. Für klinische Studien ist es erforderlich, standardisierte GMP-und GCP-gerechte Verfahren zu verwenden. Die Möglichkeit des Einfrierens der Vakzine trägt zur besseren Praktikabilität bei. Es wurde ein Verfahren etabliert, bei dem der Plasmaexpander GelifundolR (Oxypolygelatine) verwendet wird. Die DMSO-Konzentration reduzierte sich auf 5%. Es mußte kein fötales Kälberserum oder anderes Serum verwendet werden. Nach dem Einfrieren und Auftauen wiesen die dendritischen Zellen den typischen Phänotyp (CD 80+, CD83+, CD86+) auf und waren in der Lage, PBL in ähnlicher Weise zu stimulieren wie vor dem Einfrieren.

2.9 Klinische Phase I / II - Studie: Muzingen-transfizierte autologe humane dendritische Zellen als Vakzine

Pecher G., A. Häring, L. Kaiser and E. Thiel. 2002. Mucin gene (MUC1) transfected dendritic cells as vaccine: results of a phase I / II clinical trial, Cancer Immunol Immunother , in press, published online 19. 10. 2002

Es wurde eine klinische Phase I / II-Studie, bei der liposomal MUC1-transfizierte autologe dendritischen Zellen als Vakzine verwendet wurden, durchgeführt. In die Studie aufgenommen wurden 10 Patienten mit Mamma-, Pankreas- und Papillenkarzinom. Die Patienten erhielten jeweils zwei bzw. drei Immunisierungen im Abstand von drei Wochen. Appliziert wurden jeweils eine Million MUC1-transfizierte und mit dem Glykosylierungsinhibitor Phenyl-GalNac behandelte autologe dendritische Zellen subkutan in die Nähe der Leistenlymphknoten. Eine Vakzine-spezifische DTH wurde bei 3 der 10 Patienten beobachtet. 4 Patienten zeigten nach der Vakzinierung einen 2-bis 10-fachen Anstieg der Frequenz der Muzin-spezifischen Interferon-gamma-sezernierenden CD8+ T-Zellen im peripheren Blut. Es traten keine Toxizität und keine Nebenwirkungen auf. 9 der 10 Patienten mit weit fortgeschrittener Erkrankung waren weiter progredient. Eine Mammakarzinom-Patientin, die bereits vor der Immunisierung eine positive spezifische DTH-Reaktion aufwies und die auch einen Anstieg der Muzin-spezifischen


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Interferon-gamma-sezernierenden CD8+ T-Zellen im peripheren Blut nach der Immunisierung aufwies, war stabil für drei Monate seit Beginn der Vakzinierung. Die Patientin hatte außer Lebermetastasen keine weiteren Tumormanifestationen. Ihre Erkrankung war im Vergleich zu den anderen Patienten am wenigstens fortgeschritten. Das begründet möglicherweise den relativen Erfolg der Vakzinierung bei dieser Patientin.

Insgesamt konnte demonstriert werden, dass diese Art von Vakzinierung durchführbar und sicher ist, und dass Immunantworten auch bei Patienten mit weit fortgeschrittener Erkrankung erzielt wurden.


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21.10.2003